DD146006A5 - Inhibitor fuer angiotensin umwandelndes enzym - Google Patents

Abstract

Ziel ist d. Bereitstellung eines Inhibitors mit verbesserter Wirkung,der oral verabreicht werden kann.Erfindungsgem. entspricht der Inhibitor der allgemeinen Formel I, in welcher R Wasserstoff, Formyl, Acetyl, Propanoyl, Butanoyl, Phenylacetyl, Phenylpropanoyl, Benzoyl, Cyclopentylcarbonyl, tert.-Butyloxycarbonyl, Cyclopentylcarbonyl-L-lysyl, pyro-L-Glutamyl-L-lysyl, L-Arginyl, L-Lysyl oder pyro-L-Glutamyl bedeutet, A L-Phenylalanyl, Glycyl, L-Alanyl, L-Tryptophyl, L-Tyrosyl, L-Isoleucyl, L-Leucyl, L-Histidyl oder L-Valyl darstellt, wobei die *-Aminogruppe in Amidbindung an R geknuepft ist und Phenylalanyl racemisch ist, falls R fuer Benzoyl steht, R&ind1! fuer Wasserstoff oder Methyl steht, R&ind2! L-Prolin, L-3,4-Dehydroprolin, D,L-3,4-Dehydroprolin, L-3-Hydroxyprolin, L-4-Hydroxyprolin oder L-Thiazolidin bedeutet, wobei die Iminogruppe in Imidbindung an das benachbarte (Formel) gebunden ist, und n gleich 0 oder 1 mit der Maszgabe ist, dasz, wenn n fuer Null steht, R&ind1! Methyl bedeutet.

Description

Die Erfindung betrifft einen Inhibitor für Angiotensin umwandelndes Enzym sowie ein Verfahren zur Herstellung des Inhibitors«

Der erfindungsgemäße Inhibitor wird angewandt als Arzneimittel zum Behandeln von überhöhtem Blutdruck.

Cha^raj^teristik der bekannten..._tjBC:hn.i.schen_ Lösungen

Das Angiotensin umwandelnde Enzym (die im folgenden mit ACE bezeichnete Peptidyldipaptid~Hydrolase) spielt in der Physiologie der Hypertension eine zentrale Rolle und ist in der Lage, das Decapeptid Angiotensin I₁ welches die Aminosäuresequenz ·

AspArgVaITyrHeHisProPheHisLeu

besitzt, durch Abspalten des eine endständige Carboxygruppe aufweisenden Restes HisLeu in ein Octapeptid, das Angiotensin II, überzuführen. Die für verschiedene Aminosäurereste verwendeten Symbole sind folgende:

AIa = L-AIaηin Arg = L-Arginin Asp = L-Asparaginsäure < GIu = Pyro-L»glutaminsäure. GIy = Glycin

Hip = Hippursäure ( Benzoyl.-glycln) 1-iis '= L-Histidin

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215 4 5 7 . - 2 - 56198/11

lie = L-Isoleucin -

Leu = L»Leucin

Phe = L-Phonylalanin

Pro = L~Prolin

A Pro = L-3,4-Dehydroprolin

Ser.= L-Serin

Trp'= L-Tryptophan Ty r.-= L-Ty rosin

VaI - L~Valin

Weiterhin werden folgende Abkürzungen verwendet:

ACE = Angiotensin umwandelndes Enzym Hepes = N-2-Hydroxyäthylpiperazin-N' -2-äthansulfonsäure

Angioten.sin I entsteht durch Einwirkung des Enzyms Renin, einer in Nieren oder anderen Körpergeweben und im Blutplasma anzutreffender? Endopeptidas, auf im Serum enthaltenes ©4 -2-Globulin.

Der Blutdruck wird durch gewisse, im Blut vorhandene Peptide beeinflußt. Eines dieser Peptide, das Angiotensin II, ist ein stark wirkender, blutdrucksteigernder Stoff* Ein anderes dieser Peptide, das Bradykinin, ist ein die Aminosäuresequenz ArgProProGlyPheSsrProPheArg aufweisender Stoff mit starker blutdrucksenkender Wirkung. Zusätzlich zu seiner direkter) blutclrucksteigernden Wirkung besitzt Angiotensin II auch die Fähigkeit„ Aldqsteron freizusetzen, welches im Körpergewebe extrazelluläre Salze und Flüssigkeiten zurück-· hält und damit zu einer Steigerung des Blutdruckes beiträgt» Angiotensin II ist im Blut normaler Menschen in meßbaren

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Mengen vorhanden, jedoch im Blut von an renaler Hypertension leidenden Patienten in höherer Konzentration vorhanden.

ACE liegt in Menschen mit normalern Blutdruck und in Menschen mit erhöhtem Blutdruck in der Regel in größerer Menge vor, als sie zum Aufrechterhalten feststellbarer Konzentrationen an Angiotensin II erforderlich ist. Der überhöhte Blutdruck in an überhöhtem Blutdruck leidenden Patienten kann somit durch Behandeln dieses Patienten mit ACE-Inhibi™ toren abgesenkt werden. £"Gavras» I., et. al., New Engl. O. Med. 291, 817 (1974)J.

Ziel der Erfindung ist die. Bereitstellung von neuen Inhi bitoren für Angiotensin umwandelndes Enzym, die oral als Äntihypertensiva verabreicht werden können«

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Verbindungen geeigneter Konstitution und Verfahren zu deren Herstellung aufzufinden«

Die vorliegende Erfindung bezieht sich nun auf' neue ACE-Inhibitoren der allgemeinen Formel

H R~A~S-(CH₂J_n-CH"C-R₂ (I)

in welcher

R IVaeserstoff, Formyl, Acetyl, Propanoyl, Butanoyl, Phenyl-

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acetyl, Phenylpropanoyl, Benzoyl, Cyclopentylcarbonyl,

tert .-Butyloxycarbonyl, Cyclopentylcarbonyl-L-lysyl.,

pyro-L-glutainyl-L-lysyi, L-lysyl, L-arginyl oder pyro-L-

Glutamyl, bedeutet,

A L-Phenylalonyl, Glycyl, L-Alanyl, L-Tryptophyl, L-Tyrosyl, L-Isoleucyl, L-Leucyl, L-Histidyl oder L-VaIyI., darstellt, wobei die c4 -Aminogruppe dieser Reste an den Rest R in .

Amidbindung gebunden ist und Phenylalanyl racemisch ist,

falls R für Benzoyl steht.

R. für Wasserstoff oder Methyl steht,

R L-Prolin, L~3,4^-Dehydroprolin, DjL-S^-Dehydroprolin , L-3-Hydroxyprolin, L-4-Hydroxyprol.in oder L-Thiazolidin bedeutet, wobei die_nlminogruppe dieser Reste mit der be-

nachbaVten Gruppe -C- in Imidbindung verknüpft ist, und η für 0 oder 1 mit der Maßgabe steht, daß, wenn η gleich ist

Null R Methyl bedeutet«

Sofern nichts anderes angegeben ist, besitzen alle der im folgenden genannten Aminosäuren L-Konfigura-tion. Phenylalanyl ist racemisch, wenn R für Benzoyl steht. Die erfindungsgemäßen bzw. erfindungsgemäß herstellbaren Verbindungen sind ACE-lnhibitoren und können oral als Antihyper» tensiva verabreicht werden«,

Die Entdeckung, daß erfindungsgemäße bzw. erfindungsgemäß herstellbare Verbindungen der allgemeinen Formel (I) ACE-Inhibitoren sind", bedeutet einen wesentlichen Fortschritt beim Aufbau von als ACE-lnhibitoren brauchbaren Verbindungen Obzwar zahlreiche der bekannten ACE-Inhibitorcn Prolinderivate sind, können durch Ersetzen dee Prolins durch andere Aminosäuren ebenfalls stark wirkende ACE-lnhibitoren erhalten werden«, Beispielsweise sind Arginin, Phenylalanin und

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Alanin durchwegs dazu geeignet, Prolin zu ersetzen, so daß eine bestimmte Entwicklungsrichtung nicht erkennbar ist.

Der Ersatz des Prolins durch L-3,4-Dehydroprolin ist bereits in verschiedenen Systemen untersucht worden. Wenn ±n 7-Stellung des Bradykinins L-3 ,4- Α Pro eingeführt wird, wird ein Bradykininderivat starker physiologischer Wirkung erhalten £vgl.. Fisher, G, H. et al.., Arch. Biochem. Bio.phys. 189, 81 (1978)3. Andererseits wird durch Einführen von L-3,4- Λ Pro in,3-, .5- oder 9~Stellung des ACE-Inhibitors BPPg dessen Inhibitorwirkung erhöht. Derzeit kann jedoch die Verschiedenheit der bei Ersatz des Prolins durch <ό· Pro zu beobachtenden Ergebnisse nicht schlüssig erklärt werden. Tn ähnlicher Weise "ergibt sich kein klares Bild hinsichtlich der Wirkungen weiterer Prolinderivate oder an verschiedenen Stellen von ACE-Inhibitoren substituierten Analoga.

Derzeit ist die Wirkung der an der linken Seite des in der obigen Formel (I) aufscheinenden Schwefelatoms stehenden Aminosäure als zusätzliche Erkennungsstelle, für das Enzym wirkt. Falls diese Annahme zutrifft, ist zu erwarten, daß eine an dieser Stelle eine Aminosäure aufweisende Verbindung ein besserer Inhibitor -ist. Es war nicht bekannt, welche Aminosäure ,oder ob überhaupt eine Aminosäure äri dieser Stelle wirksam ist und welche Aminosäure wenn überhaupt eine Aminosäure die Inhibitorwirkung einer gegebenen Verbindung erhöht. Die Anmelderin hat gefunden, daß verschiedene Aminosäuren wirksam sind, und daß Hydroxyprolin-, Prolin-, L- und D_tL~3,4~Dehydroprolin-> und Thiazolidinderivate durchwegs antihypertensiv wirken und auf ACE eine starke Inhibitorwirkung ausüben.

. . 25.3.1980

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Besonders wirkungsvolle Inhibitoren für Angiotqnsin umwandelndes Enzym der allgemeinen. Formel I sind solche, bei denen R die folgende Bedeutung hat:

Benzoyl, Wasserstoff, Formyl, Acetyl, Propanoyl, Butanoyl, Phenylacetyl, Phenylpropanoyl, Cyclopentylcarbonyl, tert-Butyloxycarbonyl, Cyclopentyl-carbonyl-L-lysyl, Pyro~ L-glut'arnyl-L-lysyl, 'L-Arginyl, L-Lysyl, "Pyro-L-glutanyi

oder Inhibitoren, bei denen R für Benzoyl, A für Phenylalanyl, R₁ für Methyl und R₀ für L-prolin steht und η gleich 1 ist..

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zum Herstellen eines zum Behandeln von überhöhtem Blutdruck brauchbaren Inhibitors für angiotensinumwandelndes Enzym

der allgemeinen Formel

0 If R-A-S- (Ch₀) - CH - C - R₀ (Ia),

in welcher

R Wasserstoff, Formyl, Acetyl, Propanoyl, Butanoyl, Phenylacetyl, Phenylpropanoyl, Benzoyl, Cyclopentylcarbonyl, tert-Butyloxycarbonyl, Gyclopentylcarbonyl-L-lysyl, Pyro-L-glutamyl-L-lysyl, L-Arginyl, L-Lysyl oder Pyro-L-glutamyl darstellt,

A L-Phenylalanyl _t Glyoyl, L-Alanyl, L-Tryptophyl, L-Tyrosyl, L-Isoleucyl, L-Leucyl, L~Hiotidyl oder L-Va.lyl bedeutet, wobei die qC -Aminogruppe in Amidbindung an R geknüpft ist und Phenylalanyl racemisch ist, falls R für Benzoyl steht, R„ für Wasserstoff oder Methyl steht, R₂ L-Prolin, L-3,4-Dehydfoprolin, D,L«3,4-Dehydroproline, L~3-Hydroxyprolin, L-4-Hydroxyprolin oder L-Thiazolidin dar-

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stellt, wobei die Iminogruppe in Imidbindung an die angrenzende Gruppe B gebunden ist, und

η gleich O oder 1 mit der Maßgabe ist, daß wenn η gleich Null ist, R₁ für Methyl steht. Das Verfahren wird in der Weise ausgeführt, daß

(1) eine Verbindung der allgemeinen Formel

IS

R,-S-(CH₀) -CH-C-OH mit R₀ zur Verbindung der allge-

¹V

meinen Formel

O '

R-S-(CiL) -CH-C-R₀, worin ,R-, Acetyl bedeutet und R₁ · '

¹¹R,., R₀ und ή die oben angegebene-Bedeutung besitzen, umgesetzt wird, daß

(2) durch Abspalten des Restes R₁, aus der gemäß. Stufe (1) erhaltenen Verbindung eine Verbindung der allgemeinen Formel q

HS-(CH₀) -CH-C-R₀ . hergestellt wird, und daß . «c η j (L

^Rl

(3) das gemäß Stufe (2) erhaltene Produkt mit einer Verbindung der allgemeinen F'ormel R-A zu einer Verbindung der allgemeinen Formel .

