AT390795B - Verfahren zur herstellung eines neuen inhibitors fuer angiotensinumwandelndes enzym - Google Patents

Description

Nr. 390 795

Das Angiotensin umwandelnde Enzym (die im folgenden mit ACE bezeichnete Peptidyldipeptid-Hydrolase) spielt in der Physiologie der Hypertension eine zentrale Rolle und ist in der Lage das Decapeptid Angiotensin I, welches die Aminosäuresequenz

AspArgValTyrlleHisProPheHisLeu besitzt, durch Abspalten des eine endständige Carboxygruppe aufweisenden Restes HisLeu in ein Octapeptid, das Angiotensin Π, übeizuführen. Die für verschiedene Aminosäurereste verwendeten Symbole sind folgende:

Ala = L-Alanin Arg = L-Arginin Asp = L-Asparaginsäure <Glu = Pyro-L-glutaminsäure Gly = Glycin

Hip = Hippursäure (Benzoyl-glycin) His = L-Histidin Ile = L-Isoleucin Leu = L-Leucin Phe = L-Phenylalanin Pro = L-Prolin APro = L-3,4-Dehydroprolin Ser = L-Serin Trp = L-Tryptophan Tyr = L-Tyrosin Val = L-Valin

Weiters werden folgende Abkürzungen verwendet: ACE = Angiotensin umwandelndes Enzym

Hepes = N-2-Hydroxyäthylpiperazin-N-2-äthansulfönsäuie

Angiotensin I entsteht durch Einwirkung des Enzyms Renin, einer in Nieren oder anderen Körpergeweben und im Blutplasma anzutreffendem Endopeptidase, auf im Serum enthaltenes Alpha-2-Globulin.

Der Blutdruck wird durch gewisse, im Blut vorhandene Peptide beeinflußt. Eines dieser Peptide, das Angiotensin II, ist ein stark wirkender, blutdrucksteigemder Stoff. Ein anderes dieser Peptide, das Bradykinin, ist ein die Aminosäuresequenz ArgProProGlyPheSerProPheArg aufweisender Stoff mit starker blutdrucksenkender Wirkung. Zusätzlich zu seiner direkten blutdrucksteigemden Wirkung besitzt Angiotensin II auch die Fähigkeit Aldosteron freizusetzen, welches im Kötpergewebe extrazelluläre Salze und Flüssigkeiten zurückhält und damit zu einer Steigerung des Blutdruckes beiträgt. Angiotensin II ist im Blut normaler Menschen in meßbaren Mengen vorhanden, jedoch im Blut von an renaler Hypertension leidenden Patienten in höherer Konzentration vorhanden. ACE liegt in Menschen mit normalem Blutdruck und in Menschen mit erhöhtem Blutdruck in der Regel in größerer Menge vor, als sie zum Aufrechterhalten feststellbarer Konzentrationen an Angiotensin II erforderlich ist. Der überhöhte Blutdruck in an überhöhtem Blutdruck leidenden Patienten kann somit durch Behandeln dieses Patienten mit ACE-Inhibitoren abgesenkt werden. [Gavras, I., et al., New Engl. J. Med. 291, 817 (1974)].

Die vorliegende Erfindung bezieht sich nun auf die Herstellung neuer ACE-Inhibitoren der allgemeinen Formel

O

II R-A-S-(CH2)n-CH-C-R2 , (I) in welcher R Wasserstoff, Formyl, Acetyl, Propanoyl, Butanoyl, Phenylacetyl, Phenylpropanoyl, Benzoyl, Cyclopentylcarbonyl, tert.-Butyloxycarbonyl, Cyclopentylcarbonyl-L-lysyl, Pyro-L-glutamyl-L-lysyl, L-Arginyl, L-Lysyl oderPyro-L-glutamyl, bedeutet. A L-Phenylalanyl, Glycyl, L-Alanyl, L-Tryptophyl, L-Tyrosyl, L-Isoleucyl, L-Leucyl, L-Histidyl oder -2-

Nr. 390 795 L-Valyl, darstellt, wobei die Alpha-Aminogruppe in Amidbindung an R geknüpft ist und Phenylalanyl racemisch ist, falls R für Benzoyl steht,

Rj für Wasserstoff oder Methyl steht, R2 L-Prolin, L-3,4-Dehydroprolin, D,L-3,4-Dehydroprolin, L-3-Hydroxyprolin, L-4-Hydroxyprolin oder 5 L-Thiazolidincarbonsäure, insbesondere L-Thiazolidin4-carbonsäure

O

II darstellt, wobei die Iminogruppe in Imidbindung an die angrenzende Gruppe -C- gebunden ist, und n gleich 0 oder 1 mit der Maßgabe ist, daß, wenn n gleich ist Null, R für Methyl steht. 10 Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß eine Verbindung der allgemeinen Formel

O 15 HS-(CH2)n-CH-C-R2 ,(Π) R1 in welcher Rj, R2 und n die oben angegebene Bedeutung besitzen mit einer Verbindung der allgemeinen Formel 20

R-A ,(Π0 in welcher R und A die oben angegebene Bedeutung besitzen, umgesetzt wird und gegebenenfalls durch Abspalten der Schutzgruppe aus einer Verbindung der allgemeinen Formel

O 25 tert-Butyloxycarbonyl-A-S-(CH2)n-CH-C-R2,

I R1 30 in welcher A, Rj, R2 und n die oben angegebene Bedeutung besitzen, eine Verbindung der allgemeinen Formel

O 35 A-S-(CH2)n-CH-C-R2 R1 hergestellt wird. 40 Sofeme nichts anderes angegeben ist, besitzen alle der im folgenden genannten Aminosäuren L-Konfiguration. Phenylalanyl ist racemisch, wenn R für Benzoyl steht. Die erfindungsgemäß herstellbaren Verbindungen sind ACE-Inhibitoren und können oral als Antihypertensiva verabreicht werden.

Die Entdeckung, daß erfindungsgemäß herstellbare Verbindungen der allgemeinen Formel (I) ACE-Inhibitoren sind, bedeutet einen wesentlichen Fortschritt beim Aufbau von als ACE-Inhibitoren brauchbaren Verbindungen. 45 Obzwar zahlreiche der bekannten ACE-Inhibitoren Prolinderivate sind, können durch Ersetzen des Prolins durch andere Aminosäuren ebenfalls stark wirkende ACE-Inhibitoren erhalten werden. Beispielsweise sind Arginin, Phenylalanin und Alanin durchwegs dazu geeignet Prolin zu ersetzen, sodaß eine bestimmte Entwicklungsrichtung nicht erkennbar ist.

Der Ersatz des Prolins durch L-3,4-Dehydroprolin ist bereits in verschiedenen Systemen untersucht worden. 50 Wenn in 7-Stellung des Bradykinins L-3,4-APro eingeführt wird, wird ein Bradykininderivat starker physiologischer Wirkung erhalten [vgl. Fisher, G.H. et al., Arch. Biochem.Biophys. 189, 81 (1978)]. Andererseits wird durch Einführen von L-3,4-APro in 3-, 5- oder 9-Stellung des ACE-Inhibitors BPPga dessen

Inhibitorwirkung erhöht. Derzeit kann jedoch die Verschiedenheit der bei Ersatz des Prolins durch APro zu beobachtenden Ergebnisse nicht schlüssig erklärt werden. In ähnlicher Weise ergibt sich kein klares Bild 55 hinsichtlich der Wirkungen weiterer Prolinderivate oder an verschiedenen Stellen von ACE-Inhibitoren substituierten Analoga.

Derzeit ist die Wirkung der an der linken Seite des in der obigen Formel (I) aufscheinenden Schwefelatoms stehenden Aminosäure noch nicht bestimmt worden. Es wird angenommen, daß diese Aminosäure als zusätzliche Erkennungsstelle für das Enzym wirkt. Falls diese Annahme zutrifft, ist zu erwarten, daß eine an dieser Stelle -3-

Nr. 390 795 eine Aminosäure aufweisende Verbindung ein besserer Inhibitor ist. Es war nicht bekannt, welche Aminosäure oder ob überhaupt eine Aminosäure an dieser Stelle wirksam ist und welche Aminosäure, wenn überhaupt eine Aminosäure die Inhibitorwirkung einer gegebenen Verbindung erhöht. Es wurde gefunden, daß verschiedene Aminosäuren wirksam sind, und daß Hydroxypiolin-, Prolin-, L- und D,L-3,4-Dehydroprolm- und Thiazolidin-4-carbonsäurederivate durchwegs antihypertensiv wirken und auf ACE eine starke Inhibitorwirkung ausüben.

Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert In diesen Beispielen wurde die Dünnschichtchromatographie (DSC) unter Verwendung von Silicagelplatten durchgeführt. Die bei der Dünnschichtchromatographie (DSC) verwendeten Lösungsmittelsysteme sind in den Beispielen durch Nummern bezeichnet welche folgendes bedeuten: (1) Methanol:Chloroform, 1:1 (Vol.-Teile). (2) Benzol:Wasser:n-Butanol, 9:1:9 (Vol.-Teile). (3) Essigsäure:Wasser:n-Butanol, 26:24:150 (Vol.-Teile). (4) n-Butanol:Pyridin:Essigsäure:Wasser, 15:10:3:12 (Vol.-Teile). (5) n-Butanol:Essigsäure:Äthylacetat:Wasser, 1:1:1:1 (Vol.-Teile), (6) Chloroform:Methanol:Essigsäure, 2:1:0,003, (7) n-Butanol:Essigsäure:Wasser, 4:1:1.

Die bei der Papierelectrophorese verwendeten Pufferlösungen waren folgende: pH 1,9 Ameisensäure:Essigsäure:Wasser, 3:2:25 (Vol.-Teile); pH 5,0 Diäthylenglykol:Essigsäure:Pyridin:Wasser, 100:6:8,5:885 (Vol.-Teile).

Die tert.-Butyloxycarbonyl-, Benzoyl-, Acetyl-, Formyl-, Propanoyl-, Butanoyl-, Phenylacetyl- und Phenylpropanoylderivate der Aminosäuren sind im Handel erhältlich.

Beispiel 1: a) Herstellung des 3-Acetyl-2-D-methylthiopropanoyl-L-prolin-t-butylesters.

