DD208172A1 - Verfahren zur herstellung eines antibiotika-komplexes - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotika-Komplexes, der gegen grampositive Bakterien sowie einige Pilze und Protozoen aktiv ist und potentiell geeignet ist zur Verwendung als Coccidiostatikum und/oder Ergotropikum bei der Nutztierhaltung. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung des Polyether-Antibiotika-Komplexes A-110 unter Verwendung des Mikroorganismus Actinomyces hygroscopicus, Stamm 110. Ziel der Erfindung ist die Herstellung eines potentiell coccidiostatisch und/oder ergotrop wirksamen Antibiotika-Komplexes, der aus 4 Komponenten bisher nicht beschriebener Polyether-Antibiotika besteht. Die Aufgabe wird dadurch geloest, dass durch aerobe Submersfermentation des Stammes 110 in Medien mit geeigneten Einsatzstoffen der Polyether-Antibiotika-Komplex A-110 gebildet, mit geeigneten Methoden aus dem Mycel isoliert, gereinigt und noetigenfalls nachfolgend in die Komponenten A-110-1, A-110-2, A-110-3 und A-110-4 getrennt wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Antitiotika-Komplexes, der zur Gruppe der Polyether-Antibiotika gehört« Diese sind vorwiegend gegen grampositiven-Bakterien und Protozoen aktiv und auf Grund ihrer ooooidiostatiachen, ergotropen sowie herzstimulierenden Wirkungen in der Nutztierhaltung und für die Veterinärmedizin von Nutzen*

Charakteristik der bekannten teohnisohen Lösungen

Die Polyether-Antibiotika sind eine Klasse natürlicher Verbindungen, die ausschließlich durch Fermentation von Aotinomyoeten produziert werden« Das große Interesse an dieser Substanzklasse wurde durch die Bestimmung der ooccodioststischen Aktivität geweokt (Westley, Advanoes in Applied Microbiology, 22., 177, (1977))· Einige Vertreter dieser Gruppe besitzen eine eytostati« sehe Aktivität« Es wurde auch festgestellt, daß einige monovalente und divalente Polyether-Antibiotika der Herztätigkeit bei Säugetieren stimulieren»

Die Hauptvertreter der Gruppe sind Monensin £J« Amer« Cheau SoC* §2, 5737, 1967), Nigerioin (Biochem. Biophys. Res» Commun· 22* 29, 1968), Grisorisin (J, Chem* soc« Ghern« Commun» 1970 t 1421), Lasalocid (J* Chem· Soc» Chem« Commun· 1970« 71), Salinomycin (Tetrahedron Lett*. £2, 4955, 1973), Lysocellin CJ* Chem· Soo« Chem· Gommun. 1975^ 92) und Mutalomycin (J. Antibiotics 2P_s 903, 1977)· Aus der Palette der angeführten Polyether-Antibioti« ka befinden sich zur Zeit Monensin, Lasalocid und Salinomycin als Coooidiostatika in Anwendung und adnd wiohtige Agentien in der industriellen Geflügelhaltung«

13M1983*O61812

Polyether-»Antibiotika bilden auf Grund des? oyolisohen

tion d@® loleMlSj die durch eine Wasserstoffbrüekenbindung der Oarbooylgruppe mit einer endständigen Hydroxylgruppe bedingt ist} mit Alkali·» und auoh Irdalkalimetallionen sehr stabile in« »erkomplex© ¥©rWindungen_t di® in unpolaren Lösungsmitteln wie· Betroletlaer, H©xan_? Chloroform u» a« gut löslich sind. Diese Blgansoliaft ist di® Grundlage der bidögisohen Wirkung auf eukario« tisohe Eöllesj di© auf dem Einfluß auf d©& Salatransport duroh die I4pidscteaakeja der Seilmembran beruht© ^; Dar fcwtgeseiste iinsats der oben a&gefti&rten Antibiotika in der Tiererntthrang kau» infolge Resiatentwerden von Bfiikroorganie« men der Dan?» bsv_@ Saiasenflora zn einem nachlassen der Wirkung führen« Dabsr ist es. notwendig^ neue Tertreter dieser sehr wirk-» samen Sabsta&sklsßse zu suchen^ di© chemisch neue Strukturen oder ÄriTat© bekannter Verbindungen darstellen»

