FI67539B - Foerfarande foer framstaellning av nya terapeutiskt anvaendbara peptidyl-ng-karboxyl-arginaldehyder - Google Patents

Description

M (11) U L UTU SJ U LK AI SU .7r7Q

ffiTA lJ ' ’ UTLAGG N I NGSSKRI FT 6/0^7 C ^ Fatcr.tti ayjr.r.c l‘.y 13 C4 19135 (51) KvJkic 07 c 103/52, 129/12 SUOMI—FINLAND (M) Nm«»iiiwwi-NwBw>ta>i| 800008 (22) HakemtafUv·—Anaekningadag 02.01 .80 (23) ANmpflM—Glklg|Mt*dag 02.01.80 (41) Tullut JirildMlal —Blhrlt offmtNg 05.07-80

Patantti* ja rekl«t*Hh»llltu$ j. kuuLJ-k—· «"«.- 31.12.81*

Patent» och ragtstentyralMn ' amMcm «lagd och uU^knfUn puMkand (32)(33)(31) ftr***r motctkm*—B*gir4 priority 01*. 01 .79

Unkar i -Ungern (HU) G0—1-1*35 (71) Rich ter Gedeon Vegyeszeti Gyär R.T., 19, Gyömröi u., Budapest X,

Unkari-Ungern(HU) (72) Sandor Bajusz, Budapest, Erzsebet Szell näe Hasenöhrl , Budapest,

Eva Barabas, Budapest, Daniel Bagdy, Budapest, Unkari-Ungern(HU) (7l*) Oy Koi ster Ab

Q

(51*) Menetelmä uusien terapeuttisesti käytettävien peptidyy1i-N -karb-oksyyli-arginiin ia 1dehydien valmistamiseksi - Förfarande för fram-ställning av nya terapeutiskt användbara peptidyl-N^-karboxyl--arg i na1dehyder

Keksintö koskee yleiskaavan I tai Ia mukaisten uusien terapeuttisesti käytettävien peptidyyli-N -karboksyyliargiini-aldehydien ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien happoaddi-tiosuolojen valmistusmenetelmää,

I | NH

X-Y-Pro-HN-CH N-C(^ (I)

NH-COOH

OH

V i f I ™ X-Y-Pro-NH-CH NH“< Ua)

"“CHO NH-COOH

-- " r __ _ 2 67539 jossa kaavassa X on vetyatomi tai bentsoyyli- tai tert.-butyylioksikarbonyy-liryhmä, ja Y on D—fenyylialaniini—, ^J-fenyyli-D-maitohappo- tai D-allo-isoleusiinijäännös.

On yleisesti tunnettua, että peptidialdehydit, joilla on tietty rakenne, pystyvät toimimaan inhibiittoreina seriini- ja kysteii-nientsyymien proteolyyttisissä reaktioissa. Entsyymin inhibointi-mekanismiksi oletetaan entsyymin reaktiivisen OH- tai SH-ryhmän ja peptidialdehydien -CH=0-ryhmän välinen additioreaktio, jossa muodostunut hemiasetaali on entsyymin ja substraatin välille syntyneen tetraedrisen siirtymäkompleksin "ei-tuottava" analogi.

(Westernik ja Wolfenden: J. Biol. Chem. 247 (1072), s. 8195). Tämän yhdisteryhmän ensimmäiset jäsenet olivat luonnossa esiintyvät leu-peptiinit, so. asetyyli- ja propionyyli-L-leusyyli-L-leusyyli-argi-niinialdehydihydrokloridit, joista molemmat pystyivät inhiboimaan plasmiinin, trypsiinin ja papaiinin (Kawamura et ai.: Chem. Pharm.

Bull. 17 (1969), s. 1902 ; H. Umezava: Enzyme Inhibitors of Microbial Origin, University Park Press, Baltimore-London-Tokio, 1972, ss. 17-29). Muilla peptidyyliarginiinialdehydeilla, esim. bentsoyyli-D-allo-isoleusyyli-L-prolyyli-L-arginiinialdehydi-p-tolueenisulfonaatilla j a D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-L-argiini-aldehydilla, on havaittu huomattava trombiinin toimintaa estävä vaikutus (unkarilainen patentti 169870) .

Leupeptiinien NMR-tutkimusten perusteella asyyliarginiini-aldehydihydrokloridien on oletettu esiintyvän seoksina, joiden koostumus vaihtelee (Maeda et ai., J. Antibiotics (Tokio) 24 (1971) 402; Kawamura et ai., Chem. Pharm. Bull. 17 (1969) 1902). Asyyliar-giniinialdehydihydrokloridin lisäksi seos sisältää kaksi muuta komponenttia: aldehydihydraattia ja syklistä karbinoliamiinia. Aldehydi-hydraatti ei voi suoraan osallistua hemiasetaalin muodostukseen eikä siten entsyymin inhibointiin (Westernik ja Wolfenden, J. Biol. Chem.

247 (1972) 8195). Äskettäin on havaittu, että edellä mainittujen synteettisten yhdisteiden aiheuttama entsyymien inhibointiteho ja esim. D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-L-arginii.nialdehydiasetaatin ja -hydrokloridin aiheuttama trombiinin toimintaa estävän vaikutuksen teho vaihtelee ja että niiden teho vähenee niitä varastoitaessa liuoksessa (tris-(hydroksimetyyli)-metyyliamiinihydrokloridi purkuri-liuos, pH 7,4), mihin voi olla syynä aldehydihydraattipitoisuuden 3 67539 jatkuva muuttuminen.

Käsillä olevan keksinnön tarkoituksena on kehittää uusi menetelmä peptidyyliarginiinialdehydijohdannaisten valmistamiseksi, jotka yhdisteet ovat pysyvämpiä ja inhiboivat entsyymitoimintaa tehokkaammin kuin toistaiseksi saavutetut tulokset.

Havaittiin, että poistettaessa uretaanin kaltainen suojeleva ryhmä, esim. bentsyylioksikarbonyyliryhmä neutraalissa olosuhteissa peptidyyliarginiinialdehydeistä, muodostuu yleisen kaavan I mukaisia yhdisteitä, joissa X ja Y merkitsevät samaa kuin edellä.

