DD156082A5 - Verfahren zur herstellung von aktivem chondroitinsulfat - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von aktivem Chondroitinsulfat A und C oder eines Gemisches davon. Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines verbesserten Verfahrens zur Herstellung von biologisch und physiologisch "aktivem" Chondroitinsulfat in pharmazeutischer Qualitaet und guter Ausbeute. Erfindungsgemaess wird aus einem Ausgangsmaterial, beispielsweise Rindertracheoknorpel oder Fischgewebe eine waessrige Loesung hergestellt. Dieser Loesung wird ein Komplexbildner, beispielsweise ein quaternaeres Ammoniumsalz, zugesetzt zur Bildung eines Praezipitats, bei dem es sich um einen wasserunloeslichen Komplex des aktiven Materials und des Komplexbildners handelt, und der Komplex zur Rueckgewinnung des "aktiven" Materials in pharmazeutischer Qualitaet aufgespalten.

Description

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Verfahren zur_r Herstellung von aktivern Chondroitinsulfat^

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von aktivem Chondroitinsulfat A oder aktivem Chondroitinsulfat C oder eines Gemisches davon*

Die erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen werden angewandt als Arzneimittel, beispielsweise zur Anregung der Kollateralzirkulation in Herbereichen_s die durch die Zweige der Koronararterien versorgt v/erden zur Einschränkung von Herzzuständen, wie Herzinfarkten, akuter Koronarinsuffizienz mit akuter Myocardischämie»

Die vorliegende Erfindung ist eine Teilweiterbehandlung der Patentanmeldung mit dem Anmeldeaktenzeichen Nr« 82*045, eingereicht am 5» Oktober 1979·

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Wie in der US-Nr. 3«895»106 und der US-PS Ur. 3*895.107 beschrieben wird, gibt es eine Behandlungsmethode für die Inhibition der Entwicklung arteriosklerotischer Erkrankungen bei zu den Säugetierspezies gehörenden Tieren, bei der die Kollateralzirkulation in Herzbereichen, die durch die Zweige der Koronararterien versorgt werden, angeregt wird und das Auftreten von Herzzuständen wie Herzinfarkten, akuter Koronarinsuffizienz mit akuter Myocardischamie bei Menschen mit ischämischen Herzkrankheiten eingeschränkt wird, die in der im wesentlichen regelmäßigen und länger andauernden oralen Verabreichung einer wirksamen Menge von biologisch und physiologisch "aktiven" Chondoitinsulfat A, "aktiven" Chondroitinsulfat C oder Gemischen davon an Säugetiere besteht, wobei die Aktivität dadurch manifestiert wird, daß die

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Plasma-Thrombus-Bildungszeit 6 bis 12 Stunden nach der Verabreichung bei Kaninchen um mindestens 80 % verlängert wird, wie in der Chandler-Schleifen~Methode beschrieben wird*

Aus einer vor kurzem abgeschlossenen Untersuchung, bei der orales Chondroitinsulfat mit dem Placebo-Effekt bei der Verhinderung von nachoperativer Tiefvenenthrombose verglichen wurde, wurde geschlußfolgert, daß orales CSA das Auftreten von nachoperativer DVT verringert, wie durch den Test mit radioaktivem Fibrinogen bei allgemein-chirurgischen Patienten und gynäkologischen Patienten nachgewiesen wurde« Außerdem hat die Untersuchung ergeben, daß durch die Verabreichung des Medikaments keine Komplikationen auftrateno

Nach bekannten Verfahren wird das "aktive" CSA und CSC durch Digerieren und Solubilisieren des gemahlenen und entfetteten Ausgangsmaterials wie Rindertrachea und Haifischknorpel gewonnen, indem es längere Zeit der Einwirkung von durch Cysteinhydrochlorid und Dinatriumversenat aktiviertem Papain ausgesetzt wurde» Zu der Lösung, die verschiedenes fremdes Material zusammen mit dem verlangten "aktiven" CSA und/oder CSC enthält, werden anschließend zwei Volumen · Aceton gegeben, wonach das erwünschte CSA und/oder CSC ausgefällt wird«

Diese beschriebene Verfahrensweise hat in der Praxis manchen Nachteil. Die Ausfällung erfolgt nicht vollständig, wenn nicht große Mengen Aceton verwendet werden» Die Verwendung großer Acetonmengen ist unzweckmäßig, gefährlich und aufwendig, und selbst im günstigsten Falle wird zumindest ein Teil des erwünschten aktiven CSA und/oder CSC

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nicht ausgefällt und geht verloren· Der Verlust ist umso größer, je mehr das relative Volumen des Acetons zum leichteren Umgang damit verringert wird·

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines verbesserten Verfahrens zur Herstellung von biologisch und- physiologisch aktivem Chondroitinsulfat in pharmazeutischer Qualität und guter Ausbeute.

Darlegung des .Wesens der Erfindung

Der'Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, geeignete Komplexbildner für die Abtrennung von Chondroitinsulfat aufzufinden«

Erfindungsgemäß werden durch Komplexbildner wie quaternäre Ammoniumverbindungen selektiv wasserunlösliche Komplexe mit "aktivem" CSA und CSC gebildet* Sie bewirken eine im wesentlichen quantitative Ausfällung des CSA und CSC, wobei gleichzeitig alle anderen unerwünschten Stoffe in der Lösung zurückbleiben.

Mit den erfindungsgemäßen Komplexbildnern werden die Schwierigkeiten und Probleme, die sich durch die Verwendung von Aceton ergeben, ausgeschaltet.

