SU1366062A3 - Способ получения производных пептидил-ν^-карбокси-аргинин-альдегидов - Google Patents

Description

Изобретение касается производных петидов, в частности получения производных пептидил-Ν -карбокси-аргинин-альдегидов (ПКА) общей формулы (0,5 НС1)п'Х-О-РЬе-Ъ-Рго-ΝΗ-СН-С(ОН)-К-С(=НН)-ИН-С(О)ОН д=д(0,5 НС1)п·Х-О-РЬе-Ь-Рго-ΝΗ-сн(сн=о)-сн ₂-сн ₂-сн₂-ин-с(=ΝΗ)-ИН-С(О)ОН, где п=0 или 1, если

X - Н, и п=0, если X - трет-бутилоксикарбонил, которые-могут быть использованы в экспериментальной биологии и медицине. Цель - создание более активных и малотоксичных веществ указанного класса. Их синтез ведут гидрогенолизом соединения общей формулы Х^-Д-РЬе-Ь-Рго-ΝΗ-СН(СН=О)-(СН _г)₃-ΝΗ-С(=ΝΗ)-ΝΗ-С(0)-О-СН^-С₂Н₅, где X, - бензилоксикарбонил или трет-бутилоксикарбонил. Процесс ведут в смеси низшего спирта (этанола) и воды (соотношение 3:1) в присутствии катализатора РД/С. Выделение целевых ПКА ведут либо в свободном виде, либо в виде хлоридратов. Брутто-ф-ла; :

а) С₂,Н^₆0₅ 1,5 Н₂0; (-) 122-124°;

б) С₂₆Н₃₀Ы₆0₇ Н₂0; (-) 63-65°. Новые вещества увеличивают время свертывания фиброногена, индуцированного тромбином, в 10 раз, причем протромбиновая активность не изменяется в течение 20 ч в буферном растворе с рН 7,4, ЬОбо = 1200 мг/кг. 1 табл.

зи .1366062

>

СН

2

¹ 1366062

Изобретение относится к способу -Ы^&-карбокси-аргинин~альдегидов обполучения новых химических соедине- щей формулы

нин, а именно производных пептидил(0,5НС1)_л Х-П-РЪе - Ъ-Ρνο-ΝΗ-ΟΗ^.'ΝОН

С

Ъш-еоон

, \ о

(0,5НС1)_п-Х-В-рЬе-Е-Рго-1Ш- СН ΊΝΉ~<λ

сно

ΝΗ-СООН

где η - 0, 1, если X ~ водород и η - 0, если X - трет-бутилоксикарбонил, которые могут найти применение ,в экспериментальной биологии и медицине,

Цель изобретения - синтез новых

производных пептидил-аргинин-альдегидов, обладающих более высокой антитромбиновой активностью в сочетании

с низкой токсичностью.

Пример 1. О-Фенилаланил-Ьг.

-пролил-Ν -карбокси-Ь-аргинин-альдегид (Ц-РЬе-Ь-Рго-Ь-Аге(СООН)-Н).

Стадия 1. трет-Бутилоксикарбонил-Ν -бензилоксикарбонил-Ь-аргининлактам.

41,1 г (125,0 ммоль) трет-бутилоксикарбонил-Ь-аргинин-гидрата растворяют в 125 мл 4 н. раствора гидроокиси натрия, раствор охлаждают до -5 - 0°С и при интенсивном перемешивании смешивают с 75,0 мл (0,5 моль) бензилового эфира хлоругольной кислоты и 125 мл 4 н. раствора гидроокиси натрия, Реакционную смесь перемешивают 1,5 часа при 0°С, затем разбавляют 100 мл воды, экстрагируют· эфиром (3x100 мл) и подкисляют охлажденной до 4-6°СЗн. серной кислотой При охлаждении ледяной водой до рН 3. Выпавший осадок экстрагируют этилацетатом (3x250 мл), объединенный этилацетатный экстракт промывают 15%-ным раствором хлористого натрия (2x125 мл), сушат над безводным сульфатом натрия и упаривают в вакууме’. Остаток растирают с эфиром, отфильтровывают, промывают эфиром и сушат на воздухе.

В итоге получают 37,5 г (⁷6%)

25 трет-бутилоксикарбонил-Ν -бензилоксикарбонил-Ь-аргинина, К|0,170,27 "Силикагель С"· Реанал (ВНР); этилацетат-пиридин-уксусная кислотавода, 240:20:6:11).

