DD264454A1 - PROCESS FOR SYNTHESIS OF CHYMOSINE - Google Patents
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- DD264454A1 DD264454A1 DD30739485A DD30739485A DD264454A1 DD 264454 A1 DD264454 A1 DD 264454A1 DD 30739485 A DD30739485 A DD 30739485A DD 30739485 A DD30739485 A DD 30739485A DD 264454 A1 DD264454 A1 DD 264454A1
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren, durch welches das fuer die Kaeseherstellung benoetigte Chymosin nicht mehr aus dem Labmagen von Kaelbern gewonnen, sondern in beliebiger Menge synthetisch produziert werden kann; dabei soll sich aber das synthetisierte vom natuerlichen Chymosin in seiner chemischen Struktur nicht unterscheiden. Dazu wird ein isoliertes Chymosin-Gen in ein Promotor-Plasmid eingebaut, so dass in mehreren Stufen ein transformierbares Plasmid entsteht, welches in einen passenden Bacillus-Stamm transformiert wird. Nach submerser und aerober Vermehrung der Wirtszellen und Lyse der gewonnenen Zellmasse kann ein aktivierbares Prochymosin gewonnen werden. Fig. 1The invention relates to a method by which the required for the production of cheese chymosin no longer obtained from the abomasum of calves, but can be produced synthetically in any amount; at the same time, however, the synthesized natural chymosin should not differ in its chemical structure. For this purpose, an isolated chymosin gene is incorporated into a promoter plasmid, so that in several stages a transformable plasmid is produced, which is transformed into a suitable Bacillus strain. After submerged and aerobic propagation of the host cells and lysis of the cell mass obtained, an activatable prochymosin can be obtained. Fig. 1
Description
Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Synthese von Chymosin.The invention relates to a process for the synthesis of chymosin.
Das als IVi'lchgerinnungsenzym unentbehrliche Chymosin wird aus dem proteolytisch unwirksamen Prochymosin gewonnen, das seinerseits wie allgemein bekannt und gebräuchlich aus dem Labmagen junger Wiederkäuer isoliert wird. Es steht deshalb nur im begrenzten Umfang zur Verfügung, und seine Herstellung auf diese Weise ist umständlich und teuer. Man hat deshalb seit langem versucht, das Prochymosin (oder ein gleichwertiges Pseudochymosin, dem einige N-terminale Aminosäuren fehlon, ohne daß sich dieser Mangel negativ äußern würde) auf anderem Wege zu gewinnen. Es ist naholiegend, das Enzym in einem natürlichen, aber gentechnisch entsprechend veränderten Mikroorganismus zu synthetisieren, wie dies in der PCT-Anmeldung 8500382 r zw. den EP-Patentanmeldungen 133756 und 154351 bereits beispielsweise vorgeschlagen worden ist, die sich aber auf die Darlegung einer entsprechenden Aufgabenstellung beschränken und das zugehörige neue Verfahren nur in seinen Grundzügen beschreiben. Dies ist für die Durchführung der Synthese nicht ausreichend, weil dine produktive Sekretion bzw. der proteolytische Abbau chimaorer, in dem betreffenden Wirts-Mikroorganismus fremder ProteineThe chymosin, which is indispensable as an anticoagulant enzyme, is obtained from proteolytically inactive prochymosin, which in turn is isolated as is commonly known and commonly used in the abomasum of young ruminants. It is therefore available only to a limited extent, and its production in this way is cumbersome and expensive. It has therefore long been attempted to win the prochymosin (or an equivalent pseudochymosin, which some N-terminal amino acids misson, without this deficiency would express negative) by other means. It is convenient to synthesize the enzyme in a natural, but genetically engineered microorganism, as has already been proposed in PCT Application 8500382 for example, EP Patent Applications 133756 and 154351, but which is based on the disclosure of a corresponding Limit tasks and describe the associated new procedure only in its basic features. This is not sufficient for carrying out the synthesis because the productive secretion or the proteolytic degradation chimaorer, in the host microorganism of foreign proteins
durch dessen Proteasen nicht ohne weiteres erfolgt, worauf bereits in „Proceedings of the National Academy of Sciences of ' USA" 79 (1882), S. 5582-5586 hingewiesen worden ist. Es ist zwar entsprechend den PCT-Anmeldungen 8503949 und 8601826 auch schon versucht worden, die Proieolyse von Fremdproteinen in den verwendeten Mikroorganismen zu vermeiden; für die Synthese von Prochymosin sind die vorgeschlagenen Verfahren aber nicht geeignet und auch nicht vorgesehen.by its proteases is not readily done, as has already been pointed out in "Proceedings of the National Academy of Sciences of 'USA" 79 (1882), pp 5582-5586. It is indeed according to the PCT applications 8503949 and 8601826 already Attempts have been made to avoid the proieolysis of foreign proteins in the microorganisms used, but for the synthesis of prochymosin, the proposed methods are not suitable and are not intended.