-Q-

R-A-S-(CHp) -CH-O-R₀ umgesetzt wird, in welcher . R₁

R, A, R., R₀ und η die oben angegebene Bedeutung besitzen,

Insbesondere wird derart vorfahren, daß die Umsetzung gemäß Stufe (1) in Anwesenheit von 1,1' -Carbonyldiimidcfzol oder

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Dicyclohexylcarbodiimid und die Umsetzung gemäß Stufe (3) in Anwesenheit von 1,1'-Carbonyldiimidazol durchgeführt wird« Dabei weist das in Stufe (1) eingesetzte R„ eine Schutzgruppe für die Carboxylgruppe auf. Diese Schutzgruppe wird in Stufe (2) abgespalten.

Erfindungsgemäß wird durch Abspalten der Schutzgruppe aus einer Verbindung der allgemeinen Formel tert-Butyloxy-

R₁

in welcher A, R , R₂ und η die oben angegebene Bedeutung

besitzen, eine Verbindung der allgemeinen Formel

A ~ S - (Ci-L·) - CH -C- R„ hergestellt„

Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert«, In diesen Beispielen wurde'die-Dünnschicht-Chromatographie (TLC) unter Verwendung von Slicagelplatten durchgeführt» Die bei der Dünnschichtchromatographie verwendeten Lösungsmittelsysterne sind in den Beispielen durch. . S\!ummern bezeichnet, welche folgendes bedeuten:

(1) Methanol^Chloroform, 1:1 (Vol.-Teile). (2) Benzeol:Wassei Essigsäure, 9:1:9 (VoI «,-Teile )„ (3) Essigsäure :VVasser :n« Butanol, 26:24:150 (VoI.-Teile). (4) n-Butanol:Pyridini Essigsäure :Wasser_s 15:10:3:12 (Vol.-»Teile),» (5) Chloroforms Methanol :Ammoniurnhydroxxd , 60:45:20 (VoI,-Teile) _c

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Die bei eier Päpierelektrophorese verwendeten Pufferlösungen waren folgende:

pH 1,9-Ameisensäure Essigsäure:Wasser, 3:2:25 (Vol.-Teile) ; pH 5,0-Diäthylenglykol:Essigsäure:Pyridin:Wasser, 100:6:8,5:885 (VoI*-Teile).

Die tert„-Butyloxycarbonyl-, 8enz'oyl~, Acetyl-, Formyl-, Propanoyl-, Butanoyl-, Phenylacetyl- und Phenylpropanoylderivate der Aminosäuren sind im Handel erhältlich.

Sephadex LH-20, Sephadex G-IO und Sephadex G-25 sind Handelsmarken. . ,

Beispiel 1: Bestimmung der Wirkung des ACE

Bei den meisten im folgenden beschriebenen Experimenten wurde das Enzym in einem an NaCl 0,1-molaren und an HapSO. 0,75,^fTiOIaren und an Hepes 0,05-molaren Puffer mit einem pH-Wert von 8,0 geprüft. Als Substrat wurde Benzoyl-GlyHisLeu mit einer Endkonzentration von I₄₁IO" -molar, (K «=2.iO~ molar zusammen mit etwa 13000Ö' cpm ^ !-Pßonzoyl-GlyHisLeu (25 Ci/tnmol) eingesetzt. Das Enzym wurde im oben erwähnten Puffer in solcher Konzentration gelöst, daß 40 ul der Enzymlösung in der Lage waren, bei 37 C innerhalb 15 Minuten 13 % des Substrats, zu hydrolysieren. Vor Beginn des Versuchs wurden 40 ul der Enzymlösung und 10 liI Wasser oder wäßrige Inhibitorlösung 5 Minuten auf 37 ⁰C erwärmt. Anschließend wurde durch Zusetzen von 50 ul der Substratlösung die Reaktion eingeleitet und das Reaktionsgemisch 15 Minuten auf 37 C gehalten. Um die Reaktion abzubrechen, würde sodann das Reaktionsgemisch mit 1 ml einer 0,1-molaren

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Salzsäure versetzt, worauf das erhaltene Gemisch mit 1 ml Äthylacetat versetzt wurde. Das so erhaltene Gemisch wurde sodann gerührt und anschließend zwecks Phasentrennung kurz zentrifugiert.

500^1 der erhaltenen Äthylacetatphase wurden in ein Szintillationszählrohr eingebracht, welches 10 ml Riafluor enthielt. Zwecks Bestimmung der I_r0~Werte wurde die sich bei verschiedenen Inhibitorkönzentrationen ergebende Enzymaktivität mit öer sich in Abwesenheit eines Inhibitors ergebenden Enzymaktivität verglichen. Aus einer graphischen Darstellung der Abhängigkeit der in Prozent ausgedrückten Inhibition von der Inhi.bitorkonzentration ergab sich der I₅₀~Wert. .

Beispiel 2: Herstellung des 3-Acetylthiopropanoyl-L-prolint-butylesters

Eine Lösung von 0,865 g 3-Acetylthiopropansäure in 2 ml destillierten Tetrahydrofurans (THF) wurde auf 0 C gekühlt und dann mit einer gekühlten Lösung von 1,2031 g Dicyclohexylcarbodiimid in 2 ml THF versetzt, worauf dem erhaltenen Gemisch eine gekühlte Lösung von 1 g L-Prolin-t-butylester zugesetzt wurde» Das Reaktionsgemisch wurde sodann eine Stunde bei 0 C und dann über Nacht bei 4 °C gerührt und anschließend filtriert, worauf der am Filter verbliebene Niederschlag mit Äthylacetat gewaschen wurde. Von den miteinander vereinigten FiItraten wurden die Lösungsmittel sodann in einem rotierenden Verdampfer unter vermindertem Druck abgetrieben/ worauf der erhaltene Rückstand in Äthylacetat golöst, die erhaltene Lösung aufeinanderfolgend dreimal mit 1 n~Z.it ronen säure, zweimal mit qesättioter Kochsalz™

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lösung, dreimal mit kalter 1 η Natriumbicarbonatlösung und dreimal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und schließlich filtriert wurde. Vom erhaltenen Filtrat wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck in einem drehbaren Verdampfer bei 30 °C äbgeäampft, vVöbei mit einer Ausbeute von etwa 87 % ein klares farbloses öliges Produkt erhalten wurde. Dieses Produkt wanderte bei der Dünnschichtchromatographie in 5 verschiedenen Lösungsrnittelsystemen als einziger Fleck. .

Beispiel 3: Herstellung von 3~Mercaptopropanoyl-L~prolin

0,5 g des gemäß Beispiel 2 hergestellten 3~Acetyrthio~ propanoyl-L-prolin-t-butylesters wurden zwecks Abspaltens der Acetylgruppe bei Raumtemperatur unter Stickstoffatmosphäre 1 Stunde mit 4,5 ml einer 5,5 n-Lösunöj' von Ammoniak in Methanol behandelt, worauf vom Roaktionsgemisch das Lösungsmittel in einem drehbaren Verdampfer bei 25 C abgedampft und der erhaltene Rückstand in Methanol aufgenommen wurde. Vom erhaltenen Gemisch wurde das Methanol abgedampft, worauf der nunmehr vorliegende Rückstand erneut in Methanol aufgenommen und vom erhaltenen Gemisch das Methanol-wieder abgedampft wurde. Der hierbei in Form eines klaren Öles erhaltene Rückstand wurde in Äthyläther gelöst, worauf die erhaltene Lösung zweimal mit einer 5%igen Lösung von Kaliumbisulfat und einmal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen,dann über MgSO₄ getrocknet und schließlich filtriert wurde. Vom erhaltenen FiItrot wurde das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft, womit ein klares öliges Produkt erhalten wurde,das bei der Dünrachichtchromatögraphie irv drei verschiedenen Lüöungsmictelpyetemon als

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einziger Fleck wanderte. Die als Schutzgruppe vorliegende t-Butylestergruppe wurde sodann in Anisol mit Trifluoressigsäure abgespalten«

Beispiele 4 bis 6:

Bei Verwendung von 2-Acetylthiopropansäure, 3~Acetylthio~ 2-D-methylpropaneäure bzw. 3-Acetylthio~2~D,L-methylpropansäure statt der gemäß Beispiel 2 verwendeten 3-Acetylthiopropansäure wurden entsprechend den in dsn Beispielen 2 und 3 beschriebenen Arbeitsweisen die folgenden Verbindungen hergestellt* Durch Abspalten von der t~Butylestergruppe gebildeten Schutzgruppe mittels Trifluoressigsäure in Anisol und Überführen der erhaltenen Verbindung in ihr Dicyclohexylaminsalz kann das Aufspalten von Isomerengemischen in die einzelnen Isomere vereinfacht werden. Die weiterhin als Schutzgruppe vorliegende Acetylgruppe kann in einem weiteren Arbeitsgang in der in Beispiel 3 beschriebenen Weise mittels methanolischem Ammoniak abgespalten werden.

4 2~Mercaptopropanoyl~L-prol:Ln

5 ' 3~Mercapto~2~D~niethylpropanoyl~L~proliiv

6 3™Mercapto~2~D,L-methylpropanoyl^L-prolin

Beispiel 7 : .3-"Msrcapto~2~methyl~propanoyl~L-3,4~dehydroprolin

Eine auf -15 C gekühlte Lösung von 1 mmol L-3,4~dehydro~ prolin (4 3Pro) in Dimethylformamid wurde durch Zusetzen von 1 Äquivalent N-Äthyl-morpholin neutralisiert. In einem weiteren Reaktionsgefäß wurde bei-einer Temperatur von -10 C eine Lösung von 3-Acetylthio-2-methyl-propansäure im gleichen

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Volumen Dimethyiformamid mit 1,1 Äquivalenten 1,1'-Carbonyldiimidazol vermischt, worauf die erhaltene Lösung eine Stunde gerührt wurde. Die Δ Pro enthaltene Lösung wurde mit der Lösung der 3-Acetylthio~2-rnethyl~propansäure unter Aufrechterhaltung einer Temperatur von -10 C vermischt /'worauf das erhaltene Gemisch -zunächst eine Stunde bei -10 ⁰C gerührt und dann die Temperatur des Gemisches auf Raumtemperatur ansteigen gelassen wurde. Anschließend wurde vom Reaktionsgemisch das Lösungsmittel in einem rotierenden Verdampfer unter vermindertem Druck bei 40 C entfernt, worauf der erhaltene Rückstand in 25 ml Äthylacetat aufgenommen und die erhaltene" Lösung auf O C gekühlt und dann mit 2 ml 1 n~Zitronensäure versetzt wurde. Die beiden Phasen wurden zunächst gründlich miteinander vermischt und dann in einem Scheidetrichter voneinander getrennt,worauf die erhaltene .organische, Phase zweimal mit 2 ml 1 n-Zitrpnensäure und zweimal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen und dann über wasserfreiem MgSO, getrocknet wurde« Das nach Abfiltrieren des MgSO^ erhaltene Filtrat wurde sodann in einem rotierenden Verdampfer vom Lösungsmittel befreit, worauf der erhaltene Rückstand aus einem unpolaren Lösungsmittel wie Benzol umkristallisiert wurde. Auf diese Weise wurde 3-Acetylthio-2"D,L™mothyl~ propanoyl-L-3,4»cJehydroprolin erhalten. Falls das 2-D-MQthylisomer .erwünscht ist, wird der Rückstand in etwa 3 ml Acetonitril gelöst und die erhaltene Lösung nach dem Er~ wärmen auf 40 C mit 1 Äquivalent Dicyclohexylamin versetzt, worauf die erhaltene Lösung über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen wird, die hierbei entstandenen Kristalle abfiltriert und dann dreimal mit Acetonitril gewaschen werden. Falls der erhaltene Stoff weiter gereinigt werden soll, kann er aus Isopropanol umkristalliOiert werden» Die als Schutz-

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.» . . — ~ ^{AP A 61 K}/215 457

d i ^ 4 J / - 14 - 56 198/11

gruppe vorliegende Acetylgruppe kann in der in Beispiel 3 angegebenen Weise abgespalten werden.