Eine Lösung von 0,865 g 3-Acetyl-2-D-methylthiopropansäure in 2 ml destillierten Tetrahydrofurans (THF) wurde auf 0°C gekühlt und dann mit einer gekühlten Lösung von 1,2031 g Dicyclohexylcarbodiimid in 2 ml THF versetzt worauf dem erhaltenen Gemisch eine gekühlte Lösung von 1 g L-Prolin-t-butylester zugesetzt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde sodann eine Stunde bei 0°C und dann über Nacht bei 4°C gerührt und anschließend filtriert, worauf der am Filter verbliebene Niederschlag mit Äthylacetat gewaschen wurde. Von den miteinander vereinigten Filtraten wurden die Lösungsmittel sodann in einem rotierenden Verdampfer unter vermindertem Druck angetrieben, worauf der erhaltene Rückstand in Äthylacetat gelöst, die erhaltene Lösung aufeinanderfolgend dreimal mit 1 n-Zitronensäure zweimal mit gesättigter Kochsalzlösung dreimal mit kalter 1 n-Natriumbikarbonatlösung und dreimal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und schließlich filtriert wurde. Vom erhaltenen Filtrat wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck in einem drehbaren Verdampfer bei 30°C abgedampft, wobei mit einer Ausbeute von etwa 87 % ein klares farbloses öliges Produkt erhalten wurde. Dieses Produkt wanderte bei der Dünnschichtchromatographie in den 5 verschiedenen Lösungsmittelsystemen als einziger Reck. b) Herstellung von 3-Mercapto-2-D-methylpropanoyl-L-prolin 0,5 g des gemäß Stufe a) hergestellten 3-Acetyl-2-D-methylthiopropanoyl-L-prolin-t-butylesters wurden zwecks Abspaltens der Acetylgruppe bei Raumtemperatur unter Stickstoffatmosphäre 1 Stunde mit 4,5 ml einer Lösung von Ammoniak in Methanol behandelt, worauf vom Reaktionsgemisch das Lösungsmittel in einem drehbaren Verdampfer bei 25°C abgedampft und der erhaltene Rückstand in Methanol aufgenommen wurde. Vom erhaltenen Gemisch wurde das Methanol abgedampft, worauf der nunmehr vorliegende Rückstand erneut in Methanol aufgenommen und vom erhaltenen Gemisch das Methanol wieder abgedampft wurde. Der hiebei in Form eines klaren Öles erhaltene Rückstand wurde in Äthyläther gelöst, worauf die erhaltene Lösung zweimal mit einer 5 %igen Lösung von Kaliumbisulfat und einmal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, dann über MgSC>4 getrocknet und schließlich filtriert wurde. Vom erhaltenen Filtrat wurde das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft, womit ein klares öliges Produkt erhalten wurde, das bei der Dünnschichtchromatographie in drei verschiedenen Lösungsmittelsystemen als einziger Fleck wanderte. Die als Schutzgruppe vorliegende t-Butylestergruppe wurde sodann in Anisol mit Trifluoressigsäure abgespalten, womit 3-Mercapto-2-D-Methylpropanoyl-L-prolin vom Fp = 103 bis 104°C, [Alpha]D2® = 131° (C = 2, EtOH) DSC (Silicagel): Rf=0,60 (BenzokEssigsäure = 75:25) erhalten wurde. c) Herstellung des N^P^-ß-fN^P^-Acetyl-L-phenylalanylthio^-D-methylpropanoyll-L-prolins.

Eine Lösung von 41,5 mg N^P^-Acetyl-L-phenylalanin in 0,5 ml frisch destilliertem Dimethylformamids wurde in einem Trockeneis-Aceton-Bad auf -20°C gekühlt, worauf der erhaltenen Lösung eine gekühlte Lösung von 35 mg Ι,Γ-Carbonyldiimidazol in 1,0 ml Dimethylformamid zugesetzt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde zunächst 2 Stunden bei -10°C gerührt und dann mit einer kalten und zuvor mit N-Äthylmorpholin neutralisierten Lösung von 48 mg 3-Mercapto-2-D-methylpropanoyl-L-prolin in 1 ml Dimethylformamid versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde sodann bei einer Temperatur von -10°C eine weitere Stunde gerührt, worauf die Temperatur des Reaktionsgemisches langsam auf Raumtemperatur ansteigen gelassen und dann vom -4-

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Reaktionsgemisch das Lösungsmittel unter vermindertem Druck bei 40°C abgetrieben und der hiebei erhaltene Rückstand mit Äthylacetat versetzt wurde. Das erhaltene Gemisch wurde in einem Eisbad gekühlt und dann mit 0,1 η-HCl und anschließend noch 3-mal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen und dann über wasserfreiem MgS04 getrocknet, worauf das Lösungsmittel in einem drehbaren Verdampfer entfernt wurde. Die erhaltene

Verbindung wurde durch Chromatographieren über eine mit einem vernetzten Dextran-Hydroxypropylether (Korngröße 20 pm) gefüllte Kolonne von 1,2 cm Durchmesser und 95 cm Länge unter Eluieren der Kolonne mit Isopropanol gereinigt. Die Scheitelfraktionen wurden gesammelt und unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit, womit 35,5 mg der genannten Verbindung erhalten wurde. Die erhaltene Verbindung erwies sich bei der Dünnschichtchromatographie unter Verwendung der Lösungsmittelsysteme 1,2,3 und 5 als homogen. DSC (Silicagel): Rf (1) = 0,47, Rf (2) = 0,65, Rf (3) = 0,45, Rf (5) = 0,64

Aminosäureanalyse: Phe^QQ, Ptoq gg NMR Delta (in CDCI3): 1,17 (3H, breites d, CE3), 1,75 bis 2,35 (4H, m, CH2), 1,91 (3H, s, CH3), 2,55 bis 3,25 (5H, m, Cfi und Cfl2), 3,4 bis 3,8 (2H, m, CK2), 4,1 bis 4,6 (1H, m, CE), 4,6 bis 5,0 (1H, m, Cfi), 6,63 (1H, d,NH), 6,82 (1H, s, COOH) und 7,17 (5H, breites s, aromatisches fl).

Beispiel 2:

Bei Verwendung von N^P^-Acetyl-glycin, N^P^a-Benzoyl-glycin bzw. N^P^-Propionyl-tryptophan an Stelle des gemäß Beispiel 1 verwendeten N^'P^a-Acetyl-phenylalanins wurden nach der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise folgende Verbindungen hergestellt. N^pha_p_^NAlpha.Acetyjg|yCy]ü1j0)_2_Danet|1yipr0pan0yj].L-proün DSC (Silicagel): Rf(6) = 0,48, Rf(7) = 0,42, NMR Delta (in CF3OD): 1,20 (3H, breites d, CE3), 1,9 bis 2,3 (4H, m, CE2), 2.00 (3H, s, CH3), 2.5 bis 3,2 (3H, m, Cfl und CH2), 3.5 bis 3,8 (2H, m, CE2). 4.04 (2H,s,CE2) und 4.2 bis 4,7 (1H, m, CE): NAlpha_[3_(NAlpha_BeiK0yigiyCyi^0)_2_D_methyi-propan0yi]-L-pr0lin DSC (Silicagel): Rf (6) = 0,55, Rf (3) = 0,46, Rf (7) = 0,68, Rf (2) = 0,60, Rf (5) = 0,60, NMR Delta (in CDC13): 1,15 (3H, breites d, CE3), 1.6 bis 2,4 (4H, m, Cfi2), 2.5 bis 3,2 (3H, m, CE und Cfl2), 3.3 bis 3,8 (2H, m, CH2), 4.1 bis 4,6 (1H, m, CE), 4,30 (2H, d, CE2), -5-

Nr. 390 795 7,2 bis 8,1 (5H, m, aromatisches H) und 10,10 (1H, s, COOH); NAlpha_p_^Alpha.pr0pionyj_L_trypt0pj1yjtj1j0^2.D.metj1y]pr0pan0yjj_L,projjn DSC (Silicagel): Rf (6) = 0,52, Rf (7) = 0,75, NMR Delta (in CD3OD): 1,02 (3H, t, CH3), 1.08 (3H, breites d, CH3), 1.8 bis 2,5 (4H, m, CE2), 2,20 (2H, q, CH2), 2,5 bis 3,1 (3H, m, CH und CH2), 3.1 bis 3,9 (4H, m, CH2), 4.1 bis 4,5 (1H, m, CH), 4,7 bis 5,0 (1H, m, CH) und 6,95 bis 7,8 (5H, m, aromatisches H).

Beispiel 3:

Herstellung von N^P^a-[3-(N^P^a- tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanylthio)-2-D-methylpropanoyl]-L-prolin.

Eine Lösung von 133 mg N^P^a-tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanin (N^P^a-Boc-L-Phe) in 0,5 ml destilliertem Dimethylformamids wurde in einem Eis-Trockeneis-Aceton-Bad auf -20°C gekühlt, worauf diese Lösung mit einer kalten Lösung von 87 mg Ι,Γ-Carbonyldiimidazol in 1,0 ml Dimethylformamid versetzt wurde. Die erhaltene Lösung wurde bei -10°C 2 Stunden gerührt und dann mit einer zuvor mit N-Äthyl-morpholin neutralisierten Lösung von 3-Mercapto-2-D-methylpropanoyl-L-prolin in 1 ml Dimethylformamid versetzt Das Reaktionsgemisch wurde mit N-Äthyl-morpholin neutralisiert. Das Reaktionsgemisch wurde dann eine weitere Stunde bei -10°C gerührt, worauf die Temperatur des Reaktionsgemisches langsam auf Raumtemperatur ansteigen gelassen wurde, dann vom Reaktionsgemisch das Lösungsmittel unter verringertem Druck bei 40°C abgetrieben und der hiebei erhaltene Rückstand in Äthylacetat aufgenommen wurde. Das erhaltene Gemisch wurde in einem Eisbad gekühlt und dann mit 0,1 η-HCl und anschließend noch mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, dann über wasserfreiem MgSO^ getrocknet und schließlich in einem drehbaren

Verdampfer vom Lösungsmittel befreit. Die erhaltene Verbindung wurde durch Chromatographieren über eine mit einem vernetztem Dextran (Korngröße 10 μτη) gefüllte Kolonne von 1,2 cm Durchmesser und 95 cm Länge unter Ebneren der Kolonne mit einem im Volumsverhältnis von 3:7 aus Tetrahydroforan und Isopropanol bestehenden Lösungsmittelgemisch gereinigt, indem die Scheitelfraktionen miteinander vereinigt und hievon das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgetrieben wurde. Auf diese Weise wurden 165 mg der genannten Verbindung erhalten. Diese Verbindung erwies sich bei der bei einem pH-Wert von 5,0 durchgeführten Papierelektrophorese und bei der Dünnschichtchromatographie mit den Lösungsmittelsystemen 1,2 und 3 als homogen. DSC (Silicagel): Rf (1) = 0,60, Rf (2) = 0,82, Rf (3) - 0,68

Aminosäureanalyse: Phej qq, Ptoq g^.