Die Erfindung hat das Ziol, Chymosin nach einem wirtschaftlichen, weitgehend synthetischen Verfahren in beliebiger Menge so herzustellen, daß seine Eigenschaften mit dem natürlichen Enzym übereinstimmen.The invention has the ziol, chymosin by an economical, largely synthetic process in any amount to produce such that its properties match the natural enzyme.
Die Erfindung hat sich demzufolge die Aufgabe gestellt, die dargelegten Nachteile der bekannten vorgeschlagenen Methoden zu beseitigen und ein Prochymosin zu synthetisieren, das in seiner chemischen Struktur und seinen enzymatischen Eigenschaften dem aus dem Labmagon gewonnenen Enzym genau gleich ist. Durch Sekretion des von einem passenden Mikroorganismus gebildeten Prochymosins in eine Kulturlösung oder durch Fraktionierung des Zellextraktes soll das Enzym als filtriertes Konzentrat erzeugt werden. Im einzelnen ist eine geeignete Sekretions-Signal-Sequenz auszuwählen und die Primärstruktur in deren Bereich und im Bereich der Prochymosin-Senuenz der kodierenden DNS zu modifizieren.Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst daß die um die N-terminalen Basenpaare 1 bis 62 — also gerade bis zum ersten N-terminalen BamHI-Ort verkürzte und in der Konstruktion eines Plasmides pCHYA7 um die 24 Basenpaare bis zum Hpal-Ort des Plasmides pCHYA/ verlängerte cDNS-Sequenz der Donor-DNS bis zum C-terminalen Bcll-Ort (auf einem Hpal-Bcll-Fragment aus dem Plasmid pCHYA7) durch Einwirkung von Ligase derart in ein Promotorplasmid pPAS 1023 eingebaut wird, daß ein Plasmid pPAC 100 entstoht, daß die insgesamt verkürzte cDNS-Sequenz (auf einem über den C-terminalen Beil-Ort hinaus bis ζ um nächstfolgenden Hindlll-Ort reichenden Hpal-Hindlll-Fragment aus einem Plasmid pCHYKH 2) durch Einwirkung von Ligase so in ein Promotorplasmid pPAS 1023 eingebaut wird, daß ein Plasmid pPAC200 entsteht, daß nach Transformation der Ligationsgemische von Plasmiden pPAC 100 und pPAC200 für eine hohe Prochymosinbildung geeignete Plasmidtransformanten ausgewählt werden. Es ist dabei möglich, daß Teile der Gene für Bacillus-alpha-Amylase oder Bacillusbeta-Glukanase zur Herstellung von Promotorplasmiden für die Sekretion eingesetzt werden, daß ein Plasmid pSB 6 zur Reklonierung des Gens für alpha-Amylase amyA in Plasmid pPAS 10 mit der Orientierung Bell/Bell zu Bcll/Bamlll eingesetzt wird, daß oin EcoRI-Fragmnnt aus Plasmid pPAS 10 zur Herstellung des Promotorplasmides pPAS 1023 genutzt wird, oder daß das Promotorplasmid pPAS 1023 oder ein analoges Plasmid mit Teilen des Bacillus-beta-Glukanase-Gens zur Roklonierung der Prochymosin-Sequenz genutzt wird. Es Ist zweckmäßig, daß die Reklonierung der Prochymosin-Sequenz In Promotorplasmid pPAS 1023 in drei Schritten erfolgt, wobei im ersten Schritt die pPAS 1023-DNS im unikalen EcoRV geöffnet wird und die entstehenden Enden mit Bal31-Nuklease um etwa 100 Sasenpaare verkürzt worden, im zweiten Schritt eine partielle BcII-Vordauung der im ersten Schritt DNS erfolgt und im dritten Schritt die Prochymosin-Sequenz in das Promotorplasmid pPAS 1023 eingebaut wird, so daß Plasmida p."AC100 entstehen, daß dabei beim zweiten Schritt die vollständige Verdauung der im ersten Schritt präparierten DNS mit der Restriktase Hindill erfolgt und beim dritten Schritt die Prochymosin-Sequenz in das Promotorplasmid pPAS 1023 eingebaut wirci, so daß Plasmide pPAC20ύ entstehen, wobei die Prochymosin-Sequonz für don dritten Schritt vorteilhaft aus den Plasmiden pCHYA7 oder pCHYKH 2 entnommen wird und sich innerhalb eines Hpal N-terminal und Bell oder Hindlll C-terminal geschnittenon DNS-Fragmentes befindet. Es ist möglich, daß die