DD264454A1 - Verfahren zur synthese von chymosin - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren, durch welches das fuer die Kaeseherstellung benoetigte Chymosin nicht mehr aus dem Labmagen von Kaelbern gewonnen, sondern in beliebiger Menge synthetisch produziert werden kann; dabei soll sich aber das synthetisierte vom natuerlichen Chymosin in seiner chemischen Struktur nicht unterscheiden. Dazu wird ein isoliertes Chymosin-Gen in ein Promotor-Plasmid eingebaut, so dass in mehreren Stufen ein transformierbares Plasmid entsteht, welches in einen passenden Bacillus-Stamm transformiert wird. Nach submerser und aerober Vermehrung der Wirtszellen und Lyse der gewonnenen Zellmasse kann ein aktivierbares Prochymosin gewonnen werden. Fig. 1

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Synthese von Chymosin.

Oiinrakteristlk des bekannten Standes der Technik

Das als IVi'lchgerinnungsenzym unentbehrliche Chymosin wird aus dem proteolytisch unwirksamen Prochymosin gewonnen, das seinerseits wie allgemein bekannt und gebräuchlich aus dem Labmagen junger Wiederkäuer isoliert wird. Es steht deshalb nur im begrenzten Umfang zur Verfügung, und seine Herstellung auf diese Weise ist umständlich und teuer. Man hat deshalb seit langem versucht, das Prochymosin (oder ein gleichwertiges Pseudochymosin, dem einige N-terminale Aminosäuren fehlon, ohne daß sich dieser Mangel negativ äußern würde) auf anderem Wege zu gewinnen. Es ist naholiegend, das Enzym in einem natürlichen, aber gentechnisch entsprechend veränderten Mikroorganismus zu synthetisieren, wie dies in der PCT-Anmeldung 8500382 r zw. den EP-Patentanmeldungen 133756 und 154351 bereits beispielsweise vorgeschlagen worden ist, die sich aber auf die Darlegung einer entsprechenden Aufgabenstellung beschränken und das zugehörige neue Verfahren nur in seinen Grundzügen beschreiben. Dies ist für die Durchführung der Synthese nicht ausreichend, weil dine produktive Sekretion bzw. der proteolytische Abbau chimaorer, in dem betreffenden Wirts-Mikroorganismus fremder Proteine

durch dessen Proteasen nicht ohne weiteres erfolgt, worauf bereits in „Proceedings of the National Academy of Sciences of ' USA" 79 (1882), S. 5582-5586 hingewiesen worden ist. Es ist zwar entsprechend den PCT-Anmeldungen 8503949 und 8601826 auch schon versucht worden, die Proieolyse von Fremdproteinen in den verwendeten Mikroorganismen zu vermeiden; für die Synthese von Prochymosin sind die vorgeschlagenen Verfahren aber nicht geeignet und auch nicht vorgesehen.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziol, Chymosin nach einem wirtschaftlichen, weitgehend synthetischen Verfahren in beliebiger Menge so herzustellen, daß seine Eigenschaften mit dem natürlichen Enzym übereinstimmen.