Beispiele 8 bis 11:

Wenn statt des gernäß Beispiel 7 verwendeten L~3,4-Dehydro~ prolins D,L~3,4--Dehydroprolin, L-3-Hydroxyprolin, L-4-Hydroxyprolin oder L-Thiazolidin eingesetzt wurde, wurden beim Arbeiten gemäß Beispiel 7 folgende Verbindungen erhalten,

BeJ, sjojie 1_ y^L^iQ^iiOS.

8 3~i^viercapto-2-D-methylpropanoyl-d _fL~3 »4-

dehydroprolin

9 3-Mercapto-2~D-niethylpropanoyl"L"3-hydroxy~

prolin

10 3~Mercapto~2-D»methylpropanoyl~L-4~hydroxy-

11 S-Mercapto-S-D-methylpropanoyl-L-thiasolidin

Beispiel 12:

In ähnlicher Weise werden beim Arbeiten gemäß den Beispielen 7 bis 11 die L-3,4-Dehydroprolin-, D,L-3,4-Dehydroprolin-, L-3.™Hydröxyprolin-, L-4--Hydroxyprolin- und L-Thiazolidinderivate erhalten, wenn statt der 3-"Acetylthio~2~methylpropansöure 3~Acetylthioproparisäure oder 2-Acetylthiopropansäure eingesetzt v*«^fird_o

Beispiel 13: Herstellung des N^- 3~(N^-Acetyl-L-phenyl~ alanylthio)-2~D-fnethylpropanoyl -L-prolins

Eine Lösung von 41,5 mg NF^-Acetyl-L-phenylalanin in 0,5 ml frisch destillierten Dimethylformamids wurde in einem

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'Trockenei s-Acefon-ßad auf -20 ⁰C gekühlt, worauf der erhaltenen Lösung eine gekühlte Lösung von 35 mg 1,1'-Carbonyldiimidazol in 1,0 ml Dimethylformamid zugesetzt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde zunächst 2 Stunden bei -10 ⁰C gerührt und dann mit einer kalten und zuvor mit N-ÄthylmorphoMn neutr-alis-ier-ten Lösung von 48 mg 3~Mercapto~2~D-methylprOpanoyl^L-prolin in 1 ml Dimethylformamid versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde sodann bei einer Temperatur von -10 C eine weitere Stunde gerührt, worauf die Temperatur des Reaktionsgemioches langsam auf Raumtemperatur ansteigen gelassen und dann vom Reaktionsgemisch das Lösungsmittel unter vermindertem Druck bei 40 C abgetrieben und der ,hierbei erhaltene Rückstand mit Äthylacetat versetzt.wurde. Das erhaltene Gemisch wurde in einem Eisbad gekühlt und dann mit 0,1 n-HCl und anschließend noch dreimal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen und dann über wasserfreiem MgSO. .getrocknet, ..worauf ..dos Lösungsmittel in einem drehbaren Verdampfer entfernt wurde* Die erhaltene Verbindung wurde durch Chromatographiefen über eine mit Sephadex LH-20 gefüllte Kolonne von 1,2 cm Durchmesser und 95 cm Länge unter Eluieren der Kolonne mit Isopropanol gereinigt«. Die Scheitelfraktionen wurden gesammelt und unter vermindertem Drückdorn Lösungsmittel befreit, womit 35,5 mg der genannten Verbindung erhalten wurden. Die erhaltene Verbindung erwies sich boi der Dünnschichtchromatographio unter Verwendung der Lösungsmittelsysteme 1, 2, 3 und 5 als homogen.

Beispiele 14 bis 21:

Bei Verwendung von .N^6<-Acetyl-glycin, N^-Acetyl-alanin, l-t ryptophan, N^-Acetyl-tyrosin, N^-Acetyl-isoleucin,

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N^-Acetyl-leucin, N^Acetyl-histidin- bzw. N°*-Acetyl-valin anstelle, des gemäß Beispiel 13 verwendeten N**-Acetyl~ phenylalanins wurden nach der in Beispiel 13 beschriebenen Arbeitsweise folgende Verbindungen hergestellt. Beispiel Verbindung

l- I M. 1,1'i I - —Ull-m HI MII ! mil IHH H JlTlI

14 N^CiC-£ⁱ3-(N'^wC;»Acetylglycylthio)~2~D~methyl'propano· y 13-L-prolin

15 N^ - Cs- (isF*--Ace t yl~L-1 ryp tophyrthio)~2-D-met hyl< pröpanoylj -L-prolin

16 fN"^-£3-(N^sC»Acetyl~L~tyrosylthio)-2-D-rnethylpropanoyll -L-p.rolin

17 N*⁴·» j[3»(N^eC~Acetyl-'L-isole.ucylthio)~2-D-methyl-₄ pröpanoylj «L-prolin

18 N^c<"£3-(N^<Ä™Acetyl~L-leucyltbio)~2-.D"methyl» ^: pröpanoylj-L-prolin

19 N^r-fs-iF^-Acetyl-L-histidylthioJ-a-p-roethylpropanoylJ-L-prolin

20 W^e^-f3-(N^f4-Acetyl-L--valylthiö)-2"D-methyl-PropanoylJ-L-prolin

pröpanoylj-L-prolin Beispiel 22': '

Wenn bei der Arbeitsweise gernäß Beispiel 13 statt des gemäß den Beispielen 13 bis 21 eingesetzten 3~Mercaptc~2~D-meth'ylpropanoyl~L~prolin die Verbindungen gemäß den Beispielen 3 bis 12 eingesetzt wurden, wurden in ähnlicher Weise die L~3 ,4-Dehydroprolin-, D ,L-3 ,4-Dehydroprolin- , L~3~Hydroxyprolin~, L~4-~Hydroxyprolin~ und L-Thiazolid:i.nderivate erhaltene

25.3.1980 AP A 61 K/215 457 ίΐ"5'4-'5'7^; - 17 - ; 56 198/11

Beispiel 23: .

Wenn bei der Arbeitsweise gemäß Beispiel 13 die gemäß den Beispielen 13 bis 22 eingesetzten N^-Acetylderivate durch die N**-Formyl-, N^-Pröpanöyl-, N^-Butanoyl-, N^-Phenylacetyl-^äbzw. N^-Phenylpropanoylderivate von L-Pne, GIy, L-AIa, L-Trp.. L-Tyr, L-IIe, L-Leu, L~His und L-VaI ersetzt wurden, wurden die entsprechenden Formyl-, Propanoyl-, ßutanoyl-, Phenylacetyl-, und Phenylprepanoylderivate erhalten.

^Beispiel 24: Herstellung von N^5<!L-/"3--(N^ii:~tert-"Butyloxycarbonyl L"-phenylalanylthio)~2-D~methylpropanoylJ-L-prolin

Eine Lösung von 133 mg N^-tert-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanin (N^^Boc-L—Phe) in 0,5 -ml destillierten Dimethylformamid s wurde in einem Eis-Trockeneis-Aceton-Bad auf -20 C gekühlt, worauf diese Lösung mit einer kalten Lösung von 87 mg 1,1'-Carbonylciiimidazol in 1,0 ml Dimethylformamid versetzt wurde. Die erhaltene Lösung wurde bei -10 C 2 Stunden gerührt und dann mit einer zuvor mit N-Äthylmorpholin neutralisierten Lösung von 3~Mercapto--2~D--rnethyl~ propanöyl-L-prolin in 1. ml Dimethylformamid versetzt„ Das Reakti-Gnsgemisch v/urde mit N-Äthyl~morpholin neutralisiert. Das Reaktionsgerniech wurde dann eine weitere Stunde bei ~10 C gerührt, worauf die Temperatur des Reaktionsgemisches langsaii! auf Raumtemperatur ansteigen gelassen wurde, dann vom Reaktionsgemisch das Lösungsmittel unter vermindertem Druck bei 40 C abgetrieben und der hierbei erhaltene Rückstand in Äthylacetat aufgenommen 'wurde. Das, erhaltene Gemisch wurde in einem Eisbad gekühlt und dann mit 0,1 n«HCl und anschließend noch mit gesättigter Kochsalzlösung ge™

25.3.1980 AP A 61 K/215 457 - 18 - 56 198/11

waschen, dann über wasserfreiem MgSO getrocknet und schließlich in einem drehbaren Verdampfer vom Lösungsmittel befreit« Die erhaltene Verbindung wurde durch Chromatographieren über eine mit Sephadex G-IO gefüllte Kolonne von 1,2 cm Durchmesser und 95 cm Länge unter Eluieren der Kolonne mit einem im Volumenverhältnis von 3s7 aus Tetrahydrofuran und Isopropanol bestehenden Lösungsmittelgemisch gereinigt, indem die Scheitelfraktionen miteinander vereinigt und hiervon das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgetrieben wurde. Auf diese Weise wurden 165 mg der genannten Verbindung erhalten. Diese Verbindung erwies sich bei der bei einem pH-Wert von 5,0 durchgeführten Papierelektrophorese und bei der Dünnschichtchromatographie mit den Lösungsmittelsystemen 1, 2 und 3 als homogen«

Beispiele 25 bis 32?

Falls bei der Arbeitsweise gemäß Beispiel 24 statt des N^-Boc-Phe, N^-Boc-Glycin, N^-Boc-Alanin, N^-Boc-Tryptophan, N^-Boc-Tyrosin/ N^-Boc-Isoleucin, N^-Boc-Leucin, N^-Boc™ Histidin bzw» N^Boe-Valin eingesetzt wurde, wurden die folgenden'Verbindungen erhalten

Be x&p ie 1. , Ve rbindim g

25 N^'- /.'3-(N^-1ert-.butyloxycorbonylglycylthIo)~2~

D-methylpropanoylj-L-prolin

26 M^ct·- ^-(N^-iert-Butyloxycar-bonyl-L-tryptophyl«

t hio) ~2~D--me 1: hyIp ropanoylj -L-ρ rolin

27 N^ei« tz- (l¥- -· t e r t - Bu t y loxy ca rbonyl~L™ t y ro syl t h io) -

2 - D - m e ι h y 1 ρ r ο ρ a η ο y 1J - L - ρ r ο 1 i st

28 N^- ζ~6- (N'*⁴-1 e rt - Bu t y loxy ca r bony 1-L-isoleucyl t h io)

~2-D*-MethylpropanoylJ -L-prolin

25.3.1980 AP A 61 K/215 457 - 19' - 56 198/11

29 N^-£3~(N^"~tert-Butyloxycarbonyl~L-»leucylthio)~2·

D-methylpropanoylJ-L-prolin

30 . N^-Z^-lN^-tert-Butyloxycarbonyl-U-histidylthio)

2~D~methylpropanoyljl -L-prolin

31 N^-Xs-CN^-tert-Butyloxycarbonyl-L-v

D-rireThyrpropanoyl!l-L~pro3-in

32 '' N^~X3-(N^-tert-Butyloxycarbbny.l-L-alanyl'thio)-:2-

D-raethylpropanoyljf -L-prolin.

Beispiel 33:

Wenn bei der Arbeitsweise gemäß Beispiel 24 statt des gemäß den Beispielen 24 bis 32 eingesetzten 3~Mercapto~2~D-methylpropanoyl'-L-prolins die gemäß den Beispielen 3 bis 12 eingesetzten Produkte verwendet werden, werden in ähnlicher IVeise die L-3,4-Dehydroprolin-, D_#L-3,4-Dehydroprolin~, L-3-Hydroxyprolin-, L-4-Hydroxyprolin- und L-Thiazolidin~ derivate erhalten..