Gemäß der Erfindung ist es nicht mehr erforderlich; große Volumina von Aceton und ähnlichen Stoffen einzusetzen« Darüberhinaus ist es ziemlich überraschen, daß sich diese Komplexe bilden und daß sie sich selektiv mit dem "aktiven" CSA und/oder CSC bilden. Wenn es auch nicht durch eine Theorie belegt ist, wird angenommen, daß die Komplexbildner und

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das "aktive" CSA und/oder CSC entgegengesetzt geladen sind und daher gegenseitig angezogen werden, so daß sie eine solche Art der Bindung bilden. Auf jeden Fall ist die Wirkung der Bindung die, daß eine vollständige Ausfällung erzielt wird. Die Bindung kann anschließend leicht durch eine Base wie Natriumhydroxid und/oder hypertonische Kochsalzlösung aufgespalten werden, um das freie "aktive" CSA und/ oder CSC zu erhalten. Es wird angenommen, daß diese verbesserte Methode einen wichtigen Fortschritt bei der Herstellung dieses wichtigen Medikamentes bedeutet.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist für "aktives" CSA und/ oder CSC aus allen üblichen Quellen anwendbar wie Rinderträchea, Wal- und Haifischtrachea, Schweinetrachea und natürlich Säugetiergewebe ganz allgemeine Die erste Behänd-

lung des von Tier oder Fisbh stammenden Rohmaterials, wie es durch Lagerhäuser geliefert wird, besteht im Abschneiden des Fettes und im Zerschneiden oder Zermahlen der Tracheaoder anderen Gewebe«

Das fein zerteilte Ausgangsmaterial wird anschließend unter Verwendung von Pepsin, Papain oder anderer proteolitischer Enzyme zur Entfernung der Eiweißstoffe digeriert. Gleichzeitig oder nacheinander kann die Eiweißentfernung und die Solubilisierung des CSA und CSC mit Hilfe einer starken Base wie Natriumhydroxid und Kaliumhydroxid vorgenommen werden. Starke Salzsäure ist für diesen Zweck auch gut geeignet.

Auf jeden Fall wird: eine ^äßrige lösung von CSA und/oder CSC gewonnen. Diese Lösung enthält viele andere unerwünschte, und in einigen Fällen nachteilige Bestandteile, die aus dem chemischen Aufschluß des. Ausgangsmaterials stammen, und es

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ist eine Hauptaufgabe der Erfindung, das "aktive" CSA und/ oder CSC von diesen unerwünschten oder schädlichen Stoffen zu trennen und zu entfernen«

Erfindungsgemäß wird ein neuartiger und einmaliger unlöslicher Komplex von CSA und/oder CSC und Komplexbildnern aus wäßrigen Lösungen gebildet. Als Komplexbildner dienen beispielsweise Cetylpyridinimchlorid oder n~Alkyldimethylbenzylammoniumehlorid mit der Formel:

CH.

CH,

worin die Alky!gruppe vorwiegend

-Q

ist. Solche

Stoffe stehen unter der Bezeichnung "Marqual" zur Verfügung.

Ein anderer und gleich nützlicher Komplexbildner für "aktives" CSA und/oder CSC sind verschiedene Anionenaustauscherharze wie "Dowex 1-X". Diese Stoffe werden näher in der US-PS Nr. 2*591.573 und US-PS Nr* 2.591«574 beschrieben. Im allgemeinen sind diese Harze vernetzte Benzol-Divinylbenzol-Kopolymere, die niedere Alkyl-quaternäre Amingruppen enthalten*

Nach der Ausfällung und der Sammlung des Komplexes kann dieser aufgespalten oder zerbrochen werden, indem er mit einer milden Base und/oder hypertonischer Kochsalzlösung in Kon-

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takt gebracht wird und das freigesetzte "aktive" CSA und/ oder OSC gewonnen wird« Dieses Material ist direkt in einer Kapsel, Tablette usw. für die orale Verabreichung an Menschen zu gebrauchen, vor allem als Antithrombosemittel. Die Dosismengen entsprechen den in den oben genannten Patenten angeführten» Wenn das Medikament in parenteraler Form verabreicht werden soll, kann das freigesetzte "aktive" CSA und CSC weiter mit Oxydierungsmitteln wie Kaliumpermanganat behandelt werden, um alle Spuren schädlicher oxydierbarer Komponenten auszuschließen.

Ausführungebeispiel

Das folgende Beispiel dient zur Erläuterung und soll in keiner Weise eine Einschränkung darstellen* In den Beispielen werden Teile und Prozentsätze auf das Gewicht bezogen angegeben, wenn nichts anderes gesagt wird·

4,5 kg (100 Pounds) vorbereitete Rindertrachea wurde zu 25j4 mm (1 Zoll ) Stücken zerschnitten und zu etwa 190 1 (50 Gallonen) entionisiertem Wasser in einem Behälter gegeben« Der pH-Wert wurde durch die Zugabe von annähernd 400 ml Eisessig auf etwa 4»5 eingestellt. Die resultierende Suspension wurde gerührt, wobei die Temperatur des Behälterinhalts auf etwa 50 ⁰C erhöht wurde. 567 g (1 .1/4 Pounds) Pepsin wurden zugesetzt, und das Rühren wurde 30 Minuten lang fortgesetzt. In den Behälter wurden weitere 190 1 (50 Galionen) entionisiertes Wasser' geleitet, und das schwache Rühren wurde 12 Stunden lang bei 50 ⁰C fortgesetzt, bis der Tracheaknorpel von Bindegewebe befreit war. Die Temperatur der Suspension wurde danach auf 80 ⁰C erhöht, und auf