Darlegung des Webens der Erfindung

Die Erfindung hat sich demzufolge die Aufgabe gestellt, die dargelegten Nachteile der bekannten vorgeschlagenen Methoden zu beseitigen und ein Prochymosin zu synthetisieren, das in seiner chemischen Struktur und seinen enzymatischen Eigenschaften dem aus dem Labmagon gewonnenen Enzym genau gleich ist. Durch Sekretion des von einem passenden Mikroorganismus gebildeten Prochymosins in eine Kulturlösung oder durch Fraktionierung des Zellextraktes soll das Enzym als filtriertes Konzentrat erzeugt werden. Im einzelnen ist eine geeignete Sekretions-Signal-Sequenz auszuwählen und die Primärstruktur in deren Bereich und im Bereich der Prochymosin-Senuenz der kodierenden DNS zu modifizieren.Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst daß die um die N-terminalen Basenpaare 1 bis 62 — also gerade bis zum ersten N-terminalen BamHI-Ort verkürzte und in der Konstruktion eines Plasmides pCHYA7 um die 24 Basenpaare bis zum Hpal-Ort des Plasmides pCHYA/ verlängerte cDNS-Sequenz der Donor-DNS bis zum C-terminalen Bcll-Ort (auf einem Hpal-Bcll-Fragment aus dem Plasmid pCHYA7) durch Einwirkung von Ligase derart in ein Promotorplasmid pPAS 1023 eingebaut wird, daß ein Plasmid pPAC 100 entstoht, daß die insgesamt verkürzte cDNS-Sequenz (auf einem über den C-terminalen Beil-Ort hinaus bis ζ um nächstfolgenden Hindlll-Ort reichenden Hpal-Hindlll-Fragment aus einem Plasmid pCHYKH 2) durch Einwirkung von Ligase so in ein Promotorplasmid pPAS 1023 eingebaut wird, daß ein Plasmid pPAC200 entsteht, daß nach Transformation der Ligationsgemische von Plasmiden pPAC 100 und pPAC200 für eine hohe Prochymosinbildung geeignete Plasmidtransformanten ausgewählt werden. Es ist dabei möglich, daß Teile der Gene für Bacillus-alpha-Amylase oder Bacillusbeta-Glukanase zur Herstellung von Promotorplasmiden für die Sekretion eingesetzt werden, daß ein Plasmid pSB 6 zur Reklonierung des Gens für alpha-Amylase amyA in Plasmid pPAS 10 mit der Orientierung Bell/Bell zu Bcll/Bamlll eingesetzt wird, daß oin EcoRI-Fragmnnt aus Plasmid pPAS 10 zur Herstellung des Promotorplasmides pPAS 1023 genutzt wird, oder daß das Promotorplasmid pPAS 1023 oder ein analoges Plasmid mit Teilen des Bacillus-beta-Glukanase-Gens zur Roklonierung der Prochymosin-Sequenz genutzt wird. Es Ist zweckmäßig, daß die Reklonierung der Prochymosin-Sequenz In Promotorplasmid pPAS 1023 in drei Schritten erfolgt, wobei im ersten Schritt die pPAS 1023-DNS im unikalen EcoRV geöffnet wird und die entstehenden Enden mit Bal31-Nuklease um etwa 100 Sasenpaare verkürzt worden, im zweiten Schritt eine partielle BcII-Vordauung der im ersten Schritt DNS erfolgt und im dritten Schritt die Prochymosin-Sequenz in das Promotorplasmid pPAS 1023 eingebaut wird, so daß Plasmida p."AC100 entstehen, daß dabei beim zweiten Schritt die vollständige Verdauung der im ersten Schritt präparierten DNS mit der Restriktase Hindill erfolgt und beim dritten Schritt die Prochymosin-Sequenz in das Promotorplasmid pPAS 1023 eingebaut wirci, so daß Plasmide pPAC20ύ entstehen, wobei die Prochymosin-Sequonz für don dritten Schritt vorteilhaft aus den Plasmiden pCHYA7 oder pCHYKH 2 entnommen wird und sich innerhalb eines Hpal N-terminal und Bell oder Hindlll C-terminal geschnittenon DNS-Fragmentes befindet. Es ist möglich, daß die Plasmide pPACIOO bzw. pPAC 200 zur Auswahl von Plasmiden mit hoher Sekretion in geeignete Bucillus-subtilis-Stämmo transformiert werden, speziell in die Bacilius-subtilis-Stämme GSB 26 oder BG 500, daß die Transformanten-Kolonien der Plasmido pPAC 100 bzw. pPAC 200 auf Kasein-Agarplatten oder nach einer anderen üblichen Methode nach Säureaktivierung des gebildeten Prochymosins auf ihre Chymosin-Bildung enzymographisch durch Färbung von Kasein-Gelen, serologische Verfahren oder dgl. geprüft werden, daß die Plasmide pPAC 100 bzw. pPAC200 zur Herstellung von Produktionsstämmen in geeignete Bacillus-Stämme eingeführt und auf genetische Stabilität und Bildung von Prochymosin mit säure-Chymosin-Aktivität hin überprüft werden, und daß zur Ermittlung von Kolonien mit maximaler Ausscheidung von Prochymosin die Kaseographie, ein Milch-clotting-Test oder dgl. Methode zur Chymosinbestimmiing benutzt werden.

