DD254029A1 - METHOD AND MEANS FOR DETERMINING THE AMINOGLUCOSID PHOSPHORTRANSFERASE ACTIVITY - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und Mittel zur Bestimmung der Aktivitaet von Aminoglucosid-Phosphotransferasen. Anwendungsgebiete sind Gentechnologie, Biotechnologie und Medizin. Zellysate oder Zellextrakte werden mit einem Flaechentraeger auf Cellulosebasis in Gegenwart eines Gemisches aus ATP und 32P-g-ATP in Kontakt gebracht. Das phosphorylierte Kanamycin wird an der festen Phase durch Autoradiographie sichtbar gemacht.The invention relates to a method and means for determining the activity of aminoglucoside phosphotransferases. Areas of application are genetic engineering, biotechnology and medicine. Cell lysates or cell extracts are contacted with a cellulosic surface carrier in the presence of a mixture of ATP and 32P-g ATP. The phosphorylated kanamycin is visualized on the solid phase by autoradiography.
Description
Ziel der ErfindungObject of the invention
Ziel der Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren unter Verwendung eines verbesserten Mittels zur qualitativen und quantitativen Bestimmung der Aktivität von Aminoglucosid-Phosphotransferase zur Verfugung zu stellen.The object of the invention is to provide an improved method using an improved means for the qualitative and quantitative determination of the activity of aminoglucoside phosphotransferase.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren und dazu geeignete feste Phasen mit gebundenen Antibiotika zur Bestimmung der Aktivität von Aminoglucösid-Phosphotransferase zu entwickeln. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß das Lysat von Zellen oder der Extrakt von Zellen mit einem Flächenträger auf Cellulosebasis folgenden prinzipiellen Auf baus:The object of the invention is to develop a method and suitable solid phases with bound antibiotics for the determination of the activity of aminoglucoside phosphotransferase. According to the invention the object is achieved in that the lysate of cells or the extract of cells with a cellulosic surface carrier following principal construction on:
H-G-GH2O-IHG-GH 2 OI
wobei η zwischen 2500 und 15000, χ zwischen η und 0,01 η liegt und Kan ein Kanamycinrest bedeutet, in Gegenwart eines Gemisches aus Adenosintriphosphat (ATP) und 32P-y-Adenosintriphosphat in an sich bekannten Medien in Kontakt gebracht wird und das phosphorylierte Kanamycin an der festen Phase durch Autoradiographie oder Szintillations-Zählung sichtbar gemacht bzw. bestimmt wird.wherein η is between 2500 and 15000, χ between η and 0.01 η and Kan is a Kanamycinrest, in the presence of a mixture of adenosine triphosphate (ATP) and 32 Py adenosine triphosphate in known media is brought into contact and the phosphorylated kanamycin the solid phase is visualized by autoradiography or scintillation counting.
Zur Durchführung des Verfahrens sind eine Reihe von Varianten möglich. In einer ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird von Zellysaten ausgegangen. Eine bestimmte Menge des Zellysates wird mit einer normierten Fläche oder Masse der mit Kanamycin beladenen festen Phase in Gegenwart einerfestgelegten Menge an 32P-y-ATP in einem üblichen Puffer für diese Enzymreaktionen eine Stunde bei 370C inkubiert, anschließend bei Zimmtertemperatur gewaschen und entweder autoradiographiert oder in einem Szintillations-Zähler gemessen. Dieses Verfahren läßt sich auf Tüpfelplatten mit einer großen Anzahl von Proben durchführen^. B. bei Parallelansätzen oder bei einer Kinetik des Koloniewachstums.A number of variants are possible for carrying out the method. In a first embodiment of the method according to the invention is based on cell lysates. A certain amount of the cell lysate is treated with a normalized area or mass of the loaded kanamycin solid phase in the presence of a fixed amount of 32 Py-ATP in a conventional buffer for this enzyme reactions for one hour at 37 0 C incubated, then washed at Zimmtertemperatur and either autoradiographed or measured in a scintillation counter. This procedure can be carried out on plates with a large number of samples ^. In parallel approaches or kinetics of colony growth.