Beispiel 4:

Wenn bei der Arbeitsweise gemäß Beispiel 3 statt des NA1P^a-Boc-Phe N^P^-Boc-Glycin bzw. N^lpha-Boc-Isoleucin eingesetzt wurde, wurden die folgenden Verbindungen erhalten. NAlpha_[-3_(NAlpha_tert utyΐ0χyearbony 1 -glyCylthi0)-2-E>-methylpr0panoy 1]-L-prölin, Rf(6) = 0,63,

Rf(7) = 0,70, NMR Delta (in CDCI3): 1,22 (3H, breites d, CH3), 1,43 (9H, s, CH3), 1,7 bis 2,4 (4H, m, CH2), 2,6 bis 3,2 (3H, m, CH und CH2), -6-

Nr. 390 795 3.4 bis 3,8 (2H, m, CH2), 3,98 (2H, d, CH2), 4.4 bis 4,7 (lH,m, CH) und 8,68 (1H, s, COOH); 5 NAlpha.[3.^SfAlpha.terL.gutyjOXyCarbonyi-L-is0leuCylthi0)-2-D-methyl-pr0pan0yl]-L-pr0lin DSC (Silicagel): Rf (1) = 0,82, % (2) = 0,72, Rf (3) = 0,78 10 IR (CHCI3): Carbonylbanden bei 1643 und 1690 bis 1740 cm'1 und eine NH-Bande bei 3445 cm'1.

Beispiel 5: a) Herstellung des N^Pha-Cyclopentylcarbonyl-L-phenyl-alanins 15 Eine gekühlte Lösung von 2,06 g Dicyclohexylcarbodiimid in 10 ml Dichlormethan wurde bei einer Temperatur von -5°C einer Lösung von 1,4114 g Cyclopentancarbonsäure in 5 ml Dichlormethan zugesetzt, worauf das erhaltene Gemisch mit einer zuvor mittels 1,36 ml N-Äthylmorpholin neutralisierten Lösung von 4,28 g des Toluolsulfonsäuresalzes des L-Phenylalanin-benzylesters in 10 ml Dimethylformamid versetzt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde sodann eine Stunde bei 0°C und dann drei Stunden bei Raumtemperatur gerührt, 20 worauf der entstandene Dicyclohexylhamstoff abfiltriert und das Filtrat mit 50 ml Äthylacetat versetzt wurde. Die erhaltene organische Phase wurde bis zur neutralen Reaktion gewaschen und nach dem Trocknen über wasserfreiem MgSC>4 filtriert. Vom Filtrat wurde das Lösungsmittel in einem rotierenden Verdampfer abgedampft, worauf der hiebei erhaltene Rückstand aus Isopropanol und Hexan umkristallisiert wurde. Auf diese Weise wurden 2,35 g weißer Kristalle vom Fp = 88 bis 89°C erhalten. 25 DSC (Silicagel): Rf (1) = 0,75, Rf (3) = 0,76 IR (CHCI3) Carbonylbanden bei 1665 und 1736 cm'1 und NH-Bande bei 3430 cm'1, 30 Analyse: berechnet: 75,19 % C, 7,17 % H, 3,9855 % N, gefunden: 74,96 % C, 7,17 % H, 4,09 % N.

Die Benzylestergruppe wurde durch Hydrogenolyse in absolutem Alkohol unter Verwendung von 2 g eines 35 10 % Palladium auf Kohle enthaltenden Katalysator abgespalten. Der Katalysator wurde abfiltriert, worauf vom

Filtrat das Äthanol in einem rotierenden Verdampfer abgedampft wurde. Der hiebei erhaltene Rückstand wurde aus Äther und Hexan umkristallisiert und lieferte 1,15 g weißer Kristalle der genannten Verbindung vom Fp = 107 bis 108°C. 40 DSC (Silicagel): Rf (1) = 0,60, Rf (2) = 0,68, Rf (3) = 0,64 IR (CHCI3): Carbonylbandenverschiebung von 1736 auf 1722 cm'1,

Analyse: 45 berechnet: 68,94 % C, 7,33 % H, 5,36 % N, gefunden: 68,90 % C, 7,32 % H, 5,34 % N.

Die erhaltene Verbindung erwies sich bei der bei einem pH-Wert von 1,9 und bei einem pH-Wert von 5,0 durchgeführten Papierelektrophorese und bei der unter Verwendung der Lösungsmittelsysteme 1,2 und 3 50 durchgeführten Dünnschichtchromatographie als homogen. Die genannte Verbindung kann abgekürzt mit NAlpha.cpe-L-Phe bezeichnet werden. b) Herstellung von NA1Pha-[3-NA1Pha-Cyclopentylcarbonyl-L-phenylalanylthio)-2-D-methylpropanoyl]-L-prolin 55 Eine Lösung von 52,5 mg der gemäß Stufe a) hergestellten Verbindung in 0,5 ml destilliertem Dimethylformamid wurde in einem Eis-Trockeneis-Aceton-Bad auf -20°C gekühlt und dann mit einer kalten Lösung von 34 mg Ι,Γ-Carbonyldiimidazol in 1,0 ml Dimethylformamid versetzt, worauf das erhaltene Gemisch -7-

Nr. 390 795 zwei Stunden bei -10°C gerührt und dann mit einer kalten zuvor mit N-Äthyl-morpholin neutralisierten Lösung von 45,6 mg 3-Mercapto-2-D-methylpropanoyl-L-prolin in 1 ml Dimethylformamid versetzt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde dann bei -10°C eine weitere Stunde gerührt, worauf die Temperatur des Reaktionsgemisches langsam auf Raumtemperatur ansteigen gelassen und dann das Lösungsmittel unter 5 vermindertem Druck bei 40°C abgedampft wurde. Der hiebei erhaltene Rückstand wurde in Äthylazetat aufgenommen, worauf das erhaltene Gemisch gekühlt und dann aufeinanderfolgend mit 0,1 η-HCl und dreimal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen wurde. Die verbliebene organische Phase wurde über wasserfreiem MgSC>4 getrocknet, worauf das Lösungsmittel in einem rotierenden Verdampfer äbgedampft wurde. Das erhaltene

Produkt wurde durch Chromatographieren in einer mit einem vernetzten Dextran-Hydroxyprppylether (Korngröße 10 20 |xm) gefüllten Kolonne von 1,2 cm Durchmesser und 95 cm Länge unter Eluieren der Kolonne mit

Isopropanol weiter gereinigt Von den miteinander vereinigten Scheitelfraktionen wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft womit 60,5 mg der genannten Verbindung erhalten wurde. Diese Verbindung erwies sich bei der unter Verwendung der Lösungsmittelsysteme 1, 2, 3 und 5 durchgeführten Dünnschichtchromatographie als homogen. 15 DSC (Silicagel): Rf (1) = 0,48, Rf (2) = 0,73, Rf (5) = 0,72.

Beispiel 6:

Wenn bei der Arbeitsweise gemäß Beispiel 5 das gemäß Beispiel 5 Stufe a) eingesetzte L-Phe-Salz durch das 20 Toluolsulfonsäuresalz des Benzylesters des L-Isoleucins bzw. des L-Alanins ersetzt wurde, wurden folgende Verbindungen erhalten. NAlpha_[3_(^Alpha_(-;yCj0pentyjcarb0nyj.L.jS0jeuCyjt{1j0^.2.£).meti1yiprOpanOyi]-L.proijnj 25 DSC (Silicagel): Rf (1) = 0,65, Rf (2) = 0,76, Rf (3) = 0,70 NAlpha_[3_(MAlpha_c;yCi0pentyicarbonyi.L.aianyithi0)-2-D-methylpr0pan0yl]-L-pr0Im, DSC (Silicagel): Rf (6) = 0,62, Rf (7) = 0,74 30 NMR Delta (in CDC13 + CD3OD): 1,20 (3H, breites d, CH3), 1,38 (3H, d, CH3), 1,5 bis 2,4 (12H, m, CH2), 2,4 bis 3,2 (4H, m, CH und CH2), 35 3,3 bis 3,8 (2H, m, CH2) und 4,2 bis 4,8 (2H, m, CH).

Beispiel 7:

Herstellung des N^P^-(3-L-Phenylalanylthio-2-D-methylpropanoyl)-L-prolins. 40 Aus der gemäß Beispiel 3 hergestellten Verbindung wurde die Schutzgruppe dadurch abgespalten, daß ein Gemisch aus 30 mg der erwähnten Verbindung, 50 μΐ Anisol und 200 μΐ wasserfreie Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur eine Stunde gerührt wurde. Im Anschluß daran wurde aus dem Reaktionsgemisch das Anisol und die Trifluoressigsäure bei 35°C unter vermindertem Druck abgetrieben, worauf der erhaltene Rückstand mit wasserfreiem Äther verrieben wurde. Der hiebei verbliebene weiße Rückstand wurde durch Chromatographieren 45 mit einer mit einem vernetzten Dextran (Korngröße 10 pm) gefüllten Kolonne von 1,2 cm Durchmesser und 95 cm Länge unter Eluieren mit 5 %iger Essigsäure gereinigt. Die miteinander vereinigten Scheitelfraktionen wurden gefriergetrocknet und lieferten 17,5 mg der genannten Verbindung. Diese Verbindung erwies sich bei der bei einem pH-Wert von 1,9 bzw. 5,0 durchgeführten Papierelektrophorese und bei der mit den Lösungsmittelsystemen 4 und 5 durchgeführten Dünnschichtchromatographie als homogen. 50 DSC (Silicagel): Rf (4) = 0,52, Rf (5) = 0,51.

