DD246307A1 - Verfahren zur herstellung von pfropfcopolymeren fuer die oligonucleotidsynthese - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Pfropfcopolymeren aus Polytetrafluorethylen-Pulver (PTFE-Pulver) und Styren, die mit guten Ergebnissen als Traeger in der Festphasensynthese von Oligonucleotiden verwendet werden koennen. Sie verfolgt das Ziel, fuer die Festphasensynthese von Oligonucleotiden gut verwendbare Pfropfcopolymere des PTFE-Polystyren-Typs bereitzustellen. Die diesem Ziel zugeordnete Aufgabe wird geloest, indem nach dem Verfahren der strahlenchemischen Gasphasenpfropfung Inertgas, welches mit Styrendampf gesaettigt ist, kontinuierlich waehrend einer Dauer von 1 Stunde bis 10 Stunden durch einen mit PTFE-Pulver beschickten Pfropfreaktor bei gleichzeitiger Einwirkung von energiereicher ionisierender Strahlung hindurchgeleitet wird. Hierbei gelangt ein poroeses, voluminoeses PTFE-Pulver mit Partikelgroessen von 0,1 mm bis 2,0 mm zum Einsatz, und die Pfropfung wird bei Einsatztemperaturen zwischen 40C und 80C sowie Dosisleistungen zwischen 0,1 kGy/h und 10 kGy/h durchgefuehrt. Bei Beendigung des Prozesses liegen PTFE-Polystyren-Pfropfcopolymere mit Pfropfgraden zwischen 5% bis 50% vor.

Description

Hierzu 1 Seite Zeichnung

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Pfropfcopolymeren, die in der Festphasensynthese von Oligonucleotiden verwendet werden können.

Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt primär in der molekularbiologischen und gentechnologischen Forschung, darüber hinaus aber auch bei der industriemäßigen Nutzung der Gentechnologie.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Als eine der beiden Basismethoden zur Festphasensynthese von Oligonucleotiden ist das sogenannte Phosphattriesterverfahren (S.A. Narang.et al., Methods Enzymol., Acad. Press 1980, 65, 610) bekannt und weitgehend eingeführt. In diesem Verfahren werden als Träger, d. h. als Verbindungen, die in den verwendeten Lösungsmittelsystemen unlöslich sind und an denen die wachsende Oligonucleotidkette aufgebaut wird, wobei letztere durch einfache Filtration aus dem Reaktionsgemisch abgetrennt werden kann, bisher unter anderem substituierte Acrylamid-Copolymerisate (M. J. Gait, S. G. Popov et al., Nucleic Acids Res., Symp. Ser. No. 7,1980,242) sowie vernetzte Polystyrene (K. Miyoshi, T, Miyake et al.. Nucleic Acids Res. 1980,8,5473) eingesetzt. Wird jedoch einer der Träger aus diesen Verbindungsklassen herangezogen, so ergeben sich für das Phosphattriesterverfahren Effektivitätsverluste, denn diese Träger weisen gegenüber den einzusetzenden verschiedenen Lösungsmitteln unterschiedliche Quellbarkeit sowie bei wachsender Oligonucleotidkette eine Änderung im chemischen Verhalten auf; außerdem kann bei ihnen die Zugänglichkeit der auf dem Träger befindlichen Ankergruppen noch nicht befriedigen. Weiterhin tritt beim Kettenaufbau in 3'-5'-Richtung Depurinisierung des Deoxyadenosins bei Abspaltung der ö'-Tritylschutzgruppe im sauren pH-Bereich ein. In Verbindung mit den Bemühungen, diese Nachteile des Trägerverfahrens zu überwinden, ist weiterhin über die Herstellung und den Einsatz von auf Polytetrafluorethylen-Pulver (PTFE- oder Teflonpulver) gepfropften funktionalisierten Polystyrenen als Trägerin der Festphasensynthese von Oligonucleotiden berichtet worden (V. K. Potapov, V. P.Veiko et al., Nucleic Acids Res. 1979, 6, 2041; V. K. Potapov, S. !.Türkin et al., Dokl. Akad., Nauk SSSR 1978, 241,1352; O. N. Koroleva, V. K. Potapov et al., Chim. Prirod. Sojedinenij 1984,20, 362). ·