Es ist besonders vorteilha^f\ wenn die Plasmide pPAC 100 oder ρPAC200 In Mikroorganismen mit Eignung für die submerse Fermentation transformiert werden, wobei als Mikroorganismen zweckmäßig Stämme der Gattung Bacillus oder S'reptococcus oder Line andere Art der gram-positiven Bakterien oder auch Hefestämme eingesetzt und derartige Stämme zur Herstellung von Prochymosin als technisches oder gereinigtes Enzym (sog. Zymogen) genutzt werden.Es .st auch möglich, daß das so gewonnene Prochymosin sich vom authentischen Kälbor-Prochymosin N-terminal durch den Ersatz der Aminosäuren AIa GIu · lle.Thz · Azg (die Aminosäuren 17 bis 21 der Prae-Prochymosin-Sequenz) durch die Aminosäuren der CAT-Restes Thr · Arg · Cys · Ser · Leu · VaI unterscheidet und von einer unbestimmten Anzahl von N-terminalen Aminosäureresten der Bacillus-amyloliquefaciens-alpha-Amylase gekennzeichnet ist bzw. bei Nutzung von Plasmiden plG 100 das gebildete Pseudo-Prochymosin anstelle der N-terminalen Aminosäuren 1 bis 45 die N-terminalen Aminosäuren +1 bis +32 dor alpha-Amylase vom Typ Bacillus amyloliquefaciens enthält. Schließlich ist es erforderlich, daß mit bekannten Verfahren aktivierbares Prochymosin aus der Kulturlösung durch Filtration, Fraktionierung, Konzentration und Sterilisation gewonnen wird.

Ausführungsbeispiel

Die weiteren Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden nachstehend an Hand dor Zeichnung an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert. Es zeigen

Fig. 1: die Bildung eines PlasmidspPAS 10

Fig.2: die Bildung eines Promotorplasmids pPAS 1023, Fig.3: die Bildung von Plasmid pPAC 100 und Fig.4: die Bildung von Plasmid pPAC200.

1. Herstellung von Plasmid pPAS 10 (Flg. 1)

Ein In bekannter Weise (z. B. nach Maniatis et al., Molocular cloning; a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. 1982) aus Bell und BamHI-gespaltener DNS aus Plasmid pSB6 Isoliertes Bcll-BamHI-DNS-Fragmont über etwa 2000Bp wird unter Einwirkung von Ligase in ein Bcll-gespaltones Plasmid pPL603 eingebaut und das Ligationsgemisch in Protoptasten von einem Bacillus-subtilis-Stamm nach einer seit langem bekannten Methode (Chang/Cohen, Molec.Gen.Genet,, 168 (1979), S. 111-115) transformiert. Auf zur Selektion von Transformanten-Kolonien etwa 750 Mikrogramm Kanamycin pro ml enthaltenden DM3-Selektionsplatten werden solche Transformanten-Kolonien identifiziert und ausgewählt, die Plasmid-DNS der in Fig. 1 gekonnzeichneten Struktur aufweisen. Sie erhalten die Bezeichung pPAS 10.

2. Herstellung von Plasmid 1023 (Fig. 2)

Aus isolierter und gereinigter DNS von Plasmid pPAS 10 v\ ird nach Spaltung der DNS mittels Restriktase EcoRI ein DNS-Fragment über etwa 1100Bp isoliert und mittels Ligasereaktion in LroRI-gospaltene DNS eines Vektorplasmidos pPL603 eingebaut. Das Ligationsgemisch wird (wie unter 1.) in einen Bacillus-subtilis-Stamm transformiert, wobei zur Selektion neben Kanamycin (Km) das Antibiotocum Chloramphenicol (Cm) zu 10 Mikrogromm/ml dem DM 3-Medlum zugesetzt wird, um lediglich das Wachstum solch ir Transformanten zu ermöglichen, die einem Typ von der in Fig. 2 für Plasmid pPAS 1023 gekennzeichneten Art entsprechen. Na>^h Isolierung, Reinigung und Charakterisierung der aus Km- und Cm-resistenten Transformanten gewonnenen DNS erhält das Plasmkt die Bezeichnung pPAS 1023.