Beispiel 8:

Nach der in Beispiel 7 beschriebenen Arbeitsweise wurde aus den gemäß Beispiel 4 hergestellten 55 Verbindungen die Schutzgruppe abgespalten, wobei folgende Verbindungen erhalten wurden. NAlpha_(3.GiyCyithi0-2-D-methylpr0pan0yl)-L-prolin -8-

Nr. 390 795 DSC (Silicagel): Rf (6) = 0,16, Rf (7) = 0,09 NMR Delta (in CD3OD): 1,17 (3H, breites d, CH3), 1,8 bis 2,4 (4H, m, CH2), 5 2,4 bis 3,3 (3H, m, CH und CH2), 3,5 bis 3,9 (2H, m, CH2), 4,11 (2H, s, CH2) und 4,3 bis 4,7 (1H, m, CH); 10 N^P^a-(3-L-Isoleucylthio-2-D-methylpropanoyl)-L-Prolin DSC (Silicagel): Rf (1) = 0,42 und Rf (2) = 0,35.

Beispiel 9: 15 a) Herstellung des N-Hydroxysuccinimidesters der Cyclopentancarbonsäure.

Eine kalte Lösung von 11,4 g Dicyclohexylcarbodiimid in Dimethylformamid wurde bei einer Temperatur von 0°C tropfenweise einer Lösung von 5,71 g Cyclopentancarbonsäure und 5,76 g N-Hydroxysuccinimid in Dimethylformamid zugesetzt, worauf das Reaktionsgemisch 30 Minuten bei einer Temperatur von 0°C und dann 20 über Nacht bei 4eC gerührt wurde. In Anschluß daran wurde der auskristallisierte Dicyclohexylhamstoff abfiltriert und mit Äthylacetat gewaschen. Das mit der Waschflüssigkeiten vereinigte Filtrat wurde unter vermindertem Druck von Lösungsmitteln befreit, worauf der erhaltene Rückstand aus Benzol und Hexan umkristallisiert wurde. Auf diese Weise wurden 5,77 g weiße Kristalle vom Fp = 72,5 bis 73°C erhalten. Das IR-Absorptionsspektrum dieser Verbindung in Chloroform ergab das für N-Hydroxysuccinimidester typische Spektrum. 25 IR (CHCI3): Carbonylbanden bei 1738,1784 und 1812 cm"1

Analyse: berechnet: 56,86 % C, 6,20 % H, 6,63 % N, 30 gefunden: 56,77 % C, 6,07 % H, 6,66 % N. b) Herstellung des N^P^a-Cyclopentylcarbonyl-N^Ps^on-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysins.

Eine Lösung von 1,2316 g N^Ps^on- tert-B utyloxycarbony 1-L-lysin und 420 g NaHCC>3 in 10 ml Wasser und 5 ml Tetrahydrofuran wurde in einem Eisbad unter Rühren gekühlt und dann mit einer kalten Lösung von 35 1,19 g der gemäß Stufe a) hergestellten Verbindung in 10 ml Tetrahydrofuran versetzt, worauf das

Reaktionsgemisch über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und dann in einem drehbaren Verdampfer bei 35°C vom Tetrahydroforan befreit wurde. Der verbliehene Rückstand wurde mit etwa 20 ml Wasser versetzt, worauf der pH-Wert des erhaltenen Gemisches durch Zusetzen von festem NaHCC^ auf 9 eingestellt wurde.

Die wässerige Phase wurde 3-mäl mit Äthylacetat extrahiert und die organische Phase wurde verworfen. Die 40 wässerige Lösung wurde in einem Eisbad gekühlt und dann in Anwesenheit von Äthylacetat mit 1 η-HCl auf einen pH-Wert von 2 angesäuert. Die organische Phase wurde 2-mal mit Eiswasser und dann 2-mal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, dann über wasserfreiem MgSO^ getrocknet und schließlich filtriert, worauf vom Filtrat das Lösungsmittel in einem drehbarem Verdampfer abgedampft und der hiebei erhaltene Rückstand aus Äthyläther und Hexan umkristallisiert wurde. Auf diese Weise wurden 1,135 g weißer Kristalle 45 vom Fp = 104,5 bis 105,5 °C erhalten.

Analyse: berechnet: 59,63 % C, 8,83 % H, 8,18 % N, gefunden: 59,74 % C, 8,85 % H, 8,24 % N. 50

Bei der bei einem pH-Wert von 1,9 und bei einem pH-Wert von 5,0 durchgeführten Papierelektrophorese und bei der mit den Lösungsmittelsystemen 1,2 und 3 durchgeführten Dünnschichtchromatographie erwies sich die erhaltene Verbindung als homogen. DSC (Silicagel): Rf (1) = 0,52, Rf (2) = 0,83, Rf (3) = 0,69 55 IR (CHCI3): Carbonylbanden bei 1650 bis 1680 und 1690 bis 1720 cm*1 und NH-Banden bei 3340 und 3440 cm*1. -9-

Nr. 390 795 c) Herstellung des N^P^a-Cyclopentylcarbonyl-N^Psl^on-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-N-hydroxysuccinimidesters.

Eine auf -5 °C gekühlte Lösung von 1,027 g der gemäß Stufe b) hergestellten Verbindung und von 346 mg N-Hydroxysuccinimid in 10 ml GE^Clj wurde unter Rühren mit einer Lösung von 680 mg 5 Dicyclohexylcarbodiimid in 5 ml C^Clj versetzt, worauf das Reaktionsgemisch 30 Minuten bei 0 °C und anschließend über Nacht bei 4 °C gerührt, dann vom Reaktionsgemisch der auskristallisierte Dicyclohexylhamstoff abfiltriert und mit Äthylacetat gewaschen, das erhaltene Filtrat mit der Waschflüssigkeit vereinigt und das ganze 2-mal mit 1 n-NaHCO^-Lösung, 2-mal mit Wasser und schließlich mit einer gesättigten Kochsalzlösung gewaschen wurde. Die erhaltene organische Phase wurde über wasserfreiem MgS04 getrocknet, 10 dann filtriert und in einem drehbaren Verdampfer vom Lösungsmittel befreit, worauf der erhaltene Rückstand aus

Isopropanol umkristallisiert wurde. Auf diese Weise wurden 0,844 g weißer Kristalle vom Fp = 140,5 °C erhalten, deren IR-Absorptionsspektrum in Chloroform das für N-Hydroxysuccinimidester typische Spektrum ergab. 15 IR (CHCI3): Carbonylbanden bei 1640 bis 1720,1742,1787 und 1815 cm'1,

Analyse: berechnet 57,39 % C, 7,57 % H, 9,56 % N, gefunden: 57,10 % C, 7,57 % H, 9,61 % N. 20 d) Herstellung des N^P^a-Cyclopentylcarbonyl-N^Ps^on-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-phenylalanins. Eine Lösung von 220 mg der gemäß Stufe c) hergestellten Verbindung in 2 ml Dioxan wurde tropfenweise einer Lösung von 99,1 mg L-Phenylalanin und 51 mg NaHCO^ in einem Gemisch aus 2 ml Wasser und 1 ml Dimethylformamid zugesetzt, worauf das Reaktionsgemisch über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und 25 anschließend das Dioxan in einem drehbaren Verdampfer bei 35 °C abgetrieben wurde. Der hiebei verbliebene Rückstand wurde mit 10 ml Äthylacetat versetzt, worauf das erhaltene Gemisch gekühlt und dann mit 0,ln-HCl auf einen pH-Wert von 2 angesäuert und die hiebei erhaltene wässerige Phase verworfen wurde. Die organische Phase wurde aufeinanderfolgend mit Eiswasser und einer gesättigten Kochsalzlösung gewaschen, dann über wasserfreiem MgS04 getrocknet und schließlich in einem drehbaren Verdampfer vom Lösungsmittel befreit, 30 worauf der erhaltene Rückstand aus Äther und Petroläther (Kp = 30 bis 60 °C) umkristallisiert wurde. Auf diese

Weise wurden 95 mg eines weißen Festkörpers vom Fp = 90 bis 92 °C, erhalten. Die erhaltene Verbindung erwies sich bei der bei einem pH-Wert von 1,9 und einem pH-Wert von 5,0 durchgeführten Papierelektrophorese und bei der unter Verwendung der Lösungsmittelsysteme 1, 2, 3 und 4 durchgeführten Dünnschichtchromatographie als homogen. 35 DSC (Silicagel): Rf (1) = 0,66, Rf (2) = 0,67, Rf (3) = 0,645, Rf (4) = 0,76 IR (CHCI3): Carbonylbanden bei 1650 bis 1720 cm** 40 Analyse:

berechnet: 63,78 % C, 8,03 % H, 8,58 % N

gefunden: 63,40 % C, 8,07 % H, 8,34 % N e) Herstellung des N^P*ia-[3-(N^P*ia-Cyclopentylcarbonyl-N^Ps^on-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-45 phenylalanylthio)-2-D-methyl-propanoyl]-L-prolins.

Eine in einem Eis-Trockeneis-Aceton-Bad auf eine Temperatur von -20 °C gekühlte Lösung von 73,5 mg der gemäß Stufe d) hergestellten Verbindung in 0,5 ml frisch destillierten Dimethyformamids wurde mit einer gekühlten Lösung von 26 mg Ι,Γ-Carbonyldiimidazol in 1,0 ml Dimethylformamid versetzt, worauf das erhaltene Gemisch 2 Stunden bei -10 °C gerührt und dann mit einer kalten und zuvor mit N-Äthylmorpholin 50 neutralisierten Lösung von 36 mg 3-Mercapto-2-D-methylpropanoyl-L-prolin in 1 ml Dimethylformamid versetzt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde sodann bei -10 °C eine weitere Stunde gerührt, worauf die Temperatur des Reaktionsgemisches langsam auf Raumtemperatur ansteigten gelassen wurde, anschließend das Lösungsmittel bei 40 °C unter vermindertem Druck abgetrieben und schließlich der erhaltene Rückstand in Äthylacetat aufgenommen wurde. Das so erhaltene Gemisch wurde in einem Gemisch aus Eis und Wasser 55 gekühlt, dann aufeinanderfolgend mit einem Gmisch aus ln-Zitronensäure und 3-mal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, anschließend über wasserfreiem MgS04 getrocknet und schließlich in einem drehbaren Verdampfer vom Lösungsmittel befreit Der erhaltene Rückstand wurde durch Chromatographieren in einer mit einem vernetzten Dextran-Hydroxypropyläther (Kemgröße 20 pm) gefüllten Kolonne von 1,2 cm -10-

Nr. 390 795

Durchmesser und 95 cm Länge unter Eluieren der Kolonne mit einem im Volumsverhältnis von 3 : 7 aus Tetrahydrofuran und Isopropanol bestehenden Lösungsmittelgemisches weiter gereinigt, wobei von den miteinander vereinigten Scheitelfraktionen das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgetrieben wurde. Auf diese Weise wurde die oben genannte Verbindung erhalten, welche abgekürzt auch als N^P^a-[3-(N^P^a-Cpc- hjEpsilon_Boc_L_LyS_L.phe_thio)-2-D-methylpiopanoyl]-L-prolin bezeichnet werden kann. DSC (Silicagel): Rf (3) = 0,73 f) Herstellung des N^P^a-[3-(N^P^a-Cyclopentylcarbonyl-L-lysyl-L-phenylalanylthio)-2-D-methyl-propanoyl]-L-prolins.