In einer weiteren Ausführungsform dieses Verfahrens werden Tropfen des Lysates oder Zellextraktes auf einen erfindungsgemäßen Flächenträger aufgetüpfelt, z. B. in einer Transferanordnung mit einem mit 32Ρ-γ-ΑΤΡ beladenen Filterpapier in Kontakt gebracht und unter ähnlichen Bedingungen wie oben inkubiert. Anschließend kann wie oben eine große Anzahl von Zellysaten oder Extrakten gleichzeitig ausgewertet werden. In einer dritten Ausführungsform dieses Verfahrens wird ein Elektrophoresegel mit aufgetrennten Zellysaten oder ZellextraktenIn a further embodiment of this method, drops of the lysate or cell extract are spotted onto a surface support according to the invention, e.g. B. in a transfer arrangement with a loaded with 32 Ρ-γ-ΑΤΡ filter paper in contact and incubated under similar conditions as above. Subsequently, as above, a large number of cell lysates or extracts can be evaluated simultaneously. In a third embodiment of this method is an electrophoresis gel with separated cell lysates or cell extracts
a) mit dem erfindungsgemäßen Flächenträger unter Phosphotransferase-Reaktionsbedingungen in Kontakt gebracht, mit 32P-y-ATP inkubiert und nach Waschschritten das phosphorylierte Kanamycin durch Autoradiographie bestimmt, mit einem bekannten Flächenträger, z. B. Nitrocellulose, Nylon-Membran oder aktivierte Cellulose, in Kontakt gebracht, die Proteine unter bekannten Bedingungen transferiert (Elektrotransfer) und dieser mit den Proteinen beladene Flächenträger mit einem erfindungsgemäßen Flächenträger in Gegenwart von 3zP--y-ATP in Kontakt gebracht und anschließend gewaschen und durch Autoradiographie ausgewertet, odera) brought into contact with the surface support according to the invention under phosphotransferase reaction conditions, incubated with 32 Py-ATP and after washing steps the phosphorylated kanamycin determined by autoradiography, with a known surface support, for. As nitrocellulose, nylon membrane or activated cellulose, brought in the proteins under known conditions transferred (electrotransfer) and this loaded with the protein surface carrier with a surface carrier according to the invention in the presence of 3z P - y-ATP brought into contact and then washed and evaluated by autoradiography, or
direkt mit einem erfindungsgemäßen Flächenträger in Kontakt gebracht, die Proteine transferiert und der beladene, erfindungsgemäße Flächenträger dann mit 32Ρ-γ-ΑΤΡ in Kontakt gebracht, gewaschen und anschließend ausgewertet. Ineiner anderen Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens werden Bakterienkolonien auf Agarplatten angezogen und nach einer bestimmten Zeit Iysiert. Auf diese lysierten Bakterienkolonien wird der erfindungsgemäße Träger aufgelegt und entweder direkt oder in einer zweiten Versuchsanordnung mit 32Ρ-γ-ΑΤΡ in einem entsprechenden, üblichen Puffer zur Reaktion gebracht. Anschließend wird gewaschen und ausgewertet. Diese Variante läßt sich in einer zweiten Form durchführen, indem die Bakterienkolonien zunächst auf einen anderen Flächenträger, z.B. Nitrocellulose, Nylon-Membran oder aktivierte Cellulose, transferiert bzw. kultiviert werden und dieser Komplex nach Lyse mit dem erfindungsgemäßen Trägerz. B. unter Transferbedingungen in Gegenwart von ATP und 32Ρ-γ-ΑΤΡ in einem üblichen Puffer zur Reaktion gebracht wird. Anschließend wird gewaschen und ausgewertet, z. B. durch Autoradiographie innerhalb einer Stunde.brought directly into contact with a surface support according to the invention in contact, transferred the proteins and the loaded, surface according to the invention then brought into contact with 32 Ρ-γ-ΑΤΡ, washed and then evaluated. In another variant of the method of the invention, bacterial colonies are grown on agar plates and lysed after a certain time. The carrier according to the invention is placed on these lysed bacterial colonies and reacted either directly or in a second experimental setup with 32 Ρ-γ-ΑΤΡ in a corresponding customary buffer. Then it is washed and evaluated. This variant can be carried out in a second form by first transferring or cultivating the bacterial colonies onto another surface support, eg nitrocellulose, nylon membrane or activated cellulose, and after lysis with the support according to the invention. B. under transfer conditions in the presence of ATP and 32 Ρ-γ-ΑΤΡ is reacted in a conventional buffer. It is then washed and evaluated, z. By autoradiography within one hour.