Esim. suoritettaessa bentsyylioksikarbonyyli-D-fenyylialanyyli-L-pro-

G G

lyyli-N -bentsyylioksikarbonyyli-L-arginiinialdehydin (N merkitsee arginiini-sivuketjun -asemassa olevaa typpiatomia) hydrogenolyysi

Q

neutraalissa olosuhteissa, muodostuu D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-N -karboksi-L-arginiinialdehydia (yleiskaavassa I X on vetyatomi ja Y on D-fenyylialaniinijäännös), kun taas, kuten tunnettua hydrogeno-lysoitaessa emäksisissä olosuhteissa peptidyyliarginiinialdehydeja, joissa suojaryhmänä on bentsyylioksikarbonyyliryhmä, mitä seuraa suolanmuodostusreaktio, syntyy vapaita peptidyyliarginiinialdehydi-suoloja. H-D-Phe-Pro-Arg-H-asetaattia tai -hydrokloridia saatiin tällä tavalla Z-D-Phe-Pro-Arg/Z/-H:sta (unkarilainen patentti 169870) .

Aminohappojäännöksistä ja peptidijohdannaisista käytetyt lyhennykset ovat kirjallisuudessa virallisesti käytettyjä (J. Biol. Chem. 247 (1972) 977); Z, BOC ja Bz merkitsevät bentsyylioksikarbo- nyyli-, tert.-butyylioksikarbonyyli- ja bentsoyyliryhmiä, ja Arg(Z)

G

ja Arg(COOH) merkitsevät N -bentsyylioksikarbonyyli- ja vastaavasti 0 N -karboksi-L-arginiinijäännöksiä.

Havaittiin edelleen, että yleiskaavan I mukaisten tripeptidi- aldehydijohdannaisten aiheuttama entsyymejä inhiboiva vaikutus on odottamattoman suuri ja pysyvä verrattuna vastaavan aminohapposarjän vapaisiin tripeptidialdehydisuoloihin. Täten H-D-Phe-Pro-Arg(COOH)- H:n antitrombiiniaktiivisuus on suurempi ja se estää tehokkaammin trombiinin ja fibrinogeenin välistä reaktiota kuin H-D-Phe-Pro-Arg-H- hydrokloridi tai -asetaatti, joiden inhibointiaktiivisuus vaihtelee niiden synteesiolosuhteiden mukaan. Säilytettäessä yhdisteitä 20 0 tuntia puskuriliuoksessa (pH = 7,4) yleiskaavan I mukaisen N -kar-boksitripeptidialdehydin antitrombiiniaktiivisuus pysyy käytännöllisesti katsoen muuttumattomana, kun taas vastaavien vapaiden tripep- 4 67539 tidialdehydisuolojen antitrombiiniaktiivisuus laskee 1Q-2Q %:iin alkuperäisestä arvosta.

Q

Yleiskaavan I mukaisten N -karboksitripeptidialdehydien inhi-bointitehon havaittiin yllättäen nousevan protonoimalla ne osittain

Q

(suolanmuodostus). Täten D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-N -karboksi-L-arginiinialdehydin hemihydrokloridin aktiivisuus on viisinkertainen verrattuna vastaavaan yhdisteeseen, jossa suolahappoa ei ole

Q

mukana. Vaikka yleiskaavan I mukaisten N -karboksitripeptidialdehydien protonointi heikentää pysyvyyttä, niiden teho on kuitenkin suurempi kuin vastaavan aminohapposarjän vapaiden tripeptidialdehydi-suolojen säilytettäessä niitä puskuriliuoksessa 20 tuntia.

Q

Taulukossa 1 on esitetty D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-N -kar-boksi-L-arginiinialdehydin ja sen yleiskaavan I mukaisen hemihydrokloridin, jossa X on vetyatomi ja Y on D-fenyylialaniinijäännös, sekä vastaavan aminohapposarjän vapaan tripeptidialdehydin kahden suolan antitrombiiniaktiivisuus, aktiivisuuden muutos, kun liuoksia säilytetään tris-(hydroksimetyyli)-metyyliamiinihydrokloridipuskuriliuok-sessa (pH =7,4) ja suhteellinen aktiivisuus verrattuna H-D-Phe-Pro-Arg-(COOH)-H:oon (jälkimmäisen aktiivisuudelle on mielivaltaisesti annettu arvo 100). Antitrombiiniaktiivisuus on määritelty sellaiseksi lääkemääräksi, joka tarvitaan fibrinogeenin trombiiniajän kymmenkertaistamiseksi (trombiiniaika: aika, joka tarvitaan trom- biinin aiheuttamaan veren hyytymiseen).

5 67539 c Φ >1 Λί

β (O

fÖ Ή -n rp (O Φ H — g

β *+ -— *P

•P (O M ffi ^ ^ O

•ρ Φ Φ ρ σι m ^ φ φ β} β ή >, β g -Ρ -Ρ Ή β Ο -Ρ β Ο φ Ρ Φ β β Φ •h +J β -Ρ φ β > ·ρ tn -Ρ Η β Η Ο Ο Φ •Ρ Φ <Ν γΡ ο ο ρ Ο Ρ Φ β g o m Ό Ά X -Ρ -Η \ romOCN >ι0 Φ ·Ηφ tn - ' ' ' .β β -Ρ >·Ρ β. O O UD g β Ρ -Ρ Φ •ρ Φ Cu -Ρ β •Ρ 4J φ Φ Φ Λ CU ·· ιΗ g Φ — ^ a ο O X β en 04 I β Ρ ΟΦ ^ ^^(Ν(Ν ^ φ -Ρ -η φ + O O I I Ν ρ Φ Φ o lo en ro —- -Ρ -Ρ - -ρ φ ρ iHLnr-'r" t? β β :Φ g Φ — ^ Ρβ Φ Ρ Φ Φ < β rP :Φ -Ρ β I Φ β :φ Φ γΡ Ο Ρ Ο Φ g ·ρ < m ιίΐ Ρβ Λί-Ρ ΦΦ <η <ν cu Φ Λί Φ X -Ρ - I Φ β -ρ :ΦΡ ιΗ m ο ο .Η Φ Ή Φ :Φ φ g Γ' LD ι ι .β β