Durch Umsetzen von 30 mg der gemäß Stufe e) hergestellten Verbindung mit 200 μΐ wasserfreier

Trifluoressigsäure in 50 μΐ Anisol während einer Stunde bei Raumtemperatur wurde die N^Ps^on-Boc-Gruppe abgespalten, worauf vom Reaktionsgemisch das Anisol und die Trifluoressigsäure bei 35 °C unter vermindertem Druck abgetrieben und der hiebei erhaltene Rückstand mit wasserfreiem Äther verrieben wurde. Der Rückstand wurde durch Chromatographieren an einer mit einem vernetzten Dextran (Kemgröße 10 pm) gefüllten Kolonne von 1,2 cm Durchmesser und 95 cm Länge unter Eluieren mit 5-%iger Essigsäure gereinigt, wobei die miteinander vereinigten Scheitelfraktionen beim Gefriertrocknen die oben genannte Verbindung lieferten, die abgekürzt auch als N^Pka-[3-(N^P^a-Cpciiys-L-Phe-thio)-2^-methylpropanol]-L-prolin bezeichnet werden kann. DSC (Silicagel): Rf (3) = 0,16, Rf (4) = 0,52, Rf (5) = 0,58.

Beispiel 10: a) Herstellung des Pyro-L-glutamyl-L-phenylalanin-benzylesters.

Eine Lösung von 0,52 g Pyro-L-glutaminsäure, 1,72 g L-Phenylalaninbenzylester.Toluolsulfonsäuresalz und 0,55 ml N-Äthylmorpholin in 5 ml Dimethylformamid und 20 ml Dichlormethan wurde unter Rühren in einem Eisbad gekühlt und dann mit einer Lösung von 0,82 g Dicyclohexylcarbodiimid in 2 ml Dichlormethan versetzt, worauf das Reaktionsgemisch zunächst eine Stunde in einem Eiswasserbad und dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt wurde. Anschließend wurde vom Reaktionsgemisch der entstandene Dicyclohexylhamstoff abfiltriert und der Filterrückstand mit Äthylacetat gewaschen. Das Gemisch aus Filtrat und Waschflüssigkeiten wurde unter vermindertem Druck in einem drehbaren Verdampfer bei 40 °C von den Lösungsmitteln befreit, worauf der erhaltene Rückstand in 25 ml Äthylacetat aufgenommen, die erhaltene Lösung bis zur neutralen Reaktion gewaschen, dann über wasserfreiem MgSO^ getrocknet und anschließend filtriert und vom Filtrat das Lösungsmittel in einem rotierenden Verdampfer abgedampft wurde. Der hiebei erhaltene Rückstand wurde aus Isopropanol und Äther umkristallisiert und lieferte 1,01 g weißer Nadeln vom Fp = 103 bis 104,5 °C. Die erhaltene Verbindung erwies sich unter beliebigen Bedingungen bei der Dünnschichtchromatographie und bei der Elektoiphorese als homogen. DSC (Silicagel): Rf (1) = 0,69, Rf (2) = 0,61, Rf (3) = 0,66 IR (CHCI3): Carbonylbanden bei 1650 bis 1750 cnf1 und NH-Bande bei 3310 und 3418 cm'1,

Analyse:

berechnet: 68,84 % C, 6,05 % H, 7,64 % N

gefunden: 68,58 % C, 6,05 % H, 7,56 % N b) Herstellung des Pyro-L-glutamyl-L-phenylalanins.

Aus 1,0 g der gemäß Stufe a) erhaltenen Verbindung wurde die als Schutzgruppe vorliegende Benzylestergruppe durch katalytisches Hydrieren in 0,15 ml Eisessig und 15 ml Äthanol in Anwesenheit von 150 mg eines 10 Gew.-% Palladium auf Kohle enthaltenden Katalysators bei einem Wasserstoffdruck von 1,4 bar bei Raumtemperatur über Nacht abgespalten, worauf der Katalysator abfiltriert, vom Filtrat das Lösungsmittel in einem drehbaren Verdampfer abgedampft und der erhaltene Rückstand aus Isopropanol und Benzol umkristallisiert wurde. Auf diese Weise wurden 402 mg weißer Kristalle vom Fp = 147 bis 149 °C erhalten. Die erhaltene Verbindung erwies sich bei der bei einem pH-Wert von 1,9 und einem pH-Wert von 5,0 durchgeführten Elektrophorese und bei der mit den Lösungsmittelsystemen 1, 2 und 3 durchgeführten Dünnscluchtchromatographie als homogen. DSC (Silicagel): Rf (1) = 0,28, Rf (2) = 0,35, Rf (3) = 0,51 -11-

Nr. 390 795

Aminosäureanalyse: Gluj gg, Phe^ qq IR (CHClg): Carbonylbanden bei 1668 und 1719 cm"* und NH-Banden bei 3270 und 3370 cnf*

Analyse:

berechnet: 60,86 % C, 5,84 % H, 10,14 % N

gefunden: 60,37 % C, 5,85 % H, 9,98 % N c) Herstellung des N^*P^a-[3-(Pyro-L-glutamyl-L-phenyl-alanylthio)“2-D-methylpropanoyl]-L-prolins.

Eine Lösung von 87 mg Ι,Γ-Carbonyldiimidazol in 1,0 ml Dimethylformamid wurde bei einer Temperatur von -15 °C einer Lösung von 139 mg der gemäß b) hergestellten Verbindung in 0,5 ml Dimethylformid zugesetzt, worauf das erhaltene Gemisch eine Stunde bei -10 °C gerührt und dann mit einem Gemisch aus 119,5 mg 3-Mercapto-2-D-methylpropanoyl-L-prolin, 0,072 ml N-Äthyl-morpholin und 1 ml Dimethylformamid versetzt wurde und anschließend das Reaktionsgemisch eine weitere Stunde bei -10 °C gerührt wurde. Im Anschluß daran wurde die Temperatur des Reaktionsgemisches auf Raumtemperatur ansteigen gelassen, worauf das Dimethylformamid in einem rotierenden Verdampfer bei 40 °C unter vermindertem Druck abgetrieben und anschließend der erhaltene Rückstand in 7 ml Äthylacetat und 2 ml ln-Zitronensäure aufgenommen wurde. Die hiebei erhaltene organische Phase wurde 2-mal mit ln-Zitronensäure und dann 2-mal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem MgSO^ getrocknet und nach dem Filtrieren in einem rotierenden Verdampfer vom Lösungsmittel befreit. Der erhaltene Rückstand wurde durch Chromatographieren über eine mit einem vernetzten Dextran (Kemgröße 25 μιη) gefüllte Kolonne von 1,2 cm Durchmesser und 99 cm Länge unter Eluieren mit einem im Volumsverhältnis von 4 : 1 : 5 aus n-Butanol, Essigsäure und Wasser bestehenden Gemisch gereinigt. Die erhaltene Verbindung erwies sich bei der mit den Lösungsmittelsystemen 1,2 und 3 durchgeführten Dünnschichtchromatographie und bei der bei einem pH-Wert von 5,0 durchgeführten Elektrophorese als homogen. DSC (Silicagel): Rf (1) = 0,45, Rf (2) = 0,63, Rf (3) = 0,48

Aminosäureanalyse: Glug 99, Phe^ gg, Proj g-7

Beispiel 11:

HerstelUungdesN^P^-[3-(N^P^-Benzoyl-L-tryptophyl-thio)-2-D-methylpropanoyl]-L-prolins.

Eine in einem Eis-Trockeneis-Aceton-Bad auf -20 °C gekühlte Lösung von 62 mg N^lPha-Benzoyl-L-tryptophan in 0,5 ml destilliertem Dimethylformamid wurde mit einer kalten Lösung von 35 mg Ι,Γ-Carbonyldiimidazol in 1,0 ml Dimethylformamid versetzt, worauf das erhaltene Gemisch 2 Stunden bei -10 °C gerührt und dann mit einer zuvor mittels N-Äthyl-morpholin neutralisierten Lösung von 48 mg 3-Mercapto-2-D-methylpropanoyl-L-prolin versetzt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde sodann bei -10 °C eine weitere Stunde gerührt, worauf die Temperatur des Reaktionsgemisches langsam auf Raumtempertur ansteigen gelassen wurde und anschließend das Lösungsmittel vom Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck bei 40 °C abgetrieben wurde. Der hiebei erhaltene Rückstand wurde in Ähtylacetat aufgenommen, worauf das erhaltene Gemisch in einem Eisbad gekühlt und dann aufeinanderfolgend mit 0,1 η-HCl und 3-mal mit gesättigter Kochsalzslösung gewaschen wurde. Nach dem Trocknen der Lösung über wasserfreiem MgSO^ wurde das Lösungsmittel in einem rotierenden Verdampfer abgetrieben, worauf der erhaltene Rückstand durch Chromatographieren an einer mit einem vernetzten Dextran-Hydroxypropyläther (Korngröße 20 μηα) gefüllten Kolonne von 1,2 cm Durchmesser und 95 cm Länge unter Eluieren mit Isopropanol gereinigt wurde. Aus den miteinander vereinigten Scheitelfraktionen wurden nach dem Abtreiben des Lösungsmittels unter vermindertem Druck 60,5 mg der genannten Verbindung in Form eines schaumartigen Materials erhalten. Diese Verbindung erwies sich bei der unter Verwendung der Lösungsmittelsysteme 1, 2, 3 und 5 durchgeführten Dünnschichtchromatographie als homogen. DSC (Silicagel): Rf (2) = 0,70, Rf (3) = 0,68, Rf (4) = 0,59, Rf (5) = 0,74, NMR Delta (in CD3OD): 1,10 (3H, breites d, CH3), 1,65 bis 2,3 (4H, m, CH2), 2,6 bis 3,1 (3H, m, CH und CH2), 3,2 bis 3,7 (4H, m, CH2), 4,05 bis 4,35 (lH,m,CH), -12-

Nr. 390 795 4,8 bis 5,1 (1H, m, CH) und 6,88 bis 7,82 (10H, m, aromatisches H).