Die Pfropfcopolymerisate werden hiernach durch Bestrahlung des PTFE-Pulvers inv-Vakuum mity-Strahlung sowie anschließendes Überdestillieren einer definierten Menge Styren in das evakuierte Reaktionsgefäß hergestellt. Bei dieser Methode entstehen jedoch keine einheitlichen, reproduzierbaren Produkte, d.h. hinsichtlich der Erzielung definierter Pfropfgrade weist sie nur ein geringes Maß an Reproduzierbarkeit auf. Weiterhin entsteht bei dieser Methode der Herstellung von Pfropfcopolymeren ein hoher Anteil an Homopolymeren des Styrens, der durch langwierige Extraktion mit organischen Lösungsmitteln vordem Einsatz als Träger für die Oligonucleotidsynthese abgetrennt werden muß. Durch das unvollständige Eindringen des Styrens in die Hohlräume bzw. Poren der Partikel des PTFE-Pulvers wird außerdem nur eine ungleichmäßige Oberflächen-Pfropfung erreicht. Dies hat zur Folge, daß der Grad der Zugänglichkeit der Ankergruppen bzw. der wachsenden

Oligonucleotidketten nicht genügend hoch sowie in Abhängigkeit von den Herstellungsbedingungen ungleichmäßig und'nicht gut reproduzierbar ist. Beim Phosphattriesterverfahren unter Einsatz von nach o.g. Verfahren gepfropften Trägern resultieren damit in der Regel vergleichsweise niedrige Oligonucleotidausbeuten, wie Übersicht 1 zeigt.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung verfolgt das Ziel, für die Festphasensynthese von Oligonucleotiden gut verwendbare Pf ropfcopolymere des Polytetrafluorethylen-Polystyren-Typs bereitzustellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung '

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur strahlenchemischen Herstellung von Pfropfcopolymeren des Polytetrafluorethylen-Polystyren-Typs zu beschreiben, das in definierten Pfropfgraden mit guter Reproduzierbarkeit herstellbare Produkte liefert, die, eingesetzt als Träger in der Oligonucleotidsynthese, zu höheren Ausbeuten führen.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe wie folgt gelöst: .

Zur Herstellung von Pfropfcopolymeren des Polyteträfluorethylen-Polystyren-Typs, die eine gute Eignung für die Festphasensynthese von Oligonucleotiden aufweisen, wird das an sich bekannte strahlenchemische Verfahren der Gasphasenpfropfung (synonyme Bezeichnung: strahlenchemische Pfropfpolymerisation in der Gasphase) herangezogen.

Verfahrensgemäß wird das flüssige Monomere durch Erwärmen zunächst verdampft. Durch Durchleiten von Inertgas, vorzugsweise von Stickstoffgas, welches sich dabei mit dem Styren-Dampf sättigt, wird dieses dampfförmige Monomere während der Reaktionsdauer kontinuierlich zu dem mit Polymerpulver gefüllten Pf ropfreaktor geleitet. In diesem Reaktor, der der energiereichen ionisierenden Strahlung einer y- oder Elektronen-Bestrahlungsanlage ausgesetzt ist, findet bei einer Einsatztemperatur von 20°C bis 100⁰C die Pfropfreaktion zwischen dem PTFE-Pulver und dem kontinuierlich zugeführten dampfförmigen Styren statt, wobei das Pulver zweckmäßigerweise durch Wirbeln oder Rütteln bewegt wird.

Die Pfropfung wird entweder nach der Variante der Synchronbestrahlung oder nach der Variante der Vorbestrahlung durchgeführt. Bei der erstgenannten Variante erfolgt die Bestrahlung mit einer Dosisleistung von 0,1 kGy/h bis 10,0kGy/h zeitgleich zur Pfropfung, und die Bestrahlung wird auf das PTFE-Pulver wie auf das den Reaktor durchströmende dampfförmige Styren gleichermaßen erstreckt. Die Bestrahlung wird für die Dauer von 1 Stunde bis zu 10 Stunden vorgenommen.

In der anderen Variante erfolgt die Pfropfung im Anschluß an die Bestrahlung des PTFE-Pulvers. In diesem Falle wird das Polymerpulver, gleichfalls für eine Dauer von 1 Stunde bis zu 10 Stunden, der ionisierenden Strahlung in einer Gesamtdosis von 0,1 kGy bis 50,OkGy ausgesetzt.

Die bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens ist unter diesem Aspekt insbesondere dadurch gekennzeichnet, daß in beiden Varianten die Bestrahlung mit Hilfe einer-^-Bestrahlungsanlage realisiert wird.

In der Variante der Synchronbestrahlung wie in der Vorbestrahlungsgrundvariante wird die gesamte Pfropfapparatur zu Verfahrensbeginn, d.h. nach Einbringen des PTFE-Pulvers, entweder durch genügend langes Durchspülen mit Inertgas, vorzugsweise mit reinem Stickstoff, oder durch nacheinanderfolgendes Evakuieren und Spülen mit Inertgas, vorzugsweise mit reinem Stickstoff, von Sauerstoff befreit. Für den Fall der Vorbestrahlungsvariante ist es jedoch auch möglich, die Bestrahlung in Gegenwart von Luft vorzunehmen und die Pfropfreaktion nach dem Kontakt mit dem Styren durch Temperatur-Erhöhung auszulösen.