Plasmide pPACIOO bzw. pPAC 200 zur Auswahl von Plasmiden mit hoher Sekretion in geeignete Bucillus-subtilis-Stämmo transformiert werden, speziell in die Bacilius-subtilis-Stämme GSB 26 oder BG 500, daß die Transformanten-Kolonien der Plasmido pPAC 100 bzw. pPAC 200 auf Kasein-Agarplatten oder nach einer anderen üblichen Methode nach Säureaktivierung des gebildeten Prochymosins auf ihre Chymosin-Bildung enzymographisch durch Färbung von Kasein-Gelen, serologische Verfahren oder dgl. geprüft werden, daß die Plasmide pPAC 100 bzw. pPAC200 zur Herstellung von Produktionsstämmen in geeignete Bacillus-Stämme eingeführt und auf genetische Stabilität und Bildung von Prochymosin mit säure-Chymosin-Aktivität hin überprüft werden, und daß zur Ermittlung von Kolonien mit maximaler Ausscheidung von Prochymosin die Kaseographie, ein Milch-clotting-Test oder dgl. Methode zur Chymosinbestimmiing benutzt werden.The object of the invention is therefore to eliminate the stated disadvantages of the known proposed methods and to synthesize a prochymosin which, in its chemical structure and its enzymatic properties, is exactly equal to the enzyme obtained from the labmagon. By secretion of the formed by a suitable microorganism prochymosin in a culture solution or by fractionation of the cell extract, the enzyme is to be produced as a filtered concentrate. Specifically, a suitable secretion signal sequence to select and modify the primary structure in the region and in the region of the prochymosin Senuenz the coding DNA. According to the invention, the object is achieved in that the N-terminal base pairs 1 to 62 - ie straight to the first N-terminal BamHI site and in the construction of a plasmid pCHYA7 about 24 base pairs to the Hpal site of the plasmid pCHYA / extended cDNA sequence of the donor DNA to the C-terminal BcII site (on a Hpal -Bcll fragment from the plasmid pCHYA7) is incorporated by the action of ligase in a promoter plasmid pPAS 1023 so that a plasmid pPAC 100 entstoht that the total shortened cDNA sequence (on the C-terminal axles addition place to ζ Hpal-HindIII fragment from a plasmid pCHYKH 2), which is passed next to the HindIII site, is incorporated into a promoter plasmid pPAS 1023 by the action of ligase in such a way that a plasmid pPAC200 arises that after transformation of the ligation mixtures of plasmids pPAC 100 and pPAC200 suitable for high prochymosin formation plasmid transformants are selected. It is possible that parts of the genes for Bacillus alpha-amylase or Bacillusbeta-glucanase for the production of promoter plasmids for secretion are used, that a plasmid pSB 6 for recloning the gene for alpha-amylase amyA in plasmid pPAS 10 with the orientation Bell / Bell to Bclll / Bamlll is used that oin EcoRI fragment from plasmid pPAS 10 is used to produce the promoter plasmid pPAS 1023, or that the promoter plasmid pPAS 1023 or an analogous plasmid with parts of the Bacillus beta-glucanase gene for Roklonierung the prochymosin sequence is used. It is expedient that the recloning of the prochymosin sequence in promoter plasmid pPAS 1023 takes place in three steps, wherein in the first step the pPAS 1023 DNA is opened in the unique EcoRV and the resulting ends have been shortened by about 100 sasenpaare with Bal31 nuclease, in second step is a partial BcII-Vordauung the DNA in the first step and in the third step, the prochymosin sequence is incorporated into the promoter plasmid pPAS 1023, so that Plasmida p. "AC100 arise that in the second step, the complete digestion of the first step prepared DNA with the HindIII restrictase and the third step, the prochymosin sequence