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der Oberseite der Flüssigkeit bildete sich eine Fettschicht. Die Digerierflüssigkeit wurde durch eine Trommelzentrifuge abgezogen und verworfen*

Die zurückbleibenden Peststoffe wurden zweimal mit 190 1 (50 Gallonen) heißem Wasser (60 bis 80 ⁰C) gewaschen. Es wurde eine Natriumhydroxidlösung zubereitet, indem 680 g (1,5 lbs) NaOH zu 19 1 (5 Gallonen) entionisiertem Wasser' in einem Behälter gegeben wurden. Die zweimal gewaschenen Peststoffe wurden in die Natriumhydroxidlösung gelegt, und das Volumen wurde mit entionisiertem Wasser auf 45 1 (12 Gallonen) eingestellt und der pH-Wert auf 9 bis 10» Der Behälterinhait wurde 12 Stunden lang bei 37 ⁰C gerührt« Der pH-Wert wurde anschließend mit Hilfe von Eisessig auf 6,5 eingestellt» Die Flüssigkeit wurde bis zum Sieden erhitzt und anschließend zum Abkühlen stehen gelassen. Die Flüssigkeit wurde durch eine Trommelzentrifuge filtriert und das Piltrat gesammelt und aufbewahrt. Dem Filtrat wurden 680 g (1,5 Pounds) Cetylpyridiniumchlorid zugesetzt, worauf eine Rührzeit von 30 Minuten folgte. Die Flüssigkeit wurde 16 Stunden lang stehen gelassen. Es bildete sich ein Präzipitat. Das Obenstehende wurde dekantiert und das Präzipitat durch kontinuierliches Zentrifugieren in einer Sharples-Zentrifuge gesammelt. Das gesammelte Präzipitat befand sich in 19 1 (5 Gallonen) 0,5N Natriumhydroxid. 38 1 (10 Gallonen) Methanolwurden zugesetzt, und es folgte eine Abstehzeit bei Raumtemperatur von"12 Stunden« Das gebildete Präzipitat wurde wieder durch kontinuierliches Zentrifugieren gesammelt und mit 19 1 (5 Gallonen) Methanol gewaschen» Das Präzipitat wurde in 7»5 1 (2 Gallonen) destilliertem Wasser gelöst, der pH-Wert mit Eisessig auf 7 _f0 eingestellt, und 113 g (1/4 Pound) Natriumchlorid wurde zugesetzt, worauf gerührt wurde. Es wurden 15 1 (4 GaI-

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Ionen) Methanol zugegeben und es wurde 15 Minuten lang gerührt» Nach einer Abstehzeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur hatte sich ein Präzipitat gebildet, das durch Zentrifugieren gesammelt wurde. Das Präzipitat wurde unter Vakuum getrocknet» Die Analyse ergab, daß das Präzipitat im wesentlichen CSA war. Das Material bestätigte eine Verlängerung der Plasmathrombusbildungszeit 6 bis 12 Stunden nach der Verabreichung an Kaninchen, wie von der Chandler-Schleifenmethode beschrieben wird, von über 80 %,

Vom elften Behändlungstage an wurden für eine anschließende Dauer von 13 Wochen vier Tabletten pro Tag in vier gleichen Dosen verabreicht«.

Die Behandlungsdauer betrug 14 Wochen, wobei die Patienten aller 2 Wochen während der ersten sechs Wochen und anschließend monatlich während der versuchsweisen Behandlungsperiode beurteilt wurden. Vor der Behandlungsperiode wurden jedoch Beurteilungen nach folgendem Schema vorgenommen:

Die erste Beurteilung vor der Behandlung erfolgte sechs Wochen vor Einleitung der Behandlungsperiode, und die Patienten wurden weiter in Abständen von zwei Wochen in dem-Zeitraum vor dem Beginn der Behandlungsphase beurteilt.

Bei allen Beurteilungen wurde der allgemeine Zustand des Patienten notiert. Die klinische Schwere der Claudicatio und der Zustand der Haut wurden als schwach, mäßig oder schlecht eingestuft. Die individuelle maximale Wegstrecke jedes Patienten wurde genau in Metern festgehalten und irgendwelche dabei auftretenden Symptome wurden notiert.

Bei jeder Beurteilung wurden die folgenden weiteren klinischen und Labormessungen νorgenommens

1. Segmentales Plethysomogramm einer oder' beider Unterschenkel,

2. Mikromanomeirische Messung den Arterienblutdruckes des Fußes,

3. Zeitpunkt für das Einsetzen von Wadenschmerzen bei der normalen Gehgeschwindigkeit,

4« Folgende subjektive Messungen der klinischen Reaktion:

Anzahl der Anfälle von Wadenschmerzen beim Gehen während des der Beurteilungsvisite vorausgehenden Tages.

Stärke der Wadenschmerzen, gemessen auf einer visuellen analogen Skala.

Anzahl der Perioden mit Wadenschmerzen bei Ruhe in der der Beurteilungsvisite vorausgehenden Woche.

Beurteilung der Veränderung auf der Basis einer visuelle-n analogen Skala.

Art und Häufigkeit von dabei auftretenden Nebenwirkungen.