3. Darstellung der Plasmide pPAC 100 (Fig. 3)

Zunächst ist die Normierung des Exonuklease-Bal31-Abbaus erforderlich. Dazu wird DNS von Plasmid pPAS 1023 mittels Restriktase EcoRV gespalten und zur Durchführung und quantitativen Bemessung des DNS-Abbaus vom EcoRV-Schnittort bei Plasmid-DNS (z. B. nach Maniatis, s. o. unter 1.) behandelt. Die für einen durchschnittlichen Abbau von 100 Bp pro Ende ermittelten Versuchsbedingu.igen werden schließlich zur Herstellung einer pPAS 1023-DNS-Prooe verwendet, für die in einem weiteren Kontrollversuch nachzuweisen ist, daß der Bal31-Abbau tatsächlich etwa 1008p pro EcoRV-Endo beträgt. Dabei W'rd nach Spaltung der Bal31-behandelten Plasmid-DNS mittels der Restriktase Bell an einem Anteil der DNS-Probe die Kontrolle durch Spaltung durchgeführt, wobei der Bal31-Abbau mittels geeigneter Standard-DNS an der tatsächlichen mittleren Länge des kleinen Bcll-Fragmentes (532 Bp- 100Bp = 432Bp) ermittelt werden kann. Eine für die Ligation ausreichende Menge dor EcoRV-Bal31-Bcll-behandelten und im Kontrollversuch charakterisierten DNS von Plasmid pPAS 1023 wird anschließend im Gemisch mit einem aus den Plasmiden pCHYA7 oder pCHYKH 2, die aus Patentanmeldungen der Anmelderin bekannt sind, nach Spaltung mittels Restriktasen Hpal und Bell und durch Fragmontisolierung gewonnenes Hpal-Bcll-DNS-Fragment über etwa 1100Bp mittels Ligase behandelt und das Ligationsgemisch in Bacillus subtilis transformiert. Die Transformation erfolgt unter Anwendung von Kanamycin als Selektionsmittel auf DM 3-Platten nach Chang und Cohen (s. o.). Zur Erkennung und Auswahl geeigneter Transformanten werden Transformanten-Kolonien von den Selektionsplatten auf Nähragarplatten, die etwa 5 Mikrogramm/ml Kanamycin enthalten, in Blöcken zu etwa 100 Kolonien pro Platte übertragen. Die derart übertragenen Transformanten sind bezüglich ihrer Chymosin-Bildung mittels Immunoblott-Analyse (z. B. nach Helfman et al., Proc.Nat.Acad.Sci.USAeO, 1983, S.31-35) zu überprüfen. Es wird eine Zwei-Nitrocellulosefilter Methodo (Shiroza et al., Gene 34 [19851, S. 1-8) verwendet, wobei immunoblot-positive Kolonien mittel Kaninchen-Anti-Kalbf chymosin-Antiserum ermittelt werden. Das obere, mit Transformanten-Kolonien bewachsene Nitrocellulosef ilter wird zur Kolonie-Hybridisierung [?.. B. nach Maniatis, s.o.) verwendet, wobei ein geeignetes P'32-endmarkiertesChymosin-DNS-Fragment aus den Donorplasmidenp10c10 bzw. p8G6, die üus Patentanmeldungen der Anmelderin bekannt sind, als Probe eingesetzt wird. Solche Transformanten, die sowohl im Immunoblot als auch im Kolonie-Hybridisierungs-Test positive Signale ergeben, erhalten die Bezeichnung pPAC 100, werden von den Musterplatten auf Nähragar übertragen und nachfolgend auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Plasmide der in Fig.3 gekennzeichneten Art werden aus Transformanten isoliert und wie unter 5. beschrieben zur Transformation in Bacillussubtilis-Stämme verwendet.