in the promoter plasmid pPAS 1023 incorporated wirci, so that plasmids pPAC20ύ arise, the prochymosin sequence for the third step is advantageously taken from the plasmids pCHYA7 or pCHYKH 2 and within a Hpal N-terminal and Bell or HindIII C-terminal cut DNA fragment It is possible that the plasmids pPACIOO and pPAC 200, respectively, can be transformed into suitable Bucillus subtilis strains, particularly Bacilius subtilis strains GSB 26 or BG 500, to select high-secretion plasmids that the transformant colonies the Plasmido pPAC 100 or pPAC 200 on casein agar plates or by another conventional method after acid activation of the formed prochymosin on their chymosin formation enzymographically by staining of casein gels, serological methods or the like. Be checked that the plasmids pPAC 100 or pPAC200 are introduced into suitable Bacillus strains for production of production strains and tested for genetic stability and formation of prochymosin with acid chymosin activity, and for detection of colonies with maximal excretion of prochymosin, kaseography, a milk-clotting assay or the like. Method for determining chymosin.
Es ist besonders vorteilhaf\ wenn die Plasmide pPAC 100 oder ρPAC200 In Mikroorganismen mit Eignung für die submerse Fermentation transformiert werden, wobei als Mikroorganismen zweckmäßig Stämme der Gattung Bacillus oder S'reptococcus oder Line andere Art der gram-positiven Bakterien oder auch Hefestämme eingesetzt und derartige Stämme zur Herstellung von Prochymosin als technisches oder gereinigtes Enzym (sog. Zymogen) genutzt werden.Es .st auch möglich, daß das so gewonnene Prochymosin sich vom authentischen Kälbor-Prochymosin N-terminal durch den Ersatz der Aminosäuren AIa GIu · lle.Thz · Azg (die Aminosäuren 17 bis 21 der Prae-Prochymosin-Sequenz) durch die Aminosäuren der CAT-Restes Thr · Arg · Cys · Ser · Leu · VaI unterscheidet und von einer unbestimmten Anzahl von N-terminalen Aminosäureresten der Bacillus-amyloliquefaciens-alpha-Amylase gekennzeichnet ist bzw. bei Nutzung von Plasmiden plG 100 das gebildete Pseudo-Prochymosin anstelle der N-terminalen Aminosäuren 1 bis 45 die N-terminalen Aminosäuren +1 bis +32 dor alpha-Amylase vom Typ Bacillus amyloliquefaciens enthält. Schließlich ist es erforderlich, daß mit bekannten Verfahren aktivierbares Prochymosin aus der Kulturlösung durch Filtration, Fraktionierung, Konzentration und Sterilisation gewonnen wird.It is particularly vorteilha f \ when the PPAC plasmids 100 or ρPAC200 In transformed microorganisms with suitability for submerged fermentation, wherein the microorganisms employed as appropriate strains of the genus Bacillus or S'reptococcus Line or another type of gram-positive bacteria or yeast strains and Such strains can also be used for the production of prochymosin as a technical or purified enzyme (so-called zymogen). It is also possible for the prochymosin thus obtained to undergo N-terminal replacement of the authentic kalboro-prochymosin by replacing the amino acids Ala Azg (amino acids 17 to 21 of the pre-prochymosin sequence) is distinguished by the amino acids of the CAT residues Thr .Arg. Cys. Ser. Leu. VaI and an undetermined number of N-terminal amino acid residues of Bacillus amyloliquefaciens-alpha Amylase is characterized or when using plasmids plG 100, the pseudo-prochymosin formed in place of the N-terminal A. 1 to 45 containing N-terminal amino acids +1 to +32 dor Bacillus amyloliquefaciens type alpha-amylase. Finally, it is necessary that prochymosin activatable by known methods be recovered from the culture solution by filtration, fractionation, concentration and sterilization.