30 Полученный продукт растворяют в 130 мл тетрагидрофурана, раствор смешивают с 13,58 мл (97 ммоль) триэтиламина, охлаждают до -10°С и добавляют 12,8 мл (97 ммоль) изобу35 типового эфира хлоругольной кислоты. Реакционную смесь перемешивают 5 мин и добавляют 13,6 мл (97,8 ммоль триэтиламина., перемешивают еще 1 ч при 0°С и 1 ч без охлаждения и вы40 ливают в 600 мл ледяной воды. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают водой и сушат в вакууме над Ρ^,Ος.

В итоге получают 32,7^г (91%) трет-бутилоксикарбонил-Ν -бензил-оксикарбокил-Ь-аргинин-лактама с т. пл. 162-164°С; В. 0,85-0,95

"Силикагель С’’ Реанал (ВНР); этилацетат-пиридин-уксусная кислота-вода, 480:20:6:11),

Стадия 2. Бензилоксикарбонил-0-фенилаланил-Ь-пролил-Ν -бензилоксикарбонид-Ь-аргинин-лактам.

8,6 г (22 ммоль)' трет-бутилоксикарбонил-Ν °-бензилоксикарбонил-Ь55 -аргинин-лактама суспендируют в 20 мл

этилацетата и при перемешивании при

5°С смешивают с 40 мл 4 М раствора

НС1 в этилацетате. Реакционную смесь

перемешивают 30 мин при охлаждении

3 1366062

4

ледяной водой и разбавляют 100 мл охлажденного этилацетата. Осадок отфильтровывают, промывают этилацетатом и сушат в вакууме над гидроокисью калия. Полученный продукт растворяют в 20 мл диметилформамида, раствор охлаждают до -10°С и смешивают с 6,2 мл (44 ммоль) триэтиламина. Полученную суспензию вводят во взаимодействие со мешанным ангидридом, полученным указанным способом.

8,0 г (200 ммоль) бензилоксикарбонил-О-фенилаланин-Ь-пролина растворяют в 25 мл диметилформамида, раствор охлаждают до -15°С и перемешивания смешивают с 2,22 мл (20 ммоль) Ν-метилморфолина и 2,64 мл (20 ммоль) изобутилового эфира хлоругольной кислоты. Реакционную смесь перемешивают 10 мин, а затем добавляют указанную суспензию и устанавливают рН реакционной смеси 8-9 путем добавления триэтиламина. Реакционную смесь перемешивают 1 ч при -15°С и еще 1 ч при 0°С, затем разбавляют 50 мл·бензола. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают бензолом (2x20 мл). К объединенному фильтрату добавляют 50 мл воды, фазы разделяют и водную фазу экстрагируют бензолом (3x20 мл). Бензольный экстракт промывают 10%-ным водным раствором карбоната натрия, 30 мл воды, 0,1 н. соляной кислотой (2х 30 мл), водой (2x30 мл), сушат над безводным сульфатом натрия и упаривают в вакууме. Остаток растирают с 30 мл эфира, эфир декантируют, остаток растирают с петролейным эфиром, отфильтровывают осадок, промывают петролейным эфиром и высушивают на воздухе.

В итоге получают 11,7 г (87%) бензилоксикарбонил-О-фенилаланилр

-Ь-пролил-Ν -бензилоксикарбонил-Ь-аргинин-лактама, 0,72-0,78

"Силикагель С" Реанал (ВНР); этилацетат-пиридин-уксусная кислота-вода; 480:20:6:11).

Стадия 3. Бензилоксикарбонил-ϋС

-фенилаланил-Ь-пролил-Ν -бензилоксикарбонил-Ь-аргинин-альдегид.

10,05 г (15 ммоль) бензилоксикарбо нил-О-фенилаланил-Ь-пролил-Ν, -бензилоксикарбонип-Ь-аргинин-лактама растворяют в 45 мл тетрагидрофурана, раствор охлаждают до -20^сС и при интенсивном перемешивании сме25

35

10

15

20

30

40

45

50

55

шивают с 28 мл 0,4 М раствора литийалюминийгидрида (I I ,25 ммоль) в тетрагидрофуране. Ход реакции контролируют с помощью тонкослойной хроматографии ,

После окончания реакции реакционную смесь осторожно подкисляют 1 н. соляной кислотой до рН 2 и разбавляют 100 мл воды, экстрагируют н-гексаном (2 х 30 мл) и дихлорметаном (3 х 30 мл), Объединенный дихлорметановый экстракт промывают 10%-ным водным раствором карбоната натрия (3x10 мл) и водой (2x10 мл), сушат над безводным сульфатом натрия и упаривают в вакууме. Остаток растворяют в 50 мл бензола и раствор упаривают в вакууме. Эту операцию повторяют еще дважды. Остаток растируют с эфиром, осадок отфильтровывают, промывают эфиром и сушат на воздухе.