Für die Herstellung der Träger eignen sich insbesondere poröse, voluminöse PTFE-Pulver mit Partikelgrößen zwischen 0,1 mm und 2,0 mm, vorzugsweise zwischen 0,5 mm und 1,0 mm. Gegenüber der Pfropfung nach Potapov entsteht bei verfahrensgemäßem Vorgehen ein wesentlich geringerer Anteil an Homopolymeren des Styrens, der durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln wie Ethylacetat oder Toluen vom Pfropfpolymeren entfernt wird.

Die Pfropfreaktion wird fortgeführt, bis der sogenannte Pfropfgrad, definiert als in % angegebene Massezunahme des Trägerpolymeren im Ergebnis der Pfropfung, bezogen auf die Ausgangsmasse des Polymeren, einen Wert zwischen 5% und 50%, vorzugsweise zwischen 10% und 30%, erreicht hat. Dieser Parameter zur Bewertung der Qualität der hergestellten Copolymerisate, dessen Bestimmung als wesentlicher Bestandteil des vorliegenden Verfahrens aufzufassen ist, wird nach Trocknung der extrahierten Pfropfprodukte hinreichend zuverlässig nach einer modifizierten Elementaranalyse bestimmt, bei der der systematische Fehler, der aus dem Umstand, daß reines PTFE-Pulver nur unvollkommen zur Verbrennung gebracht werden kann, mit Hilfe einer Eichkurve korrigiert wird (vgl. Abbildung).

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Pfropfcopolymere wurden mit sehr guter Reproduzierbarkeit und jeweils wohldefinierten Pfropfgraden erhalten. Bei jeweils anschließender Oligonucleotidsynthese wurden die günstigsten Ergebnisse mit solchen verfahrensgemäß hergestellten Pfropfcopolymeren erzielt, die einen Pfropfgrad vorzugsweise zwischen 10% und 30% aufwiesen. Gegenüber den nach der Potapov-Methode hergestellten Pfropfcopolymeren (mit jeweils gleichem Pfropfgrad) verfügen die nach erfindungsgemäßer Pfropfung erhaltenen Träger somit über signifikant erhöhte Gesamtausbeuten in der Oligonucleotidsynthese (vgl. beiliegende Übersichten 1 bis 2).

Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens werden weiterhin darin gesehen, daß

— unter den Reaktionsbedingungen des Triesterverfahrens eine lösungsmittelunabhängige Zugänglichkeit der funktioneilen Gruppen besteht, was den Syntheseaufbau sowohl in 3'-5'-Richtung wie auch in 5'-3'-Richtung erlaubt;

— für die erhaltenen Träger keine Quellung beobachtet wird, was die Verwendung von Säulenreaktoren bei hoher Durchflußrate ermöglicht;

— die erhaltenen Träger unter den verwendeten Reaktionsbedingungen chemisch inert sind, und

— keine sterische Hinderung beim Kettenaufbau beobachtet wird.

Ausführungsbeispiele

1. 60g poröses Polytetrafluorethylen-Pulver mit Partikelgrößen zwischen 0,4mm und 1,2mm werden in einem temperierbaren • Wirbelbettreaktor 3 Stunden durch Evakuieren und Spülen mit Reinst-Stickstoff von Sauerstoff befreit. Danach wird ein mit Styren bei 60°C gesättigter Stickstoffstrom von 120 l/Stunde durch den auf 70°C erwärmten Reaktor geleitet und mit der Bestrahlung begonnen. Die Dosisleistung der eingesetzten Kobalt-60-Bestrahlungsanlage betrug im Reaktor 1 kGy/Stunde. Nach einer Reaktionszeit von 4 Stunden (entspricht einem Pfropfgrad von 20,3%, bestimmt nach modifizierter Elementaranalyse) wird das Pfropfprodukt dem Reaktor entnommen und solange mit siedendem Ethylacetat extrahiert, bis kein Homö-Polystyren mehr nachweisbar ist (Füllung des Extraktes mit Methanol).

Dieses Pfropfcopolymere ergab bei der Oligonucleotidsynthese die in Übersicht 2 angegebenen Ausbeuten/Stufe (berechnet aus der isolierten Endausbeute) sowie Gesamtausbeuten.