Die weiteren Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden nachstehend an Hand dor Zeichnung an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert. Es zeigenThe further details and advantages of the invention will be explained in more detail below on hand dor drawing on an embodiment. Show it
Fig.2: die Bildung eines Promotorplasmids pPAS 1023, Fig.3: die Bildung von Plasmid pPAC 100 und Fig.4: die Bildung von Plasmid pPAC200.FIG. 2: the formation of a promoter plasmid pPAS 1023, FIG. 3: the formation of plasmid pPAC 100, and FIG. 4: the formation of plasmid pPAC200.
1. Herstellung von Plasmid pPAS 10 (Flg. 1)1. Preparation of Plasmid pPAS 10 (Section 1)
Ein In bekannter Weise (z. B. nach Maniatis et al., Molocular cloning; a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. 1982) aus Bell und BamHI-gespaltener DNS aus Plasmid pSB6 Isoliertes Bcll-BamHI-DNS-Fragmont über etwa 2000Bp wird unter Einwirkung von Ligase in ein Bcll-gespaltones Plasmid pPL603 eingebaut und das Ligationsgemisch in Protoptasten von einem Bacillus-subtilis-Stamm nach einer seit langem bekannten Methode (Chang/Cohen, Molec.Gen.Genet,, 168 (1979), S. 111-115) transformiert. Auf zur Selektion von Transformanten-Kolonien etwa 750 Mikrogramm Kanamycin pro ml enthaltenden DM3-Selektionsplatten werden solche Transformanten-Kolonien identifiziert und ausgewählt, die Plasmid-DNS der in Fig. 1 gekonnzeichneten Struktur aufweisen. Sie erhalten die Bezeichung pPAS 10.A BcII-BamHI DNA isolated from Bell and BamHI-digested DNA from plasmid pSB6 in a known manner (eg, by Maniatis et al., Molocular cloning; a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY 1982) -Fragmont above about 2000 bp is incorporated by ligase into a BclI-cleaved plasmid pPL603 and the ligation mixture in protopeptides of a Bacillus subtilis strain according to a long-known method (Chang / Cohen, Molec.Gen.Genet ,, 168 (FIG. 1979), pp. 111-115). On selecting DM3 selection plates containing about 750 micrograms of kanamycin per ml for transformant colonies, such transformant colonies having plasmid DNA of the structure shown in Figure 1 are identified and selected. You will receive the designation pPAS 10.
2. Herstellung von Plasmid 1023 (Fig. 2)2. Preparation of Plasmid 1023 (Figure 2)
Aus isolierter und gereinigter DNS von Plasmid pPAS 10 v\ ird nach Spaltung der DNS mittels Restriktase EcoRI ein DNS-Fragment über etwa 1100Bp isoliert und mittels Ligasereaktion in LroRI-gospaltene DNS eines Vektorplasmidos pPL603 eingebaut. Das Ligationsgemisch wird (wie unter 1.) in einen Bacillus-subtilis-Stamm transformiert, wobei zur Selektion neben Kanamycin (Km) das Antibiotocum Chloramphenicol (Cm) zu 10 Mikrogromm/ml dem DM 3-Medlum zugesetzt wird, um lediglich das Wachstum solch ir Transformanten zu ermöglichen, die einem Typ von der in Fig. 2 für Plasmid pPAS 1023 gekennzeichneten Art entsprechen. Na>h Isolierung, Reinigung und Charakterisierung der aus Km- und Cm-resistenten Transformanten gewonnenen DNS erhält das Plasmkt die Bezeichnung pPAS 1023.From isolated and purified DNA from plasmid pPAS 10 after DNA cleavage by EcoRI restriction enzyme, a DNA fragment above about 1100 bp is isolated and ligated into LroRI-gospaltene DNA of a vector plasmid pPL603. The ligation mixture is transformed (as in 1.) into a Bacillus subtilis strain, wherein for selection in addition to kanamycin (Km) the antibiotic chloramphenicol (Cm) is added at 10 micrograms / ml to the DM 3 medium, only the growth of such ir transformants corresponding to a type of the type marked in FIG. 2 for plasmid pPAS 1023. Na> h Isolation, purification and characterization of the DNA obtained from Km and Cm resistant transformants gives the plasmid the name pPAS 1023.