В итоге получают 7,3 г (72%) бензилоксикарбонил-'О-фенилаланил-Ь-пролил-Ν -бензилоксикарбонил-Ь-аргннин-альдегида, К 0,32-0,40 ("Силикагель С" Реанал (ВНР); этилацетат-пиридин-уксусная кислота-вода, 480: :20:6:11), т. пл. 116-117°С.

Стадия 4. ϋ-Фенилаланил-Ь-пролил-Ν ^-карбокси-Ь-ар.гинин-альдегид.

6,7 г (10 ммоль) бензилоксикарбонил-О-фенилаланил-Ь-пролил-Ν '-бензилоксикарбонил-Ь-аргинин-альдегида растворяют в 100 мл 75%-ном водном этаноле. К раствору добавляют 1 г 10%-ного палладия на активированном угле и подвергают гидрогенолизу при нормальном давлении. Ход реакции контролируют с помощью тонкослойной хроматографии в системе этилацетат-пиридин-уксусная кислота-вода, 30:20:6:11 После окончания реакции катализатор отфильтровывают, промывают 30 мп воды. Объединенный фильтрат для удаления этанола упаривают в вакууме. Остаток разбавляют 100 мл воды, экстрагируют 30 мл дихлорметана, замораживают и лиофилизуют.

В итоге получают 4,3 г ϋ-фенилС

аланил-Ь-пролил-Ν -карбокси~Ь-аргинин-альдегида, [с<) - 123Л°(С1 ; воНайдено, %: С 52,21; Н 7,00;

N 17,89.

1,5Н₂О

Рассчитано, %: С 53,28; Н 6,97;

N 17,80.

Аминокислотный анализ: РЬе 1,02 (1); Аг§-Н 0,97 (1); Рго 1,00 (1).

5 1366062

6

Выделяющийся с серной кислотой СО/ 10,9%; С0₇, осаждаемый в виде ВаСО$ 2,1%. В.£ 0,35-0,40 ("Силикагель С", этилацетат-пиридин-уксусная кислота-вода, 30:20:6:11).

Пример 2. ϋ-ФенилаланилГ

-Ь-пролил-Ν“-карбокси-Ь-аргинин-альдегид неполный гидрохлорид (Η-ϋ-РЬе-Ь-Рго-Ь-Аг§(СООН)-Н 0.5НС1).

0,48 г ϋ-фенилаланил-Ь-пролил-И^-карбокси-Ь-аргинин-альдегида растворяют в 5 мл воды, раствор охлаждают до 3-5^аС, а затем смешивают при этой температуре с 5 мп 0,1 н. соляной кислоты. Смесь замораживают и лиофилизуют. В итоге получают 0,45 г неполного гидрохлорида ϋ-фе(л

нилаланил-Ь-пролил-Ν -карбокси-аргинин-альдегида сГс13^⁰ = -120° (С 1; вода); 0,35-0,40 ("Силикагель С; этилацетат-пиридин-уксусная кислота-вода, 30:20:6:11).

Найдено, %: С 52,86; Н 6,95;

N 17,69; С1 3,62.

С Н ЯД- 0,5НС1 · 0,5Н„0

Рассчитано, %: С 53,24; Н 6,70;

N 17,74; С1 3,74,

Пример 3. трет-Бутилоксикарбонил-О-фенилаланил-Ь-пролил-Ν -карбокси-Ь-аргинин-альдегид,

Стадия 1. трет-Бутилоксикарбонил-О-фенилаланил-Ь-пролил-Н^-бензилоксикарбонил-Ь-аргинин-лактам.

8,6 г (22 ммоль) трет-бутилоксикарбонил-Ν ^-бензилоксикарбонил-Ь-аргинин-лактама превращают в N -бензилоксикарбонил-аргинин-лактам по примеру 1 (стадия 2), который в виде суспензии в диметилформамиде вводят во взаимодействие со смешанным ангидридом, полученным указанным способом.