Das g£@l der Erfindung ist die Herstellung eines neuen Antibio·» h

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde _t di© Herstellung einea neues Antlbiot^ka-Komplezse aus leicht sugäagliohen und billigen Blneatsetoffea wxu. mit Hilf© eines neuen Mikroorganismus au be«

^ wird di© Aufgabe wie folgt gelöstι

Die Biosynthese des Stammes Aotiaomjcetes hygrosöopieus 110 wird auf V&fcrbOden,; di® Kohlenetoff« und Stickstoffquellen sowie Mineralsalze entiialten_? durchgeführt· Dieser ProzeB wird naeh Br-reictoßg dee.MariasMa d@r aatibiotischen Aktivität beendet, gewöhnlich na on''120 bie 140 h· Di© antibiotisoh© Aktivität der Kul'burfluseigfceit wird nach Susata von DimethylformaffiLd naoh der Agar-DifftielöneBiethode gegen die Sast-»Kultur Baoillue subtilis L-^2 bestiBaat«,

Zur Isolierung' dea Antibiotika-Komplexes (siehe^:'Schema 1) wird

auf einen pH-Wert.von 2,0 bis 3|0 eingestellt,

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zentrifugiert und das Myoel mit Dimethylformamid extrahiert« Die vereinigten Extrakte werden mit Wasser verdünnt und mit Chloroform ausgeschüttelt· Naoh dem Behandeln des Chloroformextraktes mit 0,1 η Natronlauge, anschließendem Wa8oneη und Trocknen über Natriumsulfat wird die Chloroformlösung säulenchromatographisoh an Magnesiumoxid gereinigt· Mit Petrolether werden die Natriumsalze des neuen Polyether-Antibiotika-Kom-» plexes eluiert·

Durch weitere Säulenohromatographie an Magnesiumtrisilikat werden die 4 Komponenten des Polyether-Antibiotikar-Komplexes gewonnen· Wie im Schema 1 ersichtlich, werden im geringen Maße ein antifungales Hexaen-Antibiotikum und Azalomyoin B bei der Biosynthese mitgebildet, die jedooh nioht Gegenstand der Erfindung sind.

Der isolierte Antibiotika-Komplex A-110 wurde auf Grund der Farbreaktion mit Vanillin-Schwefelsäure und seiner Eigenschaft, mit unpolaren Lösungsmitteln aus wäßrigen Lösungen bei alkalischer Reaktion (pH über 8,5) extrahiert zu werden, der Löslichkeit der Natriumsalze der isolierten reinen Antibiotika in unpolaren Lösungsmitteln, der Unlöslichkeit in Wasser und der Anwesenheit von Absorptionsbanden im IR-Spektrum bei 1020 bis 1080 cm , als Polyether-Antibiotika-Komplex identifiziert·

Außer der Farbreaktion mit Vanillin-Schwefelsäure (Rotfärbung) reagieren diese Antibiotika mit 10 fcLger Sohwefelsäurelösung in Ehtanol (Gelbfärbung) und mit Anisaldehyd (dunkle Flecken auf dem rosafarbenen Fluoreszenzuntergrund)· Die folgenden Farbreaktionen sind negativ: Ninhydrin, Dragendorf-Reagens, Ferriohlorid, Fehling-Re§gens, Tollens-Reagens· Die Komponenten des Komplexes (als freie Säuren oder Natriumsalze) sind löslioh in niederen Alkoholen (Methanol, Ethanol, n~Pro« panol, n-Butanol u. a»), Pentan, Heptan, Petrolether, Aceton, Chloroform, Tetraohlormethan, Dimethylformamid, Acetonitril, Dimethylsulfoxid, Methylethylketon, Ethylacetat, Benzen* Sie sind aber nioht in Wasser löslich. Die Komponenten des Komplexes zeigen nur Endabsorptionen bei W-Spektrophotometrie* Das IR-Spektrum zeigt folgende Absorptionsbandent 978 cm"" ,