β β ιβ Λί \ cMou-ir- cu O

Φ β tn - - m ro I

H Φ X o o ' - Q :Φ Ό o o ι -Ρ x: m n -ρ O U W g •n K β β •Ρ Φ β -Ρ Φ3 ui a Φ -Ρ Φ >ι · Ο Ή φ φ β ο ο > -ρ φ φ · U -ρ Φ ·Ρ TS a κ Φ ΓΟ ·Ρ -Ρ φ Η I I · Κ -Ρ g -Ρ φ ^ υ ο β ^ β •ρ KKK Φ Φ β Τ3 β ο Ο <~Ί (Μ >φ •Ρ φ Ο Ο · · β ο Ρ β UUKffi Φ β -Π CU -Ρ ---1 I β ο ο Φ Φ tn tn tn tn ·ρ CU β Ρ Ρ Ρ Ρ Μφ:φ ρ β e < >< < ή β φ Ρ Φ I I I I φ Ο Φ gi ΟΟΟΟ φ-Γ-ι-ρ β Ρ Ρ Ρ Ρ -Ρ Φ Ο CUCUCUCU Λ - ·Ρ m I I I I β φ Φ -ρ φφφφ φ -Ρ λ Τ3 β β β β Ο :φ •Ρ eu cu CU CU II β g -Ρ I I I I Ε-ι Φ CU Q Q Q Q + Φ I I I I Φ —- cu κ κ a κ ρ φ _____ · ΊΓ . . . — - 6 67539

Antitrombiiniaktiivisuus määritettiin seuraavasta matriisista : 0,5 % härän fibrinogeenia (0,2 ml) 0,9-%:isessa natrium-kloridiliuoksessa, peptidi tris-(hydroksimetyyli)-metyyliamiini-hydrokloridipuskuriliuoksessa (0,1 ml, pH = 7,4) ja ihmisen trom-biinia US-standardimateriaalina (0,1 ml) (NIH, Bethesda, Maryland, USA; 5 yksikköä/ml). Hyytymisaika ilman peptidiä kyseissä matriisissa on 15 s.

Q

D-fenyylialanyyli-L-propyyli-N -karboksyyli-L-argiinialde-hydillä (X on vetyatomi ja Y on D-fenyylialaniinijäännös yleiskaavassa I) suoritettiin kokeita elävässä elimistössä. Viidelle eläinlajille (hiiri, rotta, kaniini, koira ja apina) suoritetut kokeet osoittivat, että antritrombiiniaktiivisuus kohosi selvästi myös elävässä elimistössä. Antritrombiiniaktiivisuus oli yhtä suuri annettaessa koeaine ruiskeena suoneen, lihakseen tai ihon alle sekä myös suun kautta annettuna. H-D-Phe-Pro-Arg(COOH)-H;n antitrombiiniaktiivisuus elävässä elimistössä määritettiin trombeoelastografilia (Hellige, Wien, Itävalta) antamalla laitteessa oleville koirille suun kautta 50 mg/kg:n suuruisia annoksia, jolloin lääkeaine aiheutti trombiiniajän pitenemisen 4-6-kertaiseksi kahden tunnin aikana. Vastaavilla vapailla tripeptidialdehydisuoloilla, so. D-fenyyli-alanyyli-L-propyyli-L-argiinialdehydihydrokloridillä tai -asetaa-tilla, ei ollut käytännöllisesti katsoen mitään vaikutusta trom-biiniaikaan annettaessa suun kautta samanlaisia 50 mg/kg:n suuruisia annoksia.

Yleiskaavan I tai Ia mukaisia uusia yhdisteitä valmistetaan tunnusomaisesti siten, että uretaanin kaltainen suojaryhmä, edullisesti bentsyylioksikarbonyyliryhmä, joka on poistettavissa hydro-genolyysillä vastaavasta peptidyyliarginiinialdehydistä, jossa

Q

uretaanin kaltainen suojaryhmä on läsnä guanidinoryhmän N -atomissa, poistetaan suorittamalla suojatulle peptidyyliarginiini-aldehydille hydrogenolyysi neutraaleissa olosuhteissa veden ja alemman alkanolin seoksessa, ja haluttaessa tuote muutetaan farmaseuttisesti hyväksyttäväksi happoadditiosuolaksi.

Käsillä olevan keksinnön mukaan L-argiinilaktaami, jonka 7 67539 guanidiiniryhmään on liitetty suojaryhmäksi bentsyylioksikarbonyyli-ryhmä, kondensoidaan edullisesti vastaavan N-asyylidipeptidin kanssa, muodostunut suojaryhmän sisältävä tripeptidilaktaami pelkistetään, ja guanidiiniryhmää suojaava bentsyylioksikarbonyyliryhmä tai mahdollisesti muodostuneen tripeptidialdehydin sekä N-terminaa-linen ryhmä että guanidiiniryhmä lohkaistaan hydrogenolyysin avulla etanolin ja veden seoksessa, minkä jälkeen etanoli haihdutetaan liuoksesta alennetussa paineessa ja vesiliuos kylmäkuivataan.

Jäännös liuotetaan veteen, liuos kylmäkuivataan uudelleen, ja jäännökseen lisätään happoa vähemmän kuin yhden ekvivalentin verran.

Seuraavissa esimerkeissä kuvataan keksintöä tarkemmin. R^-ar-vot määritettiin ohutkerroskromatografiaa käyttäen absorbentin ollessa silikageeli ("Kieselgel G", Reanal, Budabest) ja eluointi-aineiden ollessa seuraavia seoksia: 1. etyyliasetaatti-pyridiini-etikkahappo-vesi 480:20:6:11 2. etyyliasetaatti-pyridiini-etikkahappo-vesi 240:20:6:11 3. etyyliasetaatti-pyridiini-etikkahappo-vesi 60:20:6:11 4. etyyliasetaatti-pyridiini-etikkahappo-vesi 30:20:6:11

Esimerkki 1

G

D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-N -karboksi-L-arginiinialdehydi (kaavassa I X on vetyatomi ja Y on D-fenyylialaniinijäännös)

G

Vaihe 1: Tert.-butyylioksikarbonyyli-N -bentsyylioksikarbo-nyyli-L-arginiinilaktaami.

