JP2540534B2 - オリゴペプチジルニトリル誘導体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はオリゴペプチジルニトリル誘導体、これらの
化合物の合成および用途、並びにセリンプロテアーゼ阻
害剤として作用するこれらの化合物を含有する医薬製剤
に関する。

オリゴペプチジルニトリル誘導体という用語はそのカ
ルボキシル基がシアニド基により置き換えられ、そして
そのアミノ基がα−アミノアシルまたはペプチジル基で
置換されているα−アミノ酸の誘導体を指称するのに用
いられる。

多数の病態生理学的条件により、ヒト血漿中の最も重
要なトロンビン阻害剤であるAT IIIが消費されトロンビ
ン−AT IIIコンプレックスが形成されることは知られて
いる。AT IIIレベルが正常の75％より低下すると血栓の
危険が増大する。後天性および先天性AT III欠乏症の治
療は供血者の血漿から採取されたAT IIIを投与すること
により行われる。この治療にはヒト血漿の入手性が限ら
れているために制約がある。このため天然トロンビン阻
害剤の代わりに凝血過程を抑制または鈍化させることの
できる合成化合物を用いることが望ましい。

現在の科学水準によれば、このタイプの合成阻害剤は
プロテアーゼの特異性を有する空所をブロックしそれに
よってその活性を低下することのできる物質である。こ
の目的に適しているのはアルギニンのペプチド誘導体で
ある。何故なればこれらはセリンプロテアーゼの特異性
を有する空所にうまくはまり込むことができるからであ
る。Ｄ−Phe−Pro−Argのペプチド配列は特に好ましい
ことが分かっており、これは特にトロンビンを阻害す
る。

これに関連して、アルギニンのＣ末端の誘導体化が特
に重要である。何故ならばこれはこれらプロテアーゼ阻
害剤の効果を大きく左右するからである（Annals of th
e New York Academy of Science（1981）,370,765〜78
4）。このタイプの誘導体はそのペプチドのＣ末端が反
応性基のとき強力なセリンプロテアーゼ阻害剤として働
くことが知られている。アルギニンにホルミル基および
クロロメチルカルボニル基が存在すると極めて活性であ
ることが判明している。

トロンビン阻害剤として働く他の既知化合物はアルギ
ニンと構造的に関連性を有し、例えばアグマチン誘導体
またはＮ−α−アリールスルホニル−ｐ−グアニジノフ
ェニルアラニンアミドである。

式Ｉ Ａ−Ｒ−NH−CHR¹−（CH₂）_ａ−NHC（＝NH）NH₂ Ｉ （式中、 R¹はシアニド基であり、 ＲはProまたはＤ−Phe−Proであり、 Ａは水素原子またはぺプチド化学において慣用される
保護基であり、 ａは２〜５、好ましくは３または４の整数である） で示される化合物がセリンプロテアーゼを阻害できるこ
とを見出した。

従って、本発明は前述の定義を有する式Ｉの化合物お
よびその生理学的に許容しうる塩に関する。

本発明化合物は一時的保護基により適当に保護された
アミノ酸誘導体を用いてペプチド化学において慣用の方
法により断片的、すなわち段階式に合成される。場合に
より保護基を除去して塩を調製する。シアニド基は相当
するアミドから水を除去することにより得られる（J.A
m.Chem.Soc.（1966）88,2025〜2035）。

本発明はまた、式Ｉ〔式中、R¹は（CONH₂）である〕
で示される化合物を脱水剤を用いて相当するニトリル体
に変換し、または式Ｉ〔式中、Ｒは結合であり、そして
R¹は（CONH₂）である〕で示される化合物を脱水剤を用
いて式Ｉ（式中、R¹はシアニド基である）で示される化
合物に変換し、そして場合により保護基を除去した後、
式Ａ−Ｒ−Ｘ（式中Ｘは活性化基である）で示される化
合物と反応させ、または式Ｉ〔式中、ＲはProであり、
そしてR¹は（CONH₂）である〕で示される化合物を脱水
剤を用いて式Ｉ（式中R¹はシアニド基である）で示され
る化合物に変換しそして保護基を除いた後Ｄ−Pheの保
護された活性化誘導体とアシル化反応させることにより
式Ｉで示される化合物を製造することよりなる、前述の
定義を有する式Ｉで示される化合物の製造方法に関す
る。