3. Darstellung der Plasmide pPAC 100 (Fig. 3)3. Preparation of Plasmids pPAC 100 (FIG. 3)
Zunächst ist die Normierung des Exonuklease-Bal31-Abbaus erforderlich. Dazu wird DNS von Plasmid pPAS 1023 mittels Restriktase EcoRV gespalten und zur Durchführung und quantitativen Bemessung des DNS-Abbaus vom EcoRV-Schnittort bei Plasmid-DNS (z. B. nach Maniatis, s. o. unter 1.) behandelt. Die für einen durchschnittlichen Abbau von 100 Bp pro Ende ermittelten Versuchsbedingu.igen werden schließlich zur Herstellung einer pPAS 1023-DNS-Prooe verwendet, für die in einem weiteren Kontrollversuch nachzuweisen ist, daß der Bal31-Abbau tatsächlich etwa 1008p pro EcoRV-Endo beträgt. Dabei W'rd nach Spaltung der Bal31-behandelten Plasmid-DNS mittels der Restriktase Bell an einem Anteil der DNS-Probe die Kontrolle durch Spaltung durchgeführt, wobei der Bal31-Abbau mittels geeigneter Standard-DNS an der tatsächlichen mittleren Länge des kleinen Bcll-Fragmentes (532 Bp- 100Bp = 432Bp) ermittelt werden kann. Eine für die Ligation ausreichende Menge dor EcoRV-Bal31-Bcll-behandelten und im Kontrollversuch charakterisierten DNS von Plasmid pPAS 1023 wird anschließend im Gemisch mit einem aus den Plasmiden pCHYA7 oder pCHYKH 2, die aus Patentanmeldungen der Anmelderin bekannt sind, nach Spaltung mittels Restriktasen Hpal und Bell und durch Fragmontisolierung gewonnenes Hpal-Bcll-DNS-Fragment über etwa 1100Bp mittels Ligase behandelt und das Ligationsgemisch in Bacillus subtilis transformiert. Die Transformation erfolgt unter Anwendung von Kanamycin als Selektionsmittel auf DM 3-Platten nach Chang und Cohen (s. o.). Zur Erkennung und Auswahl geeigneter Transformanten werden Transformanten-Kolonien von den Selektionsplatten auf Nähragarplatten, die etwa 5 Mikrogramm/ml Kanamycin enthalten, in Blöcken zu etwa 100 Kolonien pro Platte übertragen. Die derart übertragenen Transformanten sind bezüglich ihrer Chymosin-Bildung mittels Immunoblott-Analyse (z. B. nach Helfman et al., Proc.Nat.Acad.Sci.USAeO, 1983, S.31-35) zu überprüfen. Es wird eine Zwei-Nitrocellulosefilter Methodo (Shiroza et al., Gene 34 [19851, S. 1-8) verwendet, wobei immunoblot-positive Kolonien mittel Kaninchen-Anti-Kalbf chymosin-Antiserum ermittelt werden. Das obere, mit Transformanten-Kolonien bewachsene Nitrocellulosef ilter wird zur Kolonie-Hybridisierung [?.. B. nach Maniatis, s.o.) verwendet, wobei ein geeignetes P'32-endmarkiertesChymosin-DNS-Fragment aus den Donorplasmidenp10c10 bzw. p8G6, die üus Patentanmeldungen der Anmelderin bekannt sind, als Probe eingesetzt wird. Solche Transformanten, die sowohl im Immunoblot als auch im Kolonie-Hybridisierungs-Test positive Signale ergeben, erhalten die Bezeichnung pPAC 100, werden von den Musterplatten auf Nähragar übertragen und nachfolgend auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Plasmide der in Fig.3 gekennzeichneten Art werden aus Transformanten isoliert und wie unter 5. beschrieben zur Transformation in Bacillussubtilis-Stämme verwendet.First, standardization of exonuclease Bal31 degradation is required. For this purpose, DNA is cleaved from plasmid pPAS 1023 by means of EcoRV restriction enzyme and treated for carrying out and quantitating the DNA degradation of the EcoRV cut location in plasmid DNA (eg according to Maniatis, see 1. above). The experimental parameters determined for an average degradation of 100 bp per end are finally used for the production of a pPAS 1023 DNA prooe for which it can be shown in a further control experiment that the Bal31 degradation is actually about 1008p per EcoRV endo. W'rd after cleavage of the Bal31-treated plasmid DNA by means of the Restrictase Bell on a portion of the DNA sample, the control by cleavage carried out, the Bal31 degradation by means of suitable standard DNA at the actual average length of the small BcII fragment (532 