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1020 ®i 1630 ©i 2930 ©ä

®iT¹ _s 1080 ©sT¹, 1100 ββΓ¹, 130© ®βΓ¹» 1410 esT¹, 1470 ©if¹» 1935 oaf¹, <I©mpoa©nt@ 3)_s 2390 eiT¹, 2860 em"*¹,

©äf*¹ ₉ 3%a© β·"¹·

Die Ch&riikterieiciru&ii &©r 4 Komponenten dee Antibiotika-&©üB« plexts A-110 erfolgt aittele MsnöchichtChromatographie auf als Sorptiöfösasittal« Bi® Aatifeiotika-Eampoaeistea werden B@@pii!ä@!i mit ?aEillin«-S©hwefeleämr@ oder durch Bioauto« mit äer f@@t-»EultHT Stap&yloeoseus anr@us 209 P oder B

BIe R_£«f@rt® der isoliertem Sabstaasen iß verechiedenen IM™

sind In fab· 1 angeführt· Als Standard

wurde das Foljetiieff-Aötibiotikuin Hikerioia

Bae antissikrobielle Spsktr^ia und die

isolierten Antibiotika-Xoaplezee A-110 vordem an m gif@mp@@itlir©Ki m,ä grannegatlvea Bakterien,

und Γ11ε.·οίΐ b@@tint (@i@h© f@b· S)* Einen Vergleich der

malen H@ttnko»%@ntratioE@ii ύοά Antital®tik@«»KoBiplex A-ItO mit mn~±ii w&ä Salinonjei» (Tab« 5) ergibt. Sau A-110 duroh

efea?skt®j?isitrt let* Bio in reiner Form ten Kompoas.stes de© Aatiblotika-Ioffifls3£©s m«e4ea mittels

identifiziert ^snd d®r Usitergfappe der aionoTaleatea

Das IoletolargaWiolit der £omp@neiiits Ä-110-1 ist 746» Bie rische Siiw@Eform@l ist "^Atfl^fi^ ^^Β· ^ste unterssheidet

von der loaponent® a in MnneoMohtobromatogramm nur durch ihre htthere Polarität (sieh© fab* 3). Bie völlig identischen Massenspektren ?sad ΙΕ-Spektren der !©»ponente A-110-1 und &±Άά ein B@w@ie dafür, dai ©ie Isomere aind«

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Komponente Α-1ΐΟ~2

Bas Molekulargewicht der Komponente A-110-2 beträgt 746, und die empirisohe Summenformel ist ^G4o^H67°11 ^{Na# Nacn iJirer} Elementarzusammensetzung und dem chromatographischen Verhallten ist sie mit dem 1951 isolierten Nigerioin (HARNED et al_#, Antibiot. Chemother« (Waschington) j[, 594; STEINRAUF et al», Bioohenu Biophys· Res« Gommun_e 21, 29, 1968) identisch»

Der Vergleich der Eigenschaften der Komponente A-110-2 mit dem Standard Nigerioin zeigt Unterschiede bei der Massenspebtroskopie· Diese Unterschiede bestehen in der bevorzugten Abspaltung eines Wassermoleküle von der Komponente A-110-2 (m/e 728)· Diese Daten zeigen, daß in den Molekülen der von uns isolierten Substanz keine Wasserstoffbrückenbindung zwischen der Karboxylgruppe und einer Hydroxylgruppe im endständigen Ring gebildet wird.