41,1 g (125 mmoolia) tert.-butyylioksikarbonyyli-L-arginiini-hydrokloridihydraattia (Yamashiro et ai.: J. Am. Chem. Soc. 94 (1972) 2855) liuotetaan 125 ml:aan 4 N natriumhydroksidia, ja liuos jäähdytetään -5°C - 0°C:seen. Voimakkaasti sekoittaen lisätään liuokseen bentsylioksikarbonyylikloridia (75 ml, 500 mmoolia) ja 125 ml 4 N natriumhydroksidia sellaisella nopeudella, että pH ei missään vaiheessa ylitä arvoa 10. Sekoitusta jatketaan 0°C:ssa 1,5 tunnin ajan. Reaktioseokseen lisätään 100 ml vettä, se uutetaan koi- 8 67539 me kertaa 100 ml:11a dietyylieetteriä, jäähdytetään jäähauteessa 4°C - 6°C:seen ja pH säädetään arvoon 3 rikkihapolla (3 N), jota tarvitaan n. 130 ml. Erotettu tuote uutetaan kolme kertaa 250 ml:11a etyyliasetaattia. Etyyliasetaattiuutteet yhdistetään, pestään kahdesti 125 ml:11a 15-%:ista natriumkloridiliuosta, kuivataan natriumsulfaatilla, ja liuotin haihdutetaan alennetussa paineessa. Saanto: 37,5 g (76 % teoreettisesta saannosta) tert.-butyylioksi-

Q

karbonyyli-N -bentsyylioksikarbonyyli-L-arginiinia; = 0,17-0,27.

Tuote liuotetaan 130 ml:aan tetrahydrofuraania. Liuokseen lisätään 13,58 ml (97 mmoolia) trietyyliamiinia, ja seos jäähdytetään -10°C:seen. Tässä lämpötilassa seosta samalla sekoittaen lisätään 12,8 ml (97 mmoolia) kloorimuurahaishapon isobutyyliesteriä, seosta sekoitetaan 5 min, ja sen jälkeen lisätään 13,6 ml (97,8 mmoolia) trietyyliamiinia. Reaktioseosta sekoitetaan edelleen yhden tunnin ajan 0°C:ssa, jäähdytys lopetetaan, ja sekoitusta jatketaan yhden tunnin ajan, minkä jälkeen reaktioseos kaadetaan 600 ml:aan jään ja veden seosta, saostunut aines suodatetaan, pestään vedellä ja kuivataan P20^:lla alipaineessa. Saanto: 32,7 g (91 % teoreettisesta määrästä, 70 % laskettuna BOC-Arg(HC1)-OH.H2O:lie) vaiheen 1 otsikon mukaista tuotetta; R^ = 0,85-0,95, sp. = 162-164°C.

Vaihe 2: Bentsyylioksikarbonyyli-D-fenyylialanyyli-L-prolyy-

G

li-N -bentsyylioksikarbonyyli-L-arginiinilaktaami.

Q

8,6 g (22 mmoolia) tert.-butyylioksikarbonyyli-N -bentsyyli-oksikarbonyyli-L-arginiinilaktaamia (esimerkki 1, vaihe 1) suspen-doidaan 20 ml:aan etyyliasetaattia, ja 40 ml 4 M HCl/etyyliasetaat-ti-liuosta lisätään 5°C:ssa suspensiota samalla sekoittaen. Reaktio-seosta sekoitetaan 30 minuutin ajan jäähdyttämällä sitä samanaikaisesti jäähauteessa, minkä jälkeen lisätään 100 ml kylmää etyyliasetaattia, muodostunut sakka suodatetaan, pestään etyyliasetaatilla ja kuivataan sakka suodatetaan, pestään etyyliasetaatilla ja kuiva-

Q

taan kaliumhydroksidilla alipaineessa. Näin saatu N -bentsyylioksi-karbonyyli-L-arginiinilaktaamihydrokloridi liuotetaan 20 ml:aan dimetyyliformamidia, jäähdytetään -10°C:seen ja yhdistetään 6,2 ml:aan (44 mmoolia) trietyyliamiinia. Syntynyt suspensio kaadetaan seuraavaan seka-anhydridiseokseen.

8 g (20 mmoolia) bentsyylioksikarbonyyli-D-fenyylialaniini-L-proliinia (Nikolaides et ai.: J. Med. Chem. 11 (1968) 74) liuotetaan 25 ml:aan dimetyyliformamidia, liuos jäähdytetään -15°C:seen, ja tässä lämpötilassa voimakkaasti sekoittaen lisätään 2,22 ml II: 9 67539 (20 mmoolia) N-metyylimorfoliinia ja 2,64 ml (20 mmoolia) kloori-muurahaishapon isobutyyliesteriä. Seosta sekoitetaan 10 min, minkä jälkeen siihen lisätään myös edellä mainittu dimetyyliformamidi-suspensio. Reaktioseoksen pH säädetään tarvittaessa arvoon 8-9 trietyyliamiinilla, ja sekoitusta jatketaan yhden tunnin ajan -15°C:ssa ja edelleen tunnin ajan 0°C:ssa. Seokseen lisätään 50 ml bentseeniä, saostuneet suolat suodatetaan ja pestään kahdesti 20 mlrlla bentseeniä. Suodokseen lisätään 50 ml vettä, kerrokset erotetaan ja vesikerros uutetaan kolme kertaa 30 ml :11a 10 %:ista natriumkarbonaatti 1iuosta, kolme kertaa 30 ml :11a vettä, kahdesti 30 ml :11a 0,1 N suolahappoa ja lopuksi kahdesti 30 ml :11a vettä. Bentseeniliuos kuivataan natriumsulfaatilla, bentseeni haihdutetaan alipaineessa, jäännös sekoitetaan 30 ml:aan dietyylieetteriä, di-etyylieetteri dekantoidaan, ja jäännös trituroidaan 30 ml :11a petrolieetteriä, suodatetaan, pestään petrolieetterillä ja kuivataan ilmassa. Saanto: 11,7 g (87 % teoreettisesta saannosta) vaiheen 2 otsikon mukaista yhdistettä; = 0,72-0,78.

f

Vaihe 3: Bentsyylioksikarbonyyli-D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-

Q

N -bentsyylioksikarbonyyli-L-arginiinialdehydi.

