DD219673A1 - Verfahren zur herstellung von praeparaten biologisch aktiver peptide mit modifizierter wirkung - Google Patents

Abstract

Es wird ein einfaches Verfahren zur Herstellung von wirkungsmodifizierten biologisch aktiven Peptiden, insbesondere Insulin beschrieben, das auf der Immobilisierung der Wirkstoffe durch Einbettung, Fixierung oder Adsorption unter Verwendung makromolekularer gelartiger Traegermaterialien beruht. Als Traegermaterialien werden hierbei vorzugsweise physiologisch vertraegliche und biologisch abbaufaehige Verbindungen vom Polysaccharid oder Polyamid-/Polypeptid-Typ wie Agar-Agar, Agarose, Dextrose, Staerke, Kollagen oder aehnliche Biopolymere verwendet, die sich in ihrem Vernetzungsgrad und Porendurchmesser weitgehend variieren lassen. Das Einbringen des Wirkstoffes in die Matrix kann hierbei durch beliebige physikalisch-chemische Operationen z. B. Mischen, Penetrieren, Diffusion, Adsorption, Elektrophorese und andere Methoden erfolgen. Durch eine derartige Immobilisierung des Hormons wird eine erhoehte Haltbarkeit unter physiologischen Inkubationsbedingungen sowie Verbesserung der pharmakinetischen Eigenschaften wie z. B. Verzoegerung der Wirkstoffabgabe oder eine guenstigere Dosierungsmoeglichkeit erreicht.

Description

Verfahren zur Herstellung von Präparaten biologisch aktiver Peptide mit modifizierter Wirkung ' . .·

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Präparaten biologisch aktiver Peptide durch Immobilisierung an hochmolekularen inerten Trägermaterialien. Dadurch werden eine erhöhte Haltbarkeit unter pysiologischen Inkubationsbedingungen sowie eine zielgerichtete Verbesserung aus-

i

gewählter pharmakologischer Eigenschaften wie z. B. eine Verzögerung der Wirkstoffabgabe oder günstigere Dosierungsmöglichkeiten erreicht.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungswege

Die Fixierung eines Wirkstoffes an polymere Matrices ist eine verbreitete Methode zur Erzielung modifizierter bzw. prolongierter pharmakologischer Effekte. Prinzipiell kann dies erreicht werden durch Adsorption des Pharmakons an der Oberfläche eines Trägers, durch Einschluß, oder Einbettung im Inneren eines quervernetzten Polymers mit geeigneter Porenstruktur oder durch kovalente Verankerung des Wirk-* stoffes an die Polymermoleküle mittels geeigneter Spacergruppen.

Zum Beispiel besitzt normales kristallines Insulin nur kurzzeitige Wirkung. Es hat daher in der Literatur zahl- .-. reiche Versuche gegeben, durch Veränderung der Resorptionsfähigkeit, der biologischen Halbwertzeit oder auch durch Lösungsverzögerung des Hormons, Präparate mit modifizierter Wirkung, insbesondere mit Depoteffekt, zu entwickeln. Aus dieser.Zielrichtung heraus werden an Modifizierungsmöglichkeiten zum Beispiel die direkte chemische Abwandlung des Insulinmoleküls bzw. einer der beiden Teilketten, die Komplexierung von Insulin mit basischen Eiweißstoffen bzw. organischen Basen sowie die Suspendierung von kristallinen Zn-Insulinen, die unter spezifischen Bedingungen hergestellt werden (Lente-Insuline), angewandt. Weiterhin sind aus der Literatur Versuche zur kovalenten Verankerung von Insulin an Sepharose oder Agarose bzw. Polyethylenglycol bekannt /Cuatrecasas und Hollenberg, Advances in-Prot. Chem. 30» 406-429 (1976) /.