2. 100g poröses Polytetrafluorethylen-Pulver mit Partikelgrößen zwischen 0,5mm und 1,0mm werden in einem Vibrationsreaktor durch mehrmaliges Evakuieren und Spülen mit Reinst-Stickstoff von Sauerstoff befreit. Bei Temperaturen

zwischen 30°C und 5O⁰C wird 3 Stunden mit einer y-Strahlung von 10kGy/Stunde bestrahlt. Durch das bestrahlte Polymerpulver wird danach ohne Weiterführung der Bestrahlung ein mit Styren gesättigter Stickstoffstrom geleitet, wobei die Temperatur im Reaktor auf 80⁰C erhöht wird. Nach einer Reaktionszeit von 8 Stunden (entspricht einen Pfropfgrad von 12%, bestimmt mittels modifizierter Elementaranalyse) wird das Pfropfprodukt dem Reaktor entnommen. Die geringen Mengen an Homo-Polystyren werden durch Extrahieren mit Toluen entfernt. Dieses Pfropfcopolymere ergab bei der Oligonucleotidsynthese die in Übersicht 3 ausgewiesenen Werte.

Übersicht 1: OligonucleotidausbeUten im Verfahren nach V. K. Potapov (entnommen aus O. N.Koroleva, V.K. Potapovet al., 1984, a.a.O.)

	Polymer	Nucleosid-	Ausbeute	Gesamt
	mg	Komponente	Oligonucleotid	ausbeute
Oligonucleotid	100	μΜ	μΜ	%
dAACTAGTT	200	2,8	0,13	4,6
dAGTTAACT	100	5,6	0,0	1,8
dAACTAGTTp	150	2,8	0,044	1,6
dAGTTAACTp	2,4	0,03	1,2

Übersicht 2: OligonucleotidausbeUten mit einem Träger, hergestellt unter den Verfahrensbedingungen gemäß Ausführungsbeispiel 1

synthetisiertes Oligonucleotid	Ausbeute/Stufe	Gesamtausbeute
dGATCACACATG	97,7%	75,5%
dAACAGCTATGACCATG	94,4%	42,0 %
dGATCCATGTGTGATCTCCC	93,0%	29,7%
dGCTGATATCACCAGGATCCCT	93,0%'	24,9%

Übersicht 3: OligonucleotidausbeUten mit einem Träger, hergestellt unter den Verfahrensbedingungen gemäß Ausführungsbeispiel 2

synthetisiertes Oligonucleotid dGATCACACAT dGATCACACATG dGAATGTTTGACAGA dTGCTATAATGATCA

Ausbeute/Stufe	Gesamtausbeute
93,0 %	. 54,3%
90,5%	41,0%
91,0%	30,9%
88,7 %	20,0%

Claims (9)

1. Erfindungsanspruch:

   1. Verfahren zur Herstellung von Pfropfcopolymeren für die Oligonucleotidsynthese aus Polytetrafluorethylen-Pulver und Styren unter Anwendung von Grundschritten der strahlenchemischen Pfropfpolymerisation in der Gasphase, gekennzeichnet dadurch, daß das Polytetrafluorethylen-Pulver unter Einwirkung energiereicher ionisierender Strahlung bei einer Einsatztemperatur von 20°C bis 100 ^CC kontinuierlich mit gasförmigem Styren behandelt wird, bis Pfropfgrade zwischen 5% und 50% erreicht sind.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Pfropfung unter Einwirkung von γ-Strahlung durchgeführt wird.
3. 3. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Pfropfung unter Einwirkung von Elektronenstrahlung durchgeführt wird. ·
4. 4. Verfahren nach Punkt 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß die Pfropfung in Abwesenheit von Sauerstoff zeitgleich zur Bestrahlung durchgeführt wird (Synchronbestrahlung), wobei die Bestrahlung mit einer Dosisleistung von 0,1 kGy/h bis 10,0kGy/hfür die Dauer von 1 Stunde bis 10 Stunden erfolgt.
5. 5. Verfahren nach Punkt 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß die Pfropfung im Anschluß an die Bestrahlung durchgeführt wird (Vorbestrahlung), wobei während einer Dauer von gleichfalls 1 Stunde bis 10 Stunden eine Bestrahlung mit einer Gesamtdosis von 0,1 kGy bis 50,0 kGy erfolgt.
6. 6. Verfahren nach Punkt 1 bis 4 bzw. 5, gekennzeichnet dadurch, daß für die Pfropfung ein poröses, voluminöses Polytetrafluorethylen-Pulver mit Partikelgrößen von 0,1 mm bis 2,0 mm zum Einsatz ko.mmt.
7. 7. Verfahren nach Punkt 6, gekennzeichnet dadurch, daß ein Polytetrafluorethylen-Pulver mit Partikelgrößen zwischen 0,5 mm und 1,0mm zum Einsatz kommt.
8. 8. Verfahren nach Punkt 1 bis 7, gekennzeichnet dadurch, daß das Polytetrafluorethylen-Pulver mit dem gasförmigen Styren behandelt wird, bis Pfropfgrade zwischen 10% und 30% erreicht sind.
9. 9. Verfahren nach Punkt 1 und 8, gekennzeichnet dadurch, daß der Pfropfgrad mittels modifizierter Elementaranalyse bestimmt wird.