Dadurch werden Bedingungen für die Abspaltung des Wassermole— küls von Molekül-Ion und einiger Fragmente bei der Massenspektroskopie geschaffen. Die Ursache für das Auftreten dieser Eigenschaften bei der Komponente A-11iO~2 ist offensichtlich durch eine unterschiedliche sterisohe Anordnung einiger· Substituenten im Vergleich zum Nigericin bedingt»

Komponente

Das Molekulargewicht der Komponente A-11:0-3 ist 788 und die impirische Summenformel 0^69⁰12 ^Na* ^Die I^s"-^sP^elrbroskoP^ie zeigt die Anwesenheit einer Estergruppe mit der Absorptions« bande bei 1735 onf^« Bei der Massenspektrometrie wird eine Reihe von Ionen gewonnen, die der Grundstruktur nach der Komponente A-11.0-2 analog sind, aber jeweils 42 Massenein-

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heiten /TJRv-C-Ö/ höher liegen. Die Komponente A-110-3 ist also ein acetyliertes Derivat der Komponente A-110-2·

Komponente A-110-4

Das Molekulargewicht der Komponente A-110-4 ist 728 und die empirische Summenforme1 ^ολο^η65^Ο1Ο ^Na* Massenepektrometrisehe UnterBuchungen zeigen, daß die Komponente A-110-4 ein dehydratisiertes Derivat der Komponente A-110^2¹ ist j das bei der Biosynthese durch Abspaltung eines Wassermoleküls gebildet werden könnte. Die Komponente A-110-4 kann auch aus der Komponente A-110-2 durch Erhitzen auf 200 ⁰C im Vakuum gewonnen werden, aber nicht vom Nigericin· Die biologische Aktivität der Komponente A-110-4 ist niedriger als die der übrigen Komponenten des Komplexes.

Der zur Biosynthese des oben beschriebenen Polyether-Antibio« tika-Komplexes eingesetzte Actinomyoeten-Stamm ist in der bulgarischen Mikrobensammlung im Staatlichen Institut für Ar zneimitte Ikontrolle in Sofia unter der Nummer 110 hint erliegt· Dieser Stamm ist neu» Er wird auf Magermilchsubstrat lyophilisiert aufbewahrt. Um versportes Mycel zu erhalten ₃ wird auf Agarmedium SR-1 nach Krassilnikov und auf Maisagarmedium kultiviert»

Morphologische und physiologische Charakteristik der Kultur des Stammes Actomyoetes hygroscopicus 110«

Die morphologischen Besonderheiten des Stammes wurden auf verschiedenen synthetischen und organischen Agarnährböden <£>iets und Mathews, 1962, J. Appl. Microbiol. IjD, 258-263; Shirling und Gotlieb, 1960, J. Systemat· Baot. 1j6, 313-340) untersucht, von denen einige in Tabelle 3 dargestellt sind» Makroskopische Untersuchungen zeigten, daß auf den meisten von ihnen der Stamm der Größe nach verschiedene Kolonien (von 3 bis 10 mm Durchmesser) bildet. Charakteristisch für den Stamm ist seine morphologische Instabilität· Abhängig

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von den angewandten Nährböden bildet er 4 bis 6 natürliche morphologische Varianten, die sich nach der Farbe des Luftoder Substratmycels oder nach der Sporulation unterscheiden. Die mikroskopischen Untersuchungen zeigten, daß der Stamm Actinomycetes hygroscopicus 110 auf den meisten verwendeten Nährböden spiralenförmige Sporophoren (Typ S) bildet· Nach den elektronenmikroskopischen Untersuchungen sind die Sporophoren nicht segmentierte Sporenketten mit aufgerauhter, runzeliger Oberfläche. Nach 20 Tagen Kultivierung brechen die Spiralen auseinander und die Sporen bilden Anhäufungen, ähnlich einem offenen Sporangium· Infolgedessen wird die Oberfläche der Kolonien fast schwarz und hygroskopisch, ein besonders charakteristisches Merkmal für die Gruppe Hygroscopious· Auf den meisten Nährböden ist die Farbe des luftmycels grauviolett bis mausgrau oder lebhaft gefärbt bis beige braun und schwarz· Andererseits sind die Kolonien in den meisten Fällen gelb beige bis schmutzig braun· Die physiologischen und biochemischen Besonderheiten des Stammes sind in Tab· 4 dargestellt.

