DD254029A1 - Verfahren und mittel zur bestimmung der aminoglucosid-phosphortransferaseaktivitaet - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und Mittel zur Bestimmung der Aktivitaet von Aminoglucosid-Phosphotransferasen. Anwendungsgebiete sind Gentechnologie, Biotechnologie und Medizin. Zellysate oder Zellextrakte werden mit einem Flaechentraeger auf Cellulosebasis in Gegenwart eines Gemisches aus ATP und 32P-g-ATP in Kontakt gebracht. Das phosphorylierte Kanamycin wird an der festen Phase durch Autoradiographie sichtbar gemacht.

Description

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren unter Verwendung eines verbesserten Mittels zur qualitativen und quantitativen Bestimmung der Aktivität von Aminoglucosid-Phosphotransferase zur Verfugung zu stellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren und dazu geeignete feste Phasen mit gebundenen Antibiotika zur Bestimmung der Aktivität von Aminoglucösid-Phosphotransferase zu entwickeln. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß das Lysat von Zellen oder der Extrakt von Zellen mit einem Flächenträger auf Cellulosebasis folgenden prinzipiellen Auf baus:

H-G-GH₂O-I

wobei η zwischen 2500 und 15000, χ zwischen η und 0,01 η liegt und Kan ein Kanamycinrest bedeutet, in Gegenwart eines Gemisches aus Adenosintriphosphat (ATP) und ³²P-y-Adenosintriphosphat in an sich bekannten Medien in Kontakt gebracht wird und das phosphorylierte Kanamycin an der festen Phase durch Autoradiographie oder Szintillations-Zählung sichtbar gemacht bzw. bestimmt wird.

Zur Durchführung des Verfahrens sind eine Reihe von Varianten möglich. In einer ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird von Zellysaten ausgegangen. Eine bestimmte Menge des Zellysates wird mit einer normierten Fläche oder Masse der mit Kanamycin beladenen festen Phase in Gegenwart einerfestgelegten Menge an ³²P-y-ATP in einem üblichen Puffer für diese Enzymreaktionen eine Stunde bei 37⁰C inkubiert, anschließend bei Zimmtertemperatur gewaschen und entweder autoradiographiert oder in einem Szintillations-Zähler gemessen. Dieses Verfahren läßt sich auf Tüpfelplatten mit einer großen Anzahl von Proben durchführen^. B. bei Parallelansätzen oder bei einer Kinetik des Koloniewachstums.

In einer weiteren Ausführungsform dieses Verfahrens werden Tropfen des Lysates oder Zellextraktes auf einen erfindungsgemäßen Flächenträger aufgetüpfelt, z. B. in einer Transferanordnung mit einem mit ³²Ρ-γ-ΑΤΡ beladenen Filterpapier in Kontakt gebracht und unter ähnlichen Bedingungen wie oben inkubiert. Anschließend kann wie oben eine große Anzahl von Zellysaten oder Extrakten gleichzeitig ausgewertet werden. In einer dritten Ausführungsform dieses Verfahrens wird ein Elektrophoresegel mit aufgetrennten Zellysaten oder Zellextrakten

a) mit dem erfindungsgemäßen Flächenträger unter Phosphotransferase-Reaktionsbedingungen in Kontakt gebracht, mit ³²P-y-ATP inkubiert und nach Waschschritten das phosphorylierte Kanamycin durch Autoradiographie bestimmt, mit einem bekannten Flächenträger, z. B. Nitrocellulose, Nylon-Membran oder aktivierte Cellulose, in Kontakt gebracht, die Proteine unter bekannten Bedingungen transferiert (Elektrotransfer) und dieser mit den Proteinen beladene Flächenträger mit einem erfindungsgemäßen Flächenträger in Gegenwart von ^3zP--y-ATP in Kontakt gebracht und anschließend gewaschen und durch Autoradiographie ausgewertet, oder