4. Herstellung der Plasmide ρPAC200 (Fig.4)

Die erforderlichen Arbeitsschritte sind mit denen, wie sie unter 3. beschrieben sind, soweit identisch, daß lediglich nach den Kontrollversuchen zur Bestimmung des BaI 31 -Abbaus der EcoRV-Bal 31 -behandelten pPAS 1023-DNS-Probe eine weitere Spaltung dieser DNS mittels Restriktase Hindill erfolgt und anschließend aus DNS der Plasmide pCHYA7 bzw. pCHYKH 2 (dieses bevorzugt) nach Hpal-Hindlll-Spaltucg isoliertes HpalHindlll-Fragment mittels Ligation eingebaut und das Ligationsgemisch in Bacillus-subtilis-Stämme transformiert wird. Die Transformanton-Kolonien werden dem unter 3. beschriebenen Auswahl verfahren unterworfen. Plasmide solcher Transformanten, die entsprechend Immunoblot und Kolonie-Hybridisierung als positiv ermittelt werden und die in Fig. 4 gekennzeichnete Struktur aufweisen, erhalten die Bezeichnung pPAC200 und stehen alternativ zu Plasmiden pPAC 100 zur Transformation in verschiedene Bacillus- oder andere Mikroorganismen-Stämme zur Verfügung.

5.- Transformation in geeignete Wirtsstämme und Nachweis der Prochymosln-Synthese in Bacillus subtilis Dio Plasmide pPAC 100 bzw. pPAC 200 werden entweder in einen protease-dofekten Bacillus-subtilis-Stamm wie z. 13. GB 500 (DD-Patentschrift 245244) oder einen anderen geeigneten Bacillus, Streptococcus oder gram-positiven Bakterienstamm mittels . - , Protoplasten-Transformation(nachChangundCohen, s.o. unter 1.) oder auf andere Weise transformiert. l'lasmidpPAS 1023

i~~~-· dient nach gleichartiger Transformation in den jeweils ausgewählton Bakterienstamm zur Kontrolle. Nach Überprüfung der

: Anwesenheit von Plasmid pPAC 100 bzw. pPAC 2G0 in den WIi .szellen werden Reinkulturen der Transformanten über 12,24 und

* _; 36 Stunden bei 37°C in einem für die Fermentor-Kultur von Bacillus subtilis geeigneten Nährmedium (z. B. Na-Succinat-LGS nach

*-,· * j Biochem.Biophys.Res.Commun. 128[1986),S.601-606oderGlutamat-Casein-Medium nach Appl.Env.Microbiol. 50(1985)

*"*""" S. 503-507) durchgeführt. Wenn die Zahlen aus diesen Kultur η geerntet und zur Lyse gebracht worden, kann im " '!extrakt

mittels SDS-PAGE nach Lämmli (Nature 227 (1970) S. 680-685) unter Verwendung der von Foltmann et al. (in FE , Advanced

-5- 2644B4

Course on aspartic proteinases and their inhibitors, Praha 10119841, S. 20-24, published by Walter de Gruyter Berlin New York) vorgeschlagenen Casein-Enzyme-Gram-Technik oder nach Proteln-Blotting (z. B. nach Proc.Nat.Acad.Sci.USA76 (1979) S.4350-4354) unter Verwendung von chymosin-spezifischnn Antikörpern oder durch Bestimmung dor Milch-Clotting-Aktivität (ζ. Β. nach Goff et al., Gene 27 [1984] S. 35-46) nachgewioson und bestimmt werden.