Bei dem folgenden Versuch wiesen alle Versuchspersonen klinisch erwiesene Okklusive Perlveskulitis der Arterien in Verbindung mit zeitweiser Glaudicatio und Anzeichen von beeinträchtigtem Arterienblutstrom zu einem oder beiden Unterschenkeln. Bei allen Versuchspersonen war der klinische Status und der Krankheitsverlauf während der vorausgehenden sechs Monate verhältnismäßig konstant geblieben. In den voraufgehenden sechs Monaten hatte keiner der Patienten eine Antikoagulptia» oder thrombolytische Therapie erhalten. Außerdem hatten Personen, die Vasodilator—Medikamente einnahmen, diese auch in den vorausgehenden sechs bis acht Monaten in einer konstanten Menge erhalten.

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Personen mit anderen Symptomen, die ihre Aktivität einschränkten, wie Herzleiden, wurden ausgeschlossen, gleichfalls Personen mit Diabetes Mellitus und Personen, bei denen gefäß-chirurgische Eingriffe an der Abdominal»Aorta$ den Iliacus-Arterien, oberflächlichen und tiefliegenden Femoralarterien und den Terminalzweigen derselben in den Unterschenkeln vorgenommen worden viaren.

Es wurde eine vorausgehende Ermittlung der folgenden klinischen Daten vorgenommen; Alter, Gewicht, Gr'o'ße, Rauchgewohnheiten, Vorhandensein von Krampfadervenen, Stärke von Wadenschmerzen in Ruhe und nach dem Gehen. Die Patienten wurden nach Alter, Geschlecht und Zigaretten-Rauchstatus eingeteilt und willkürlich einer Kontrollgruppe (Placebo) oder einer aktiven Behandlungsgruppe zugeteilt (das "aktive" CSA wurde nach dem vorstehenden Beispiel hergestellt).

Die aktive Testsubstanz lag in Form von Tabletten vor, die 500 mg "aktives" CSA enthielten» Placebo-Tabletten waren in Form, Farbe und Konsistenz den aktiven Tabletten gleich, lach öer Einteilung wurden die Patienten willkürlich für die Verabreichung entweder der aktiven Substanz oder der Placebo ausgewählt, wobei folgende Reihenfolge eingehalten wurde?

In den ersten fünf Behandlungstagen: 12 Tabletten täglich in vier gleichen Dosen zu je drei Tabletten.

Vom sechsten bis zum zehnten Behändlungstag: acht Tabletten täglich in vier gleichen Dosen zu je zwei Tabletten.

5. Laboruntersuchungen:

(a) Hämatologie: Hämoglobinkonzentration, PCV, MCHC, WBC-Zählung und Differenzzählung, Blutplättchenzählung, Retikulozytenzählung, und ESR.

(b) Plasmabindungsspiegel von Fibrinogen.

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(c) Serumbindungsspiegel von Cholesterin, Liproproteinen und Triglyceriden.

(d) Blutkoagulationsmechanismus; Plasmathrorobingerinnungszeit, Euglobulin-LyeiQZieit und Blutplättchen^Aggregationszeit.

41 Patienten waren an der Untersuchung beteiligt, das sind zweiundzvuanzig in der Gruppe mit aktivem CSA und neunzehn in der Kontroll-Placebo-Gruppe.

Alle Patienten'wiesen bilaterale Erkrankung auf.

Die bei dem Versuch ermittelten klinischen, Labor- und Koagulationswerte der 41 Patienten sind in Tabelle I enthalten«

Tabelle 1j Klinische and Laborwerte von zwei Patientengruppen nach den Versuchen: Mittelwerte - S.Ξ.Μ.

Anzahl der Fälle Alter (Jahre) Zigarettenraucher {% der Gruppe) % Übergewicht zur Größe Wegstrecke (Meter) Wadenschmerzen bei Ruhe (Häufigkeit je Woche)

Wadenschmerzen (visuell analog/mms) 45,6 - 4,5

Fibrinogen (g/l) Plasmathrombin-Gerinnungszeit {% normal) Buglobulin-Lysiszeit (min) Blutplättchen-Aggregationszeit (s) Cephalinzeit (s) Cholesterin (mg/dl) "S"«Partikel (mg/dl) Maximaler Wadenblutstrom (ml/100 ml Gewebe/Minute)

Der Unterschied zwischen den Gruppen ist bei der 0,05-Menge nicht signifikant.

"CSA" Gruppe	Placebo-	61	19	0,94
	Gruppe		ί	,7
22			73S	,8
62 ± 1,09	55,9	36,	4,7
77,3	11,4	±	2,0
31,8	50,1	±	5,7
55,4 ± 3,9	3,37	«α*	0,13
11,8 ~ 1,9	103	1	1,88
45,6 ± 4,5	330	t	4,24
3,49 ~ 0,16	641	i	4,2
101 ± 1,52	41,3		0,41
327 ± 5,23	297,;		3,48
639 ± 3,2	539,'	3 i	5,6
40,1 ±0,34	19,4		1,8
295,1 - 2,8	±
535,7 ± 6,1
20,8 ± 1,91

Die beiden Gruppen ν;aren hinsichtlich der Verteilung dee Alters, der Gescülechtszugehb'rigkeit, Zigaretten-Rauchgevjohnheiten und ihrer Bewertung in bezug auf subjektive und objektive Messungen der klinischen Reaktion vergleichbar.