direkt mit einem erfindungsgemäßen Flächenträger in Kontakt gebracht, die Proteine transferiert und der beladene, erfindungsgemäße Flächenträger dann mit ³²Ρ-γ-ΑΤΡ in Kontakt gebracht, gewaschen und anschließend ausgewertet. Ineiner anderen Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens werden Bakterienkolonien auf Agarplatten angezogen und nach einer bestimmten Zeit Iysiert. Auf diese lysierten Bakterienkolonien wird der erfindungsgemäße Träger aufgelegt und entweder direkt oder in einer zweiten Versuchsanordnung mit ³²Ρ-γ-ΑΤΡ in einem entsprechenden, üblichen Puffer zur Reaktion gebracht. Anschließend wird gewaschen und ausgewertet. Diese Variante läßt sich in einer zweiten Form durchführen, indem die Bakterienkolonien zunächst auf einen anderen Flächenträger, z.B. Nitrocellulose, Nylon-Membran oder aktivierte Cellulose, transferiert bzw. kultiviert werden und dieser Komplex nach Lyse mit dem erfindungsgemäßen Trägerz. B. unter Transferbedingungen in Gegenwart von ATP und ³²Ρ-γ-ΑΤΡ in einem üblichen Puffer zur Reaktion gebracht wird. Anschließend wird gewaschen und ausgewertet, z. B. durch Autoradiographie innerhalb einer Stunde.

Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Verwendung von Zellysaten, die elektrophoretisch getrennt wurden, und dem Nachweis einer oder mehrerer Banden als phosphorylierendes Enzym. Überraschend ist in diesem Zusammenhang, daß die Proteine unter denaturierenden Bedingungen in Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelen (SDS-PAA-Gelen) getrennt und die Proteine ohne Renaturierung in dieser Form nachgewiesen werden können. Gentechnisch veränderte Rekombinationen können Fusionsproteine exprimieren (Resistenzgen plus zusätzliche Information). Durch Vergleich der Lysate von verschiedenen Rekombinanten kann durch elektrophoretische Auftrennung und Reaktion mit einem erfindungsgemäßen Träger in Gegenwart von ³²Ρ-γ-ΑΤΡ deren Größebestimmtwerden,dain den SDS-PAA-Gelen die Trennung streng nach der Molmasse der Proteine erfolgt.

In der oben beschriebenen Ausführungsform, die direkt von Bakterienkolonien ausgehen und entweder als Tüpfeltest oder Abklatschtechnik oder nach der elektrophoretischen Auftrennung der Lysate durchgeführt wird, kann auf diese Weise zwischen kanamycinresistenten und nicht resistenten Mikroorganismen unterschieden werden, da nur erstere ein Signal produzieren. Das wesentliche Mittel des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein Flächenträger, der über eine Spacergruppe von mehr als 2 Atomen ein Antibiotikum gebunden enthält. Es hat sich gezeigt, daß diese erfindungsgemäßen Mittel besonders günstig aus Cellulose hergestellt werden können, wenn diese mit 2,4,6-Trihalogen-s-triazinen aktiviert wird. Ein solches Aktivierungsverfahren wird z. B. in dem DD-WP 154622 beschrieben. Die wesentlichen Schritte dieses Verfahrens sind:

a) Umsetzung derCellulose mit Natronlauge, z.B. 3n-NaOH;

b) Abquetschen nicht benötigter Natronlauge;

c) Aktivierung mit 2,4,6-Trichlor-s-triazin, z. B. in einem Lösungsmittelgemisch aus Xylen und Aceton bei einer Konzentration von 5 bis 6Gew.-% bei Zimmertemperatur innerhalb von 10 bis 120 Minuten;

d) Waschung des so aktivierten Trägers entweder mit Wasser oder mit Aceton und/oder mit Aceton: Essigsäure-Gemischen

e) Trocknung des Trägers oder Weiterverarbeitung.

Auf diesem Wege wird durch 4,6-Dichlor-s-triazine aktivierte Cellulose hergestellt, die mit Aminogruppen enthaltenden Verbindungen weiter umgesetzt werden kann. Solche Umsetzungen sind z. B. im DD-WP 237844 beschrieben. Vorzugsweise wird dabei mit wäßrigen Lösungen von organischen Verbindungen mit mindestens einer Aminogruppe und mindestens einer Carbonsäure-oder Sulfonsäuregruppe, die auf einen bestimmten pH-Wert, vorzugsweise im Bereich von 7-8, eingestellt wurde, gearbeitet. Als besonders günstig hat sich die Umsetzung mit Sulfanilsäure erwiesen. Die „hart" bindende Sulfonsäuregruppe am Ende der Seitenkette führt zu einerfesten Bindung des Antibiotikums an den Träger und damit zu keinerlei Verlusten bei den notwendigen Waschschritten und folglich zu sehr scharfen Autoradiogrammen bei sehr geringem oder keinem Untergrund. Der bevorzugte Flächenträger für das erfindungsgemäße Verfahren besteht also aus