Beispiel 34: Herstellung des N^-Cyclopentylcarbonyl-L-phenyl· alanine

Eine gekühlte Lösung von 2,06 g Dicyclohexylcarbodiimid in 10 ml 'Dichlorinethan ivurde bei einer Temperatur von -5 'C einer Losung von 1,4114 g Cyclopen.tancarbonsäure in 5 ml Dichlorrnethan' zugesetzt , worauf das erhaltene Gemisch mit einer zuvor mit:reis 1,36 ml IJ-Kthylmorpholin neutralisierten Lösung von 4,28 g des Toluolsulfonsäuresalzee des L-Phenyl~ alaninbenzoylesters in 10 ml Dimethylformamid versetzt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde sodann eine Stunde bei 0 ⁰C und dann drei Stunden bei Raumtemperatur gerührt, worauf der ent-• Gtandene -Dicyclohoxylhai-nst-of f -abfütrdert und das F-il-t-rat

25.3.1980

AP A 61 K/215 457

2ί Ε Α^7 -20- 55 198/11

mit 50 ml Äthylacetat versetzt wurde. Die erhaltene organische Phase wurde bis zur neutralen Reaktion gewaschen und nach dem Trocknen über wasserfreiem MgSO, filtriert. Vom FiItrat wurde das Lösungsmittel in einem rotierenden Verdampfer abgedampft, worauf der hierbei erhaltene Rückstand aus Isopropanol und Hexan umkristallisiert wurde. Auf diese Weise, wurden 2,35 g weißer Kristalle mit Fp =88 bis 89 °C erhalten

Analyse:

berechnet: 75,19% C/ 7,17% H₁ 3,9855% N gefunden: 74,95 % C, 7,17 % H₁ 4,09 % N.

Die Benzylestergruppe wurde durch Hydrogenolyse in absol'utem Alkohol unter Verwendung von 2 g eines 10 % Palladium auf Kohle enthaltenden Katalysator abgespalten. Der Katalysator wurde abfiltriert, worauf vom FiItrat das Äthanol in einem rotierenden Verdampfer abgedampft wurde« Der hierbei erhaltene Rückstand wurde aus Äther und Hexan umkristallisiert und lieferte 1,15 g weißer Kristalle de" genannten Verbindung mit Fp = 107 bis 108 ^OC_ä Analyse:

berechnet: 68,94 % C, 7,33 % H, 5,36 % N gefunden: 68,90 % C₁ 7_?32 % U₁ 5,34 % N.

Die erhaltene Vorbindung erwies sich bei der bei einem ρH-Wert von 1,9 und be.i einem ρH-Wert von 5,0 durchgeführten Papierelektrophorese und bei der unter Verwendung der Lösungsmittel syst eine 1, 2 und 3 durchgeführten Dünn-8 c h i c h t c h r ο m a t ο g r a ρ h i e als h ο m c g e η . Die g e η a η η t e V e r b i η d υ r> g kann abgekürzt mit N^-Gpc~L-Phe bezeichnet werden«

25.3.1980 AP A 61 K/215 457 - 21 - · 56 198/11

Beispiel¹'35: Herstellung des N^-fs L-phenyl~alanylthio)-2~D~methylpropanoylJ-L~prolins

Eine Lösung von 52,5 mg der gemäß Beispiel 34 hergestellten Verbindung in 0,5 ml destilliertem Dimethylformamid wurde in einem Eis-Trockeneis-Aceton-Bad auf -20 C gekühlt und dann mit einer kalten Lösung von 34 rag 1,1'-CarbOnyldiimidazol in 1,0 ml Dimethylformamid versetzt, worauf das erhaltene Gemisch zwei Stunden bei -10 C gerührt und dann mit einer kalten zuvor mit N-Athyl-morpholin neutralisierten Lösung von 45,6 mg 3-Mercapto-2-D-methylpropanoyl~L-prolin in 1 ml Dimethylformamid versetzt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde dann bei -10 C eine weitere Stunde gerührt, worauf die Temperatur des Reaktionsgemisches langsam auf Raumtemperatur ansteigen gelassen und dann das Lösungsmittel unter vermindertem Druck bei 40 C abgedampft wurde. Der hierbei erhaltene Rückstand wurde in A'thylacetat" auf genommen, worauf das erhaltene Gemisch gekühlt und dann aufeinanderfolgend mit 0,1 n-HCl und dreimal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen wurde. Die verbliebene organische Phase wurde über wasserfreiem MgSO. getrocknet, worauf das Lösungsmittel in einem rotierenden Verdampfer abgedampft wurde. Das erhaltene Produkt wurde d,urch Chromatographieren in einer mit Sephadex LH-20 ' gefüllten Kolonne von 1,2 cm Durchmesser und 95 cm Länge unter Eluieren der Kolonne mit Isopropanol weiter gereinigt. Von den miteinander vereinigten Scheitelfraktionen wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft, womit 60,5 mg der genannten Verbindung erhalten wurde. Diese Verbindung erwies sich bei der unter Verwendung der Lösungsmittelsysteme 1, 2, 3 und 5 durchgeführten Dünnschicht Chromatographie ale homogen. r '

25.3,1980

.*.;.«.« ^{AP A 61 K}/215 457

2 Ij- 4 Ö / - 22 - ' 56 198/11 . . .

Beispiele 36 bis 43:

Wenn bei der Arbeitsweise gemäß den Beispielen 34 und 35 das gemäß Beispiel 34 eingesetzte L-Phe-Salz durch die Toluolsulfonsäuresalze der Benzoy.lester des Glycine, L~ Alanine, L-Tryptophany_f L-Tyrosins, L-Isoleucins, L-Leucins, L-Histidins bzw, L-Valins ersetzt wurde, wurden folgende Verbindungen erhalten.

Beisp^ie^l y©_tI ^r^iⁿiL^uil9.

36 . .N^£3~(N*-Cyclopentylcarbonylglycylthio)-2--D-

methylpropanoylj-L-prolin

37 Ν*^-Γ3-(N^-Cyclopentylcarbonyl-L-t ryptophylthio)™2'

D-methylpropanoyll "L-proliri

38 * N⁰^iTs-(N^-Cyclopen ty lcarbonyl-L-ty ro sylt hio)-2~

D-methyl.propanoy3j-L-pro.liri -

39 N«ⁱ-^3-(N^ei^Cyclopentylcarbonyl-L-Isoleucylthio)-2·-

D-met hy !propan oy3j-L~ prolin

40 N^eÄ~£3""(N^iSi:-Cyclüpentylcarbonyl-L-leucyli:hio)-2»

D-methylpropanoylj-L-prolin

41 N^'»/,"3-(N^eii»Cyclopentylcarbonyl~L-histidylthxo)~2~

D-methylpropanoyl3-L~prolin

42 _r W^-13-(N^-Cyclopentylca rbonyl-L-valy11h io)-2-D-

methylpropanoylJ-L-prolin

43 U^" i°3 - (Ν⁵·¹·- Cy c 1 ο ρ e η t y 1 c a r b ο η y 1 - L -a 1 anylthio)~2~D»

m e t h y 1 ρ r ο ρ a η ο y Ij - L - ρ r ο 1 i n

Beispiel 44:

Wenn bei der Arbeitsweise gemäß Beispiel 35 das gemäß den Beispielen 35 bis 43 eingesetzte 3~i^v!ereapto-"2»D»methy 1-propanoy3.TL-proJ.in durch die gemäß den Beispielen 3 bis 12 eingesetzten Verbindungen ersetzt wurde, wurden in ähnlicher

25.3.1980 , · . AP A 61 Κ/215 457

:§ &.:$. 7 - 23 - . 56.198/11

Weise die L-3,4-Dehydroprolin-, D,L-3,4-Dehydroprolin-, .L-3-Hydroxyprolin-, L~4~Hydroxyprolin~ und L-Thiazolidinderivate erhalten.

Beispiel 45: Herstellung des N^e^-(3~L-Phenylalanylthio~2-D~methylpropanOyl)~L-prolins .

Aus der gemäß Beispiel 24 hergestellten Verbindung wurde die Schutzgruppe dadurch abgespalten, daß ein Gemisch aus 30 mg der erwähnten Verbindung, 50 ^uI Anisol und 200 jul wasserfreie Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur eine Stunde gerührt wurde. Im Anschluß daran wurde aus dem Reaktionsgemisch das Anisol und die Trifluoressigsäure bei 35 C

* unter vermindertem Druck abgetrieben, Worauf dor erhaltene Rückstand mit wasserfreiem Äther verrieben wurde. Der hierbei verbliebene weiße Rückstand wurde durch Chromatographieren mit einer Sephadex G-10^L gefüllten Kolonne von 1,2 cm Durchmesser und 95 cm Länge unter Eluieren mit 5%iger Essigsäure gereinigt. Die miteinander vereinigten Scheitelfraktionen wurden gefriergetrocknet und lieferten 17,5 mg der genannten Verbindung. Diese Verbindung erwies sich bei der bei einem pH-Wert von 1,9 bzw. 5,0 durchgeführten Papierolektrophorese und bei der mit den Löoungs.mit telsystemen 4 und 5 durchgeführten Dünnschichtchromatographie als homogen,

Beispiele 46 bis 53:

Nach der in Beispiel 45 beschriebenen Arbeitsweise wurden aus den gemäß den Beispielen 25 bis 32 hergestellten Verbindungen die Schutzgruppen abgespalten, wobei folgende Verbindungen erhalten wurden«.

i O 4 |t / - ²⁴ ~ ⁵⁶

25.3.1'98O

AP A 61 K/215 457

46 N^-(3-Glycylthio~2-D-methylpropanoyl)-L-

prolin

47 N*-(3-V-Tryptophylthio-2-D-methylpropänoyl)~

L-prolin

48 N^-"("3-L~Tyrosylthio-2-D»inethylpropanoyl)-L~

prolin

49 N^~(3~L~IsoleucyithiQ~2-"D~methylpropanayl)-L~-

prolin

50 - N^e4~(3~L-Leucylthio-2-D-methylpropanoyl)-L-

prolin

51 N^™(3-L-Hist.idylthio~2-D--methylprppanoyl}"L-

prolin ·

52 H^(3-L-Valylthio-2-D~methylpropanoyl)-L- .

prolin

53 N"⁴-(3-L-Alanylt hio~2~D-rnethylp ropanoyl)-L-

prolin

Beispiel 54: '

Nach der in Beispiel 45 beschriebenen Arbeitsweise wurden durch Abspalten der Schutzgruppen aus aen gemäß Beispiel hergestellten Verbindungen die entsprechenden L.-3_t4~ Dehydroprolin-, D,L-3.,4-Dehydroprolxn-, L~3~Hydrcxyprolin- , L-4-Hydroxyprolin- und L-Thiazolidinderivate horgostellt.

Beispiel 55; Herstellung des N-Hydroxysu-ccinimidesterr. der Cyclopentancarbonsäure

Eine kalte Lösung von 11,4 g Dicyclohexylcarbodiimid in. Dimethylformamid vmrde bei einer Temperatur von 0 ⁰C tropfenweise einer Lösung 5,71 g CycVopentancarbonsäure und

.25,3.1980 AP A 61 K/2.15 457 -"25 - 56 198/11

5,76 g N-Hydroxysuccinimid in Dimethylformamid zugesetzt, worauf das Reaktionsgemisch 30 Minuten bei einer Temperatur von O ⁰C und dann über Nacht bei 4 C gerührt wurde. Im Anschluß daran vvur.de der auskristallisierte Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und mit Äthylacetat gewaschen. Das mit den Waschflüssigkeiten vereinigte FiItrat wurde unter vermindertem Druck von Lösungsmitteln befreit, worauf der erhaltene Rückstand aus Benzol und Hexan umkristallisiert wurde. Auf diese Weise wurden 5,77 g weiße Kristalle mit Fp = 72,5 bis 73 C erhalten. Das IR-Absorptionsspektrum dieser Verbindung in Chloroform ergab das für N-Hydroxysuccinimidester typische Spektrum

Analyse:

berechnet: 56,86 % C₁ 6,20 % H, 6,63 % N gefunden: 56,77 % C, 6,07 % H, 6,66 % N.

Beispiel 56: Herstellung des N^fii~Cyclopentylcarbonyl~N^£--tert~ butyloxycarbonyl-L-lysins

Eine Lösung von 1,2316 g N^e-tert~Butyloxycarbonyl-L~lysin und 420 g NaHCO- in 10 ml Wasser und 5 ml Tetrahydrofuran wurde in einem Eisbad unter Rühren gekühlt und dann mit einer kalten Lösung von 1,19 g der gemäß Beispiel 50 hergestellten Verbindung in 10 ml Tetrahydrofuran versetzt, worauf das Reaktionsgemisch über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und dann in einem drehbaren Verdampfer bei 35 C vom Tetrahydrofuran befreit wurde«. Der verbliebene Rückstand wurde mit etwa 20 rnl Wasser versetzt, worauf der pH-Wert des erhaltenen Gemisches durch Zusetzen von festem NaHCO.,

auf 9 eingestellt wurde. Die wäßrige Phase wurde dreimal mit Äthylacotat extrahiert, und die organische Phase wurde verworfen. Die wäßrige Lösung wurde in einem Eisbad gekühlt

25.3.1980 AP Λ 61 Κ/215 ' 215 4 5 7 - 26 - 56 198/11

und dann in Anwesenheit von Äthylacetat mit 1 n-HCl auf einen. pH-Wert von 2 angesäuert. Die organische Phase wurde zweimal mit Eiswasser und dann zweimal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, darin über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und schließlich filtriert, worauf vom Filtrat das Lösungsmittel in einem drehbaren Verdampfer abgedampft und der hierbei erhaltene Rückstand aus Äthyläther und Hexan umkristallisiert wurde« Auf diese Weise wurden 1,135 g weißer Kristalle mit Fp = 104,5 bis 105,5 ⁰C erhalten. Analyse:

berechnet: 59,63 % C, 8,83 % H, 8,18 % H gefunden; 59,74 % C, 8,85 % H, 8,24 % N.