bp-100bp = 432bp) can be determined. A sufficient for the ligation dor EcoRV Bal31 Bcll-treated and characterized in the control DNA of plasmid pPAS 1023 is then in admixture with one of the plasmids pCHYA7 or pCHYKH 2, which are known from patent applications of the Applicant, after cleavage by means of Restraktasen Hpal and Bell and Fragmontisolierung Hpal Bcll DNA fragment about 1100 bp ligase treated and transformed the ligation mixture in Bacillus subtilis. The transformation is carried out using kanamycin as a selection agent on DM 3 plates according to Chang and Cohen (see above). To recognize and select suitable transformants, transformant colonies are transferred from the selection plates to nutrient agar plates containing about 5 micrograms / ml kanamycin in blocks of about 100 colonies per plate. The transformants thus transferred are to be checked for their formation of chymosin by immunoblot analysis (eg according to Helfman et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1983, pp. 31-35). A two-nitrocellulose filter method (Shiroza et al., Gene 34 [19851, pp. 1-8]) is used to detect immunoblot positive colonies using rabbit anti-calcified chymosin antiserum. The upper transformant-colonized nitrocellulose filter is used for colony hybridization [... , According to Maniatis, supra), with a suitable P'32 end-labeled chymosin DNA fragment from donor plasmids p10c10 and p8G6, respectively, as described in patent applications Applicants are known, is used as a sample. Such transformants, which give positive signals in both the immunoblot and colony hybridization assays, are designated pPAC 100, are transferred from the template plates to nutrient agar, and subsequently checked for their plasmid content. Plasmids of the type indicated in FIG. 3 are isolated from transformants and used for transformation into Bacillus subtilis strains as described under 5..
4. Herstellung der Plasmide ρPAC200 (Fig.4)4. Preparation of Plasmids ρPAC200 (Fig. 4)
Die erforderlichen Arbeitsschritte sind mit denen, wie sie unter 3. beschrieben sind, soweit identisch, daß lediglich nach den Kontrollversuchen zur Bestimmung des BaI 31 -Abbaus der EcoRV-Bal 31 -behandelten pPAS 1023-DNS-Probe eine weitere Spaltung dieser DNS mittels Restriktase Hindill erfolgt und anschließend aus DNS der Plasmide pCHYA7 bzw. pCHYKH 2 (dieses bevorzugt) nach Hpal-Hindlll-Spaltucg isoliertes HpalHindlll-Fragment mittels Ligation eingebaut und das Ligationsgemisch in Bacillus-subtilis-Stämme transformiert wird. Die Transformanton-Kolonien werden dem unter 3. beschriebenen Auswahl verfahren unterworfen. Plasmide solcher Transformanten, die entsprechend Immunoblot und Kolonie-Hybridisierung als positiv ermittelt werden und die in Fig. 4 gekennzeichnete Struktur aufweisen, erhalten die Bezeichnung pPAC200 und stehen alternativ zu Plasmiden pPAC 100 zur Transformation in verschiedene Bacillus- oder andere Mikroorganismen-Stämme zur Verfügung.The required working steps are identical to those described in 3. above, so that only after the control experiments to determine the BaI 31 degradation of the EcoRI-Bal 31-treated pPAS 1023 DNA sample a further cleavage of this DNA by means of restrictase HindIII takes place and then from DNA of the plasmids pCHYA7 or pCHYKH 2 (this preferred) after Hpal HindIII-Spaltucg isolated HpalHindlll fragment incorporated by ligation and the ligation mixture is transformed into Bacillus subtilis strains. The transformant colonies are subjected to the selection method described under 3.. Plasmids of such transformants, which are determined to be positive according to immunoblot and colony hybridization and have the structure indicated in FIG. 4, are designated pPAC200 and are available alternatively to plasmids pPAC 100 for transformation into various Bacillus or other microorganism strains.