10,05 g (15 mmoolia) tripeptidilaktaamia, joka sisältää suojaryhmän (esimerkki 1, vaihe 2), liuotetaan 45 ml:aan tetrahydro-furaania, ja -20°C:ssa vaimakkaasti sekoittaen lisätään 11,25 mmoolia tetrahydrofuraaniin liuotettua litiumalumiinihydridiä (noin 28 ml noin 0,4 M liuosta). Reaktion kulkua seurataan ohutkerroskro-matografian avulla (laktaamin R^ = 0,72-0,78, ja aldehydin 0,32-0,40) ja tarvittaessa lisätään hydridiliuosta. Reaktion loputtua tetrahydrofuraaniliuoksen pH säädetään arvoon 2 lisäämällä varovasti 1 N suolahappoa, sen jälkeen liuokseen lisätään noin 100 ml vettä niin, että ei muodostu saostumaa, ja liuos uutetaan kahdesti 30 ml:11a n-heksaania. Vesipitoinen tetrahydrofuraaniliuos uutetaan kolme kertaa 75 mlrlla metyleenikloridia, yhdistetyt metyleeniklori-diuutteet pestään ensin kolme kertaa 10 ml:11a 10 %:ista natrium-karbonaatti liuos ta ja sen jälkeen kahdesti 10 mlrlla vettä. Metylee-nikloridiliuos kuivataan natriumsulfaatilla, ja liuotin haihdutetaan alipaineessa. Jäännös liuotetaan 50 mlraan bentseeniä, joka sen jälkeen haihdutetaan alipaineessa. Bentseeniliuotus ja haihdutus toistetaan. Jäännös trituroidaan dietyylieetterillä, suodatetaan, pestään dietyylieetterillä ja kuivataan ilmassa. Saantor 7,3 g (72 % teoreettisesta saannosta) vaiheen 3 otsikon mukaista yhdis-

F

10 ^ „ 67539 tettä; = 0,32-0,40, sp. = 116-117°C.

Q

Vaihe 4: D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-N -karboksi-L-arginii-nialdehydi.

6,7 g (10 mmoolia) tripeptidialdehydiä, joka sisältää suojaryhmän, (esimerkki 1, vaihe 3), liuotetaan 100 ml:aan 75 %-ista vesi/etanoli-seosta ja hydrogenolysoidaan 10 %:isen palladium/hiilen (1 g) toimiessa katalyyttina. Reaktiota seurataan ohutkerroskromatografiän avulla (tripeptidialdehydin, joka sisältää G 4 suojaryhmän, ja vapaan N -karboksijohdannaisen R^-arvot ovat 0,90-0,95 ja 0,35-0,40). Reaktion loputtua katalyytti suodatetaan erilleen, ja pestään 30 ml :11a vettä, ja suodos haihdutetaan alipaineessa noin 30-40 ml:ksi, jolloin etanoli on haihtunut. Jäännökseen lisätään 100 ml vettä, vesiliuos uutetaan 30 ml:11a metyleeniklori-dia ja pakastekuivataan. Saanto: 4,3 g vaiheen 4 otsikon mukaista yhdistettä; R^ = 0,35-0,40 {aij= -123 - 1° (c = 1, vedessä); aminohappoanalyysi: Phe = 1,02, Arg-H = 0,97 (määritetty NH3:na),

Pro = 1,00 (emäksinen muoto). Aminohappoanalyysin perusteella laskettu molekyylipaino on 471. CC>2 = 10,9 % (vapautettu rikkihapon avulla) ja 2,1 % (saostettu BaC03:na).

Esimerkki 2

Q

D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-N -karboksi-L-arginiinialdehydi- hemihydrokloridi

Q

0,48 g N -karboksi-D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-L-arginiini-aldehydiä liuotetaan 5 ml:aan vettä ja 3-5°C:ssa lisätään 5 ml 0,1 N suolahappoa. Liuos pakastekuivataan. Saanto: 0,45 g esimerkin 2 mukaista yhdistettä. R^ = 0,35-0,40, = -120° (c = 1, vedessä).

Esimerkki 3

Q

Tert.-butyylioksikarbonyyli-D-fenyylialanyyli-L-prolyyli-N -karboksi-L-arginiinialdehydi (kaavassa I X on tertiäärinen butyyli-oksikarbonyyliryhmä ja Y on D-fenyylialaniinijäännös).

Vaihe 1: Tert.-butyylioksikarbonyyli-D-fenyylialanyyli-L-pro-

G

lyyli-N -bentsyylioksikarbonyyli-L-arginiinilaktaami.

Käyttäen lähtöaineena 8,6 g (22 mmoolia) tert.-butyylioksi-

G

karbonyyli-N -bentsyylioksikarbonyyli-L-arginiinilaktaamia, valmis-

G

tetaan N -bentsyylioksikarbonyyli-L-arginiinilaktaami esimerkin 1 vaiheessa 2 esitetyn menetelmän mukaan, ja näin saatuun dimetyyli- 11 67539 formamidisuspensioon lisätään seuraava seka-anhydridiseos.

7,25 g (20 nunoolia) tert.-butyylioksikarbonyyli-D-fenyyli-alanyyli-L-proliinia (U. Ludescer ja R. Schwyzer, Helv. Chim. Acta 55 (1972) 2052) ja 2,22 ml (20 mmoolia) N-metyylimorfoliinia liuotetaan 20 ml:aan dimetyyliformamidia. Liuos jäähdytetään -15°C:seen, sekoitetaan, lisätään 2,64 ml (20 mmoolia) isobutyyliklooriformi-aattia, ja 5 minuutin kuluttua lisätään edellä mainittu dimetyyli-formamidiliuos. Reaktioseosta sekoitetaan yhden tunnin ajan -15°C:ssa ja edelleen tunnin ajan 0°C:ssa, minkä jälkeen seokseen lisätään 30 ml bentseeniä. Saostuneet suolat suodatetaan ja pestään kahdesti 10 ml:11a bentseeniä. Bentseeni/dimetyyliformamidi-liuok-seen lisätään 50 ml vettä, ja kerrokset erotetaan. Vesikerros uutetaan kahdesti 10 ml :11a bentseeniä, minkä jälkeen yhdistetyt bentseeniuutteet pestään kolme kertaa 30 ml :11a 10 %:ista natrium-karbonaattiliuosta, 30 ml:lla vettä, kolme kertaa 30 ml:lla 0,5 N rikkihappoa ja kahdesti 30 ml:11a vettä, sekä kuivataan natrium-sulfaatilla, ja sen jälkeen liuotin haihdutetaan alipaineessa. Jäännös käsitellään kevytpetrolilla, suodatetaan, pestään kevytpetro-lilla ja kuivataan ilmassa. Saanto: 9,65 g (76 % teoreettisesta saannosta) vaiheen 1 otsikon mukaista tuotetta; R^ = 0,81-0,89.