Claims (21)

1. Verfahren zur Synthese von Chymosin, bei dem

— ein genetischer Stoff, der zur Synthese von Prochymosin fähig ist, aus einem natürlichen tierischen Organ, beispielsweise einem Kälbermagen, isoliert wird,

— aus dem genetischen Stoff ein DNS-Fragment hergestellt wird, das als Donor-DNS verwendbar ist,

— die Donor-DNS in einem geeigneten genetischen Vektor, beispielsweise einem Promoterplasmid, eingebaut und mit einer Vektor-DNS zu einem DNS-Chimärenmolekül fusioniert wird,

— das DNS-Chimärenmolekül zum Zwecke seiner Vei mehrung in geeignete Wirtszellen, vorzugsweise Mikroorganismen der Gattung Bacillus, transformiert wird und

— aus dem von den Wirtszellen in eine Kulturlösung abgesonderten extrazellulären Sekret durch Einengung und Fraktionierung der Kulturlösung schließlich Prochymosin gewonnen wird, dadurch gekennzeichnet, daß

— die um die N-terminalen Basenpaare 1 bis 62 — also gerade bis zum ersten N-terminalen BamHI-Ort- verkürzte und in der Konstruktion eines Plasmids pCHYA7 um die 24 Basenpaare bis zum Hpal-Ort des Plasmides pCHYA7 verlängerte cDNS-Sequenz der Donor-DNS bis zum C-terrninalen Bcll-Ort (auf einem Hpp.l-Bcl I-Fragment aus dem Plasmid pCHYA7) durch Einwirkung von Ligase derart in ein Promoterplasmid pPAS 1023 eingebaut wird, daß ein Plasmid pPAC 100 entsteht,

— die insgesamt verkürzte cDNS-Sequenz (auf einem, über den C-terminalen Bcl-Ort hinaus bis zum nächstfolgenden Hind HI-Ort reichenden Hpa-Hind Ill-Fragment aus einem Plasmid pCHYKH 2) durch Einwirkung von Ligase so in ein Promotorplasmid pPAS 1023 eingebaut wird, daß ein Plasmid pPAC200 entsteht,

— nach Transformation der Ligationsgemische aus den Plasmiden pPAC 100 und pPAC200 die für eine hohe Prochymosinbildung geeigneten Plasmidtransformanten ausgewählt werden oder

— die Plasmide pPAC100 und pPAC200 zur Reklonierung eines Pvu Il-Fragmontes verwendet werden, das zur Herstellung eines in Bacillus exprimierenden Plasmides pPAC300 oder pPAC 400 dient.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Teile der Gene für Bacillus-Alpha-Amylase oder Bacillus-beta-Glukanase zur Herstellung von Promoterplasmiden für die Sekretion eingesetzt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Plasmid pSB 6 zur Reklonierung des Gens für Alpha-Amylase amyA in Plasmid pPAS 10 mit der Orientierung Ocll/Bcll zu Bcll/Bamlll eingesetzt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein EcoRI-Frament aus Plasmid pPAS 10 zur Herstellung des Promoterplasmides pPAS 1023 genutzt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Promoterplasmid pPAS 1023 oder ein analoges Plasmid mit Teilen des Bacillus-beta-Glukanase-Gens zur Reklonierung der Prochymosinsequenz genutzt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reklonierung der Prochymosinsequenz in Promoterplasmid pPAS1023 in drei Schritten erfolgt, wobei im ersten Schritt die pPAS 1023-DNS im unikalen EcoRV geöffnet wird und die entstehenden Enden mit Bal31-Nuklease um etwa 100 Ba jenpaare verkürzt werden, im zweiten Schritt eine partielle BcII-Verdauung der im ersten Schritt präparierten DNA erfolgt und im dritten Schritt die Prochymosinsequenz in das Promoterplasmid pPAS 1023 eingebaut wird und ein Plasmid pPAC 100 entsteht.

7. Verfahren nach Anspruch 1 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß beim zweiten Schritt die vollständige Verdauung dor im ersten Schritt präpai teilen DNS mit der Restriktase Hind III erfolgt und beim dritten Schritt die Prochymosinsequenz in das Promoterplasmid pPAS1023 eingebaut wird, so daß Pläsmide pPAC200 entstehen.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 1,6 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Prochymosinsequenz für den dritten Schritt aus den Plasmiden pCHYA7 oder pCHYKH 2 entnommen wird.