本発明は更に、式Ｉ〔式中、R¹は（CONH₂）である〕
で示される化合物を脱水剤を用いてカルボキサミド基に
おける脱水反応に付し、または式Ｉ〔式中、Ｒは結合で
ありそしてR¹は（CONH₂）でありそしてＡはペプチド化
学において慣用される保護基である〕で示される化合物
をカルボキサミド基における脱水により相当するシアニ
ド化合物に変換し、そして保護基を除去した後式Ａ−Ｒ
−Ｘ（式中、Ｘは活性化基を表わす）で示される化合物
と反応させて式Ｉで示される化合物とすることよりな
る、前述の定義を有する式Ｉで示される化合の製造方法
にも関する。

カルボキサミド基のシアニド基への変換は任意の合成
段階、すなわちトリペプチド、ジペプチドまたはアミノ
酸カルボキサミド段階のいずれにおいても行うことがで
きる。

好ましく用いられる出発物質はそのグアニジノ基が好
ましくはプロトン化されたＬ−アルギニンアミドであ
る。ペプチド合成および保護基の導入は、例えばM.Boda
nszkyによる「Principles of Peptide Synthesis」Spri
nger,Berlin−Heidelberg発行（1984年）に記載されて
いるようなペプチド化学の標準的方法によって行われ
る。カップリング反応は好ましくは溶液中で酸性化合物
例えば１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの存在下にＣ
末端カルボキシル基をカルボジイミド好ましくはジシク
ロヘキシルカルボジイミドで活性化し、そしてそれを有
機塩基の存在下にアミノ基と反応させてペプチド結合を
形成することによって行われる。

このようにして好ましくはBoc−Ｄ−Phe−Pro、Fmoc
−Ｄ−Phe−Pro、Ｚ−Ｄ−Phe−ProまたはFmoc−Proを
Ｌ−アルギニンアミドのアミノ基に結合させる。

このようにして製造されたアルギニンアミド誘導体
（これらは相当するニトリルに変換するのに適してい
る）のほか、α−アミノ基に一時的保護基を有するアル
ギニンアミド誘導体をニトリルに変換することもでき
る。Boc基を一時的保護基として用いるのが好ましい
が、その場合脱水反応の後、この保護基の除去により生
成するニトリルはカップリング可能でありそして目的化
合物を得るために反応させることができる。

前記アミドは脱水剤、例えばジメチルホルムアミド中
のチオニルクロリド好ましくはピリジン中のオキシ塩化
燐を用いてニトリルに変換することができる。

脱水の特に好ましい態様においては１モルのアミドを
ピリジン中２モルのイミダゾールの存在下に1.1モルの
オキシ塩化燐と反応させる。

オキシ塩化燐を添加する間の温度は−25〜−15℃の範
囲に保つのが好ましい。次にその混合物を室温で30分〜
５時間、好ましくは１時間攪拌することによって反応を
完了させる。生成物はペプチド化学において慣用される
精製方法により単離されるが、好ましくは粗製生成物を
有機溶媒と水の間に分配し、そしてカラムクロマトグラ
フィを用いて単離される。

このようにして製造されたニトリル誘導体は分析した
結果正しい組成を示した。すなわちニトリル三重結合は
約2250cm^-1で予測された赤外スペクトルの領域において
認められた。核磁気共鳴検査では¹³CNMRスペクトルにお
いて約119ppmでニトリル基の存在を示した。