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Verwendung von Zellysaten, die elektrophoretisch getrennt wurden, und dem Nachweis einer oder mehrerer Banden als phosphorylierendes Enzym. Überraschend ist in diesem Zusammenhang, daß die Proteine unter denaturierenden Bedingungen in Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelen (SDS-PAA-Gelen) getrennt und die Proteine ohne Renaturierung in dieser Form nachgewiesen werden können. Gentechnisch veränderte Rekombinationen können Fusionsproteine exprimieren (Resistenzgen plus zusätzliche Information). Durch Vergleich der Lysate von verschiedenen Rekombinanten kann durch elektrophoretische Auftrennung und Reaktion mit einem erfindungsgemäßen Träger in Gegenwart von 32Ρ-γ-ΑΤΡ deren Größebestimmtwerden,dain den SDS-PAA-Gelen die Trennung streng nach der Molmasse der Proteine erfolgt.A preferred embodiment of the method according to the invention consists in the use of cell lysates which have been separated electrophoretically and the detection of one or more bands as phosphorylating enzyme. It is surprising in this connection that the proteins can be separated under denaturing conditions in sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gels (SDS-PAA gels) and the proteins can be detected without renaturation in this form. Genetically engineered recombinations can express fusion proteins (resistance gene plus additional information). By comparing the lysates of various recombinants, their size can be determined by electrophoretic separation and reaction with a support according to the invention in the presence of 32 Ρ-γ-,, in which the SDS-PAA gels are separated strictly according to the molecular weight of the proteins.
In der oben beschriebenen Ausführungsform, die direkt von Bakterienkolonien ausgehen und entweder als Tüpfeltest oder Abklatschtechnik oder nach der elektrophoretischen Auftrennung der Lysate durchgeführt wird, kann auf diese Weise zwischen kanamycinresistenten und nicht resistenten Mikroorganismen unterschieden werden, da nur erstere ein Signal produzieren. Das wesentliche Mittel des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein Flächenträger, der über eine Spacergruppe von mehr als 2 Atomen ein Antibiotikum gebunden enthält. Es hat sich gezeigt, daß diese erfindungsgemäßen Mittel besonders günstig aus Cellulose hergestellt werden können, wenn diese mit 2,4,6-Trihalogen-s-triazinen aktiviert wird. Ein solches Aktivierungsverfahren wird z. B. in dem DD-WP 154622 beschrieben. Die wesentlichen Schritte dieses Verfahrens sind:In the embodiment described above, which originate directly from bacterial colonies and is carried out either as a spot test or Abklatschtechnik or after the electrophoretic separation of the lysates, can be distinguished in this way between kanamycin resistant and non-resistant microorganisms, since only the former produce a signal. The essential agent of the process according to the invention is a surface carrier which contains an antibiotic bound via a spacer group of more than 2 atoms. It has been found that these agents according to the invention can be made particularly favorable from cellulose, when activated with 2,4,6-trihalo-s-triazines. Such an activation method is z. B. in DD-WP 154622 described. The essential steps of this process are:
a) Umsetzung derCellulose mit Natronlauge, z.B. 3n-NaOH;a) reaction of the cellulose with caustic soda, e.g. 3N NaOH;
b) Abquetschen nicht benötigter Natronlauge;b) squeezing off unneeded sodium hydroxide solution;
c) Aktivierung mit 2,4,6-Trichlor-s-triazin, z. B. in einem Lösungsmittelgemisch aus Xylen und Aceton bei einer Konzentration von 5 bis 6Gew.-% bei Zimmertemperatur innerhalb von 10 bis 120 Minuten;c) activation with 2,4,6-trichloro-s-triazine, z. In a mixed solvent of xylene and acetone at a concentration of 5 to 6 wt .-% at room temperature within 10 to 120 minutes;
d) Waschung des so aktivierten Trägers entweder mit Wasser oder mit Aceton und/oder mit Aceton: Essigsäure-Gemischend) washing the thus activated support either with water or with acetone and / or with acetone: acetic acid mixtures
e) Trocknung des Trägers oder Weiterverarbeitung.e) drying of the carrier or further processing.