Unter der Vielzahl dieser Möglichkeiten haben sich in der medizinischen Praxis im wesentlichen nur die Lente-Insuline als Depot-Präparate durchgesetzt. Deshalb ist es erforderlich, nach neuartigen Wegen zu suchen, die es ermöglichen, die pharmakologischen Eigenschaften biologisch aktiver Peptide gezielt zu verändern. _:

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die einfache und kostengünstige Gewinnung von Präparaten biologisch aktiver Peptide mit verbesserter biologischer Haltbarkeit und günstigeren pharmakinetischen Eigenschaften, vorzugsweise von Depot-Formen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zu entwikkeln, das die biologische Stabilität sowie die pharmakologischen Eigenschaften biologisch aktiver Peptide, insbesondere Insulin unter Verwendung makromolekularer Matrices gezielt modifiziert.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß man eine Immobilisierung durch Einschluß, Einbettung oder Adsorption vornimmt. Als Matrices kommen hierfür in die engere Auswahl inerte, nicht toxische, gelartige Trägermaterialien, die sich in unterschiedlichen Porengrößen und Vernetzungsgraden gewinnen lassen. Unter diesen verdienen insbesondere die biologisch abbaufähigen Vertreter vom Polysaccharid- oder Polyamid-Typ, wie z.B. Agar-Agar, Agarose, Dextrane, Stärke, Polypeptide, Kollagen oder ähnliche Verbindungen bzw. partielle Abbauprodukte davon den Vorrang. Prinzipiell kommen aber auch andere atox.ische, physiologisch ver-j· trägliche Polymere in Betracht. Der Einschluß, oder die Fixierung bzw. Adsorption des Hormons erfolgt hierbei unter Lösungsbedingungen bzw. pH-Werten, unter denen eine Denaturierung weitgehend vermieden wird und wozu beliebige Methoden wie Mischen, Penetrieren, Diffusion bzw. Elektrophorese einbezogen werden können. Durch die Immobilisierungsformen des geschilderten Typs läßt sich eine Stabilität des Peptidwirkstof fes, gegenüber äußeren Einflüssen, wie Veränderungen des pH-Wertes und hydfolysierende Bedingungen erreichen, wodurch die volle biologische Aktivität über lange Zeiträume erhalten bleibt

Gleichzeitig ergeben sich auf diese Weise infolge veränderter

Löslichkeits- und Diffusionsprozesse in der Matrix Möglichkeiten für eine dosierbäre Wirkstoffabgabe, die sich für die Herstellung von Depot-Präparaten nutzen lassen. Hierbei liegen beispielsweise die Vorteile des Verfahrens ,darirn, daß., sich Insulin unter Anwendung ausgewählter Puffersysteme auf elektrophoretischem Wege in Polyacrylaraidgele unterschiedlichen Vernetzungsgrades derart einbringen lä&t, daß Wirkstoffkonzentrationen bis zu 18 % erreicht werden. Die so erhaltenen Einbettungsformen weisen das Insulin in biologisch voll aktiver Form auf und bewirken eine vollständige und über mehrere Stunden anhaltende Wiederabgabe. Derartige Modifizierungsformen besitzen gegenüber den bisher in der Literatur /B. K. Davis, Experientia 28, 348 (1972) / beschriebenen, bei welchen Insulin in Polyacrylamidgele einpolymerisiert wurde, erhebliche Vorteile, da hier das Wirkstoffmolekül chemisch unverändert und biologisch voll aktiv bleibt.

Eine andere Möglichkeit dieses Grundprinzipes besteht darin, daß peptidartige Biowirkstoffe wie z. B. Insulirt oder GnRH in kristalliner oder gelöster Form in Agar-Agar-Gele unterschiedlicher Konsistenz unter ebenfalls nicht denaturierenden Bedingungen eingebracht werden. Auf diese Weise ergeben sich Präparate, die es ermöglichen, die Stabilität wesentlich zu erhöhen und die Wiederfreisetzungsrate des Hormons zu steuern.