Die Verbesserung der von jeder der Gruppen zurückgelegten V/egstrecke ist in Tabelle 2 aufgeführte

Tabelle 2s Verbesserung der Wegstrecke

Therapie: Anzahl der Wegstrecke In Metern (Mittel * SEM);

Patienten:

Vorversuch Woche: 0 Woche: 2 Woche; 4 Woches 6 Woche; 10 Woche;14

^IfCSA"

22 55,4*3,9 52,6*4,1 53,1*3*8 78,0*5,7^ 81, 2*4,9³ⁱ 86_?7*5_f1² 89,3*6, 2^ä

Placebo 19 55,9*4,7 53,8-4,3 54,5*4,9 49,3*4,5^ 49,6±5₉O^S 50,3*4,9 48,7*5,1

Bedeutende Verbesserung bei "CSA"-Gruppen; t_in(J = 3,98; P < 0,01

Anzahl der Patienten mit verbesserter Wegstrecke

Therapie; Gesamt-

fälle: Woche? 0 Woche: 2 Woche: 4 Woche: β Woche: 10 Y/oche: 14

"CSA" 22 2 (9,1 %) 6 (27,3 %) 11 (50,0 %) 14 (63,6 %) 15 (68,2 %) 14 (63,6 %) Placebo 19 2 (10,5 ^) 3 (15,8 %) 2 (10,5 %) 4 (21,1 #) 3 (15,8 %) 4 (21,1 9δ)

&Z& &J35»

- H

In der vierten Behändlungs vjοehe zeigte sich eine signifikante Verbesserung der Y/egstrecke bei der Gruppe, die Chondroitinnatriumsulfat bekommen hatte (t. -, = 3,98$ P< 0,01). Diese Verbesserung blieb auch in den folgenden zehn Wochen des Versuchs erhalten. Bei der Placebo verabreichten Gruppe war keine signifikante Verbesserung der Y/egstrecke festzustellen.

In Tabelle 2 ist auch die .Anzahl der Patienten angegeben, bei denen eine Verbesserung der Wegstrecke zu verzeichnen war. 3ine willkürliche Definition wäre; Sin nichtgebesserter Patient zeigte keine Verlängerung der Wegstrecke oder eine minimale Verbesserung (z.B. eine anfängliche Claudicatio-Strecke von 50 m wurde auf 65 ra erhöht)« "Gebesserte" Patienten zeigten eine erhebliche Verlängerung der Y/egstrecke (z.B. 50 m anfangs waren auf 80 ... 90 Meter verlängert). Aus den in Tabelle 2 wiedergegebenen Werten ist zu entnehmen, daß die "gebesserten Patienten" eine mittelbare Verlängerung der Wegstrecke in der vierten, sechsten und zehnten V/o ehe der- Behandlungsperiode zeigten, was auf eine progressive Verbesserung hindeutet.

In Tabelle 3 werden die Veränderungen im Blutkreislauf (maximale Wadenstrom-Reaktion) dieser beiden Patientengruppen gezeigt.

Tabelle 3% Veränderungen des Blutstromes (maximale Waden-Blutstrom-Reaktion) bei den beiden Patientengruppen

Max. Blutstrom in der Wade (ml/100 ml Gewebe/Minute) Therapie Vorversuchi Woche: 0 Woche: 4 v/o ehe s 10 Woche:

20,8*1,91 19,3*1,76 27,4*1,56* 35,6*1,81* 34,9*1,90* Placebo 19,4-1,82 20,4-1,90 18,6±1,73 21,3*1,52 20,1*1,87

Signifikante Erhöhung des durchschnittlichen Blutstromes in der "GSA"-Gruppe P< 0,01

Man wird .feststellen, da3 in der vierten Behandlungswoche eine signifikante Erhöhung des durchschnittlichen Blutstromes bei der Chondroitinnatriumsulfat-Gruppe zu verzeichnen war, die euch in Woche 10 und Woche 14 des Versuchs vorhanden war.

Sine Beurteilung der Patienten über eine Veränderung der Stärke von Wadenschmerzen, gemessen durch eine Visuell-Analog-Skala, ist in Tabelle 4 enthalten.

?abelle 4: Beurteilung der Patienten über eine Veränderung der Stärke von Wadenschmerzen unter Anwendung der iO-cm~Zeile:a Visuell-Analog-Skala

Therapie

Anz. der Patienten

"CSA" Placebo Wert von t

22 19

Mittlere - DS Wadenschmerzenstärke (cm) Woche 0 Woche 2 Woche 4 Woche 6 Woche 10 Woche

3,83*1,68 4,O1±1,77 4,16*1,80 6,44^±1_i71 5_i63^±2_J44 6,10^2,18 3,76±1y.57 4,27^±2,t4 4,38-1,52 4,16-2,03 3,94^1,97 3,18Ϊ1,88

xnd, ••CSA«-Gruppe. . _β _ _Q>34 _ _O>63 . _5f10

Reaktion gegenüber V/oche 0

Signifikante Yerbesserung nur bei der "CSA"-Gruppe P< 0,01;

- 2,

-3,86

P < 0,001.

Nur in der "CSA"-Gruppe war eine signifikante Besserung festzustellen, die zuerst in der V/oche 6 der Behandlungsperiode sichtbar wurde. Bei dem Versuch ermittelte Labor- und Koagulationsvjerte der beiden Behandlungsgruppen sind in Tabelle zusammengestellt·

Tabelle 5: Labor- und Koagulationswerte der beiden Behändlungsgruppen während des Versuchs (Mittel * SD)

"GSA"-Gruppe (N = 22) Placebo-Grüppe.(N = 19)

Woche 4 Woche 10 Woche 14 Woche 4 Woche 10 Woche

Fibrinogen (g/l) 3,97* 0,71 3,71* 0,50 3,48* 0*47* 3,50* 0,50 3,52* 0,55 3,34* 0,57

Thrombin-Gerinnungs- , , ,

zeit {% normal) 99,7* 5,32 102,8 * 9,80 104,5-10,76 97_f2* 7,19 102*11,10 99,3* 8,9

Euglobin-Lysis-Zeit .