Vaihe 2: Tert.-butyylioksikarbonyyli-D-fenyylialanyyli-L-

Q

prolyyli-N -bentsyylioksikarbonyyli-L-arginiinialde-hydi.

Käyttäen lähtöaineena 9,52 g (15 mmoolia) esimerkin 3 vaiheessa 1 valmistettua tripeptidilaktaamia, joka sisältää suojaryh-män, vaiheen 2 otsikon mukainen yhdiste valmistettiin esimerkin 1 vaiheessa 3 esitetyn menetelmän mukaaan, paitsi että litiumalumiini-hydridillä suoritetun pelkistyksen jälkeen liuos tehtiin happamaksi 0,5 N rikkihapolla. Saanto: 6,9 g (72 % teoreettisesta saannosta) vaiheen 2 otsikon mukaista yhdistettä; R^ = 0,46-0,56.

Vaihe 3: Tert.-butyylioksikarbonyyli-D-fenyylialanyyli-L-pro-

Q

lyyli-N -karboksi-L-arginiinialdehydi.

Käyttäen lähtöaineena 6,4 g (1Q mmoolia) esimerkin 3 vaiheessa 2 valmistettua tripeptidialdehydiä, joka sisältää suojaryhmän, vaiheen 3 otsikon mukainen yhdiste valmistetaan esimerkin 1 vaiheessa 4 esitetyllä menetelmällä. Saanto: 5,1 g (85 % teoreettisesta 3 saannosta) vaiheen 3 otsikon mukaista yhdistettä; R^ = 0,46 -0,56( 12 67539 /jpCj ^ = -64 - 1° (c = 1, vesiliuoksessa, pH säädetty suolahappoa arvoon 7). Aminohappoanalyysi: Phe = 0,96, Arg-H = 0,97 (määritetty NH^sna), Pro = 1,00 (emäksinen muoto). Aminohappoanalyysin perusteella laskettu molekyylipaino on 570.

CO2 = 10,1 % (vapautettu rikkihapolla), ja 3,1 % (saostettu BaCO^:na).

Esimerkki 4

Q

Bentsoyyli-D-aalloisoleusyyli-L-prolyyli-N -karboksi-L-argi-niinialdehydi (kaavassa I X on bentsoyyliryhmä ja Y on D-allo-isoleusiinijäännös).

Vaihe 1: Bentsoyyli-D-alloisoleusyyli-L-proliinidisyklohek-syyliammoniumsuola.

19,2 g (81,5 mmoolia) bentsoyyli-L-isoleusiinia (F. Ehrlich: Berichte 37 (1904), s. 1809) ja 16,5 g (80 mmoolia) disykloheksyy-likarbodi-imidiä liuotetaan 150 ml:aan metyleenikloridia, joka on jäähdytetty 5-10°C:seen. Liuosta sekoitetaan jäähauteessa kaksi tuntia, minkä jälkeen lisätään 2 ml trietyyliamiinia ja 100 ml pet-rolieetteriä. Saostunut disykloheksyyliurea suodatetaan ja pestään kahdesti 20 ml :11a petrolieetteriä. Suodos uutetaan kahdesti 50 ml :11a vettä, kahdesti 50 ml :11a 5 %:sta natriumvetykarbonaatti-liuosta ja vedellä, kuivataan natriumsulfaatilla, ja liuotin haihdutetaan alipaineessa. Jäännös liuotetaan 80 ml:aan pyridiiniä, ja liuokseen lisätään 9,2 g (80 mmoolia) L-proliinia ja 22,4 ml (160 mmoolia) trietyyliamiinia. Reaktioseosta sekoitetaan huoneen lämpötilassa kuusi tuntia, minkä jälkeen liuotin haihdutetaan alipaineessa. Jäännös liuotetaan vesi/eetteriseokseen (100 ml vettä ja 50 ml eetteriä), vesikerros pestään kahdesti 20 ml:11a eetteriä, ja yhdistetyt eetteriuutteet pestään kahdesti 20 ml:11a vettä. Vesikerrokset yhdistetään, ja liuoksen pH säädetään 5 N rikkihapolla arvoon 2. Erotettu öljy uutetaan kolme kertaa 50 ml:11a etyyliasetaattia, yhdistetyt etyyliasetaattiuutteet pestään kahdesti 20 ml:11a vettä, kuivataan natriumsulfaatilla, ja liuotin haihdutetaan alipaineessa. Jäännös liuotetaan 100 ml:aan eetteriä, ja 16 ml disyklo-heksyyliamiinia kaadetaan liuokseen. Muodostuneet kiteet erotetaan suodattamalla, pestään kolme kertaa 20 ml :11a eetteriä ja kuivataan väkevällä rikkihapolla tyhjössä. Saanto: 26,3 g (64 % teoreettisesta saannosta) vaiheen 1 otsikon mukaista yhdistettä. Sp. = 117-118°C. = 0,36-0,46 ja 0,13-0,23 (disykloheksyyliamiini). Amino- 67539 happoanalyysi: proliini = 1,Q0 (emäksinen muoto), alloisoleusiini = 0,92, isoleusiini = 0,02.

Q

Vaihe 2: Bentsoyyli-D-alloisoleusyyli-L-prolyyli-N -bentsyyli-oksikarbonyyli-L-arginiinilaktaami.

Käyttäen lähtöaineena 8,6 g (22 mmoolia) tert.-butyylioksi-

Q

karbonyyli-N -bentsyylioksikarbonyyli-L-arginiinilaktaamia valmis-G

tetaan N -bentsyylioksikarbonyyli-L-arginiinilaktaami esimerkin 1 vaiheessa 2 esitetyn menetelmän mukaan, ja saatu dimetyyliformamidi-suspensio lisätään seuraavaan seka-anhydridiseokseen.