Beispiel 12: 5 Wenn bei der Arbeitsweise gemäß Beispiel 11 das gemäß diesem Beispiel eingesetzte NA1Pha-Benzoyl-L-tryptophan durch N^P^-Benzoyl-L-phenylalanin, NA^Pha-Benzoyl-glycin, N^P^a-Benzoyl-L-alanin bzw. NAlpha.Benzoyl-L-isoleucin ersetzt wurde, wurden die folgenden Verbindungen erhalten. NAlpha_p_(^Alpha_Benz0yi_phenylalanylthi0)-2-D-methylpropanoyl]-L-pr0lin, 10 DSC (Silicagel): % (1) = 0,52, Rf (2) = 0,70, Rf (3) = 0,56, Rf (4) = 0,61, NMR Delta (in CDCI3+CD3OD): 1,19 (3H, breites d, CH3), 1,5 bis 2,4 (4H, m, CH2), 15 2,5 bis 3,3 (5H, m, CH und CH2), 3,3 bis 3,8 (2H, m, CH2), 4,0 bis 4,4 (1H, m, CH), 4,8 bis 5,2 (1H, m, CH), 7,23 (5H, s, aromatisches H) und 20 7,2 bis 7,9 (5H, m, aromatisches H); NAlpha_[3_(j^Alpha.ßenz0yi.g|yCyithi0).2.D.methyipr0pan0yi].L.pr0iin, DSC (Silicagel): Rf (2) = 0,60, Rf (3) = 0,46, Rf (5) = 0,60; 25 NAlpha_[3_(^Alpha_ßenz0yj_L-a]anyitf1j0)_2_ß_meÜ1yipr0pan0y|j_L_pr0|jn> DSC (Silicagel): Rf (6) = 0,58, Rf (7) = 0,75, 30 NMR Delta (in CDCI3): 1,19 (3H, breites d, CH3), 1,48 (3H, d, CE3), 1,7 bis 2,4 (4H, m, CH2), 2.5 bis 3,2 (3H, m, CH und CH2), 3,25 bis 3,8 (2H, m, CH2), 35 4,2 bis 4,7 (1H, m, CH), 4,89 (1H, q, CH), 7.06 (1H, d, NH), 7,3 bis 8,0 (5H, m, aromatisches H) und 10,21 (1H, s, COOH); 40 N^Pha.p-lNAlph^Benzoyl-L-leucylthioJ^-D-methylpropanoylJ-L-piolm, DSC (Silicagel): Rf (6) = 0,58, Rf (7) = 0,82, 45 NMR Delta (in CD3OD): 0,99 (6H, breites d, CH3), 1,22 (3H, breites d, CH3), 1.5 bis 2,4 (7H, m, CH und CH2), 2.5 bis 3,15 (3H, m, CH und CE2), 3,4 bis 3,9 (2H, m, CH2), 50 4,1 bis 4,45 (1H, m, CH), 4.6 bis 5,0 (1H, m, CH) und 7,45 bis 8,1 (5H, m, aromatisches H). -13-

Nr. 390 795

Beispiel 13: a) Herstellung des N^P^a-Benzoyl-phenylalanin-N-hydroxysuccinimidesters.

In ein im Volumsverhältnis von 1 : 1 aus Tetrahydrofuran und Dimethylformamid bestehendes 5 Lösungsmittelgemisch wurden 1,347 g Benzoyl-phenylalanin und 0,576 g N-Hydroxy-succinimid eingemischt, worauf das erhaltene Gemisch in Anwesenheit von 1,133 g Dicyclohexylcarbodiimid über Nacht bei 4 °C stehen gelassen wurde.

Das Reaktionsgemisch wurde sodann filtriert, worauf vom Filtrat das Lösungsmittel bei 30 °C unter vermindertem Druck abgetrieben wurde. Der hiebei erhaltene weiße Rückstand wurde aus einem Gemisch aus 10 Tetrahydrofuran und Isopropylalkohol umkristallisiert und lieferte mit einer Ausbeute von 65,2 % 1,194 g eines weißen Feststoffes vom Fp = 156 bis 157 °C. Das IR-Absorptionsspektrum in Chloroform zeigte eine für eine NH-Gruppe typische Absorptionsbande bei 3440 cm"·*·, für die N-Carboxysuccinimidgruppe typische Absorptionsbanden bei 1818 cm"^, 1790 cm"* und 1744 cm'* und eine für die N-Benzoylgruppe typische Absorptionsbande bei 1669 cm'V 15 b) Herstellung des N^P^a-[3-(NAlpha.Benzoyl-phenylalanylthio)-2-D-methylpropanoyl]-L-prolins.

Ein aus 93,3 mg 2-D-Methyl-3-mercaptopropanoyl-L-prolin, 62 mg 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) und 165 mg des gemäß Stufe a) hergestellten N-Benzoyl-phenyl-alanyl-N-hydroxy-succinimidesters hergestelltes Reaktionsgemisch wurde in einem Eisbad auf etwa 0 °C gekühlt und dann mit 0,0544 ml N-Äthylmorpholin 20 versetzt, worauf das nunmehr vorliegende Gemisch in einem Eisbad 3 Stunden gerührt, dann über Nacht bei 4 °C und schließlich 20 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen wurde. Die Umsetzung wurde durch Zusetzen von 25 μΐ N,N-Dimethyl-1,3-propandiamin zum Reaktionsgemisch und 2-stündiges Rühren desselben abgebrochen. Das Reaktionsgemisch wurde sodann mit Äthylacetat verdünnt, worauf das verdünnte Reaktionsgemisch mit kalter 0,1 η-HCl, dann 2-mal mit Wasser und schließlich 3-mal mit gesättigter 25 Kochsalzlösung gewaschen wurde. Die verliehene organische Phase wurde über wasserfreiem MgSC^ getrocknet, dann filtriert und unter vermindertem Druck in einem drehbaren Verdampfer vom Lösungsmittel befreit, wobei als Rückstand ein klares öliges Produkt verblieb.

Dieses ölige Produkt wurde durch Chromatographieren in einer mit einem vernetzten Dextran-Hydroxypropylether (Korngröße 20 |im) gefüllten Kolonne von 1,2 cm Durchmesser und 96 cm Länge unter 30 Eluieren mit Tetrahydrofuran, wobei Fraktionen zu je 2,5 ml aufgefangen wurden, gereinigt. Die Fraktionen Nr. 30 und Nr. 31 wurden miteinander vereinigt und lieferten beim Abtreiben des Lösungsmittels im Hochvakuum 110 mg eines Rückstandes. Durch Zusetzen von wasserfreiem Äther zum erhaltenen Rückstand wurde ein weißes, gummiartiges Material erhalten, das nach dem Abdekantieren des Äthers in Tetrahydrofuran gelöst wurde. Die erhaltene Lösung wurde in ein Reagenzglas übergeführt und darin im Stickstoffstrom und anschließend über 35 Nacht über ^2^5 getrocknet. Hiebei wurden 82 mg eines schaumartigen Produktes erhalten.

Die Fraktionen Nr. 29, Nr. 32 und Nr. 33 wurden unter identischen Bedingungen emeut Chromatographien, wobei die hiebei erhaltenen Fraktionen Nr. 33 bis 36 miteinander vereinigt und in der beschriebenen Weise weiter verarbeitet wurden. Hiebei wurden weitere 51 mg der Verbindung erhalten. Die Gesamtausbeute betrug 71 %. 40 DSC (Silicagel): Rf (1) = 0,52, Rf (2) = 0,70, Rf (3) = 0,56, Rf (4) = 0,61, Rf (5) = 0,75.

Eine alternative Methode zur Herstellung des Ni^pha-[2-(N/^P*ia-Benzoyl-phenylalanylthio)-propanoyl]-L-3,4-dehydroprolins und verwandter Derivate wird im folgenden Beispiel beschrieben. 45 Beispiel 14: a) Herstellung der 2-Benzoyl-phenylalanylthiopropansäure.

Eine auf -20 °C gekühlte Lösung von Benzoyl-phenylalanin in 30 ml destilliertem Dimethylfonnamid wurde unter kräftigem Rühren tropfenweise mit einer Lösung von Ι,Γ-Carbonyl-diimidazol in 10 ml destilliertem 50 Dimethylformamid versetzt, wobei die Temperatur des Gemisches nicht über -14 °C ansteigen gelassen wurde. Im

Anschluß daran wurde das erhaltene Gemisch bei -10 °C zunächst 2 Stunden gerührt und dann bei einer Temperatur von 10 °C innerhalb einer Stunde mit einer zuvor mittels destilliertem N-Äthylmoipholins neutralisierten Lösung von D,L-Thiomilchsäure in destilliertem Dimethylformamid versetzt. Die erhaltene Lösung wurde dann langsam auf Raumtemperartur erwärmt und dann mit dem gleichen ihres Volumens an 55 Äthylacetat versetzt, worauf das erhaltene Gemisch gekühlt und dann mit einer konzentrierten Lösung von HCl in gesättigter Kochsalzlösung neutralisiert wurde. Die hiebei entstandene organische Phase wurde 3-mal mit einem Gemisch aus 5 Vol.-teilen gesättigter Kochsalzlösung und 1 Vol.-teil Wasser gewaschen.

Gelegentlich entsteht ein dreiphasiges System. In einem solchen Fall wird die mittlere Schicht zusammen mit der unteren wässerigen Phase weiter verarbeitet. Die organische Phase wurde über wasserfreiem MgSO^ -14-

Nr. 390 795 getrocknet, filtriert und dann in einem rotierenden Verdampfer vom Lösungsmittel befreit. Die mit der wässerigen Phase vereinigte mittlere Phase wurde mit konzentrierter Salzsäure bei einer Temperatur von 0 °C auf einem pH-Wert von 2 angesäuert und dann 3-mal mit Äthylacetat extrahiert. Die hiebei erhaltene organische Phase wurde mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, anschließend über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, 5 dann filtriert und schließlich in einem rotierenden Verdampfer eingedampft, wobei als Rückstand ein klares Öl erhalten wurde, das beim Umkristallisieren aus EtOAc und Hexan weiße Kristalle vom Fp = 151 bis 152 °C lieferte.