(s) 326,8*14,03 331,1*16,07 329,2*13,64 334,4* 7,52 327,6*8,15 328,5*15,24

Blutülättchen-Aggre- . , . ,

gationszeit (s) 631,5- 7,63 638,5*11,46 640,1*10,84 646 *13,33 638,9*12,34 637,5*13.69

Cephalin-Zeit (s) 40,5* 4₉8 40,5* 2,6 40,1* 2,9 39₉5* 3,7 40,5* 3,0 41,1* 2,6

Cholesterin (mg/dl) 293,1*13,6 290,8*14,4 277,5*17#7**291,0*21_s3 297,7 -11,9 288,3*18,9

^isS"-Partikel (mg/dl) 532,6*18,6 538,9*20,9 536,5*19,7 533,0*17,1 537 *14₉4 538,0*16,1

Signifikante Abnahme gegenüber den Ausgangswerten: ^s 0,01 < P < 0,02; ^S3E P<0,01.

Q - ta -

Es waren auch signifikante Verringerungen bei den durchschnittlichen Serum-Cholesterin-Konzentra.tionen und den durchschnittlichen Fibrinogen-Spiegeln bei der ⁿCSA"~Gruppe in der 14. IVoehe im Verhältnis zum Ausgangswert festzustellen. Bei allen anderen, bei dem Versuch vorgenommenen Messungen waren keine anderen signifikanten Veränderungen ermittelt worden.

"Aktive" CSA-Tabletten ergaben statistisch signifikant bessere Ergebnisse bei Patienten mit intermittierender Claudicatio als bei Placebo, wobei eine beträchtliche Verbesserung hinsichtlich der Wegstrecke bei denjenigen Patienten zu verzeichnen war, die "aktives" CSA erhalten hatten. Die orale Verabreichung von "aktivem" CSA wurde gut vertragen und verursachte keinerlei nennenswerte Nebenwirkungen.

Bei dem vorgenommenen Versuch war die orale Verabreichung von "aktivem" CSA von keinen signifikanten Veränderungen in der Plasma-Thrombin-Gerinnungszeit und der Blutplättchenaggregationszeit begleitet.

Bs ist wiederum, nicht möglich, den möglichen Verlauf der Wirkung von "aktivem" CSA zu verfolgen, aber die signifikante Verringerung in den Plaema-Fibrinogenspiegeln und den Serum-Cholesterin-Spiegeln haben dabei möglicherweise die größte Bedeutung.

Es wurde auch beschlossen, einen gesteuerten Versuch zur Beurteilung der Wirksamkeit von wie oben hergestelltem "aktivem" CSA bei der Verhinderung von Tiefvenen-Thrombose nach Operationen durchzuführen.

140 Patienten, an denen größere gynäkologische Eingriffe oder ähnliche allgemein-chirurgische Operationen vorgenommen worden waren, wurden untersucht. Patienten, an denen Operationen am Bein oder an der Hüfte ausgeführt worden waren, wurden von dem Versuch, ausgeschlossen. .

2/

Es wurden die folgenden klinischen Daten festgehalten? Alter, Gewicht, Große, Krankenhausaufenthalt vor der Operation, voroperative Hämoglobinspiegels Eauchgewohnheiten, Vorhandensein variköser Yenen bei klinischer Untersuchung, Verlauf von venöser·' Thromboembolie, Art der Operation und ob äex chirurgische Eingriff wegen einer gutartigen oder bösartigen Erkrankung erfolgte. Die Patienten wurden nach Alter, Gerschlecht und Zigarettenrauchstatus eingeteilt und wurden willkürlich einer Kontroll (Placebo)- oder aktiven Behandlungsgruppe zugeordnet. Alle Patienten erhielten die übliche Krankenhausphysiotheraoie vor und nach der

wurden

Operation und/sobald als möglich nach der Operation ambulant

behandelt«

Die Behandlungsgruppe erhielt oral 10 g "aktives"- CSA an den beiden der Operation vorausgehenden Tagen und anschließend 5 g "aktives" CSA (in einzelnen Dosen) täglich sieben Tage lang nach der Operation oder bis der Patient aus dem Krankenhaus entlassen wurde.

Die Blutplättchen wurden mit einem Colter-Thrombozähler gemessen. Das Nachlassen des Plättchenfaktors III wurde nach der Methode von Spaet und Cintron, das Fibrinogen nach der Methode von Ratnoff und Menzie und durch Slektroimnmnodiffusion. Antithrombin III nach der Methode von Howie, u.a«,, der Faktor VIII durch eine Sinstufen-Methode von Brecken und Ratnoff, die Euglobulin-Lysis-Zeit nach der Methode von KiLsson und Dlow, das Serumfibrin verwandte Antigen (FR-Antigen) nach der Methode von Merskey»u.a., die Thrombinzeit nach der Methode von Aylward, u.a. gemessen, und die Blutplättchenaggregation wurde in bezug auf Adenosendiphosphat, Collagen, und Adrenalin mit Hilfe der Aggregometer«Methode von Bourne und Cross gemessen.