Auf diesem Wege wird durch 4,6-Dichlor-s-triazine aktivierte Cellulose hergestellt, die mit Aminogruppen enthaltenden Verbindungen weiter umgesetzt werden kann. Solche Umsetzungen sind z. B. im DD-WP 237844 beschrieben. Vorzugsweise wird dabei mit wäßrigen Lösungen von organischen Verbindungen mit mindestens einer Aminogruppe und mindestens einer Carbonsäure-oder Sulfonsäuregruppe, die auf einen bestimmten pH-Wert, vorzugsweise im Bereich von 7-8, eingestellt wurde, gearbeitet. Als besonders günstig hat sich die Umsetzung mit Sulfanilsäure erwiesen. Die „hart" bindende Sulfonsäuregruppe am Ende der Seitenkette führt zu einerfesten Bindung des Antibiotikums an den Träger und damit zu keinerlei Verlusten bei den notwendigen Waschschritten und folglich zu sehr scharfen Autoradiogrammen bei sehr geringem oder keinem Untergrund. Der bevorzugte Flächenträger für das erfindungsgemäße Verfahren besteht also ausIn this way, activated cellulose is produced by 4,6-dichloro-s-triazines, which can be further reacted with amino-containing compounds. Such reactions are z. B. in DD-WP 237844 described. Preference is given to working with aqueous solutions of organic compounds having at least one amino group and at least one carboxylic acid or sulfonic acid group, which was adjusted to a certain pH, preferably in the range of 7-8. The reaction with sulfanilic acid has proved to be particularly favorable. The "hard" binding sulfonic acid group at the end of the side chain results in a firm binding of the antibiotic to the carrier and thus no losses in the necessary washing steps and consequently very sharp autoradiograms with very little or no background out
a) Cellulose als Grundmatrix,a) cellulose as a basic matrix,
b) daran gebundenen 4,6-Trichlor-s-triazin-Einheiten,b) 4,6-trichloro-s-triazine units attached thereto,
c) an die durch die verbliebenen Chloratome gekennzeichneten Kohlenstoffatome durch Substitution der Chloratome über die NH2-Gruppe gebundene Sulfanilsäurereste,c) Sulfanilic acid residues bound to the carbon atoms characterized by the remaining chlorine atoms by substitution of the chlorine atoms via the NH 2 group,
d) an die Sulfanilsäure-Sulfonsäuregruppen über ionische Wechselwirkungen mit Aminogruppen des Kanamycins gebundenes Kanamycind) kanamycin bound to sulfanilic acid sulfonic acid groups via ionic interactions with amino groups of kanamycin
folgenden prinzipiellen Aufbaus:following basic structure:
-so:-so:
wobei η, χ und Kan die Bedeutung aufweisen, wie sie bereits definiert worden ist.where η, χ and Kan have the meaning as already defined.