Analyse: 10 berechnet: 63,85 % C, 5,36 % H, 3,92 % N, gefunden: 62,80 % C, 5,31 % H, 3,90 % N, DSC (Silicagel): Rf (1) = 0,65, Rf (2) = 0,72, Rf (3) = 0,68, Rf (4) = 0,83. 15 b) Herstellung des N^P^-[2-(N^P^a-Benzoyl-phenylalanyl-2-thio-propanoyl)]-L-3,4-dehydroprolins.

Aus 213 mg (1 mmol) Boc-L-3,4-dehydroprolin wurde mittels 1 ml wasserfreier Trifluoressigsäure während einer Stunde die Schutzgruppe abgespalten, wobei dem Reaktionsgemisch 3 ml Äthyläther zugesetzt und anschließend die Lösungsmittel bei 30 °C in einem rotierenden Verdampfer abgetrieben wurden. Der hiebei erhaltene Rückstand wurde 3-mal mit Äther gewaschen und dann in einem Vakuumexsiccator über NaOH 20 getrocknet.

Eine in einem Trockeneis-Aceton-Bad auf -20 °C gekühlte Lösung von 358 mg (1 mmol) der gemäß a) hergestellten Verbindung in 3 ml destilliertem Dimethylformamid wurde unter Aufrechterhaltung einer Temperatur von -10°C bis -15°C tropfenweise mit einer Lösung von 171 mg (1,05 mmol) l.l'-Carbonyldiimidazol in 1 ml destilliertem Dimethylformamid versetzt, worauf das Reaktionsgemisch 25 2 Stunden gerührt und dann mit einer zuvor mittels Triäthylamins neutralisierten kalten Lösung von L-3,4-

Dehydroprolin.Trifluoracetat in 2 ml Dimethylformamid gelöst wurde. Die Temperatur des Reaktionsgemisches wurde sodann langsam auf Raumtemperatur gebracht, worauf vom Reaktionsgemisch im Vakuum bei 35 °C in einem rotierenden Verdampfer das Lösungsmittel abgedampft wurde. Der hiebei erhaltene Rückstand wurde in einem Gemisch aus 10 ml Äthylacetat und 2 ml Wasser aufgenommen, worauf das erhaltene Gemisch bei 0 °C 30 mit ln-HCl auf einen pH-Wert von 2 angesäuert und durchgemischt wurde. Nach dem Abtrennen der organischen

Phase des Gemisches wurde die wässerige Phase des Gemisches 3-mal mit je 5 ml Äthylacetat extrahiert.

Die miteinander vereinigten organischen Phasen wurden 2-mal mit Wasser und dann 3-mal mit gesättiger Kochsalzlösung gewaschen und anschließend mit Aktivkohle entfärbt. Sodann wurde die organische Phase mittels wasserfreiem MgS04 getrocknet und dann filtriert. Das Filtrat wurde in einem rotierenden Verdampfer zur 35 Trockene eingeengt, wobei 336 mg eines öligen Produktes erhalten wurde, das durch Chromatographieren in einer mit ins Gleichgewicht gebrachtem mit einem vernetzten Dextran-Hydroxypropylether (Korngröße 20 pm) gefüllten Kolonne von 1,2 cm Durchmesser und 98 cm Länge unter Eluieren der Kolonne mit Methanol weiter gereinigt wurde, wobei Franktionen zu je 150 Tropfen (2,9 ml) aufgefangen wurden. Die gewünschte Verbindung war in den Fraktionen Nr. 24 bis Nr. 29 enthalten, aus welchen das Lösungsmittel in einem rotierenden 40 Verdampfer entfernt wurde.

Die erhaltene Verbindung wurde durch nochmaliges Chromatographieren an einer obzitierten Kolonne gereinigt, wobei die Kolonne mit Isopropanol ins Gleichgewicht gebracht und eluiert wurde und von den miteinander vereinigten Scheitelfraktionen das Lösungsmittel in einem rotierenden Verdampfer abgedampft wurde. Das erhaltene Produkt besaß nach der mit den Lösungsmittelsystemen 2 und 3 durchgeführten 45 Dünnschichtchromatographie eine Reinheit von annähernd 95 %. DSC (Silicagel): Rf (2) = 0,73, Rf (3) = 0,59, Rf (4) = 0,615, Rf (5) = 0,73.

Wenn bei dieser Arbeitsweise statt des Boc-L-3,4-dehydroprolins Boc-L-prolin eingesetzt wurde, wurde 50 N^P^a-[2-(N^P^a-Benzoyl-phenylalanyl-2-thio-propanoyl]-L-prolin erhalten. DSC (Silicagel): Rf (1) = 0,58, Rf (2) = 0,78, Rf (3) = 0,59, Rf (4) = 0,59.

Entsprechend den in den obigen Beispielen beschriebenen Arbeitsweisen wurden noch folgende Verbindungen 55 hergestellt.

[Alpha]D =-151,3 NMR Delta (in CDClj): 0,92 (6H, d, CH3), NA,pha_[3_(NA1pha-Acetyi-L- -leucylthio)-2-D-methylpro- panoyl]-L-prolin -15-

Nr. 390 795 1,21 (3H, d, CH3), 2,01 (3H, S, CH3CO), 1,4 bis 4,0 (12H, m, CH und CH2), 4.0 bis 5,0 (2H, m, CH), 6.0 bis 6,6 (1H, m, NH), 6,72 (1H, S, COOH). NA1Pha_[3-(jsjA1Pha-Acetyl-L- -valylthio)-2-D-methylpro- panoyl]-L-prolin [Alpha]D = -153,5 NMR Delta (in CDCI3): 0,90 (3H, d, CH3), 0,96 (3H, d, CH3), 1,23 (3H, d, CH3), 1.7 bis 2,5 (4H, m, CH2), 2.08 (3H, S, CH3CO), 2,5 bis 4,0 (6H, m, CH und CH2), 4,1 bis 5,0 (2H, m, CH), 6.58 (1H, d, NH), 8.58 (1H, S, COOH). NAlpha-[3-NA1Pha-Acetyl-L- -alanylthio)-2-D-methylpro- panoyl]-L-prolin [Alpha]D =-151,7 NMR Delta (in CDCI3): 1,20 (3H, d, CH3), 1,37 (3H, d, CH3), 2,01 (3H, S, CH3CO), 1,7 bis 2,5 (4H, m, CH2), 2.5 bis 4,0 (5H, m, CH und CH2), 4,0 bis 5,0 (2H, m, CH), 6.5 bis 7,3 (2H, m, NH und COOH). N^P^-P-CN^P^-Propanoyl-L- -tryptophylthio)-2-D-methyl- propanoyl]-L-prolin [Alpha]D = -116,7 NMR Delta (in CDCI3): 1.0 (3H, t, CH3CH2), 1,21 (3H, d, CH3), 1,6 bis 4,0 (13H, m, CH und CH2), 4.0 bis 5,3 (2H, m, CH), 6.0 bis 6,6 (1H, m, NH), 6.8 bis 7,8 (5H, m, aromatisches H), 8.8 bis 9,2 (2H, m, NH und COOH). NAPa.E3.(NAlpha.tBrL.ButylOTy. carbonyl-L-alanylthio)-2-D- methylpropanoyl]-L-prolin Fp = 143 bis 145 °C [Alpha]]} = -153,8 j^ÄlpMp-iNÄiplia-terL-Butancarbonyl- glycylthio)-2-D-methyl- propanoyl]-L-prolin [Alpha]D =-101,7 Rf (6) = 0,56 Rjr (7) = 0,63 NMR Delta (in CDCI3): 1,21 (3H, d, CH3), 1,35 (9H, S, CH3), 1.5 bis 2,5 (4H, m, CH2), 2.5 bis 3,9 (5H, m, CH und CH2), -16-

Nr. 390 795 3,9 bis 4,8 (3H, m, CH und CH2), 6,5 bis 7,4 (1H, m, NH), 11,11 (1H, S, COOH). bfAlpha_ [2-(N'^!pha.Acetyl-L-phenyl- [Alpha]p = -44,4 alanyltio)-propanoyl]-L-prolin (6) = 0,83 10 N^P^-P-CN^P^-Benzoyl-L-phenyl- Rf (1) = 0,58 alanylthio)-propanoyl]-L-prolin Rf (2) = 0,78

Rf (3) = 0,59 Rf(4) = 0,59

Pharmakologische Prüfung: 15 Die Inhibitionswirkung verschiedener der oben hergestellten Verbindungen wurde in vitro nach folgender Methode gemessen.

Das Enzym wurde in einem an NaCl 0,1-molaren und an Na2S04 0,75-molaren und an Hepes 0,05-molaren Puffer mit einem pH-Wert von 8,0 geprüft. Als Substanz wurde Benzoyl-GlyHisLeu mit einer Endkonzentration von 1.10“4-molar, (Km = 2.10“4-molar) zusammen mit einem 130000 cpm [^HJBenzoyl-GlyHisLeu 20 (25 Ci/mmol) eingesetzt. Das Enzym wurde im oben erwähnten Puffer in solcher Konzentration gelöst, daß 40 μΐ der Enzymlösung in der Lage waren, bei 37 °C innerhalb 15 Minuten 13 % des Substrats zu hydrolisieren. Vor Beginn des Versuchs wurden 40 μΐ der Enzymlösung und 10 pl Wasser oder wässerige Inhibitorlösung 5 Minuten auf 37 °C erwärmt. Anschließend wurde durch Zusetzen von 50 μΐ der Substratlösung die Reaktion eingeleitet und das Rekationsgemisch 15 Minuten auf 37 °C gehalten. Um die Reaktion abzubrechen, wurde 25 sodann das Reaktionsgemisch mit 1 ml einer 0,1-molaren Salzsäure versetzt, worauf das erhaltene Gemisch mit 1 ml Äthylacetat versetzt wurde. Das so erhaltene Gemisch wurde sodann gerührt und anschließend zwecks Phasentrennung kurz zentrifugiert. 500 μΐ der erhaltenen Äthylacetatphase wurden in ein Szintillationszählrohr eingebracht, welches 10 ml einer auf einem Pseudokumol basierenden Szintillationszählflüssigkeit für Radioimmunotests enthielt. Zwecks 30 Bestimmung der I^g-Werte wurde die sich bei verschiedenen Inhibitorkonzentrationen ergebende Enzymaktivität mit der sich in Abwesenheit eines Inhibitors ergebenden Enzymaktivität verglichen. Aus einer graphischen Darstellung der Abhängigkeit der in Prozent ausgedrückten Inhibition von der Inhibitorkonzentration ergab sich der I^Q-Wert