Alle Patienten wurden vor der Operation einer isotopiechen

125 Untersuchung der Beine unter Anwendung der I-Pibrinogen-Technik von Kakkar unterzogen. Eine regelmäßige nachoperative Abtastung wurde am ersten, dritten und sechsten Tag vorgenommen, wenn, nicht eine signifikant hohe Zählung bei der Vornahme täglicher Abtastungen erzielt wurde. Die radioaktive Zählung an verschiedenen Stellen des Beines wurde als direkter Prozent-"

satz des Herzschlages notiert. Es wurde angenommen, daS Patienten eine Tiefvenen-Thrombose haben, wenn eine Erhöhung von 20 % an der gleichen Stelle an zwei verschiedenen Tagen oder zwischen zwei benachbarten Stellen beobachtet wurde, vorausgesetzt, ds3 diese Erhöhung langer- als 24 Stunden anhielt*

In der Placebo-Gruppe waren 70 Patienten und in der aktiven Behandlungsgruppe 70 Patienten. Die klinischen und die Koagulationsv.'erte der 140 Patienten vor der Operation sind in Tabelle 6 aufgeführt. Die beiden Gruppen waren hinsichtlich der Altersverteilung, der Geachlechtszugehorigkeit und der Arten der vorgenommenen Operationen vergleichbar. Das Auftreten der verschiedenen Faktoren, die auf die Entwicklung von Tiefvenen-Thrombose hindeuten, war bei beiden Gruppen ähnlich«,

Tabelle 6: Voroperative klinische und Köagulationswerte der untersuchten Patientengruppen

näkoloffische Fälle Aktive Gruppe Placebo-Grumve

Anzahl der Pälle Alter (Jahre)

Zigarettenraucher {% der Gruppe) Voroperativer Aufenthalt (Tage) % Übergewicht zur Große

Vorhandensein variköser Venen {% der Gruppe) Bösartige Erkrankung {% der Gruppe) Fibrinogen (g/l) Faktor VII (% von normal) Euglobul'in-Lysis-Zeit (min) Serum-FR-Antigen (mg/1) Plasma-Thrombin-Gerinnungszeit (% von normal)

32	32	2	0,10
52 ί 3	51 -	,5	7
35	37	1	23
4 i 1	4±		.1
1-2,5	15	,8	5
25	18	25
6,25	6,	4·
3,03 έ O9H	2,99	4-
116 ί 6	114	-S-
312 i 21	326	ί
7± 1	8	±
106-± 4	104

Fälle AkJ: ί y e Gr upjp e P1 β c e b ο - Gr u ρ ρ e

	38	44	38	3	,5
42	i β		ί
	12		13
	13	2	14	0	,09
2	±0,5		ί	5
	10		12,		3
	11	2,96	10	0
2,94	ί 0,08	125	±	7
123	± 8	296	±	1
298	± 15	7	ί	1
8	ί ι	102	ί	3
103	± 4	ί

Anzahl der Fälle Alter (Jahre) Weibliche Pälle

Zigarettenraucher (% der Gruppe) Voroperotiver Aufenthalt (Tage) % Übergewicht zur Größe Vorhandensein variköser Yenen Fibrinogen (g/l) Paktor VII {% von normal) Buglobulin™Lysis-Zeit (min) Serum-FR-Antigen (mg/1)

Plasma-Thrombin-Gerinnunga» zeit (% von normal)

Tabelle 7 zeigt das allgemeine Auftreten von Tiefvenen-Thrombosen bei der Placebo- und der Behandlungsgruppe. Bei fünfzehn der fünfundzwanzig Patienten mit Tiefvenen-Thrombose in der Placebo-Gruppe und sechs 6ex elf Patienten mit Tiefvenen-Thrombose der Behandlungsgruppe ergaben sich positive bilaterale Beinabtastungen. Das ist ein beträchtlicher Unterpchied (P £ 0,02). Betrachtet man die Art der Operation in den beiden Patientengruppen, so zeigt sich eine beträchtliche Verringerung im Auftreten von Tiefvenen-Thrombose bei der behandelten Gruppe, vor allem bei denjenigen Patienten, an denen eine Oophorektomie vorgenommen worden v;ar. Das Auftreten von Tiefvenen-Thrombose in beiden Gruppen ist in Abhängigkeit von der Art der Operation in Tabelle 8 gezeigt.

Tabelle 7: Auftreten von Tiefvenen-Thrombose in beiden Patientengruppen

Gruppen Anz« der Anz. mit Tief- Anz. mit

. Pälle venen-Thrombose bilateraler

Gynäkologisch:

Kontrolle 32 12 (37,5 %) 8

Behandlung 32 5 (15,6 55) 3

I ο

Gruppen

Allgemeinchirurgisch: Kontrolle Behandlung

Patienten insgesamt

Anz. der Fälle

38 38

140

Anz. mit Tief- Anz. mit venen-Thrombose bilateraler

Thrombose

13 (34,2 %) 6 (15,8 %)

36 (25,6 %)

7 3

21

Tabelle 8s Auftreten von Tiefvenen-Thrombose in beiden Patientengruppen je- nach der Operation:

Operation

Hysterektomie abdominalis

Hysterektomie abdominalis und Oophorektomie

Bilaterale Oophorektomie

Beckenbodenoperation

Allgemeinchirurgisch Laparotomie Mastektomie Adrenalektomie Verschiedenes

Plac ebo-Gruppe% behandelte Grutme:

Αώ.ζ. (%) Anz. (%) Anz. (%) Anz. (%) der Pa- mit Tief- der Patien- mit Tieftienten venen- ten venen-Thrombose Thrombose

15 (50 %) 5 (15,6 %) 16 (50 %) 2 (6,3 %)

9 (28,1 %) 4 (12,5 %) 10 (31,2 $5) 2 (6,3 %)

5 (15,6 %) 2 (6,3 %) 4 (12,5 %) 1 (3,1 %)

2 (6,3 %) 1 (3,1 %) 2 (6,3 %) 0 (0)

16 (42,1 %) 8 (21,1 %) 14 (36,8 ?5) 2 (5,3 ^)

(23,7 %) 4 (10,5 ^) 10 (26,3 %) 2 (5,3 %)

(26,3 %) 1 (2,6 %) S (23,7 ίί) 1 (2,6 %)

(7,9 ^) 0 (0) 5 (13,2 %) 1 (2,6 ^)

Übermäßiger Blutverlust während oder nach der Operation war reeler bei behandelten Patienten noch bei Patienten der Kontrollgruppe ein Problem.