Die morphologischen, physiologischen und biochemischen Charakteristika des Stammes bilden den Grund, ihn in die Gruppe des Actinomycetes hygroscopicus einzuordnen, die von Waksman und Henriex 1948 (Bergey¹s Manual of Determinative Bacteriology, 8, Ed·, 1975) beschrieben wurde· Der Vergleich des Stammes Actinomycetes hygroscopicus 110 mit dem Typ des Stammes Streptomyces hygrosoopicus NELL 2387 zeigt offensichtliche Unterschiede hinsichtlich der Verwertung von L-Inositol und Raffinose und der Bildung von löslichem Pigment und Melaninen, (siehe Tab* 4) Der Stamm Actinomycetes hygroscopicus 110 ist nach Krassilnikov dem Stamm Actinomycetes polyetherinus (Krassilnikov, N, A·, "Lutschistye Gribki", Verlag Nauka, 1970) am ähnlichsten, aber er unterscheidet sich nach der Sporenoberfläche und Bildung von Melanin· Nach den gewonnenen Daten wird der Stamm als Actinomycetes hygroscopicus 110 klassifiziert«

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AusführungSbeispiel

1a) Das Sporenmaterial vom Stamm Actinomyces hygroscopicus wird in 1000 ml-Korben übertragen, die 400 ml Soja-Nährboden folgender Zusammensetzung in g/l enthalten:

Sojamehl 10

-Glukose 10

Natriumchlorid 5 Kalziumkarbonat 2 Leitungswasser ad 11

pH-Wert nach der Sterilisation 6,8 bis 7,0/Regulierung mit 10 <& Katronlauge

Die Kultivierung wird 48 bis 60 h im Schüttelapparat mit 200 bis 220 U/m bei 26 bis 32 ⁰G durchgeführt. Von dem Inokulat werden 5 bis 7 # auf das Fermentationsmedium folgender Zusammensetzung (g/l) übertragen:

Sojamehl	25
Glukose	30
NaOl	5
CaCO3	1
EIi2PO4 MnCl0 . 4H 0 1 2 Pe2(SO4)3	0,1 0,6 0,3
Sojaöl	5
dest. Wasser ad	1 1

Die Kultivierung wird in Fermentoren 120 bis 160 h bei 26 bis 32 ⁰C durchgeführt, bei einer Rührgeschwindigkeit von ,160 bis 350 U/m und Belüftung von 1 Volumen Luft auf 1 Volumen Nährboden pro Minute·

Die Aktivität der Kulturflüssigkeit wird periodisch nach der Agardiffusionsmethode gegen die Test-Kulturen Bacillus subtilis L~2 und G. albicans 562 geprüft. Nach Erreichen des Maximums der Konsentration der antibiotischen Substanz in der Kulturflüssigkeit wird die Fermentation abgebrochen

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und der .pH-Wert auf 2,0 bis 3,0 mit 1 η HGl eingestellt» Das angesäuerte Medium wird filtriert oder zentrifugiert» Die Mycelmasse wird gesammelt; vereinigt und zweimal mit Dimethylformamid im Volumen-Verhältnis 1 : 3 extrahiert*

b) Die Fermentation, Ansäuerung und Extraktion des Antibiotika-Komplexes wird wie in a durchgeführt· Der Dimethylformamidextrakt wird mit Wasser im Verhältnis 1 : 3 V/V verdünnt und dreimal mit Chloroform reextrahiert· Die vereinigten Chloroformextrakte werden mit dem gleichen Volumen 0,1 η NaOH geschüttelt und mit Wasser bis zur neutralen Reaktion gegen Phenolphthalein gewaschen. Nach dem Waschen wird der Extrakt mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter Vakuum bei 35 bis 50 ⁰C bis zur Gewinnung eines gelben Öls· verdampft«