Das Enzympräparat wurde aus menschlichem Urin nach der von Ryan, J.W., et al., in Tissue and Cell 10, 35 555 (1978) angegebenen Methode hergestellt. Die folgende Tabelle I zeigt die I^g-Werte für verschiedene

Verbindungen. Der I^g-Wert bedeutet jene Konzentration an Inhibitor, bei welcher das Enzym unter normierten Versuchsbedingungen, wobei das Substrat mit einer wesentlichen unter liegenden Konzentration vorliegt, zu 50 % inhibiert wird. 40

Verbindung Beispiel 1 45 Beispiel 3

Beispiel 5 Beispiel 7 Beispiel 9e) Beispiel 9f) 50 Beispiel 11

Beispiel 12a) Beispiel 12b) Beispiel 14

Tabelle I *50 2,6.10'** - molar 3,4.10'** - molar 7,5.10'^ - molar 8,8.10'^ - molar 2,5.10“** - molar 1,5.10'** - molar 9,4.10"^ - molar 2,5.10'** - molar 7,5.10'^ - molar 3.10'^ - molar -17-

Nr. 390 795

Wirkung verschiedener Verbindungen bei oraler Verabreichung derselben

Ein Körpergewicht von 210 bis 290 g besitzende Ratten wurden über Nacht hungern gelassen und dann durch intraperitoneale Verabreichung von Pentobarbital in einer Menge von 50 bis 60 mg/kg anästhesiert, worauf eine Trachesostomie durchgeführt und die Tiere mechanisch ventiliert wurden. Um Angiotensin I zu injizieren, wurde in eine Femoralvene eine Kanüle eingeführt, wobei eine weitere Kanüle in eine Carotidarterie eingeführt wurde, um den arteriellen Blutdruck direkt messen zu können. Über die Femorvene wurden 1000 Einheiten Heparin zugeführt, um eine Koagulation zu vermeiden. Der Blutdruck wurde mittels eines an einen Vielfachschreiber angeschlossen Druckwandlers gemessen. In die Ratten wurde sodann Angiotensin I in einer Menge von 160 bis 400 ng/kg in Form einer Lösung in 20 μΙ einer 0,9 gew.-%-igen Kochsalzlösung injiziert. Diese Menge an Angiotensin I reicht aus, den durchschnittlichen arteriellen Blutdruck um 36 bis 67 mbar zu erhöhen. Nachdem festgestellt wurde, daß die jeweilige Ratte auf Angiotensin I anspricht, wurde die zu prüfende Verbindung in einer Menge von 5,5 bis 23 pmol/kg in Form einer Lösung in 0,15 ml Wasser und 10 μΐ ln-NaHCC>3 über einen

Magenschlauch verabreicht. In bestimmten Zeitabständen wurde die Wirkung von 160 bis 400 ng/kg von Angiotensin I auf den mittleren arteriellen Blutdruck bestimmt Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle II angegeben, wo die jeweils verabreichte Dosis einer speziellen Verbindung in Klammer unter die Nummer der Verbindung gesetzt ist Beispeisweise bedeutet 1 (13,6), daß 13,6 pmol/kg der Verbindung gemäß Beispiel 1 oral verabreicht wurden. Die zwischen dem Zeitpunkt der oralen Verabreichung der jeweiligen Verbindung und dem Zeitpunkt des Messens der Wirkung des Angiotensins I verstrichene und in Minuten gemessene Zeit ist hinter den Prozentangaben in eckige Klammem gesetzt. (Es folgt Tabellen) -18-

Nr. 390 795

-Φ co CS r—» r—i r—, r—t i—i r—i i—ι ι—i r—n r—i r—s ι—i Ti* Tf \Λ ΗΟί^ίη^ιη'ΰοοοΝΗΗΛ _ I-1 I-1 l—I l—J t—J t__l l__l l__l l__l I—J L<J 80'-i-5f't-a-cn\os-Ot"is-'OQ ooot^-t'-c^vO'nri-iocnTtr'tno

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Claims (13)

1. Nr. 390 795 Wirkung verschiedener Verbindungen bei intravenöser Verabreichung Zunächst wurden Ratten in der zuvor angegebenen Weise anästhesiert. Nachdem das Ansprechen einer Ratte auf Angiotensin I festgestellt worden war, wurden die zu prüfende Verbindung in einer Menge von 2 pmol/kg in 15 μΐ einer 0,01n-Natriumbicarbonatlösung über eine Femorvene verabreicht. Die Wirkung des in einer Menge von 400 ng/kg verabreichten Angiotensins I auf den mittleren arteriellen Blutdruck wurde in bestimmten Zeitabständen ermittelt. Die erhaltenen Ergebnisse zeigt die folgende Tabelle III, für welche die zu Tabelle II gegebenen Erläuterungen gelten. Tabelle ΙΠ Blutdruck nach Verabreichung von Angiotensin I in einer Menge von 400 ng/kg in % des Vergleichswertes [Minuten nach dem intravenösen Verabreichen] Verbindung (Dosis) 3 9f 11 (2) (2) (2) 100% [-5] 100% [-5] 100% [-5] 0 [+0,5] 8 [+3] 8 [+0,5] 19 [3] 15 [9] 18 [5] 19 [9] 23 [14] 21 [11] 22 [13] 23 [19] 24 [14] 31 [18] 33 [24] 29 [17] 31 [22] 41 [37] 34 [20] 50 [34] 46 [45] 42 [24] 63 [47] 46 [54] 47 [32] 78 [65] 46 [77] 53 [43] 75 [103] 51 [87] 58 [49] 94 [113] 61 [56] 71 [71] 78 [76] 76 [88] 76 [99] 74 [109] 84 [125]. PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung eines neuen Inhibitors für angiotensinumwandelndes Enzym der allgemeinen Formel O II R-A-S-(CH2)n-CH-C-R2 , (I) 1 R -20- Nr. 390 795 in welcher R Wasserstoff, Formyl, Acetyl, Propanoyl, Butanoyl, Phenylacetyl, Phenylpropanoyl, Benzoyl, Cyclopentylcarbonyl, tert-Butyloxycarbonyl, Cyclopentylcarbonyl-L-lysyl, Pyro-L-glutamyl-L-lysyl, L-Arginyl, ' L-Lysyl oder Pyro-L-glutamyl darstellt, 5 A L-Phenylalanyl, Glycyl, L-Alanyl, L-Tryptophyl, L-Tyrosyl, L-Isoleucyl, L-Leucyl, L-Histidyl oder L-Valyl bedeutet, wobei die Alpha-Aminogruppe in Amidbindung an R geknüpft ist und Phenylalanyl racemisch ist, falls R für Benzoyl steht, R i für Wasserstoff oder Methyl steht, R2 L-Prolin, L-3,4-Dehydroprolin, D,L-3,4-Dehydroprolin, L-3-Hydroxyprolin, L-4-Hydroxyprolin oder 10 L-Thiazolidincarbonsäure insbesondere L-Thiazolidin-4-carbonsäure darstellt, wobei die Iminogruppe in Imidbindung an die O II 15 angrenzende Gruppe-C-gebunden ist, und n gleich 0 oder 1 mit der Maßgabe ist, daß wenn n gleich ist Null, Rj für Methyl steht, dadurch gekennzeichnet, daß eine Verbindung der allgemeinen Formel 20 0 II HS-(CH2)n-CH-C-R2 , (II) 25 R 1 in welcher R^, R2 und n die oben angegebene Bedeutung besitzen mit einer Verbindung der allgemeinen Formel 30 R-A ,(ΠΙ) in welcher R und A die oben angegebene Bedeutung besitzen, umgesetzt wird und gegebenenfalls durch Abspaltung der Schutzgruppe aus einer Verbindung der allgemeinen Formel O 35 40 tert-Butyloxycarbonyl-A-S-(CH2)n-CH-C-R2, I R1 in welcher A, Rj, R2 und n die oben angegebene Bedeutung besitzen, eine Verbindung der allgemeinen Formel O 45 A-S-(CH2)n-CH-C-R2 50 hergestellt wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung in Anwesenheit von Ι,Γ-Carbonyldiimidazol durchgeführt wird. 55
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Ausgangsprodukt der Formel III Verbindungen verwendet werden, worin R Benzoyl ist. -21- Nr. 390 795
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Ausgangsprodukte der Formel ΠΙ Verbindungen verwendet werden, worin R Formyl, Acetyl, Propanoyl, Butanoyl, Phenylacetyl oder Phenylpropanoyl ist.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Ausgangsprodukte der Formel III Verbindungen verwendet werden, worin R Cyclopentylcarbonyl oder tert-Butyloxycarbonyl ist.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Ausgangsprodukte der Formel III Verbindungen verwendet werden, worin R Cyclopentylcarbonyl-L-lysyl oderPyro-L-glutamyl-L-lysyl ist
7. 7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Ausgangsprodukte der Formeln II und ΙΠ Verbindungen verwendet werden, worin R für Benzoyl, A für Phenylalanyl, Rj für Methyl, R2 für L-Prolin und n für 1 steht
8. 8. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Ausgangsprodukte der Formeln II und ΙΠ Verbindungen verwendet werden, worin R für Benzoyl, A für Phenylalanyl und R2 für L-Prolin steht und N gleich ist Null oder 1 und Rj eine in D-Konfiguration stehende Methylgruppe ist
9. 9. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Ausgangsprodukte der Formeln II und ΠΙ Verbindungen verwendet werden, worin R für Benzoyl, A für Phenylalanyl und R2 für L-3,4-Dehydroprolin steht und n gleich ist Null oder 1 und Rj Wasserstoff oder eine in D-Konfiguration stehende Methylgruppe ist.
10. 10. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Ausgangsprodukte der Formeln Π und ΙΠ Verbindungen verwendet werden, worin R für Benzoyl und A für L-Tryptophyl, L-Tyrosyl oder L-Histidyl steht.
11. 11. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Ausgangsprodukte der Formeln II und ΙΠ Verbindungen verwendet werden, worin R für Benzoyl und A für Glycyl, L-Alanyl, L-Isoleucyl, L-Leucyl oder L-Valyl steht
12. 12. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Ausgangsprodukte der Formel IH Verbindungen verwendet werden, worin R für Wasserstoff steht
13. 13. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Ausgangsprodukte der allgemeinen Formel ΙΠ Verbindungen verwendet werden, worin R für L-Arginyl, L-Lysyl oder L-Pyroglutamyl steht -22-