Die Blutplättcheh-Aggregationszeit war bei Patienten nach •'aktivem" CSA merklich erhöht. Hinsichtlich der Blutr)lSttchen~ zählung gab es bei den beiden Gruopen keinen UnterFchied, euch keine wesentliche .Veränderung in bezug auf Härcatokrit.

Die Einführung des Tests mit radioaktivem Fibrinogen hat den Umfang dee Problems aufgezeigt, das durch nachoperative Tiefvenen-Thrombose auftritt, und die Korrelation mit der Phlebographie hat bestätigt, daß dieser Test eine genaue und rasche Methode zur Ermittlung des Auftretens und der Stelle von Thrombosen bei Patienten nach der Operation ist.

Bei allgemein-chirurgischen Patienten beginnen Thrombi gewöhnlich in den tiefen Sinussen der Wade, und wenn die Thrombose auf diese Yenen und die tiefen Tibiavenen beschränkt bleibt, ist die Gefahr einer Lungenembolie gering. Durch die Ausdehnung des Thrombus in die Poplesvenen und die unteren Pemoralvenen erhöht sich die Gefahr einer Lungenembolie. Es ist daher von größter Bedeutung, eine nachoperative Tiefvenen-Thrombose vjenn immer möglich zu verhindern und die Ausdehnung zu begrenzen, wenn sich ein Wadenthrombus entwickeln sollte»

Diese Ergebnisse zeigen, da3 durch "aktives" CSA das Auftreten von nachoperativer Tiefvenen-Thrombose verringert werden kenn, wie der Test mit radioaktivem Fibrinogen bei allgemein-chirurgischen Patienten und gynäkologischen Patienten ergeben hat* Ss zeigten sich keinerlei Komplikationen durch die Verabreichung des Medikaments. Prüfungen der Blutplättchenfunktion und der Wirkungen verschiedener Medikamente in vitro brauchen die in-vivo~Situation nicht wiederzugeben. Trotzdem dienen derartige Versuche als Monitore und sie haben bestätigt, da3 an Patienten eine aktive Behandlung vorgenommen wurde. Aus den vorgelegten Ergebnissen ist es hier nicht möglich, den vermutlichen Verlauf der Wirkung von "aktivem" CSA darzulepen, wenn es auch möglich ist, da3 eine Inhibition der Blutplättchen-

Zb

Aggregation und eine Verlängerung der Plasma-Thrombin-Gerinnungszeit eine Eolle spielen. Man sollte jedoch beachten, daß durch "aktives" CSA auch erhöhte Spiegel von Plasma-Pibrinogen gesenkt worden aind, und diese Beobachtung konnte eine große Bedeutung für die günstige Wirkung von "aktivem" CSA haben.

Die ausführlich beschriebene Erfindung soll nur durch den gesetzlichen Rahmen der anschließenden Ansprüche begrenzt werden.

Claims (10)

1« Verfahren zur Herstellung von aktivem Chondroitinsulfat A oder aktivem Chondroitinsulfat C oder eines.Gemische davon, gekennzeichnet dadurch, daß eine wäßrige Lösung des (der) Chondroitinsulfats(e) aus einem entsprechenden Ausgangsmaterial hergestellt wird, der Lösung ein Komplexbildner zur Bildung eines Präzipitats, bei dem es sich um einen wasserunlöslichen· Komplex von Chondroitinsulfat (en) und dem Komplexbildner handelt, zugesetzt wird, und das (die) Chondroitinsulfat(e) aus dem Komplex zurückgewonnen wird (werden)«

2« Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Ausgangsmaterial um Säugetiergewebe handelt.

3« Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß das Ausgangsmaterial Rindertracheaknorpel ist.

4« Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Ausgangsmaterial Fischgewebe ist.

5« Verfahren nach einem der vorstehenden Punkte, gekennzeichnet dadurch, daß das Ausgangsmaterial vor der Bildung der Lösung entfettet wird.

6» Verfahren nach einem der vorstehenden Punkte, gekennzeichnet dadurch, daß das Ausgangsmaterial vor der Bildung der Lösung gemahlen wird.

7» Verfahren nach einem der vorstehenden Punkte, gekennzeichnet dadurch_f daß das Ausgangsmaterial mit einem Enzym zur Entfernung von Eiweiß digeriert wird.

21,7.1981 58 661 18

8« Verfahren nach einem der vorstehenden Punkte, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Komplexbildner um ein quaternares Ammoniumsalz oder ein Anionenaus™ ta.uscherh.arz handelt*

9« Verfahren nach einem der vorstehenden Punkte, gekennzeichnet dadurch, daß der Komplex durch eine Base oder hypertonische Kochsalzlösung zur Rückgewinnung des (der) Chondroitinsulfatsfe) daraus aufgespalten wird·

10«, Wasserunlöslicher Komplex von Chondroitinsulfat A und/ oder Chondroitinsulfat C und einem Komplexbildner, ge-. . kennzeichnet dadurch, daß er nach einem Verfahren, gemäß Punkt 1 bis 8 hergestellt ist«.