Ausführungsbeispiele . ,

1. Beispiel:

Einbettung von Insulin in Polyacrylamidmatrices mittels , Polyacrylamideiektrophorese

Reagenzien: (jeweils mit destilliertem Wasser auf 100 ml aufgefüllt)

Lösung A: 1 η HCl: ' 48 ml

./ . ν

Tris-(hydroxymethyl)-amino-methan,: 36,6 g

N;N;N';N' Tetramethylethylendiamin: 0,23 ml Lösung B: frisch umkristallisiertes Acrylamid: 30,0 g frisch umkristallisiertes NN" Methylenbisacrylamid: 0,8 g

Lösung C: Ammoniumperoxidisulfat: 0,14 g

Lösung D: frisch umkristallisiertes Acrylamid: 60,0 g frisch umkristallisiertes NN' Methylenbisacrylamid: , Q_t4 g

Lösung E:' Saccharose: 34 g

Glycin: ;.' 2,88 g

Elektrophoresepuffer: Tris-(hydroxymethyl)-

amino-methan: ' 0,6 g

Glycin: 2,88 g

als 10 %ige wäßrige Lösung für Elektrophorese verwendet.

Zur Herstellung der 7,5 %igen Polyacrylamidmatrices (= Gewicht % /Gesamtreaktionsvolumen) werden die Lösungen A, B₁C und destilliertes Wasser im Verhältnis 1, : 2 : 4 : gemischt und 60 Minuten in Gelröhrchen (70 mm χ 5 mm) poly-

merisiert. Nach einer Vorelektrophorese von 60 Minuten werden 150 /ül Insulinlösung (250 mg Insulin pro ml Lösung E) pro Gelröhrchen aufgetragen und durch Elektrophorese (U= 200 V, 1=3 mA/Röhrchen, t = 90 Minuten) in das Gel eingebracht. Anschließend werden die beladenen Gele durch ein Sieb entsprechender Mäschenweite direkt in absolutes Aceton hineingedrückt, das entwässerte Gel abgesaugt, mit Aceton gewaschen und über P₂ ⁰K bei 1 Torr getrocknet. Im Tierexperiment zeigen die so gewonnenen Insulin-Präparate einen Depoteffekt.

2. Beispiel:

Zur Herstellung von 15 %igen Polyacrylamidmatrices mischt man die LösungeVi A, B, C im Verhältnis 1 : 4 : 2 und es wird weiter wie im BeispieL 1 verfahren.

Auf Grund des geringen mittleren Porendurchmessers der gewählten Matrix zeigte diese Insulineinbettung eine gegenüber Beispiel 1 gesteigerte protahierende Wirkung.

3. Beispiel:

Herstellung von Insulin-beladenen Dextranen; Es werden 5,6 g Dextran (M = 500 000) mit 4,6 ml destilliertem Wasser zu einer zähen Masse verrührt. Mittels Mikrospritze werden 1000 /ul Insulinlösung (250 mg/ml 0,2 η Na₂HP0₄-Lösung; pH 9,7) zu dieser Masse zugegeben und untergerührt. Das Gel wird einer Vortrocknung in absolutem Aceton unterworfen. Anschließend erfolgt eine Trocknung an der ölpumpe bei 1 Torr und 25 ⁰C. Die ausgehärtete Matrix wird im Mörser zerkleinert. Auf diese Weise konnten Gele von 3_t5 ?

Insulinanteil (bezogen auf Trockenmasse) hergestellt werden, die im Tierversuch eine Depotwirkung zeigten.

4. Beispiel:

Herstellung von Insulineinbettungsformen in Agar-Agar-Matrice s:

Es werden 5-'und 7,5 %ige Agar-Agar-Lösungen durch Auflösen entsprechender Mengen Agar-Agar in destilliertem Wasser (90 ⁰C) hergestellt. Oeweilß 3 ml dieser Lösungen läßt man auf 40 ⁰C abkühlen und versetzt diese kurz vor dem Ausgelieren mit 50 bis 1000 AiI Insulinlösung (250 mg Insulin in 1 ml 0,2: η Na₂HPO₄-Lösung; pH 9,7), so daß Proben mit 10 bis 60 Gewicht % Insulinanteil (bezogen auf Trockenmasse) resultieren. Die gelierten Proben werden anschließend wie im Beispiel 1 zerkleinert und getrocknet. Die so gewonnenen Einbettungsformen von Insulin und Agar-Agar zeigen im Tierversuch, wie die unter Beispiel 1 und 2 gewonnenen Präparate, eine deutliche Depotwirkung.