式Ｉ（式中、ＲはＤ−Phe−Proであり、そしてＡは保
護基である）で示されるニトリル誘導体の場合、ウレタ
ン型の保護基（BocおよびFmocが好ましい）を慣用の試
薬を用いて除去しＮ末端アミノ基を露出させることがで
きる。好ましくは氷酢酸中1.2N HClまたはメチレンクロ
リド中50％トリフルオロ酢酸を用いてBoc基を除去し、
またはメチレンクロリド中ピペリジンを用いてFmoc基を
除去する。

本発明化合物は予想以上にセリンプロテアーゼに対し
強力な阻害作用を示す。この作用はトロンビンに対して
特に強く示される。その他の酸素、例えばF Xaについて
の特異性はＮ末端の基により影響される。

本発明化合物は天然セリンプロテアーゼ阻害剤、好ま
しくはAT IIIの代替物として適している。これらの物質
およびそれらの生理学的に許容される塩は、AT III欠乏
を除くための剤として働き、これにより血栓の危険を少
なくまたは除去することができる。これらの剤は、更に
生理学的に許容し得るビヒクルまたは助剤を含むことも
できる。

略号 AT III アンチトロンビンIII Ｚ ベンジルオキシカルボニル Boc tert.−ブチルオキシカルボニル Fmoc ９−フルオレニルメチルオキシカルボニル NMR 核磁気共鳴 TLC 薄層クロマトグラフィ R_F 保持係数 C/T 塩素/4,4−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルメ
タン試験 UV 紫外可視化 DCU ジシクロヘキシル尿素 DCC ジシクロヘキシルカルボジイミド HOBt ヒドロキシベンゾトリアゾール DMF ジメチルホルムアミド NMM Ｎ−メチルモルホリン 薄層クロマトグラフィの移動相： （Ａ）ｎ−ブタノール／氷酢酸／水 3:1:1 （Ｂ）クロロホルム／メタノール／氷酢酸 50:20:5 実施例 １ Ｎ（α）−Boc−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリル
−Ｌ−（１−アミノ−４−グアニジノ）バレロニトリル 1.N（α）−Boc−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリル
−Ｌ−アルギニンアミド 6.6gのBoc−Ｄ−Phe−Pro（18ミリモル）と2.43gのHO
Btを100mlのDMFに溶解し、そしてその溶液を０℃に冷却
し、そして3.8gのDDCを添加した。その混合物を０℃で3
0分間および室温で30分間攪拌した。次に5.28gのArg−N
H₂×2CH₃COOHおよび3.8mlのNMMを添加した。沈澱したDC
Uを吸引去し、溶媒を真空蒸発により除去し、そして
残留物をクロロホルムにとった。有機相を飽和重炭酸ナ
トリウム溶液で３回および飽和塩化ナトリウム溶液で３
回振盪することにより抽出した。このクロロホルム溶液
を硫酸ナトリウムで乾燥しそして真空濃縮した。その濃
縮クロロホルム溶液をジエチルエーテルに滴加すること
によりペプチド誘導体を結晶として得た。得られた結晶
を高度真空下に五酸化燐で乾燥した。

収量:7.3g（理論値の70％） 純度チェック:TLC R_F＝0.46（Ａ） 2.N（α）−Boc−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリル
−Ｌ−（１−アミノ−４−グアニジノ）バレロニトリル 上記１で製造したアミド4gと1gのイミダゾールを60ml
のピリジンに溶解した。2.8mlのオキシ塩化燐を−20℃
で滴加した。次にその混合物を室温で１時間攪拌し、真
空濃縮しそして残留物をクロロホルムにとった。有機相
を水で３回抽出し、そして硫酸ナトリウムで乾燥した。
ペプチド誘導体をジエチルエーテルに滴加することによ
り結晶化しエーテルで洗浄し、そして高度真空下に乾燥
した。