10,3 g (20 mmoolia) bentsoyyli-D-alloisoleusyyli-L-proliini-disykloheksyyliammoniumsuolaa (esimerkki 4, vaihe 1) ja 0,23 ml (2 mmoolia) N-metyylimorfoliinia liuotetaan 20 mlraan dimetyyli-formamidia, liuos jäähdytetään -15°C:seen, ja jatkuvasti sekoittaen lisätään ensin 2,64 ml (20 mmoolia) isobutyyliklooriformiaattia ja 5 minuutin kuluttua edellä mainittu dimetyyliformamidiliuos. Reaktioseosta sekoitetaan yhden tunnin ajan -15°C:ssa ja edelleen tunnin ajan 0°C:ssa. Saostuneet suolat erotetaan suodattamalla ja pestään kahdesti 5 ml:11a dimetyyliformamidia. Yhidstettyihin suo-doksiin lisätään 100 ml bentseeniä, ja bentseenikerros pestään kolme kertaa 30 ml:11a vettä, kahdesti 20 ml:11a 1 n natriumhydroksidi-liuosta, kolme kertaa 30 ml:lla vettä, kahdesti 20 ml :11a 0,5 N rikkihappoa ja kolme kertaa 20 ml:11a vettä, kuivataan natrium-sulfaatilla, ja liuotin haihdutetaan alipaineessa. Jäännös tritu-roidaan petrolieetterillä, erotetaan suodattamalla, pestään petroli-eetterillä ja kuivataan ilmassa. Saanto 9,3 g (76 % teoreettisesta saannosta) vaiheen 2 otsikon mukaista yhdistettä; Rf = 0,52-0,62.

Vaihe 3: Bentsoyyli-D-alloisoleusyyli-L-prolyyli-N -bentsyyli-karbonyyli-L-arginiinialdehydi.

9,2 g (15 mmoolia) tripeptidilaktaamia, joka sisältää suoja-ryhmän (esimerkki 4, vaihe 2), liuotetaan 40 ml:aan tetrahydrofu-raania, ja jatkuvasti sekoittaen -20°C:ssa lisätään 0,427 g (11,25 mmoolia) tetrahydrofuraaniin liuotettua litiumalumiinihydridiä. Reaktioseoksen pH säädetään 1 N suolahapolla arvoon 2, ja seokseen lisätään 80 ml vettä. Liuos pestään 3Q ml :11a n-heksaania ja uutetaan kolme kertaa 50 ml :11a metyleenikloridia. Yhdistetyt metyleeni-kloridiuutteet pestään kahdesti 10 ml :11a 10 %:ista natriumkarbo-naattiliuosta ja kahdesti 10 ml :11a vettä, kuivataan natriumsulfaa- 14 67539 tiliä, ja liuotin haihdutetaan alipaineessa. Jäännös käsitellään dietyylieetterillä ja kuivataan väkevällä rikkihapolla tyhjössä. Saanto: 6,7 g (72 % teoreettisesta saannosta) vaiheen 3 otsikon mukaista yhdistettä; = 0,47-0,57.

G

Vaihe 4: Bentsoyyli-D-alloisoleusyyli-L-prolyyli-N -karboksi-L-arginiinialdehydi.

6,2 g (10 mmoolia) tripeptidialdehydiä, joka sisältää suojaryhmän, hydrogenolysoidaan esimerkin 1 vaiheessa 4 esitetyn menetelmän mukaan, eristetään ja kylmäkuivataan. Saanto: 4,05 g (81 % teoreettisesta saannosta) vaiheen 4 otsikon mukaista yhdistettä; = 0,4-0,5 Zctf_7p0 = -42,6 - 1° ( c = 1, vesiliuoksessa, jonka pH on säädetty arvoon 7 suolahapolla). Aminohappoanalyysi: allo-Ile = 0,97, Ile = 0,02, Arg-H = 0,95 (määritetty NH^tna),

Pro = 1,00 (emäksinen muoto). Aminohappoanalyysin perusteella laskettu molekyylipaino on 590 . CC>2 = 9,5 = (vapautettu rikkihapolla) ja 2,0 % (saostettu BaCO^na).

Esimerkki 5

G

β-fenyyli-D-laktyyli-L-prolyyli-N -karboksi-L-arginiini (kaavassa I X on vetyatomi ja Y on β-fenyyli-D-maitohappo- jäännös)

Vaihe 1: 0-tert.-butyylioksikarbonyyliamidi-β-fenyyli-D-laktyyli-L-proliini.

15,1 g (40 mmoolia) O-tert.-butyylioksikarbonyyliamidi-/i -fenyyli-D-maitohapon N-hydroksimeripihkahappoimidiesteriä (Kisfaludy et ai: Acta Biochim. Biophys. Acad. Sei. Hung, 6 (1972), s. 393) liuotetaan 50 ml:aan pyridiiniä, ja liuokseen lisätään 4,7 g (40 mmoolia) L-proliinia ja 5,6 ml (40 mmoolia) trietyyliamii-nia, ja sekoitetaan, kunnes ne ovat liuenneet täydellisesti. Liuotin haihdutetaan alipaineessa. Jäännös käsitellään vesi/dietyylieette-ri-seoksella (100 ml vettä ja 100 ml dietylieetteriä). Vesikerros pestään 30 ml :11a dietyylieetteriä, ja yhdistetyt eetteriuutteet pestään 30 ml:11a vettä. Vesikerros yhdistetään, liuoksen pH säädetään 3 N suolahapolla arvoon 2, ja liuos uutetaan kolme kertaa 50 ml :11a etyyliasetaattia. Yhdistetyt etyyliasetaattiuutteet pestään kahdesti 20 ml:11a vettä, kuivataan natriumsulfaatilla, ja liuotin haihdutetaan alipaineessa. Saanto: 9,85 g (65 % teoreetti- 2 sesta saannosta) vaiheen 1 otsikon mukaista yhdistettä: R^ = 0,4-0,5.

Il 15 67539

Vaihe 2: O-tert.-butyylioksikarbonyyliamidi-/3 -fenyyli-D-

Q

laktyyli-L-prolyyli-N -bentsyylioksikarbonyyli-L-arginiinilaktaami.