o)Das nach a und b gewonnene gelbe Öl wird in einem kleinen Volumen Chloroform gelöst und mit Kieselgur bis zur Gewinnung einer trockenen homogenen Masse behandelt. Diese wird in eine chromatographische Säule übertragen, die mit Magnesiumoxid gefüllt ist· Der Antibiotika-Komplex A-110 wird von der Säule mit Petrolether eluiert. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und unter Vakuum bei 35 bis 50 ⁰C konzentriert, wobei der rohe Antibiotika-Komplex als Natriumsalz erhalten wird«

d)Die getrockneten Rohprodukte, die nach Stufe c gewonnen werden, gibt man in einem kleinen Volumen Chloroform gelöst auf eine mit Magnesiumtrisilicat (150 - 250^n m) gefüllte Säule. Die Komponenten des antibakteriellen Polyether-Komplexes werden an der Säule mittels Elution mit Chloroform-Aceton-Gemischen bei stufenweiser Erhöhung der Acetonkonzentration getrennt. Die Polyether-Antibiotika werden unter dieser Bedingung bei einer Konzentration des Acetons im Chloroform von 40 bis 70 # in der Reihenfolge Komponente A-110-1, A-110-2, A-110-3, A-110-4 getrennt. Dia getrennten» gereinigten Suh.gtan.gen. werden aus Petrolether umkristallisiert·

Schema 1

Schema für die Isolierung, Reinigung und Trennung des Antibiotika-Komplexes aus dem Stamm Actinomycetes hygroscopicus 110

Kulturmedium

Ansäuern auf pH 2,0 bis 3,0 und Zentrifugation

r~

Sediment Extraktion mit Dimethylformamid und Zentrifugation

Difo-Extrakt

Verdünnung mit Wasser und Extraktion mit CHCl.

Wasser-Phase Filtration

Sediment (antifungales Hexaen-Antibiotikum)

Supernätante

CHC1₃-Extrakt

(Polyether-Antibiotika μnd Azalomycin B) Behandlung mit 0,1 η NaOH, Waschen mit Wasser und Trocknen mit NapSO^

CHC1₃-Extrakt

(Na-Salze der Polyether-Antibiotika und Azalomycin B

Säulenchromatographie an Magnesiumoxid

ElAate mit

Petrolether

(Na-Salze der Polyether-Antibiotika)

Säulenchromatographie an Magnesiumtrisilioa-t

Eluate mit CHCl₃ (rohes Azalomycin B)

A-110-1 Α-Ι1Ό-2 A-110-3 A-110-4

iX.

23 7 72 7

Tabelle 1

R_f-Werte der isolierten Polyether-Äntibiotika Sorptionsschieht: Kieselgel

Lösungsmittel«	A-110-1	Rf-W.ert	0,72	A-110-4	Nigeri- cin
3ystem	0,43	A-iiO-2 A-110-3	0,38	0,85	0,60
petrolether-Chloro- form-Methanol = 10:10:2	0,17	0,60	0,52	0,52	0,26
Heptan-Chloroform- piethanol « 20:10:1	0,23	0,26	0,48	0,59	0,42
Ethylacetat	0,08	0,42		0,55	0,34
Ethylacetat-Chloro- form =6:4	0,34