収量:2.6g（理論値の69％） 純度チェック:TLC R_F＝0.61（Ａ） 融点:75℃以上で分解 実施例 ２ Ｎ（α）−Fmoc−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリル
−Ｌ−（１−アミノ−４−グアニジノ）バレロニトリル 1.N（α）−Fmoc−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリ
ル−Ｌ−アルギニンアミド 1.45gのFmoc−Ｄ−Phe−Pro（３ミリモル）および405
mgのHOBtを40mlのDMFに溶解しそして０℃で630mgのDCC
を添加し、次いでその混合物を０℃で30分間および室温
で30分間攪拌した。次いで880mgのArg−NH₂×2CH₃COOH
および630μのNMMを添加した。12時間後不溶物を別
しDMFを蒸発除去し、そして油状残留物をクロロホルム
にとった。有機相を飽和重炭素ナトリウムで３回、及び
飽和塩化ナトリウム溶液で３回振盪することにより抽出
しそして硫酸ナトリウムで乾燥した。クロロホルムを蒸
発除去後純粋な生成物が得られた。

収量:900mg（43％） 純度チェック:TLC R_F＝0.34（Ｂ） 2.N（α）−Fmoc−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリ
ル−Ｌ−（１−アミノ−４−グアニジノ）バレロニトリ
ル 770mgの１で合成された生成物を10mlのピリジンに溶
解し100mgのイミダゾールを添加しそしてその混合物を
−20℃に冷却した。0.5mlのオキシ塩化燐を滴加しその
混合物を室温で１時間攪拌した。次に真空蒸発乾涸し残
留物をクロロホルムにとった。この溶液を飽和重炭酸ナ
トリウム溶液および飽和塩化ナトリウム溶液で各々３回
振盪することにより抽出した。そして硫酸ナトリウムで
乾燥した。その溶液を真空中部分濃縮した後、生成物を
エーテル／酢酸エチル（2:1）に滴加することにより結
晶化し別しそして高度の真空下に乾燥した。

収量:380mg（52.5％） 純度チェック:TLC R_F＝0.62 融点:125℃以上で分解 実施例 ３ Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−（１−
アミノ−４−グアニジノ）バレロニトリルジトリフルオ
ロアセテート 0.5mlのアニソールおよび3mlのトリフルオロ酢酸を実
施例１と同様に製造された270mgの生成物に添加しそし
てその混合物を水分排除下に５分間室温に保った。生成
物をジエチルエーテルに滴加することにより結晶化し
た。それを遠心分離により除去し、ジエチルエーテルで
洗浄しそして水にとった。水相をジエチルエーテルで３
回抽出しそして凍結乾燥した。ふわふわした白色粉末を
得た。

収量:170mg（54％） 純度チェック:TLC R_F＝0.275（Ａ） 機能試験 実施例１、２または３と同様にして製造された物質の
活性をトロンビン時間の測定により確認した。これはト
ロンビン時間を倍化する濃度（μmol/l）の確認により
行った。

試験手順 50μの各種濃度の阻害剤溶液、 50μの標準ヒト血漿および 100μのジエチルバルビツール酸／酢酸ナトリウム
緩衝剤（pH7.6） を37℃で45秒間インキュベートしそして100μのα−
ヒトトロンビン（3.0IU/ml）を添加した。試験はトロン
ビン時間測定用のSohnitger＆Grossの装置で行った。

毒性試験 Ｈ−Ｄ−Phe−Pro−Arg−CN×2HCOOHの毒性を動物モ
デルで調べた。供試物質をマウスに静脈内注射を行っ
た。50mg/kgを上回る投与量で臨床的に検出可能な病理
学的所見が認められた。治療効果を得るための投与量は
約１〜4mg/kgであるべきである。