a) Cellulose als Grundmatrix,

b) daran gebundenen 4,6-Trichlor-s-triazin-Einheiten,

c) an die durch die verbliebenen Chloratome gekennzeichneten Kohlenstoffatome durch Substitution der Chloratome über die NH₂-Gruppe gebundene Sulfanilsäurereste,

d) an die Sulfanilsäure-Sulfonsäuregruppen über ionische Wechselwirkungen mit Aminogruppen des Kanamycins gebundenes Kanamycin

folgenden prinzipiellen Aufbaus:

-so:

wobei η, χ und Kan die Bedeutung aufweisen, wie sie bereits definiert worden ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren stellt somit auf leicht zugänglichem Wege an feste, auf Cellulose basierenden Phasen gebundenes Kanamycin zur Verfügung, so daß das Kanamycin seine Wirksamkeit in den Enzymreaktionen und auch nach längerer Lagerzeit behält. Damit ist insbesondere für den Nachweis der Aktivität von Aminoglucosid-Phosphotransferase in exprimierten Bakterienkolonien ein wesentlicher Fortschritt zur schnellen und quantitativen Bestimmung erreicht. Durch die Verwendung von Flächenträgern auf Cellulosebasis wird für das erfindungsgemäße Verfahren ein erfindungsgemäßes Mittel zur Verfügung gestellt, das eine hohe Bindungskapazität aufweist. Das gebundene Kanamycin bleibt unter diesen Bedingungen gut phosphorylierbar. Beim direkten Kontakt mit Bakterienkulturen bleibt eine hohe Schärfe des Signals erhalten. Durch Waschungen mit Wasser ist das Signal nicht oder sehr wenig auswaschbar.

Das erfindungsgemäße Verfahren stellt somit eine wesentliche Verbesserung des Verfahrens zur Bestimmung der Aminoglucosid-Phosphotransferase-Aktivität aus Trenngelen direkt auf den Träger dar. Außerdem wird es mit dem erfindungsgemäßen Mittel und unter Nutzung des erfindungsgemäßen Verfahrens möglich, bei Reihenkulturen die bereits erreichte Enzymaktivität oder bei Wachstumsprozessen die Veränderungen über der Zeit in großer Zahl durchzuführen und maschinell auszuwerten. Die spezielle Oberfläche des erfindungsgemäßen Trägers erlaubt die Anfärbung der Proteine mit Coomassie-Brillantblau, ohne daß der Träger eine Untergrundfärbung aufweist. Neben diesen Vorteilen weist der erfindungsgemäße Flächenträger eine hohe mechanische Stabilität auf.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1 Herstellung des erfindungsgemäßen Mittels

Es wird eine makromolekulare Masse mit chemisch aktiven Füllstoffen nach DD-WP 154622 wie folgt hergestellt: Cellulosepapier wird 15 Minuten in 3 η NaOH unter leichtem Schütteln umgesetzt. Dieses Produkt wird nach Abquetschen der größten Menge Natronlauge in ein Aktivierungsbad aus 5,5Gew.-% Cyanurchlorid, 50Gew.-%Xylen und 44,5Gew.-% Aceton 30 Minuten unter leichtem Schütteln aktiviert, anschließend mit Aceton bzw. Aceton/Essigsäure gewaschen und getrocknet. Das so erhaltene Produkt wird in eine Lösung aus 10Gew.-%des Natriumsalzes der Sulfanilsäure, die durch Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt wurde, gegeben und 5 Stunden unter leichtem Schütteln umgesetzt. Dieses Produkt wird 5x mit destilliertem Wasser jeweils 15 Minuten gewaschen und schließlich in eine Lösung aus 1,5Gew.-%Kanamycinsulfat, die mit Triethanolamin auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt worden ist, gegeben und darin unter leichtem Schütteln 5 Stunden inkubiert. Man erhält so ein Trägermaterial, das.mit Kanamycin beladen ist.