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Tabelle 2

Antiraikrobielles Spektrum des Antibiotika-Komplexes A-110,

isoliert aus dem Stamm Actinomyces hygroscopicus 110

Test-Organismus	MHK (,u g/ral)	24 h	\ 48 h	72 h
1· Staphylococcus aureus 2O9P 2. Bacillus subtilis L-2 3. Bacillus subtilis 7241 (ATCC-6633) k· Bacillus mesentericus ?. Bacillus mycoides 6# Bacillus mycoides B-2 7«, Bacillus pseudoanthracis 3» Bacillus idosus ?· Micrococcus luteus 9341 (früher Sarcina lutea 9341) 10. Escherichia coli 11· Serratia marcescens 12» Proteus vulgaris 13· Streptococcus faecalis 14. Candida parapsilosis 15. Candida albicans 562 16· Saccharomyces cerevisiae 17· Torula utilis 18, Penicillium chrysogenum 19. Alternaria tenius 2Q. Botrytis cinerea 21· Pusarium lini 22. Pusarium oxysporum 23. Pullularia pullulans	0,50 0,25 100 0,25 1,00 0,50 0,50 0,50 120 60 120 15,0 15,0 30,0 fm	0,50 0,25 100 0,25 1,00 0,50 0,50 0,50 2,00 120 60 120 1,00 15,0 15,0 15,0 30,0 60,0 «9 MH	mm mm mm 752 , — ! mm> ! 752 752 752 100

Tabelle 3

Morphologische und physiologische Eigenschaften der Kultur des Stammes Actinomyeeö hygrosoo— picus 110

Medium	Wachstum	Luftmyeel	Substratmycel	lösliches	Sporophoren
				Pigment
SR-1 (CP-1)	gut	a2""a4* dunkelgrau bis	ko—d-,, schmutzig	nicht	kompakte Spi
		mausgrau	braun		ralen
Wr. 6 Mais	gut	a3""a2» gJrauvlolett	n«-k«, bräunlich	nicht	η
nährboden		bis dunkelgrau	bis beige
Nr. 2 ISP	gut	a2~"a3> dunkelßrau bis	b £, s chmut zigbraun	nicht	η
		grauviolett
Wr. 3 ISP	gut	a?~a~» dunkelgrau bis	e„, grünlichgrau	nicht	lange kompakte
		grauviolett und ver			Spiralen
		einzelt ac> blaß grau
		violett
Nr. 4 ISP	gut	a2"*a3> dunkelg^au ^is	w«, gelbgrau	nicht	Spiralen
		grauviolett, bunt
Nr, 5 ISP	gut	a2"*a3* t)un'^ ^111^ ^a~	b. ~b c, schmut zig	nicht	kompakte Spiralen
		zwischen 1?, beige	gelbbraun

ro oo -ο

Fortsetzung Tabelle 3

Medium	Wachstum	Luftmycel	"Substratmycel	lösliches Pigment	Sporophoren
Sr. 7 ISP	gut	a3"*a4> dazwischen l„f	krjt schmutzig.	braunes	Spiralen
		grauviolett und dazwi	braun	Pigment
		schen beigefarbene
		Kolonien
Bennet	gut	bunt, überwiegend a« und	b^, blaß schmu	nicht	Il
		dazwischen I7	tzig braun
Öapeck mit	gut	a4~*a5 unc* dazwischen	b7> rötlichgrau	nicht	Il
Saccharose		helle Kolonien	bis graubraun
Maltose-Trip	gut	Po} schmutzig braun	Zg, dunkel	nicht	Il
ton		schwarz } dazwischen	gelbbraun
		I7, beige
L—Tyrosin	schwach	a,-, sehr hell grau	-	kupferbrau	η
		violett		nes Pigment
Casein-Stärke	gut	a2~a3> dunkelerau,	W4, grau	nicht	Il
		gräulich violett

Die Parbe des luft- und Substratmycels wurden nach A.C. Bondarzev (Farbskala, Verlag der Akademie der V?issenschaften der UdSSR, Moskau, 1954) bestimmte

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Tabelle 4

Vergleich des Stammes Actinomyces hygroscopicus 110 mit Streptomyces hygroscopicus NRRL 2387 und Actinomyces

polyetherinus

Test

Actinomyces

hygroscopicua

110 Streptomyces hygroscopicus NRRL 2387

Actinomyces , polyetherinus

1

2

3

4

5

6

7

8.