Q

11,2 g (28,6 mmoolia) tert.-butyylioksikarbonyyli-N -bentsyy-lioksikarbonyyli-L-arginiinilaktaamia (esimerkki 1, vaihe 1) sus-pensoidaan 25 ml:aan etyyliasetaattia, ja suspensiota samalla sekoittaen siihen kaadetaan 5°C:ssa 50 ml 4 M suolahappo/etyyliase-taatti-seosta. Sekoitusta jatketaan jäähauteessa 30 minuutin ajan, minkä jälkeen reaktioseokseen lisätään 130 ml kylmää etyyliasetaat-

G

tia, ja seos kuivataan kaliumhydroksidilla tyhjössä. Saatu N -bentsyy lioksikarbonyyli-L-arginiinilaktaamihydrokloridi liuotetaan 25 ml:aan dimetyyliformamidia, jäähdytetään -10°C:seen, ja lisätään 8,1 ml (57,8 mmoolia) trietyyliamiinia. Saatu suspensio kaadetaan seuraavaan seka-anhydridiseokseen.

9,85 g (26 mmoolia) O-tert.-butyylioksikarbonyyliamidi- β -fenyyli-D-laktyyli-L-proliinia, joka on valmistettu esimerkin 5 vaiheessa 1 esitetyllä menetelmällä, liuotetaan 33 ml:aan dimetyyliformamidia, jäähdytetään -15°C:een, ja tässä lämpötilassa lisätään ensin 2,89 ml (26 mmoolia) N-metyylimorfoliinia ja 3,43 ml (26 mmoolia) isobutyyliklooriformiaattia voimakkaasti sekoittaen, sekoitusta jatketaan 10 min, minkä jälkeen lisätään edellä mainittu dime-tyyliformamidisuspensio. Seoksen pH säädetään tarvittaessa 8-9 tään trietyyliamiinilla, ja sekoitusta jatketaan -15°C:ssa yhden tunnin ajan ja edelleen tunnin ajan 0°C:ssa. Reaktioseokseen lisätään 60 ml bentseeniä, saostuneet suolat suodatetaan ja pestään kahdesti 30 ml:lla bentseeniä. Suodokseen lisätään 70 ml vettä, kerrokset erotetaan, ja vesikerros pestään kolme kertaa 30 ml :11a bentseeniä. Yhdistetyt bentseeniuutteet pestään kolme kertaa 40 ml :11a 10-%:ista natriumkarbonaattiliuosta, kahdesti 40 ml :11a 0,1 N suolahappoa ja lopuksi kahdesti 40 ml:11a vettä, kuivataan natriumsulfaatilla, ja liuotin haihdutetaan alipaineessa. Jäännös käsitellään kevytpetro-lilla, suodatetaan, pestään kevytpetrolilla ja kuivataan ilmassa.

Saanto: 10,3 g (60 % teoreettisesta saannosta) vaiheen 2 otsikon mu- 2 kaista yhdistettä; = 0,65 -Q,7Q.

16 67539

Vaihe 3: O-tert.-butyylioksikarbonyyliamidi- -fenyyli-D-

Q

laktyyli-L-prolyyli-N -bentsyylioksikarbonyyli-L-arginiinialdehydi.

Käyttäen lähtöaineena 10,2 g (15 mmoolia) tripeptidilaktaa-mia, joka sisältää suojaryhmän (esimerkki 5, vaihe 2), valmistetaan vaiheen 3 otsikon mukainen yhdiste esimerkin 1 vaiheessa 3 esitetyllä menetelmällä, paitsi että haihdutuksen jälkeen jäännös käsitellään dietyylieetteri/kevytpetroli-seoksella (1:1), suodatetaan ja pestään samalla liuottimena. Saanto: 6,4 g (62 % teoreettisesta 2 saannosta) vaiheen 3 otsikon mukaista yhdistettä; = 0,32-0,42.

Vaihe 4: ft-fenyyli-D-laktyyli-L-prolyyli-NG -karboksi-L- arginiinialdehydi.

6,2 g (9 mmoolia) tripeptidialdehydiä, joka sisältää suoja- ryhmän (esimerkki 5, vaihe 3), liuotetaan 100 ml:aan 75 %:ista vesi/etanoliseosta, ja liuos hydrogenolysoidaan 10 %:isen palla- dium/hiilen toimiessa katalyyttina (1 g). Reaktion kulkua seurataan ohutkerroskromatografiän avulla (tripeptidialdehydin, joka sisältää G 4 suojaryhmän, ja N -karboksijohdannaisen R^ -arvot olivat 0,92-0,97 ja 0,56-0,66). Reaktion loputtua katalyytti suodatetaan erilleen, pestään 30 ml :11a vettä, ja suodos konsentroidaan alipaineessa 30-40 ml:ksi. Jäännökseen lisätään 100 ml vettä, vesiliuos uutetaan 30 ml :11a metyleenikloridia ja kylmäkuivataan. Saanto: 3,8 g vaiheen 4 otsikon mukaista yhdistettä: R^ = 0,56-0,66 - “81 - 1° (c = 1, vedessä). Aminohappoanalyysi: Arg-H = 0,96 (määritetty NH^:na), Pro = 1,00 (emäksinen muoto). Aminohappoanalyysin perusteella laskettu molekyylipaino on 470. CC^ =9,6 % (vapautettu rikkihapolla) ja 1,3 % (saostettu BaCO^na).

Il

Claims (1)

17 67539 Patenttivaatimus Menetelmä yleiskaavan I tai Ia mukaisten uusien terapeutti- Q sesti käytettävien peptidyyli-N -karboksyyli-arginiinialdehydien ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien happoadditiosuolojen valmistamiseksi, NH I I ^ X-Y-Pro-NH- CH N-C (I) | NH-COOH OH (Ia) X-Y-Pro-NH — ' NH-C L "CHO XNH-COOH jossa kaavassa X on vetyatomi, bentsoyyli- tai tert-.butyylioksikarbonyy-liryhmä, ja Y on D-fenyylialaniini-, β -fenyyli-D-maitohappo- tai D-alloisoleusiinij äännös, tunnettu siitä, että uretaanin kaltainen suojaryhmä, edullisesti bentsyylioksikarbonyyliryhmä, joka on poistettavissa hydro-genolyysillä vastaavasta peptidyyliarginiinialdehydistä, jossa Q uretaanin kaltainen suojaryhmä on läsnä guanidinoryhmän N -atomissa, poistetaan suorittamalla suojatulle peptidyyliarginiinialdehydille hydrogenolyysi neutraaleissa olosuhteissa veden ja alemman alkano-lin seoksessa, ja haluttaessa tuote muutetaan farmaseuttisesti hyväksyttäväksi happoadditiosuolaksi.