Beispiel 2 Bestimmung der Aminoglucosid-Phosphotransferase-Aktivität von Enzymen aus Polyacrylamid-Gelen

Lysate von Bakterien mit und ohne Kanamycin-Resistenzgen werden auf ein SDS-PAA-GeI gegeben und die Proteine durch Gelelektrophorese aufgetrennt. Danach wird das Gel 15 Minuten in einer Lösung von 2OmMoI Tris-HCI-Puffer, pH = 7,2; 125mMol Ammoniumchlorid, 1 mMol Dithiothreitol, 1OmMoI Magnesiumchlorid, 2mMol ³²P-y-ATP (verdünnt auf eine spezifische Aktivität von 0,3mCi/mMol) inkubiert.

Der nach Beispiel 1 hergestellte Träger und 3 Lagen dickes Filterpapier werden mit dergleichen Lösung getränkt. Es wird folgender Aufbau verwendet: Zuunterst eine Glasplatte, darauf die drei Lagen getränktes Filterpapier, darauf das Gel, anschließend der getränkte, erfindungsgemäße Träger mit Kanamycin, darauf eine Lage nicht getränktes, dickes Filterpapier, einige Lagen Zellstoff, schließlich wieder eine Glasplatte und ein Gewicht von 100 g. Dieser Aufbau wird in einem geschlossenen Plastegefäß 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Danach wird die Versuchsanordnung auseinandergenommen und der erfindungsgemäße Träger vom Gel getrennt. Zunächst wird das Gel mit Coomassie-Brillantblau angefärbt. Im Gel wird ein komplettes Restbandenmuster festgestellt, d.h. aus dem Gel wurde nichts auf den Träger transferiert

Der erfindungsgemäße Träger wird 4 x 15 Minuten mit Wasser gewaschen und getrocknet. Anschließend wird autoradiographiert (2 Stunden bei Zimmertemperatur). Die Autoradiographie zeigt nach dem Entwickeln in der Position, an der im Gel die Phosphotransferase unter den vielen Lysat-Proteinen vorhanden war, sehr scharfe und der Menge des vorhandenen Enzyms proportionale Schwärzungen (Banden), d.h. diese lassen sich dem Enzym und dessen Menge bzw. Aktivität genau zuordnen. Anhand angefärbter Markerproteine werden die Molekulargewichte des Enzyms und der Fusionsproteine genau bestimmt.

Beispiel 3 Test zur Unterscheidung von Bakterienkolonien mit und ohne Kanamycin-Resistenzgen

Es wurden E. coli Bakterien des Stammes DH1 mitundohne Plasm id, das das Neogen desTN-5 enthielt, auf Agarplatten unter üblichen Bedingungen angezogen. Nach 12 Stunden wurde die Agarplatte mit den Kolonien mit einer Nitrocellulose-Membran belegt und weiter kultiviert. Nach weiteren sechs Stunden wurde diese Membran vorsichtig abgenommen und in folgendem Versuchsaufbau eingesetzt: Auf eine Glasplatte werden drei Schichten dickes Filterpapier, die mit dem gleichen Puffer wie in Beispiel 2 getränkt sind, gelegt, darauf wird das erfindungsgemäße Mittel nach Beispiel 1 gelegt, auf dieses die Nitrocellulosemembran mit den lysierten Kolonien (Lyse durch Inkubieren in einem Lysepuffer aus 2OmMoI Tris-HCI, pH = 8,0; 0,1 % TritonX—100 und 5mg/ml Lysozym, 10 Minuten bei Zimmtertemperatur), darauf wieder einige Lagen dickes Filterpapier, eine Glasplatte und ein Gewicht von 250g. Diese Anordnung wird in einer Plastebox eine Stunde bei 37°C gehalten. Schließlich wird der Aufbau auseinandergenommen, das beladene erfindungsgemäße Mittel mehrfach gewaschen und autoradiographiert. Die Positionen auf der Agarplatte, an denen die Kolonien mit dem Neogen gezogen worden waren, wiesen sich durch sehr starke, scharfe Signale nach 2 Stunden aus, während an den Stellen der Kolonien ohne das Neogen keine Signale (Schwärzungen) auftraten.