Das erfindungsgemäße Verfahren stellt somit auf leicht zugänglichem Wege an feste, auf Cellulose basierenden Phasen gebundenes Kanamycin zur Verfügung, so daß das Kanamycin seine Wirksamkeit in den Enzymreaktionen und auch nach längerer Lagerzeit behält. Damit ist insbesondere für den Nachweis der Aktivität von Aminoglucosid-Phosphotransferase in exprimierten Bakterienkolonien ein wesentlicher Fortschritt zur schnellen und quantitativen Bestimmung erreicht. Durch die Verwendung von Flächenträgern auf Cellulosebasis wird für das erfindungsgemäße Verfahren ein erfindungsgemäßes Mittel zur Verfügung gestellt, das eine hohe Bindungskapazität aufweist. Das gebundene Kanamycin bleibt unter diesen Bedingungen gut phosphorylierbar. Beim direkten Kontakt mit Bakterienkulturen bleibt eine hohe Schärfe des Signals erhalten. Durch Waschungen mit Wasser ist das Signal nicht oder sehr wenig auswaschbar.The method of the invention thus provides easily accessible routes to solid cellulose-based kanamycin, so that kanamycin retains its efficacy in enzyme reactions and even after prolonged storage. Thus, in particular for the detection of the activity of aminoglucoside phosphotransferase in expressed bacterial colonies, a significant advance for rapid and quantitative determination has been achieved. By the use of cellulosic surface carriers, an agent according to the invention is provided for the process according to the invention which has a high binding capacity. The bound kanamycin remains well phosphorylatable under these conditions. In direct contact with bacterial cultures a high sharpness of the signal is maintained. By washing with water, the signal is not or very little washable.
Das erfindungsgemäße Verfahren stellt somit eine wesentliche Verbesserung des Verfahrens zur Bestimmung der Aminoglucosid-Phosphotransferase-Aktivität aus Trenngelen direkt auf den Träger dar. Außerdem wird es mit dem erfindungsgemäßen Mittel und unter Nutzung des erfindungsgemäßen Verfahrens möglich, bei Reihenkulturen die bereits erreichte Enzymaktivität oder bei Wachstumsprozessen die Veränderungen über der Zeit in großer Zahl durchzuführen und maschinell auszuwerten. Die spezielle Oberfläche des erfindungsgemäßen Trägers erlaubt die Anfärbung der Proteine mit Coomassie-Brillantblau, ohne daß der Träger eine Untergrundfärbung aufweist. Neben diesen Vorteilen weist der erfindungsgemäße Flächenträger eine hohe mechanische Stabilität auf.The process according to the invention thus represents a substantial improvement in the method for determining the aminoglucoside phosphotransferase activity from separating gels directly onto the carrier. In addition, it is possible with the composition according to the invention and using the method according to the invention, in row cultures, the already achieved enzyme activity or in growth processes to carry out the changes over time in large numbers and to evaluate them by machine. The special surface of the carrier according to the invention allows the staining of the proteins with Coomassie brilliant blue, without the carrier having a background coloration. In addition to these advantages, the surface support according to the invention has a high mechanical stability.
Es wird eine makromolekulare Masse mit chemisch aktiven Füllstoffen nach DD-WP 154622 wie folgt hergestellt: Cellulosepapier wird 15 Minuten in 3 η NaOH unter leichtem Schütteln umgesetzt. Dieses Produkt wird nach Abquetschen der größten Menge Natronlauge in ein Aktivierungsbad aus 5,5Gew.-% Cyanurchlorid, 50Gew.-%Xylen und 44,5Gew.-% Aceton 30 Minuten unter leichtem Schütteln aktiviert, anschließend mit Aceton bzw. Aceton/Essigsäure gewaschen und getrocknet. Das so erhaltene Produkt wird in eine Lösung aus 10Gew.-%des Natriumsalzes der Sulfanilsäure, die durch Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt wurde, gegeben und 5 Stunden unter leichtem Schütteln umgesetzt. Dieses Produkt wird 5x mit destilliertem Wasser jeweils 15 Minuten gewaschen und schließlich in eine Lösung aus 1,5Gew.-%Kanamycinsulfat, die mit Triethanolamin auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt worden ist, gegeben und darin unter leichtem Schütteln 5 Stunden inkubiert. Man erhält so ein Trägermaterial, das.mit Kanamycin beladen ist.A macromolecular mass with chemically active fillers according to DD-WP 154622 is prepared as follows: Cellulose paper is reacted for 15 minutes in 3 η NaOH with gentle shaking. This product is activated after squeezing the largest amount of caustic soda into an activation bath of 5.5% by weight of cyanuric chloride, 50% by weight of xylene and 44.5% by weight of acetone for 30 minutes with gentle shaking, followed by washing with acetone or acetone / acetic acid and dried. The product thus obtained is added to a solution of 10% by weight of the sodium salt of sulphanilic acid, which has been adjusted to a pH of 7.5 by means of sodium hydroxide solution, and reacted for 5 hours with gentle shaking. This product is washed 5x with distilled water for 15 minutes each and finally added to a solution of 1.5% by weight of kanamycin sulfate adjusted to pH 7.2 with triethanolamine and incubated therein with gentle shaking for 5 hours , This gives a carrier material laden with kanamycin.