Bei car bei einem pH-Wert von 1,9 und bei einem pH-Wert von 5,0 durchgeführten Papierelektrophorese und bei der mit den Lösungsmittelsystemen 1, 2 unö 3 durchgeführten Dünnschicht-Chromatographie erwies sich die erhaltene Verbindung als homogen,

Beispiel 57: Herstellung dos N^-Cyclopentylcarbonyl-N^-tertbu t y loxy ca r bony 1~L~ Iy sin*-N~hydr oxy succinimide st ers

Eine auf -5 'C gekühlte Lösung von 1,027 g der gemäß Beispiel 56 hergestellten Verbindung und von 346 mg N-Hydroxysuccinimid in 10 ml CH₀CIp wurde unter Rühren mit einer Lösung von 680 mg uicyclohexylcarbodiimici in 5 ml CrLCl₀ versetzt, vvoreuf das Reaktioncgemiech 30 Minuten bei O "C und anschließend über Nacht bei 4 C gerührt, dann vom Reaki ionsgernisen aer aus kristallisierte D icy c lohe xy !harns10ff abfiltriert uηd mit Άthy1acetat gewa3cheη, das erhaI- tenβ Filtrat mit der Waschflüssigkeit vereinigt und das Ganze zweimal mit ln-NaHCO₇~Lösung, zweimal mit Wasser und

25.3.1980 AP A 61 K/215 457 - 27 - 56 198/11

schließlich mit einer gesättigten Kochsalzlösung gewaschen wurde. Die erhaltene organische Phase wurde über wasserfreiem MgSO.getrocknet, dann filtriert und in einem drehbaren Verdampfer vorn Lösungsmittel befreit, worauf der erhaltene Rückstand aus Isopropanol umkristallisiert wurde. Auf diese Weise wurden 0,844 g weißer Kristalle mit Fp. = 140,5 C erhalten, deren IR-Absorptionsspektrum in Chloroform das für N-Hydroxysuccinimidester typische Spektrum ergab

Analyse:

berechnet: 57,39 % C₁ 7,57 % H, 9,56 % N gefunden: 57,10 % C₁ 7,57 % H, 9,61 %.N

Beispiel 58: Herstellung dos N^-Cyclopentylcarbonyl-N^&~tert- -butyloxycarbonyl-L-Lysyl-L-phenylalanins

Eine Lösung von 220 mg der gemäß Beispiel 57 hergestellten Verbindung in 2 ml Dioxan wurde tropfenweise einer Lösung von 99,1 mg L-Phenylalanin und 51 mg NaHCO₇' in einem Gemisch aus 2 ml Wasser und 1 ml Dimethylformamid zugesetzt, worauf das Reaktionsgemisch über Nacht bei Raumtemperatur gorührt und anschließend das Dioxan in einem drehbaren Verdampfer bei 35 ⁰C abgetrieben wurde. Der hierbei verbliebene Rückstand wurde mit 10 ml Äthylacetat versetzt, worauf das erhaltene Gemisch gekühlt und dann mit 0,In-HCl auf einen pH-Wert von 2 angesäuert und die hierbei erhaltene wäßrige Phase verworfen wurde» Die organische Phase wurde aufeinanderfolgend mit Eiswasser und einer gesättigten Kochsalzlösung gewaschen, dann über .wasserfreiem· MgSO. getrocimet und schließlich in einem drehbaren Verdampfer vom Lösungsmittel befreit, worauf der erhaltene. Rückstand aus Äther und Petroläther (Kp = 30 bis 60 C) umkristallisiert wurde.

25.3.1980 AP A 61 K/215 457 - 28 - 55 198/11

Auf diese Weise wurden 95 mg eines weißen Festkörpers mit Fp = 90 bis 92 ^GC erhalten. Die erhaltene Verbindung erwies sich bsi der bei einem pH-Wert -von 1,9 und einem pH-Wert von 5,0 durchgeführten Papierelektrophorese und bei der unter Verwendung der Lösungsmittelsysterne 1, 2, 3 und 4 durchgeführten Dünnschichtchromatographie als homogen, Analyse: .

berechnet: 63_f78 % C₁ 8,03 % H, 8,58 % N gefunden: 63,40 % C, 8,07 % H, 8,34 % N

Beispiel 59: Herstellung des NS»tert~butyloxycarbonyl-L™lysyl~L~phenylalanylthio)»2"D-methylpropanoylj -L-pro.lins . · .

Eine in einem Eis-Trockeneis-Aceton-Bad auf eine Temperatur von "20 C gekühlte Lösung von 73,5 mg der gemäß Beispiel hergestellten Verbindung in 0,5 ml frisch destilliertem Dimethylformamid wurde mit einer gekühlten Lösung von 25 mg 1,1'-Carbonyldiimidazol in I₁O ml Dimethylformamid versetzt, worauf das erhaltene Gemisch 2 Stunden bei -10 C gerührt und dann mit einer kalten und zuvor mit N-Athylmorpholin neutralisierten Lösung von 36 mg 3-*Mercapto~2~D™mothyl~ prcpancyl-L-pFolin in 1 ml Dimethylformamid versetzt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde sodann bei -10 C ©ine weitere Stunde gerührt j worauf die Temperatur des.Reaktionsgemischea langsam auf Raumtemperatur ansteigen gelassen wurde, anschließend das Lösungsmittel bei 40 C unter vermindertem Druck abgetrieben und schließlich der erhaltene Rückstand in Äthylacetat aufgenommen wurde«. Das so erhaltene Gemisch wurde in einem Gemisch aus Eis und Wasser gekühlt, dann a u f e i η a η c! e r f ο 1 g e η d m i t e i η e m G α m i s c h a us In-Zitrone η s ä u r e und dreimal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, an-

25.3.1980 AP A 61 K/215 29 - 56 198/11

schließend über wasserfreiem MgSO. getrocknet und .schließlich in einem drehbaren Verdampfer vom Lösungsmittel befreit. Der erhaltene Rückstand wurde, durch Chromatographieren in einer mit Sephadex LH-20 ⁿ gefüllten Kolonne von 1,2 cm Durchmesser und 95 cm Länge unter Eluieren der Kolonne mit einem im Volumenverhältnis von 3:7 aus Tetrahydrofuran und Isopropanol bestehenden Lösungsmittelgemisches weiter gereinigt, wobei von den miteinander vereinigten Scheitelfraktionen das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgetrieben wurde. Auf diese Weise wurde die oben genannte Verbindung erhalten, welche abgekürzt auch als N ¹^-£3·-.(N⁴^- Cpc~N^&~BoC"L~Lys-L~Phe~thio)~2~D~methylpropanoylJ-L-prolin bezeichnet werden kann.

Beispiel 60: Herstellung des N^-fS-fN^-Cyclopentylcarbonyl-L-iysyl"L«phenylalanylthio)-2-D~methylpropanoylJ-L-prolins

Durch Umsetzen von 30 mg der gemäß Beispiel 59 hergestellten Verbindung mit 200^1 wasserfreier Trifluoressigcäure in 50 ^iI Anisol während einer Stunde bei Raumtemperatur wurde die N^-Boc-gruppe abgespalten, worauf vom Reaktionsgemisch das Anisol und die Trifluoressigsäure box 35 C unter vermindertem Druck abgetrieben und der hierbei erhaltene Rückstand mit wasserfreiem Äther verrieben wurde. Der Rückstand wurde durch Chromatographieren an einer mit Sephadex G-IO ^m gefüllten Kolonne von 1,2 cm Durchmesser und 95 cm Länge unter iZluieren mit 5%iger Essigsäure gereinigt, wobei die miteinander vereinigten Scheitelfraktionen beim Gefriertrop-knen die- oben genannte Verbindung lieferten, die abgekürzt auch als N"^-|.*3-(M'-^i:i-Cpc-L-Lys™L-Phe-thio)-2~D-rnethyl-, propanoylj-L-prolin bezeichnet werden kann»

25.3.1980

AP A 61 K/215

215 4 5/ - 30 - 56 198/11

Beispiele 61 bis 68:

Wenn bei der Arbeitsweise gemäß den Beispielen 58, 59 und 60 das gemäß Beispiel 58 eingesetzte L-Phenylalanin durch Glycin, L-Alanin, L-fryptophan, L-Tyroein, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Histidin bzw, L-Valin ersetzt wurde, wurden die folgenden Verbindungen erhalten.

61 1Ψ<~£3~ (N^-Cy el open tylcarbonyl-L-lysyl-glycyl-'

i:hio)-2~D-rnethylpropanoyl.] ~L~prolin

62 N^c4-_tr3-(N<^~Cyclopentylcarbonyl~L~lysyl~L~t rypto-

phylthio)~2-D-'-methylpropano3/y'J-L-prolin

63 N^-l.'S-iN^'-Cyclopentylcarbohyl-L-lysyl-L-tyrosyl-

. thio)~2~D~methylpropanOjljf ~L-prolin

64 N*⁴-/ 3-(N⁴^-CyC lopen ty !carbon yl~L.-lysyl~L.--i so™

leucylthio)~2~D~methylpropanoyin»L-prolin

65 N^-i3-"(N^~Cyclopentylcarbonyl"L-ly8yi-L-leucyl»

thlo)~2-D~methylpropanoyl1-L-prolin

66 N^-fS-CM^-Cyclopentylcarbonyl-L-lysyl-L-histi-

dylthio)-2™D-methylpropanoyIj-L-prolin 6 7 · N^c4·- Iz »(Ν^Λ-. Cy c 1 ο ρ e η t y 1 c a r b ο η y 1 - L-lysyl-L- ν a 1 y 1 -

thxo)-2-D~methylpropanoylJ~L-prolin 68 ' . W—iZ- (N^-Cyclopen t ylca rbonyl-L-'lysyl-L-alanyl-

th:Lo)-=2-D~met!iylpropanoylj~L-prolin

Beispiel 69 ;

Wenn bei der Arbeitsweise gemäß den Beispielen 59 und das gemäß dan Beispielen 59 und 61 bis 68 eingesetzte 3~Mercapto-2~D~raethylpropsnoyl-L~prolin durch die Verbindungen gemäß den Beispielen 3 bis 12 ersetzt wurde* wurden in ähnlicher IVeiee die entsprechenden L-3,4~DehydrQprolin-,

25.3.1980 AP A. 61 K/215 457 - 31 - 56 198/11

D,L-3,4-Dehydroprolin-, L-3-Hydroxyproliri-, L-4-Hydroxyprolin- und L-Thiazolidinderivate erhalten«

Beispiel 70:

Wenn bei der Arbeitsweise, gemäß den Beispielen 55 bis 57 die gemäß Beispiel 55 eingesetzte Cyclopentancarbonsäure durch Pyro-L-glutaminsäure ersetzt wurde, wurde der N^-Pyro-L-glutamyl-N^-tert-butyloxycarboriyl-L-lyöin-N-hydroxy-succinimidester erhalten. Wenn bei der Arbeitsweise gemäß den Beispielen 58 bis 69 der gemäß Beispiel 58 eingesetzte N^Cpc-N^-Boc-L-Lye-N-hydroxysuccinimidester durch die in der oben angegebenen Weise hergestellte Verbindung ersetzt wurde, wurden die Pyro-L-glutamyl-derivato erhalten.