阻害定数（K_i値） Ｈ−Ｄ−Phe−Pro−Arg−CN×2HCOOH: K_i＝６×10^-7mol/l（α−ヒトトロンビン）

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】式Ｉ Ａ−Ｒ−NH−CHR¹−（CH₂）_ａ−NHC（＝NH）NH₂ Ｉ （式中、 R¹はシアニド基であり、 ＲはProまたはＤ−Phe−Proであり、 Ａは水素原子またはぺプチド化学において慣用の保護基
   であり、そして ａは２〜５、好ましくは３または４の整数である） で示される化合物およびその生理学的に許容される塩。
2. 【請求項２】Ａ−ＲがBoc−Ｄ−Phe−Pro、Fmoc−Ｄ−P
   he−Pro、Ｚ−Ｄ−Phe−ProまたはFmoc−Proである特許
   請求の範囲第１項に記載の化合物。
3. 【請求項３】Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ
   −（１−アミノ−４−グアニジノ）バレロニトリルおよ
   びそのＮ末端にペプチド化学において慣用される保護基
   を有する誘導体である特許請求の範囲第１項記載の化合
   物およびその生理学的に許容される塩。
4. 【請求項４】式Ｉ Ａ−Ｒ−NH−CHR¹−（CH₂）_ａ−NHC（＝NH）NH₂ Ｉ （式中、 R¹はシアニド基であり、 ＲはProまたはＤ−Phe−Proであり、 Ａは水素原子またはペプチド化学において慣用の保護基
   であり、そして ａは２〜５、好ましくは３または４の整数である） で示される化合物およびその生理学的に許容される塩を
   ビヒクルおよび場合により助剤または添加剤と共に含有
   する抗凝血製剤。
5. 【請求項５】式Ｉ Ａ−Ｒ−NH−CHR¹−（CH₂）_ａ−NHC（＝NH）NH₂ Ｉ （式中、 R¹はシアニド基であり、 ＲはProまたはＤ−Phe−Proであり、 Ａは水素原子またはペプチド化学において慣用の保護基
   であり、そして ａは２〜５、好ましくは３または４の整数である） で示される化合物の製造方法において式Ｉ〔式中、R¹は
   （CONH₂）である〕で示される化合物を脱水剤を用いて
   担当するニトリル体に変換、または式Ｉ〔式中、Ｒは結
   合であり、そしてR¹は（CONH₂）である〕で示される化
   合物を脱水剤を用いて式Ｉ（式中、Ｒ′はシアニド基で
   ある）で示される化合物に変換し、そして場合により保
   護基を除去した後、式Ａ−Ｒ−Ｘ（式中、Ｘは活性化基
   である）で示される化合物と反応させ、または式Ｉ〔式
   中、ＲはProであり、そしてR¹は（CONH₂）である〕で示
   される化合物を脱水剤を用いて式Ｉ（式中、R¹はシアニ
   ド基である）で示される化合物に変換しそして保護基を
   除去した後Ｄ−Pheの保護された活性化誘導体とアシル
   化反応させることにより式Ｉで示される化合物を製造す
   ることよりなる前記製造方法。
6. 【請求項６】式Ｉ Ａ−Ｒ−NH−CHR¹−（CH₂）_ａ−NHC（＝NH）NH₂ Ｉ （式中、 R¹はシアニド基であり、 ＲはProまたはＤ−Phe−Proであり、 Ａは水素原子またはペプチド化学において慣用の保護基
   であり、そして ａは２〜５、好ましくは３または４の整数である） で示される化合物の製造方法において式Ｉ〔式中、R¹は
   （CONH₂）である〕で示される化合物を脱水剤を用いて
   カルボキサミド基における脱水反応に付すか、または式
   Ｉ〔式中、Ｒは結合であり、そしてR¹は（CONH₂）であ
   り、そしてＡはペプチド化学において慣用の保護基であ
   る〕で示される化合物をカルボキサミド基における脱水
   により相当するシアニド化合物に変換し、そして保護基
   を除去した後、式Ａ−Ｒ−Ｘ（式中、Ｘは活性化基を表
   わす）で示される化合物と反応させて式Ｉで示される化
   合物とすることよりなる前記製造方法。