Lysate von Bakterien mit und ohne Kanamycin-Resistenzgen werden auf ein SDS-PAA-GeI gegeben und die Proteine durch Gelelektrophorese aufgetrennt. Danach wird das Gel 15 Minuten in einer Lösung von 2OmMoI Tris-HCI-Puffer, pH = 7,2; 125mMol Ammoniumchlorid, 1 mMol Dithiothreitol, 1OmMoI Magnesiumchlorid, 2mMol 32P-y-ATP (verdünnt auf eine spezifische Aktivität von 0,3mCi/mMol) inkubiert.Lysates of bacteria with and without kanamycin resistance gene are added to an SDS-PAA gel and the proteins are separated by gel electrophoresis. Thereafter, the gel is placed in a solution of 20 mM Tris-HCl buffer, pH 7.2 for 15 minutes; 125mMol ammonium chloride, 1 mM dithiothreitol, 1OmMoI magnesium chloride, 2 mmol 32 Py-ATP (diluted to a specific activity of 0,3mCi / mmol) were incubated.
Der nach Beispiel 1 hergestellte Träger und 3 Lagen dickes Filterpapier werden mit dergleichen Lösung getränkt. Es wird folgender Aufbau verwendet: Zuunterst eine Glasplatte, darauf die drei Lagen getränktes Filterpapier, darauf das Gel, anschließend der getränkte, erfindungsgemäße Träger mit Kanamycin, darauf eine Lage nicht getränktes, dickes Filterpapier, einige Lagen Zellstoff, schließlich wieder eine Glasplatte und ein Gewicht von 100 g. Dieser Aufbau wird in einem geschlossenen Plastegefäß 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Danach wird die Versuchsanordnung auseinandergenommen und der erfindungsgemäße Träger vom Gel getrennt. Zunächst wird das Gel mit Coomassie-Brillantblau angefärbt. Im Gel wird ein komplettes Restbandenmuster festgestellt, d.h. aus dem Gel wurde nichts auf den Träger transferiertThe carrier prepared according to Example 1 and 3 layers thick filter paper are soaked with the same solution. The following structure is used: At the bottom a glass plate, then the three layers of soaked filter paper, then the gel, then the impregnated carrier according to the invention with kanamycin, a layer not soaked thick filter paper, some layers of pulp, finally again a glass plate and a weight of 100 g. This assembly is incubated in a closed plastic tube for 30 minutes at 37 ° C. Thereafter, the experimental arrangement is disassembled and separated the carrier according to the invention from the gel. Initially, the gel is stained with Coomassie Brilliant Blue. The gel detects a complete residual band pattern, i. nothing was transferred from the gel to the carrier
Der erfindungsgemäße Träger wird 4 x 15 Minuten mit Wasser gewaschen und getrocknet. Anschließend wird autoradiographiert (2 Stunden bei Zimmertemperatur). Die Autoradiographie zeigt nach dem Entwickeln in der Position, an der im Gel die Phosphotransferase unter den vielen Lysat-Proteinen vorhanden war, sehr scharfe und der Menge des vorhandenen Enzyms proportionale Schwärzungen (Banden), d.h. diese lassen sich dem Enzym und dessen Menge bzw. Aktivität genau zuordnen. Anhand angefärbter Markerproteine werden die Molekulargewichte des Enzyms und der Fusionsproteine genau bestimmt. The support according to the invention is washed with water for 4 × 15 minutes and dried. Subsequently autoradiographed (2 hours at room temperature). Autoradiography shows, after development in the position where the phosphotransferase was present in the gel among the many lysate proteins, very sharp and proportional to the amount of enzyme present, blackening (bands); These can be precisely assigned to the enzyme and its quantity or activity. Using stained marker proteins, the molecular weights of the enzyme and fusion proteins are accurately determined.