Beispiel 71: Herstellung des Pyro-L-glutamyl-L-phenylalaninbenzylesters ·

Eine Lösung von 0,52 g Pyro-L-glutaminsäure', 1,72 g L~Phenylalaninbenzylester-Toluolsulfonsäuresalz und 0,55 ml N-Äthylmorpholin in 5 ml Dimethylformamid und 20 ml Diehlormethan wurde unter Rühren in einem Eisbad gekühlt und dann mit einer Lösung von 0,82 g Dicyclohexylcarbodiimid .in 2 ml Dichlormethan -versetzt, worauf das Reaktionsgemisch zunächst .eine Stunde in einem Eiswasserbad und dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt wurde« Anschließend wurde vom Reaktionsgernisch der entstandene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und der Filterrückstand mit Äthylacetat gewaschen. Das Gemisch aus FiIt rat und Waschflüssigkeiten wurde unter vermindertem D^uck in einem drehbaren Verdampfer bei 40 C von den Lösungsmitteln befreit, worauf der erhaltene Rückstand in 25 ml Äthylacetat aufgenommen, die erhaltene Lösung

25.3,1980 AP A 61 K/215 457 - 32 - 56 198/11

bis zur neutralen Reaktion gewaschen, dann über wasserfreiem MgSO. getrocknet und anschließend filtriert und vom FiItrat das Lösungsmittel in einem rotierenden Verdampfer abgedampft wurde« Der hierbei erhaltene Rückstand wurde aus Isopropanol und Äther umkristallisiert und lieferte 1,01 g weißer Nadeln mit Fp - 103 bis 104,5 ⁰C. Die erhaltene Verbindung erwies sich unter beliebigen Bedingungen bei der Dünnschichtchromatographie und bei der Elektrophorese als homogen

Analyse: . "

berechnet: 68,84 % C₁ 6,05 % H, 7,64 % N gefunden: 68,58 % C, 6,05 % H, 7,56 .% N

t ·

Beispiel 72: Herstellung des Pyro~L-glutamyl~L~phenylalanins

Aus 1,0 g der gemäß Beispiel 71 erhaltenen Verbindung wurde die als Schutzgruppe vorliegende Benzoylestergruppe durch katalytisches Hydrieren in 0,15 nil Eisessig und 15 ml Äthanol in Anwesenheit von 150 mg eines 10 Gew.-% Palladium auf Kohle enthaltenden Katalysators bei einem Wasserstoff™ druck von 1,4 bar bei Raumtemperatur über Nacht abgespalten, worauf der Katalysator abfiltriert _l vom Filtrat das Lösungsmittel in einem drehbaren Verdampfer abgedampft und der erhaltene Rückstand aus Isopropanol und Benzol umkristallisiert wurde» Auf diese Weise wurden 402 mg weißer Kristalle mit Fp » 147 bis 149 ⁰C erhalten. Die erhaltene Verbindung erwies sich bei der bei einem pH-Wert von 1,9 und einem pH-Wert von 5,0 durchgeführten Elektrophorese und box der mit den Lösungsmiitelsystemen 1*2 und 3 durchgeführten Dünnschicht Chromatographic als homogen. ' · Analyse % '

berechnet; 60,86 %C, 5,84. % H, 10,14% N gefunden.: 60,37 % C₁ 5,85 % H, 9,98 %'H

25.3.1980

AP A 51 K/215 457 - 33 - 56 198/11

Beispiel 73: Herstellung des N^oi~£3~(Pyro~L.~glutarnyl-L- -phenylalanylthio)~2-D-met"hylpropanoyl3 -L-prolins

Eine Lösung von 87 mg 1,1'-Carbonyldiirnidazol in 1,0 ml Dimethylformamid Wurde bei einer Temperatur von -15 C einer Lösung von 139 mg der gernäß ,Beispiel 72 hergestellten Verbindung in 0,5 ml Dimethylformamid zugesetzt, worauf das erhaltene Gemisch eine Stunde bei -10 C gerührt und dann mit einem Gemisch aus 119,5 mg 3-Morcapto-2~D-methyl^- propanoyl-L~pyrolin, 0,072 ml N-Äthyl-morpholin und 1 ml Dimethylformamid versetzt wurde und anschließend das Reaktionsgemisch eine weitere Stunde bei -10 C gerührt wurde. Im Anschluß'dara'n wurde die Temperatur des Reaktionsgemisches auf Raumtemperatur ansteigen gelassen, worauf das Dimethylformamid in einem rotierenden Verdampfer bei 40 ⁰C unter vermindertem Druck abgetrieben und anschließend der erhaltene Rückstand in 7 ml Äthylacetat und 2 ml ln~Zitronensüure aufgenommen wurde. Die hierbei erhaltene organische Bhase wurdo zweimal mit ln~Z.it ronensäure und dann zweimal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem MgSO_/ getrocknet und nach dem Filtrieren in einem rotierenden Verdampfer vom Lösungsmittel befreit. Der erhaltene Rückstand wurde durch Ghromatographieren über -eine mit Sephadex G-25 ''V gefüllte Kolonne von 1,2 cm Durchmesser und 99 cm Länge unter Eluieren mit einem im Volumenvsrhältnis von 4:1:5 aus n-Butanol, Essigsäure und Wasser bestehenden Garnisch goreinigt. Die erhaltene Verbindung erwies sich bei der mit den Lösungsmittelsystemen 1, 2 und 3 durchgeführten Dünnschichtchromatographie und bei der b,ei einem pH-Wert von 5,0 durchgeführten Elektrophorese als homogen.

• 25.3.1980

AP A 61 K/215 457 - 34 ~ 56 198/11

Beispiel 74:

Beim Arbeiten nach der in Beispiel 71 beschriebenen Arbeitsweise wurde bei Verwendung von N^si,N^g~Bis~t-butyloxycarbonyl- -L-Iysin (später als Bis-Boc-L-Lys bezeichnet) bzw, U^U',H?-', N^-Triadamantyloxycarbonyl-L-arginin (später als Tri~Adoc- · -L-Arginin bezeichnet) statt der pyro-L-Glutaninsäure das entsprechende Bis-Boc-L-Lys- bzw. Tri-Adoc-L-Argderivat des L~Phe«benzylesters erhalten. Bis-Boc-L-Lys ist im Handel erhältlich. Tri-Adoc~L-Arg kann nach den Angaben von Oager, G. und Geiger, R. in Chem. Ber. 103, 1727 (1970) hergestellt werden, .·

Beispiel 75:

Wenn bei der Arbeitsweise gemäß den Beispielen 71 und.74 die Benzylester von Gly, AIa, Trp, Tyr,ILe, Leu, His bzw. VaI eingesetzt wurden, wurden die entsprechenden Pyro-L- -glutamyl-, Bie-Boc-L-Lys- und Tri-Adoc~L-Arg~derivate erhalten, Die erwähnten Benzylester sind im Handel erhältlich«, Die als Schutzgruppe vorliegende Bonzylestergruppe kann im wesentlichen nach der in Beispiel 72 beschriebenen Arbeitsweise abgespalten werden«,

Beispiel 76:

Wenn die gemäß den Beispielen 72, 74 und 75 hergestellten Verbindungen entsprechend der in Beispiel 73 beschriebenen Arbeitsweise mit irgendeiner der gemäß den Beispielen 3 bis 12 hergestellten Verbindungen umgesetzt werden, werden die entsprechenden Bis-Boc~L»Lys~ und Tri~Adoc«L~Arg-derivate erhalten« Die als Schutzgruppen vorliegenden Bis-Boc-- und

25.3.1980

AP A 61 K/215 457

"91 Si^!57-^: " ³⁵ " 56.198/11

Tri-Adoc-Gruppen können durch Umsetzen der Verbindungen mit Trifluoressigsäure in Anisol abgespalten werden.

Wenn im wesentlichen nach den in den Beispielen 2 bis 12 und 71 bis 76 beschriebenen Methoden vorgegangen wird, kann eine Familie von Thiolestern der allgemeinen Formel

O • . ·!

R-A-S- (CH₂)_n - CH - C - R₂

. «1

hergestellt werden, worin

J? L-Arginyl, L-Lysyl oder Pyro-L~glutamin bedeutet, A L-Piienylalanyl-, Glycyl, L-Al-anyl, L~Tryptophyl, L-Tyrosyl, L-Isoleucyl, L-Leucyl, L-Histidyl odor L-Valyl darstellt, deren pe-Aminogruppe in Amidbindung

rait R verknüpft ist,

R für Wasserstoff oder Methyl steht, R₉ L~Prolin, L-3,4-Dehydroprolin, D,L-3,4-Dehydroprolin, L~3-Hydroxyprolin, L-4—Hydroxyprolin oder L-Thiazolidin bedeutet, deren Irninogruppe in Imidbindung mit λ steht

und η gleich O oder 1 ist mit der Maßgabe, daß, wenn η für

,Null steht, R₁ Methyl· ist.

Beispiel 77: Herstellung des !^-/^-(N^-Benzoyl-L-tryptophyl™ thio}~2-ⁱD~methylpropanoyi3 -L~prolins

Eine in einem Eis-Trockeneis-Aceton-Bad auf -20 C gekühlte Lösung von 62 mg N^lrft~BenzOyl~L--tryptophan in 0,5 ml destillierten Dimethylformamids wurde mit einer⁴ kalten Lösung von 35 -ng 1,1'-Carbonyldiimidazol in 1_;0 ml Dimethylformamid versetzt, worauf das erhaltene Gemisch. 2 Stunden bei -10 ⁰C gerührt und dann mit einer zuvor mittels N-Äthylmorpholin

. -25.3.1980

AP A5i K/215 457 a I C I e I - 36 - 56 .198/11

neutralisierten Lösung von 48 mg 3-Mercapto~2~D-methylpropanoyl-L-prolih versetzt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde sodann bei -10 C eine weitere Stunde gerührt", worauf die Temperatur des Reaktionsgemisches langsam auf Raumtemperatur ansteigen gelassen wurde und anschließend das Lösungsmittel vom Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck bei 40 ⁰C abgetrieben wurde. Der hierbei erhaltene Rückstand wurde in Äthylacetat aufgenommen, worauf das erhaltene Gemisch in einem Eisbad gekühlt und dann aufeinanderfolgend mit 0,1 n~HCl und dreimal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen wurde. Nach dem Trocknen der Lösung über wasserfreiem MgSO. wurde das Lösungsmittel in einem rotierenden Verdampfer abgetrieben, worauf der erhaltene Rückstand durch Chromatographieren an einer mit Sephadex

t m LH-20 ' gefüllten Kolonne von 1,2 cm Durchmesser und 95 cm Länge unter Eluieren mit Isopropanol gereinigt wurde=, Aus den miteinander vereinigten Scheitelfraktionen wurden nach .dem Abtreiben des Lösungsmittels unter vermindertem Druck 60.5 mg oer genannten Verbindung in Form eines schaumartigen Materials erhalten«, Diese Verbindung erwies sich bei der unter Verwendung der Lösungsmittelsyoteme I₁ 2, 3 und 5 durchgeführten Dünnschichtchromatographie als homogen»

Beispiele 78 bis 85:

Wenn bei der Arbeitsweise gemäß Beispiel 77 das gernäß diesem Beispiel eingesetzte N^-Benzoyl-L-t ryptophan durch N. ^-Benzoyl-L-tyrosin, N^Benzo.yl-L-hiscidin , N^Benzoyl-phenylalanin , N**-Ben;zoyl~glycin, N^-Bonzoyl-alanin , [\H»Benzoyl~L~ isoleucin, iv^-Benzoyl-L»leucin bzw. N^-Benzoyl-L-valin ersetzt wurde, wurden die folgenden Verbindungen erhalten«

25.3«1980

AP A 61 K/215 457

5 / - 37 - 56 198/11

Verbindung

78 ^- f3- (Ν«*·- Benzoyl-L-1 y ro sylt h io) -2-D-rae t hy 1-

propanoylj-L-pyrolin

79 N^rf-/'3~(N^-Benzoyl-L~histidylthio)~2-D-methyl

propanoyij-L-pyrolin

80 N^-fS-t^-Benzoyl-L-phenylalanylthioJ-a-D»

-methylpropanoylJ-L-pyrolin

81 N«^t-J['3-(N«^<-Ben2oyl-glycylthio)'-2»D--methyl-

propanoyljf-L-prolin

82 N«⁴-.f3-(N«^Ä--BenEoyl-L-alanylthio)'-2-D-methyl~

propanoylJ.-L~prolin

83 N^-^S-fN^-Benzoyl-L

propanoyll-L-prolin

84 N^etr..jr3-(N^Ben-2.oyl-L

propanpylj-L-prolin

85 N»<-f 3-(N⁰⁴V-Benzoyl-L-va IyI thio)-2-D-m-et hyl-

propanoyl3-L-prolin

Beispiel 86:

In ähnlicher Weise wurden beim Arbeiten nach der in Beispiel 77 beschriebenen Arbeitsweise unter Verwendung der Verbindungen gemäß den Beispielen 3 bis 12 statt des in den Beispielen 77 bis 85 eingesetzten •3-Mercapto-2~D-me-thyl~ propanoyl-L«prolins die entsprechenden L-3,4-Dehydroprolin-, D ,L-3 ,4-Dehydrpprolin- , L-3-Fly dr oxy prolin- , L-4™ Hydroxyprolin bzw. L-Thiazolldinderivate erhalten.