D-Glucose +

L-Arabinose +

Saccharose +

D-Xylose +

L-Inosit +

D-Mannit +

D-Pructose +

Ramnose +

Raffinose + Salicin

D-Galaotose + Melanin-Produktion schwach +

Lösliches Pigment «

Gelatineverflüssigung +

Stärkehydrolyse +

Nitratreduktion —

gelb

Peptonisierung vo=n Milch

Antibiotika-Produktion

19. Sporophoren

20. Oberfläche der Sporophoren

Polyether-Antibiot. Hexaen-Antib. Azalomycin B

Spiralen nicht segmentiert

aufgerauht, runzlig Spiralen nicht segmentiert

aufgerauht, runzlig

Polyetherin

Spiralen glatt

237727 k

Tabelle 5

Vergleichende Daten für minimale Hemmkonzentration (ΒΟΙΕ:) des Antibiotika-Komplexes A-110 mit Monensin und Salinomyoin im Agar-Diffusuonsplattentest

Testkultur	MHK (	rUg/ml)	Salinomy cin
.. ..	A-110	Monensin	12,5
Staphylococcus aureus 209 P	1,0	15,0	10,0
Baoillus subtilis ATCC	0,5	7,0	7,0
Bacillus subtilis L-2	0,5	2,0	10,0
ffiaoillus myooides "*")	1,0	17,0	15,0
Saroina citrina +)	1,5	17,0	100,0
Eaoherichia ooli BTCC 0111	100,0	100,0	50,0
Candida albicans 562	50,0	50,0	50,0
Saocharomyces cerevisiae +)	50,0	50,0	50,0
PenieiIlium chrysogenum j	50,0	50,0	50,0
Alternaria tennis +)	50,0	50,0	50,0
Botrytis oinerea +)	50,0	50,0	50,0
Puaarium lini *)	50,0	50,0

⁺) Diese Stämme wurden aus der Bulgarian Type Culture Collection (BTCC) ohne Nummer entnommen·

Claims (4)

Erfindungsanspruch

1. Verfahren zur Herstellung eines Antibiotika^-Komplexes auf mikrobiologischem Wege, gekennzeichnet dadurch, daß der Mikroorganismus Actinomycetes hygroscopicus, Stamm 110, unter aeroben Bedingungen in Nährmedien, die Kohlenstoff« und Stickstoff quellen sowie Mineralsalze enthalten, bei einer Temperatur von 26 bis 32 ⁰G während eines Zeitraumes von 5 bis 7 Tagen kultiviert wird und der dabei gebildete Polyether-Antibiotika-Komplex A-110 anschließend nach an sich bekannten Verfahren extrahiert, konzentriert und durch Chromatographie gereinigt sowie gegebenenfalls durch weitere Chromatographie in die einzelnen Komponenten A-110-1, A-110-2, A-110-3 und A-110-4 getrennt wird»

2· Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der Antibiotika-Komplex A-110 mit dem Feuchtmycel aus der Kulturlösung, nach Ansäuern mit anorganischen Säuren auf pH 2,0 bis 3,0 durch Zentrifugieren oder Filtrieren abgetrennt wird_e

3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß der Antibiotika-Komplex A-110 nach Extraktion aus dem Mycel mit organischen Lösungsmitteln durch Zusatz von Alkalilaugen in das Alkalisalz überführt wird,

4. Verfahren nach Punkt 1, 2 und 3, gekennzeichnet dadurch, daß durch Chromatographie an Magnesiumtrisilicat und Verwendung von Ghloroform-Aceton-Gemischen mit steigender Konzentration von Aceton als Elutionsmittel der Antibiotika-Komplex A-110 in seine Komponenten A-110-1, A-110-2, A-110-3 und A-110-4 getrennt wird«.