Es wurden E. coli Bakterien des Stammes DH1 mitundohne Plasm id, das das Neogen desTN-5 enthielt, auf Agarplatten unter üblichen Bedingungen angezogen. Nach 12 Stunden wurde die Agarplatte mit den Kolonien mit einer Nitrocellulose-Membran belegt und weiter kultiviert. Nach weiteren sechs Stunden wurde diese Membran vorsichtig abgenommen und in folgendem Versuchsaufbau eingesetzt: Auf eine Glasplatte werden drei Schichten dickes Filterpapier, die mit dem gleichen Puffer wie in Beispiel 2 getränkt sind, gelegt, darauf wird das erfindungsgemäße Mittel nach Beispiel 1 gelegt, auf dieses die Nitrocellulosemembran mit den lysierten Kolonien (Lyse durch Inkubieren in einem Lysepuffer aus 2OmMoI Tris-HCI, pH = 8,0; 0,1 % TritonX—100 und 5mg/ml Lysozym, 10 Minuten bei Zimmtertemperatur), darauf wieder einige Lagen dickes Filterpapier, eine Glasplatte und ein Gewicht von 250g. Diese Anordnung wird in einer Plastebox eine Stunde bei 37°C gehalten. Schließlich wird der Aufbau auseinandergenommen, das beladene erfindungsgemäße Mittel mehrfach gewaschen und autoradiographiert. Die Positionen auf der Agarplatte, an denen die Kolonien mit dem Neogen gezogen worden waren, wiesen sich durch sehr starke, scharfe Signale nach 2 Stunden aus, während an den Stellen der Kolonien ohne das Neogen keine Signale (Schwärzungen) auftraten.E. coli bacteria of strain DH1 with and without plasmid containing the neogen of TN-5 were grown on agar plates under usual conditions. After 12 hours, the agar plate with the colonies was covered with a nitrocellulose membrane and further cultured. After another six hours, this membrane was carefully removed and used in the following experimental setup: On a glass plate are three layers thick filter paper, which are impregnated with the same buffer as in Example 2, placed on the agent of the invention according to Example 1 is placed on this the nitrocellulose membrane with the lysed colonies (lysis by incubation in a lysis buffer of 20 mM Tris-HCl, pH = 8.0, 0.1% TritonX-100 and 5 mg / ml lysozyme, 10 minutes at teat temperature), then several layers of thick filter paper again , a glass plate and a weight of 250g. This arrangement is kept in a plastic box for one hour at 37 ° C. Finally, the structure is dismantled, the loaded agent according to the invention washed several times and autoradiographed. The positions on the agar plate on which the colonies were grown with the Neogen showed very strong, sharp signals after 2 hours, while no signals (blackening) occurred in the colonies without the Neogen.
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DD29675586A DD254029A1 (en) | 1986-11-27 | 1986-11-27 | METHOD AND MEANS FOR DETERMINING THE AMINOGLUCOSID PHOSPHORTRANSFERASE ACTIVITY |
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DD254029A1 true DD254029A1 (en) | 1988-02-10 |
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DD29675586A DD254029A1 (en) | 1986-11-27 | 1986-11-27 | METHOD AND MEANS FOR DETERMINING THE AMINOGLUCOSID PHOSPHORTRANSFERASE ACTIVITY |
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1986
- 1986-11-27 DD DD29675586A patent/DD254029A1/en not_active IP Right Cessation
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