Eine alternative Methode zum Herctellen des N^CS-(N ~Benzoyl-'phenylalanylthio)«2~D"niethylpropanoylJ -prolins wird in den folgenden beiden Beispielen beschriebene

. 25.3.1980

AP A 61 K/215 21 5 4 57 - 38 - . 55 198/11

Beispiel 87: Herstellung des N^-Benzoyl-phenylalanin-N- -hydroxysuccinimidesters

In ein im Volumenverhältnis von 1:1 aus Tetrahydrofuran und Dimethylformamid bestehendes Lösungsmittelgemisch wurden 1,347 g BenzoyJL-phenylalanin und 0,576 g N-Hydroxy- -succinimid eingemischt» worauf das erhaltene Gemisch in Anwesenheit von 1,133 g Dicyclohexylcarbodiimid über Nacht bei 4 C stehen gelassen wurde.

Das Reaktionsgemisch wurde sodann filtriert, worauf vom Filtrat das Lösungsmittel bei 30 C unter vermindertem Druck abgetrieben wurde. Der hierbei erhaltene weiße Rückstand wurdetaus einem Gemisch- aus Tetrahydrofuran und Isopropylalkohol umkristallisiert und lieferte mit einer Ausbeute von 65,2 % 1,194 g eines weißen Feststoffes mit Fp ~ 156 bis 157 ⁰C. Das IR--Absorp.tionsspekt.rum in Chloroform zeigte eine für eine NH-Gruppe typische Absorptionsbando bei 3440 cm ", für die N-Carboxy&ucciniraidgruppe typische Absorption.ebanden bei 1818 cm , 1790 cm und 1744 cm r und eine für die N~Beri2oylgruppe typische Absorptionsbande bei 1669 cm ' „

Beispiel 88: Herstellung des N^äff:-^3-"(N^<:!i™Benzoyl-phenyl« alanylthio)~2-D-methylpropanoylj-L~prolins

Ein entsprechend den Angaben in Beispiel 87 aus 93,3 mg 2~D-Methyl-3-mercaptopropanoyl~L~prolin, 62 mg i-Hydroxybenzotriözol (HOBt) und 165 mg N-Benzoyl-phenylalanyl-N- -hydroxy-succinimidester hergestelltes Reaktionsgemisch wurde in einem Eisbad auf etwa 0 ⁰C gekühlt und dann mit 0,0544 ml N-Äthylrnorpholin versetzt, worauf das nunmehr vorliegende Gemisch in einem Eisbad 3 Stunden gerührt, dann

25.3.1980

AP A 61 K/215

^:2! 1 5 '4 5 7 - 39 - ' 56 19.8/11

über Nacht bei 4 ⁰C und schließlich 20 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen wurde. Die Umsetzung wurde durch Zusetzen von 25 μΙ-Ν,Ν-Dimethyl-l,3~propandiarnin zum Reaktionsgemisch und 2stündiges Rühren desselben abgebrochen» Pas Reaktionsgemisch wurde sodann mit Äthyl-' acetat verdünnt, worauf das verdünnte Reaktionsgernisch mit kalter 0,1 n~HCl, dann zweimal mit Wasser und schließlich dreimal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen wurde. Die verbliebene organische Phase wurde über wasserfreiem MgSO^ getrocknet, dann filtriort und unter vermindertem Druck in einem drehbaren Verdampfer vorn Lösungsmittel befreit, wobei als Rückstand ein klares öliges Produkt verblieb.

Dieses ölige Produkt wurde durch Chromatographieren in

t m einer mit Sephadex LH--20 gefüllten Kolonne von 1,2 cm Durchmesser und 96 cm Länge unter Eluieren mit Tetrahydrofuran, wobei 'Fraktionen zu je 2,5 ml aufgefangen wurden, gereinigt. Die Fraktionen Nr. 30 und Nr. 31 wurden miteinander vereinigt und lieferten beim Abtreiben des Lösungsmittels im Hochvakuum 110 mg eines Rückstandes. Durch Zusetzen von wasserfreiem Äther zum erhaltenen Rückstand wurde ein .weißes.,. ,.g.um.miart.iges Material erhalten, das nach dem Äbdekantieren des Äthers in Tetrahydrofuran gelöst vvurde. Die erhaltene Losung wurde in ein Reagenzglas übergeführt und darin im-Stickstoffstrom und anschließend über Nacht über PpO₆. getrocknet» Hierbei wurden 82 mg eines · schaumartigen Produktes erhalten»

Die Fraktionen Nr. 29, Nr. 32 und Nr, 33 wurden'unter identischen Bedingungen erneut chromatographiort, wobei die hierbei erhaltenen Fraktionen Nr. 33 bis 36 miteinander vereinigt und in der beschriebenen Weise weiter verarbeitet

25.3.1980 AP A 61 K/215 457 - 40 - " 55 198/11

wurden. Hierbei wurden weitere 51 mg der Verbindung er halten« Die Gesamtausbeute betrug 71 %,

Eine alternative Methode zum Horstellen des -Benzoyl"phenylalanylthio)~propanoyi}-3 ,4-dehydroprolins und verwandter Derivate wird in den folgenden zwei Beispielen beschrieben« ' .

Beispiel 89: Herstellung der.2-Benzoylphenylalanylthiopropansäure

Eine auf ~20 C gekühlte Lösung von Benzoyl-phenylalanin in 30 ml destillierten Dimethylformamids wurde unter kräftigem Rühren tropfenweise mit einer Lösung von 1,1'« Carbonyldiimidazol in 10 rnl destillierten Dirnethylformamids versetzt, wobei die Temperatur des Gemisches nicht über -14 C ansteigen gelassen wurde« Im Anschluß daran wurde das erhaltene Gemisch bei -.1.0 ¹C 'Zunächst 2 Stunden gerührt und dann bei einer Temperatur von 10 C innerhalb einer Stunde mit einer zuvor mittels destillierten N-Äthylmorpholins neutralisierten Lösung von D,L-Thiornllchsäu.re in destilliertem Dimethylformamid versetzt. Die erhaltene Lösung wurde 'dann langsam auf Raumtemperatur erwärmt und dam mit dem gleichen ihres Volumens an Äthylacetat versetzt, worauf das erhaltene Gemisch gekühlt und dann mit einer konzentrierten Lösung von HCL in gesättigter Kochsalzlösung neutralisiert-wurde« Die hierbei entstandene organische Phase wurde dreimal mit einem Gemisch aus 5 Vol..-Teilen gesättigter Kochsalzlösung und 1 VoI»-Teil Wasser gewaschen.

Gelegentlich entsteht ein dreiphasiges System«, In einem solchen Fall wird die mittlere Schicht zusammen mit der

25.3.1980 AP A 61 K/215 457 - 41.- 56 198/11

unteren wäßrigen Phase weiter verarbeitet. Die organische Phase wurde über wasserfreiem MgSO. getrocknet, filtriert und dann in einem rotierenden Verdampfer vom Lösungsmittel befreit. Die mit der wäßrigen Phase vereinigte mittlere Phase wurde mit konzentrierter Salzsäure bei einer· Temperatur von O ⁰G auf einen pH-Wert von 2 angesäuert und dann dreimal mit Äthylacetat extrahiert. Die hierbei erhaltene organische Phase wurde mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, anschließend über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, dann filtriert und schließlich in einem rotierenden Verdampfer eingedampft, wobei als Rückstand ein klares öl erhalten wurde.

Beispiel 90: Herstellung des N^-rS-iN^ thio-propanoyl)~L~3,4-dehydroprolins

Aus 213 mg (1 mmol) F3oc--L«-3,4~dehydroprolin wurde mittels 1 nil wasserfreier Trifluoressigsäure während einer Stunde die Schutzgruppe abgespalten, worauf dem Reaktionsgemisch 3 ml Äthyläther zugesetzt und anschließend die Lösungsmittel bei 30 ⁰C in einem rotierenden Verdampfer abgetrieben wurden, Der hierbei erhaltene Rückstand wurde dreimal mit Äther gewaschen und dann in einem Va.kuumexsiccätor .über NaOH getrocknet»

Eine in einem Trockeneis-Aceton-Bad auf ~·20 C gekühlte Lösung von 358 mg (1 mmol) dor gemäß Beispiel 89 hergestellten Verbindung in 3 ml destilliertem Dimethylformamid wurde unter Aufrechterhaltung einer Temperatur von -10 C ,bis -15 Ό tropfenweise mit einer Lösung von .171 mg (1,05 mmol) 1,1'-Carbonyldiimidasol in 1 ml destillierten Dimethyl formamid s versetzt, worauf das Reakfd'onsgeinisch

25.3.1980 AP A 61 K/215 215 457 - 42 - 56 198/11.

2 Stunden gerührt und dann mit einer zuvor mittels Tri» äthylamin neutralisierten kalten Lösung von L~3,4-Dehydroprolin.Trifluoracetat in 2 ml Dimethylformamid gelöst wurde. Die Temperatur des Reaktionsgemisches wurde sodann langsam auf Raumtemperatur gebracht, worauf vom Reaktionsgemisch iro Vakuum bei 35 ⁰C in einem rotierenden Verdampfer das Lösungsmittel abgedampft wurde. Der hierbei erhaltene Rückstand wurde.in einem Gemisch aus 10 ml Äthylacetat und 2 ml Wasser aufgenommen, worauf das erhaltene Gemisch bei 0 ⁰C mit In-HCl auf einen ρH-Wert von 2 angesäuert und durchgemischt wurde. Nach dem Abtrennen der organischen Phase des Gemisches wurde die wäßrige Phase des Gemisches dreimal mit je 5 ml Äthylacetat extrahiert«.

Die miteinander vereinigten organischen Phasen wurden zweimal mit Wasser und dann dreimal mit gesättigter Koch™ salzlösung gewaschen und anschließend mit Aktivkohle entfärbt. Sodann wurde die organische Phase mittels wasserfreiem MgSO. -getrocknet und dann filtriert. Das Filtrat wurde in einem rotierenden Verdampfer zur Trockne eingeengt, wobei 366 mg eines öligen Produktes erhalten wurde, das durch Chromatographieren in einer mit ins Gleichgewicht gebrachten Sep'hadex t^M—SO" gefüllten Kolonne von 1,2 cm Durchmesser und 98 cm Länge unter Eluieren der Kolonne mit Methanol weiter goreinigt wurde, wobei Fraktionen zu je 150 Tropfen (2,9 ml) aufgefangen wurden, Die gewünschte Verbindung war in den Fraktionen Nr, 24 bis Nr, 29 enthalten, aus welchen das Lösungsmittel in einem rotierenden Verdampfer entfernt wurde..

Die erhaltene Verbindung wurde durch nochmaliges Chromato-

*- rn

graphieren an Sephade^ LH«20'" gereinigt, wobei die Kolonne

25.3.1980 AP A 61 K/215 457 - 43 - 56 198/11

mit Isopropanol ins Gleichgewicht gebracht und eluiert wurde und von den miteinander vereinigten Scheitelfraktionen das Lösungsmittel in einem rotierenden Verdampfer abgedampft"wurde. Das erhaltene Produkt besaß nach der mit den Lösungsmittelsystemen 2 und 3 durchgeführten Dünnschichtchromatographie eine Reinheit von annähernd 95 %,

Beispiel 91:.

Die Inhibitionswirkung verschiedener der oben hergestellten Verbindungen wurde in vitro nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode gemessen. Das Enzympräparat würde aus menschlichem Urin nach, der von Ryan, CJ. VV., et al., in Tissue und Cell 10, 555 (1978) angegebenen Methode hergestellt. Die folgende Tabelle I zeigt die I^₀-Werte für verschiedene Verbindungen» Der 1" _n~v7ort bedeutet jene Konzentration an Inhibitor, bei welcher das Enzym unter normierten Versuchsbedingungen, wobei das Substrat mit einer wesentlich unter K liegenden Konzentration vorliegt, zu 50 % inhibiert wird. .