5.- Transformation in geeignete Wirtsstämme und Nachweis der Prochymosln-Synthese in Bacillus subtilis Dio Plasmide pPAC 100 bzw. pPAC 200 werden entweder in einen protease-dofekten Bacillus-subtilis-Stamm wie z. 13. GB 500 (DD-Patentschrift 245244) oder einen anderen geeigneten Bacillus, Streptococcus oder gram-positiven Bakterienstamm mittels . - , Protoplasten-Transformation(nachChangundCohen, s.o. unter 1.) oder auf andere Weise transformiert. l'lasmidpPAS 10235.- Transformation into suitable host strains and detection of the synthesis of prochymosin in Bacillus subtilis Dio plasmids pPAC 100 and pPAC 200 are either in a protease-defective Bacillus subtilis strain such. 13. GB 500 (DD patent 245244) or another suitable Bacillus, Streptococcus or gram-positive bacterial strain by means of. , Protoplast transformation (according to Chhang and Cohen, supra under 1.) or otherwise transformed. l'lasmidpPAS 1023
i~~~-· dient nach gleichartiger Transformation in den jeweils ausgewählton Bakterienstamm zur Kontrolle. Nach Überprüfung deri ~~~ - · is used after similar transformation in the selected bacterial strain for control. After checking the
: Anwesenheit von Plasmid pPAC 100 bzw. pPAC 2G0 in den WIi .szellen werden Reinkulturen der Transformanten über 12,24 und: Presence of plasmid pPAC 100 or pPAC 2G0 in the WIi cells are pure cultures of the transformants via 12,24 and
* _; 36 Stunden bei 37°C in einem für die Fermentor-Kultur von Bacillus subtilis geeigneten Nährmedium (z. B. Na-Succinat-LGS nach* _; For 36 hours at 37 ° C in a suitable for the fermentor culture of Bacillus subtilis nutrient medium (eg., Na-succinate-LGS after
*-,· * j Biochem.Biophys.Res.Commun. 128[1986),S.601-606oderGlutamat-Casein-Medium nach Appl.Env.Microbiol. 50(1985)* -, · * j Biochem.Biophys.Res.Commun. 128 [1986], pp. 601-606 or glutamate-casein medium according to Appl. Env. Microbiol. 50 (1985)
*"*""" S. 503-507) durchgeführt. Wenn die Zahlen aus diesen Kultur η geerntet und zur Lyse gebracht worden, kann im " '!extrakt* "*" "" P. 503-507). When the numbers from this culture η have been harvested and lysed, it is possible to extract in the extract
mittels SDS-PAGE nach Lämmli (Nature 227 (1970) S. 680-685) unter Verwendung der von Foltmann et al. (in FE , Advancedby means of SDS-PAGE according to Lämmli (Nature 227 (1970) pp. 680-685) using the methods described by Foltmann et al. (in FE, Advanced
-5- 2644B4-5- 2644B4
Course on aspartic proteinases and their inhibitors, Praha 10119841, S. 20-24, published by Walter de Gruyter Berlin New York) vorgeschlagenen Casein-Enzyme-Gram-Technik oder nach Proteln-Blotting (z. B. nach Proc.Nat.Acad.Sci.USA76 (1979) S.4350-4354) unter Verwendung von chymosin-spezifischnn Antikörpern oder durch Bestimmung dor Milch-Clotting-Aktivität (ζ. Β. nach Goff et al., Gene 27 [1984] S. 35-46) nachgewioson und bestimmt werden.Course on aspartic proteinases and their inhibitors, Praha 10119841, pp. 20-24, published by Walter de Gruyter Berlin, New York), or by proteln blotting (for example Proc.Nat.Acad Sci. USA 76 (1979) p. 4350-4354) using chymosin-specific antibodies or by determining the milk-clotting activity (ζ.Β. according to Goff et al., Gene 27 [1984] pp. 35-46 ) nachgewioson and determined.
Claims (21)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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Family Applications (1)
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