5. Beispiel:

Es werden 7,5 %ige Agar-Agar-Lösungen durch Auflösen entsprechender Mengen Agar-Agsr(l,5 g) in destilliertem Wasser (18,5 ml) bei 90 ⁰C hergestellt. Kurz vor dem Aüsgelieren der auf 40 ⁰C abgekühlten Lösung wird die entsprechende Menge Kristallinsulin (330 mg) zugegeben und verrührt. Die gelierten Proben werden anschließend wie im Beispiel 1 zerkleinert und getrocknet. Auf diese' Weise können Gele rtfit 15 Gewichts % Insulinanteil (bezogen auf Trockenmasse) her-

gestellt werden, die im Tierversuch eine stärkere Depotwirkung als die unter Beispiel 1, 2, 3 und 4 beschriebenen Präparate zeigten.

6. Beispiel:

Herstellung von GnRH-Einbettungsformen in Agar-Agar: Es werden 7,5 %ige Agar-Agar-Lösungen durch Auflösen entsprechender Mengen Agar-Agar (450 mg) in destilliertem Wasser (4,5 ml) bei 90 ⁰C hergestellt. Kurz vor dem Ausgelieren der auf 40 ⁰C abgekühlten Agar-Agar-Lösungen werden 1000 >ul GnRH-Lösung (100 mg in 1 ml destilliertem Wasser; pH 6,0) zugegeben und verrührt. Es erfolgt eine Zerkleinerung und anschließende Trocknung wie in Beispiel 1 ausgeführt. Auf diese Weise konnten Gele mit 13 Gewichts % GnRH-Anteil (bezogen auf Trockenmasse) hergestellt werden.

Claims (6)

1. Erfindungsanspruch

   1. Verfahren zur Herstellung von immobilisierten ,in ihrer biologischen Aktivität stabilisierten und in ihren pharmakologischen Eigenschaften modifizierten biolO'-gisch aktiven Peptiden, vorzugsweise von Depot-Formen,

   ν gekennzeichnet dadurch, daß das Peptid in inerte makromolekulare, gelartige atoxische und biologisch abbaufähige Matrices, vorzugsweise solche vom Polysaccharid- oder Polyamid- bzw. Polypeptid-Typ mit frei wählbaren Porositäten und Vernetzungsgraden, physikalisch eingeschlossen oder eingebettet bzw. an diesen adsorbiert wird.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1 gekennzeichnet dadurch, daß

   dieses Prinzip für die Gewinnung von Insulin-Depot-Formen herangezogen wird. ,
3. 3. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Peptid aus einer hochkonzentrierten Lösung mittels Elektrophorese in auspolymerisierte Polyacrylamidgele eingebettet wird.
4. 4. Verfahren nach Punkt 3, gekennzeichnet dadurch, daß * für die Einbettung 5- bis 20 %ige Polyacrylamidgele (Gewichts % / Gesamtreaktionsvolurnen) verwendet werden,
5. 5. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Peptid unter nicht denaturierenden pH-Bedingungen

   und Temperaturbedingungen in das sich bildende Gel, z, B. vom Polysaccharid-Typ wie Dextran oder Agar-Agar, eingebracht wird.
6. 6. Verfahren nach Punkt 1:, gekennzeichnet dadurch, daßdas mit dem Peptid beladene Gel schockgetrocknet wird, z. B. indem es durch ein Sieb in absolutes Aceton hinein gedrückt , das entwässerte Gel abgesaugt, mit Aceton gewaschen und über PpOc bei 1 Torr getrocknet wird.