Claims (8)

1. Patentansprüche:

   1. Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung der Aminoglucosid-Phosphotransferase-Aktivität in Zellysaten oderZellextrakten gegebenenfalls nach elektrophoretischer Auftrennung der darin enthaltenen Proteine durch den Nachweis der enzymatischen Aktivität mittels Phosphorylierung von Kanamycin, gekennzeichnet dadurch, daß das Lysat oder der Extrakt mit einem Flächenträger auf Cellulosebasis folgenden prinzipiellen Aufbaus j

   HO₅-C.

   SCÜ H^N-Kan

   Ö Hj

   wobei η zwischen 2500 und 15000, χ zwischen η und 0,01 η liegt und Kan einen Kanamycinrest bedeutet, in Gegenwart eines Gemisches aus Adenosintriphosphat und ³²P-y-Adenosintriphosphat in an sich bekannten Medien in Kontakt gebracht wird und das phosphorylierte Kanamycin an der festen Phase durch Autoradiographie sichtbar gemacht wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß elektrophoretisch getrennte Zellysate eingesetzt werden, wobei eine oder mehrere Banden als phosphorylisierendes Enzym nachgewiesen werden.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die elektrophoretische Trennung der Proteine an Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelen (SDS-PAA-GeIe) erfolgt und in den so aufgetrennten Proteinen die Phosphotransferase nachgewiesen wird.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß Zellysate von verschiedenen Rekombinanten mit im Plasmid befindlichen, gentechnisch veränderten Kanamycin-Resistenz-Genen elektrophoretisch aufgetrennt werden und die Größe von Fusionsproteinen bestimmt wird.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, gekennzeichnet dadurch, daß die Auftrennung der Zellysate an SDS-PAA-Gelen erfolgt.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 1, 2 und 4, gekennzeichnet dadurch, daß auf Tüpfeltests oder nach elektrophoretischer Auftrennung von Lysaten, die die Phosphotransferase enthalten, zwischen Kanamycin-resistenten und Kanamycin-nicht-resistenten Mikroorganismen unterschieden wird.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 1, 2,4 und 6, gekennzeichnet dadurch, daß von Bakterienkolonien nach deren Lyse zwischen Kanamycin-restistenten Kolonien und Kanamycin-nicht-resistenten Kolonien unterschieden wird.
8. 8. Mittel zur Bestimmung der Aminoglucosid-Phosphotransferase-Aktivitätgekennzeichnetdadurch, daß es ein Flächenträger ist, der aus

   a) Cellulose,

   b) daran gebundenen 2,4,6-Trichlor-s-triazineinheiten,

   an die durch die verbliebenen Chloratome gekennzeichneten Kohlenstoff atome durch Substitution der Chloratome über die NH₂-Gruppe gebundene Sulfanilsäurereste, an die Sulfanilsäure-Sulfonsäuregruppen über ionische Wechselwirkungen mit Aminogruppen des Kanamycins gebundenes Kanamycin

   folgenden prinzipiellen Aufbau^

   - I ι '

   HC-CHp-C- ά /ί-Τ

   wobei η, χ und Kan die Bedeutung aufweisen, wie sie bereits definiert worden ist, besteht.

   Anwendungsgebiet der Erfindung

   Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Aminoglucosid-Phosphotransferasen, insbesondere von Neomycin-Phosphotransferase (NPT II) in Zellysaten oder Kolonien. Anwendungsgebiet der Erfindung sind Gentechnologie, Biotechnologie, Molekularbiologie und Medizin.

   Charakteristik des bekannten Standes der Technik

   Es sind bereits eine Reihe von Methoden zum Nachweis und zur Analyse der Expression klonierter Gene entwickelt worden. Durch die Koloniehybridisierung können Klone schnell in Hinblick auf spezifische DNS-Sequenzen untersucht werden. In Immunoassays wiederum sind die Klone, die spezifische Antigene produzieren, nachweisbar. Mit Hilfe der Rekombinanten-Technik können in Zellen (z. B. Bakterien) Genabschnitte oder Gene für bestimmte Proteine eingebracht werden. Zur Selektion von Rekombinanten werden u.a. Resistenzgene gegen Antibiotika benutzt. Die Resistenz gegen Antibiotika beruht dabei meist auf der Wirkung von entsprechenden Enzymen, die von den Resistenzgenen kodiert werden, auf die Antibiotika. In Kolonie-Tests lassen sich dann resistente von nicht resistenten Zellen unterscheiden.