	Tabelle Ϊ	ng '	I	50	» molar
Verbindu	13	2,6.10	»8	- molar
Beispiel	24	3,4.10	«8	- molar
Beispiel	35	7,5.10	-9	- molar
Beispiel	45	8,8.10	-9	- molar
Beispiel	59	2,5.10	-8	- molar
Beispiel	60	1,5,10	-8	- "molar
Beispiel	77	9,4,10	»9	- molar
Beispiel	80	2,5.10	-8	--· molar
Beispiel	81	7,5.10		« molar
Beispiel	90 (racemisch)	3.10""9
Beispiel

25.3.1980 AP A 61 K/215 457 - 44 - 56 198/11

Beispiel 92: Wirkung verschiedener Verbindungen bei oraler Verabreichung derselben

Ein Körpergewicht von 210 bis 290 g besitzende Ratten wurden über Nacht hungern gelassen und dann durch intraperitoneale Verabreichung von Pentobarbital in einer Menge von 50 bis 60 mg/kg anästhesiert, worauf, eine Trachesostomie durchgeführt und die Tiere mechanisch ventiliert wurden. Um Angiotensin I zu injizieren, wurde in eine Femoralvene eine Kanüle eingeführt, wobei eine weitere Kanüle in eine Carotidarterie eingeführt wurde, um den arteriellen Blutdruck direkt messen zu können. Über die Femoralvene wurden 1000 Einheiten Heparin zugeführt/ um-eine Koagulation zu vermeiden. Der Blutdruck wurde mittels eines an einen Vielfachschreiber angeschlossenen Druckwandlers gemessen. In die Ratten wurde sodann Angiotensin I in einer Menge von 160 bis 400 mg/kg in Form einer Lösung in 20 ^l einer 0,9 gew.-%igen Kochsalzlösung injiziert« Diese Menge an Angiotensin reicht aus, den durchschnittlichen arteriellen Blutdruck um 27 bis 50 mmHg zu erhöhen. Nachdem festgestellt -wurde, daß die jeweilige. Ratte auf Angiotensin I anspricht, wurde die zu prüfende Verbindung in einer Menge von 5,5 bis 23 umol/kg in Form einer Lösung in 0,15 ml Wasser und 10 pi In-NaHCO über einen Magenschlauch verabreichte In bestimmten Zeitabständen wurde die Wirkung von 160 bis 400 ng/kg von Angiotensin 1 auf den mittleren arteriellen Blutdruck bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle II angegeben, wo die jeweils verabreichte Dosis einer speziellen Verbindung in Klammer hinter die Nummer der Verbindung gesetzt ist, Beispielsweise bedeutet 13 (13,6), daß 13,6 ,umol/kg der Verbindung' gemäß Beispiel oral verabreicht wurden«, Die zwischen dem Zeitpunkt der

25.3.1980 AP A 61 K/215 KI - 45 - 56 198/11

oralen Verabreichung der jeweiligen Verbindung und dem Zeitpunkt des Messens der-Wirkung des Angiotensins I verstrichene und in Minuten gemessene Zeit ist hinter den Prozentangaben in eckige Klammern gesetzt.

25.3.1980

AP A 61 K/215

56 198/11

Tabelle II

Blutdruck nach Ver in einer Menge von Ve rgleichsü'8 rtes

sbreichung von Angiotensln I 160 bis 400 ng/kg in % des

/"Minuter: nach dem oralen Verabreichen)"

	13	100	24	35	1-5}	45	r-53	Verbindung	60		£-53	100	77	100	80	•	(	80
	13.5)	100	(20)	(23)	1*2.1	(20)	C+63	(Dosis)	17)		f+ 13	92	(20)	67	(H)		100	5.5)
	£-53	43	ί~5?	100	[6 J	100	£103 '		£»5l		£5 7	64	r-5J	57	Γ-63	111	£-63
(	C +3 j	27	C+33	71	£161	77	£-153	(	£ + 53	73	1153	32	£+3 3	43	ΖΓ+63	93	£+6j
LOO	£7 3	24	ί nj	63	£23 J	69	£253	100	£101	(20)	£187	40	£7 3	37	C12 3	81	£127
40	Γ 131	22	f 223	49	£373	46	£293	59	/Γ153	100	£213	40	£213	17	£243	85	£18,7
40	£ 18 J ..	19	£29J	43	Γ 48 J	33	£387	44	£31J	53	£253	20	£26 J	' 17	£35J	56	£24 3
28	£233		£34]	43	L 647	38	£507	44	£ 3 73	66	£29 J	8	C 32 j	20	£48 3	56	£357
24	C 313		£513	40	£'713	33	£577	44	Γ457	26	£397	8	£333	17	£58 J	52	£587
20	I 343			• 25	£84J	33	£657	38	£ 5 5J	26	/443	8	r507	13	£6S;f	30	£687
18	£42 J			26	/96J	31	£74 J	44	£813	21	C49J	20	/567	27		37	£88J
20	£483			. 37	Γ109 J	31	£88 J	44	/933	21	£54 J	12	£707	33	£ 83 J	60	£1183
20	r 58J			37	£1243	26		36	C1043	24	L. 607	12	£79 3	33	£1853	.37	£138,3
ι ε	Γ 67J -			40	L 140 J	36		36		18	£.747	20		43	£2057	37	£169J
ι 6	£ 80J			54	£1577			38		16	£85-3	40	£1043		/_213 J	44	£1357
20	£903			51	£1717					15	£1103	40	£114 J		L 226 J.		£2057
20	£ 10OJ			63						18	L120J	36	£1247
18	Γ1123			77						18	£1323	48	r 136.3
16	£ 125J. ·									18	£142J	48	£143 J
20	Γ 1377								21			£1737
20	£ 167J								21			£l86J
30						26
50					26
			26

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23.3.1980

AP A 61 K/215. 457

56 198/11

Tabelle II (Fortsetzung)

13 (13.6)

24

(20)

35 (23)

45 (20)

Verbindung (Dosis)

60 (17)

73 (20)

	77	80	80
(	20)	(H)	(5.5)
68	£199]
64	Γ2123 .
64	£2263
80	£242j .
80	£2603
84	£2911

25.3.1980 AP A 61 K/215- % § " 56 1.98/11

Beispiel 93: Wirkung verschiedener Verbindungen bei intravenöserVerabreichung

Zunächst wurden Ratten in der in Beispiel 92 angegebenen Weise anästhesiert. Nachdem das Ansprechen einer Ratte auf Angiotensin I festgestellt worden war, wurde die zu prüfende Verbindung in einer Menge von 2 umol/kg in 15 til einer OjOln-Natriumbicarbonatlösung über eine Femoralvene verabreicht. Die Wirkung des in einer Menge von 400 ng/kg verabreichten Angiotensins I auf den mittleren arteriellen Blutdruck wurde in bestimmten Zeitabständen ermittelt. Die erhaltenen Ergebnisse zeigt die folgende Tabelle III, für welche die zu Tabelle II gegebenen Erläuterungen gelten.

Tabelle III

Blutdruck nach Verabreichung von Angiotensin I in einer Menge von 400 ng/kg in % des Vergleichswertes fMinuten nach dem intravenösen VerabreiehenJ

Verbindung (Dosis)

24 60 77

(2) · (2) ^ (2J^

100 % C-51

8 £-1-0.5]

Ϊ8 -£."5 J

21 till

24 -£143

29 £17J

34 f20 3

42 £24 3

47 £323

53 £433

58 £49]

61 .£56 J

71 £711

-78 _f76j

76 fr 88 J

76 r99J

74 P.09J

84 £12 5 τ

loo <;	ΰ / ~5 j
O	f + 0.53
19	Γ 3 3
19	C9 3
22	£133
31	.'£18 "\
31	£221
50	/"34 1
63	E47.3
78	Γ651
75	Ll O Zl
94	fll3]

100 ^)	u + ο .1
8	Γ9 3
..15	1143
23	£19.1
23	f 24 \
33	£373
41	.£45 3
46	£54 j
46	177 3
46	187 3
51

Claims (9)

Erfindungsansprüche- in welcher · R Wasserstoff7 Forsnyl, Acetyl, Propanoyl, Butanoyl, Phenylacetyl, Phenylpropanoyl, Benzoyl, Cyclopentylcarbonyl, tert-Butyloxycarbonyl, Cycldpentylcarbonyl- -L-lysyl, Pyro-L-vglutamyl-L-lysyl, L-Arginyl, L-Lysyl, oder Pyro-L-glutaayl darstellt, A- L-Phenylalanyl, Glycyl, L-Alanyl, L-Tryptophyl, L-TyrosyliL-Isoleucyl, L-Leucyl, L-Histidyl oder L-Valyl bedeutet, ivobei die »£ -Aminogruppe in Amidbindung an R geknüpft ist und Phenylalanyl racemisch ist, falls R für Benzoyl steht, R,. für Wasserstoff oder Methyl steht, Rp L-Prolin, L-3,4--Dehydroprolin, D^L-3,4-Dehydroproline, L-3-Hydroxyprolin,, L-4-Hydroxyprolin oder L-Thiazolidin darstellt, wobei die Iminogruppe in Imidbindung an O die angrenzende Gruppe -ö~.gebunden ist, und η gleich 0 oder 1 mit der Maßgabe ist, daß, wenn η gleich Mull ist, R für Methyl steht, gekennzeichnet: dadurch, daß
1. (1) eine Verbindung der allgemeinen Formel

   R₃-S-(CHg)-CH-C-OH mit R₂ zur Verbindung der ' R₁ _

   25*3.1980

   AP A 61 K/215 457

   56 198/11

   allgemeinen Formel

   R_-S-(CH₀) -CH-C-R₀ worin R_ Acetyl bedeutet und 3 ^x 2'n . 2 3 '

   R₁, Rp und η die oben angegebene Bedeutung besitzen, umgesetzt wird, daß
2. (2) durch Abspalten des Restes R_, aus der gemäß StusF/e (1) erhaltenen Verbindung eine Verbindung der allgemeinen Formel ,

   Il

   HS-(CH₀) -CH-C-R₀ hergestellt wird, und daß ^Rl
3. (3) das gemäß Stufe (2) erhaltene Produkt mit einer Verbindung der allgemeinen Formel R-A zu einer Verbindung der allgemeinen Formel

   R-A-S-(CH^) -CH-C-Rp umgesetzt wird, in welcher

   R» A, R , R„ und η die oben angegebene Bedeutung besitzen.

   Verfahren nach Punkt 11, gekennzeichnet dadurch, daß die Umsetzung gemäß Stufe (1) in Anwesenheit von 1,1'-Carbonylcüimidazol oder Dicyclohexylcarbodiimid und die Umsetzung gemäß Stufe (3) in Anwesenheit von 1,1' -Carbonylciiimidazol durchgeführt wird.

   Vorfahren nach Punkt 12, gekennzeichnet' dadurch, daß in Stufe (1) eingesetztes R₀ eine Sghutzgruppe für die Carboxylgruppe aufweist und diese Schutzgruppe in Stufe (2) abgespalten wird.

   25.3.1980

   AP A 61 K/215 457

   56 198/11
4. .4. Verfahren nach eines der Punkte 11, 12 oder 13, gekennzeichnet dadurch, daß R Benzoyl ist.
5. 5. Verfahren nach einera der-Punkte 11, 12 oder 13, gekennzeichnet dadurch, daS R Fortnyl, Acetyl, Propanoyl,
   Butanoyl,^henylacetyl oder Phenylpropanoyl ist.
6. 6. Verfahren nach einera der Punkte 11, 12 oder 13, gekennzeichnet dadurch, daB R Cyclopentylcarbonyl oder tert-Butyloxycarbonyl ist.
7. 7« Verfahren nach einera der Punkte 11, 12 oder 13, gekennzeichnet dadurch, daß R Cyclopentylcarbonyl-L-lysyl oder Pyro-L-glutarnyl-L-lysyl ist.
8. 8. Verfahren nach eines der Punkte 11, 12 oder 13, gekennzeichnet dadurch, oa?s R L-Arginyl, L-Lysyl oder Pyro-L- -glutamyl ist.
9. 9. Verfahren nach Punkt 16, gekennzeichnet dadurch, daß
   durch Abspalten der Schutzgruppe aus einer Verbindung
   der allgemeinen Formel tert~Butyloxycarbonyl-

   in welcher A, R , R₀ und η die oben angegebene Bedeutung besitzen, eine Verbindung der allgemeinen Formel

   A-S- (CH₉). ~ CH,- C ·» R„ hergestellt wird.

   R₁

   . Verfahren nach eines uer Punkte 11, 12 oder 13, gekennzeichnet dadurch, da$ R für Benzoyl, A für Phenylalanyl, R für Methyl, R₀ for L»Prolin und η fur I steht.