9. Verfahren nach Anspruch 1 und 6 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Prochymosinsequenz sich innerhalb eines Hpa l-N-terminal und Bell oder Hind III C-terminal goschnittenen DNS-Fragmentes befindet.

10. Verfahren nach Anspruch 1 und 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Plasmide pPAC 100 bzw. pPAC200 zur Auswahl von Plasmiden mit hoher Sekretion in geeignete Bacillus-subtilis-Stämme transformiert werden.

11. Verfahren nach Anspruch 1 und 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Plasmide pPAC 100 bzw. pPAC200 in Bacillus-subtilis-Stämme GSB26 oder BG 500 transformiert werden.

12. Verfahren nach Anspruch 1 und 6 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß dio Transformantenkolonien der Plasmide pPAC 100 bzw. pPAC200 auf Kasein-Agarplatten oder einer üblichen Methode nach Säureaktivierung des gebildeten Prochyrnosins auf ihre Chymosinbildung enzymographisch durch Färbung von Casein-Gelen, serologische Verfahren oder dgl. geprüft werden.

13. Verfahren nach Anspruch 1 und 6 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Plasmide pPACIOO bzw. pPAC200zur Herstellung von Produktionsstämmen in geeignete Bacillus-Stämme eingeführt und auf genetische Stabilität und Bildung von Prochymosin mit säureaktivierbarer Chymosinaktivität hin überprüft werden.

14. Verfahren nach Anspruch 1 und 13, dadurch gekennzeichnet, daß zur Ermittlung von Kolonien mit maximaler Ausscheidung von Prochymosin die Kaseographie, ein Milch-clotting-Test oder dgl. Methode zur Chymosinbestimmung genutzt werden.

15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Plasmid pSB6 zur Reklonierung der Pseudo-Prochymosinsequenz genutzt wird.

16. Verfahren nach Anspruch 1 und 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Pseudo-Prochymosinsequenz auf einem Hincll-Hindlll-Fragment in das bei Eco RV geschnittene Plasmid pSB6 zur Herstellung von Plasmiden pIG 100 genutzt wird.

17. Verfahren nach Anspruch 1 und 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Plasmide pPAC 100 oder pPAC200 oder pIG 100 in Mikroorganismen mit Eignung für die submerse Fermentation transformiert werden.

18. Verfahren nach Anspruch 1,13 und 17, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismen Stämme der Gattungen Bacillus, Streptococcus, Clostridium, Nostoc oder eine andere Art der Gampositiven Bakterien oder auch Hefestämme verwendet werden.

19. Verfahren nach Anspruch 1,13,17 und 18, dadurch gekennzeichnet, daß derartige Stämme zur Herstellung von Prochymosin als technisches oder gereinigtes Enzym (Zymogen) genutzt werden.

20. Verfahren nach Anspruch 1,13, und 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß das so gewonnene Prochymosin sich vom authentischen Kälber-Prochymosin N-terminal durch den Ersatz der Aminosäuren AIa · GIu · He · Thr · Arg (die Am. losäuren 17 bis 21 der Präprochymosinsequenn) durch die Aminosäuren des CAT-Restes Thr · Arg · Cys Ser · Tyr · Ser · Leu · VaI unterscheidet und von einer unbestimmten Anzahl von N-terminalen Aminosäureresten der Bacillus-Amyloliquefaciens-alpha-Amylase gekennzeichnet ist bzw. bei Nutzung von Plasmiden pIG 100 das gebildete Pseudo-Prochymosin anstelle der N-terminaien Aminosäuren 1 bis 45 die N-terminalen Aminosäuren +1 bis +32 der Alpha-Amylase vom Typ Bacillus amyloliquefaciens enthält.

21. Verfahren nach Anspruch 1,13 und 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß ein mit bekannten Verfahren aktivierbares Prochymosin aus der Kulturlösung durch Filtration, Fraktionierung, Konzentration und Sterilisation gewonnen wird.

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