   Zur Bestimmung der Resistenz-Enzymaktivität können z. B. an feste Phasen gebundene Antibiotika verwendet werden, die in Gegenwart eines Substrates nur die Resistenzgene enthaltenden Zellen wachsen lassen. Dazu sind an feste Phasen gebundene Antibiotika notwendig. Die Bindung von Antibiotika und anderen Medikamenten an feste Phasen ist bekannt. Diese Bindung wird vorzugsweise über kovalente Bindungen durchgeführt. Durch die Hydrolyse dieser Bindungen in vivo wird dann eine gesteuerte Wirkstoffabgabe möglich. Die Herstellung solcher Produkte sowie ihre Anwendung wird z. B. von S. Dumitriu et al., Cellulose Chemistry and Technology (1985) 19, S. 601 und S. 609, beschrieben. Als feste Phasen dienen hier Cellulosederivate, an die z. B. 6-Aminopenicillansäure, 7-Aminocephalosporansäure, Tetracyclin, Ampicillin, Kanamycin, Neomycin, Chloramphenicol oder Oxytetracyclin gebunden werden. Allgemein wird festgestellt, daß diese Art der Kopplung eine niedrige Reaktivität ergibt. Eine weitere Möglichkeit der Kopplung von Antibiotika an festen Phasen ist die Nutzung quarternisierbarer Stickstoffatome der Antibiotika zur Bindung an saure Ionenaustauscher. Die nach diesem Verfahren hergestellten Produkte werden z. B. zur Bestimmung der Neomycin-Phosphotransferase aus Zellextrakten verwendet, wie es von B. Reiss, R.Sprengel, H. Will und H. Schaller in Gene (1984) 30, S. 211-218, beschrieben wird. Als feste Phase wird hierein handelsübliches Phosphatcellulose-Papier verwendet, bei dem die Phosphatgruppen direkt über die OH-Gruppen der Cellulose verknüpft sind. Bei diesem relativ aufwendigen Verfahren wird das Resistenz-Enzym zunächst in einem Polyacrylamid-Gel elektrophoretisch aufgetrennt, danach in einer zusätzlich aufgebrachten Agaroseschicht ³²Ρ-γ-ΑΤΡ und Kanamycin (nicht trägerfixiert) als Substrate unter Enzym-Reaktionsbedingungen angeboten und anschließend versucht, das phosphorylierte Kanamycin auf Phosphatcellulose-Papier durch eine Kapillarblotting-Technik zu übertragen. .Nachteile des Verfahrens sind der Arbeitsschritt mit Radioaktivität enthaltender Agarose, die Vielzahl der Arbeitsschritte, die erforderliche Waschung mit heißem Wasser (80⁰C) (Verluste) und die langen Waschzeiten (3 bis 16 Stunden), um den Untergrund des Trägermaterials zu reduzieren. Im Ergebnis erhält man diffuse Autoradiographien, die bei komplexen Aufgabenstellungen eine Auswertung erschweren oder gar unmöglich machen. Von V. I.Kiselev, A. F.Gorkun und V.O. Rechinski wird in Anal. Biochem. (1985) 146, S.434, ein Verfahren zur Bestimmung der Enzymaktivität in Bakterienkolonien unter Verwendung von Kanamycin, das an Carboxymethylcellulose (CM-Cellulose) gebunden ist, beschrieben. Mit dieser Methode gelingt nur der Kolonienachweis. Die diffuse Autoradiographie kann darauf hinweisen, daß ein Teil des Kanamycins vom Träger durch die sehr enge Bindung an die Cellulose bzw. teilweise Hydrolyse abgewaschen werden kann. Zu diesem Verfahren ist insgesamt zu sagen, daß derivatisierteCelluloseträger dieser Art, bei denen Cellulosederivate mit direkter Kopplung der ionisch aktiven Gruppe an die Cellulosekette verwendet werden, mechanisch relativ instabil und hydrolytisch anfällig sind, wobei ersteres zu einer nicht ausreichend festen Bindung des Antibiotikums an den Träger und letzteres zu einem erhöhten Untergrund bei den Nachweistechniken (in erster Linie Autoradiographie) führt.