7,25 г (20 ммоль) трет-бутилоксикарбонил-Б-фенилаланил-пролина и 2,22 мл (20 ммоль) Ν-метидморфолина растворяют в 20 мл диметилформамида. Раствор охлаждают до -15°С и при этой температуре, интенсивно перемешивая добавляют 2,64 мл (20 ммоль) изобутилового эфира хлоругольной кислоты и через 5 мин добавляют указанную суспензию. Реакционную смесь перемешивают 1 ч при -15°С и еще 1 ч при 0°С и разбавляют 30 мл бензола. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают бензолом (2x10 мл). Объединенный фильтрат смешивают с 50 мл воды и фазы разделяют. Водную

фазу экстрагируют бензолом (2x10 мл) и бензольный экстракт объединяют с бензольной фазой. Объединенный бензольный экстракт промывают 10%-ным раствором карбоната натрия (3x30 мл), водой (1x30 мл), 0,5 н. серной кислотой (ЗхЗО мл) и снова водой (3x30 мл), сушат над безводным сульфатом натрия и упаривают в вакууме. Остаток растирают с петролейным эфиром, осадок отфильтровывают, промывают петролейным эфиром и высушивают на воздухе.

₁₅ В итоге получают 9,65 г (76%) трет-бутилоксикарбонил-Б-фенил-аланил-Ь-пролил-Ν ⁽’-бензилоксикаобонил-Ь-аргинин-лактама. 0,81-0,89

("Силикагель С" Реанал (ВНР); этил„ ,ацетат-пиридин-уксусная кислота-вода , 480 : 20 : 6 : 1 1 ) .

Стадия 2. трет-Бутилоксикарбонил-Б-фенилаланил~Ь-пролил-Н⁽’’-бензилоксикарбонил-Ь-аргинин-альдегид.

ос 9,52 г (15 ммоль) трет-бутилоксикарбонил-Б-фенилаланил-Ь-пролил-Ν -бензилоксикарбонил-Ь-аргинин-лактама вводят во взаимодействие с литийалюминийгидридом по примеру 1 (стадия 3) с тем отличием, что после окончания реакции реакционную смесь подкисляют 0,5 н. серной кислотой.

В итоге получают 6,9 г (72%)

'т р е т-бутило к сик ар б онил-Б-фенил-аланил-Ь-пролил-Ν -бензилоксикарбонил35 -Ь-аргинин-альдегида с 0,46-0,56 ("Силикагель С", Реанал (ВНР); этилацетат-пиридин-уксусная кислота-вода, 240:20:6:11).

₄θ Стадия 3. трет-Бутилоксикарбонил-Б-фенил аланил-Ь-пролил-Ν'“-карбокси-Ь-аргинин-альдегид.

6,4 г (10 ммоль) трет-бутилоксикарбонил-О-фенилаланил-Ь-пролил-Ν -бензилоксикарбонил-Ь-аргинин-альде45

гида подвергают гидрогенолизу по примеру 1 (стадия 4).

В итоге получают 5,1 г (85%) трет-бутилоксикарбонил-Б-фенил-аланил-Ь-пролил-Ν -карбокси-Ь-аргинин⁵⁰ альдегида с[^1^° = -64+1° (С 1; в водном растворе с рН 7, уставленном с помощью соляной кислоты). 0,460,56 ("Силикагель С" Реанал (ВНР);, этилацетат-пиридин-уксусная кислота⁵⁵ вода, 30:20:6:11).

Найдено, %: С 55,1; Н 6,90;

N 15,10.

С^Н^О, Н_?0

Рассчитано, %: С 55,31; Н 6,79; N14,90.

Выделяющийся с серной кислотой СО^ 10,1%, осаждаемый в виде ВаСО 3,1%. Аминокислотный анализ: РНе 0,96 (1); Аг§-Н 0,97 (определен в виде ΝΗ₃); Рго 1,00 (1).

Антитромбиновая активность предлагаемых соединений изучена в опытах ϊη νΪΡΓο по способности увеличивать время свертывания фибриногена, индуцированного тромбином. Исследование проводилось в сравнении с известными соединениями, обладающими анти.тромбиновой активностью (Н-О-РНе-Ь-Рго-Аг£-Н·НС1 и ϋ-РНе-Ь-Рго-Агё-Н* х 2С1ЦСООН).

В эксперименте использовали 0,2 мл 0,5%-ного фибриногена крупного рогатого скота в 0,9%-ном растворе хлористого натрия; 0,1 мл трис/НС1 буфера (рН 7,4), в котором растворяли исследуемое соединение; 0,I мл ,5 Е/мл раствора стандарта США человеческого тромбина (ΝΙΗ, ВебНезЛа Мэриленд, США). Время свертывания фибриногена в этой системе без добавки наследуемых пептидов 15 с.

Антитромбиновая активность пептидов определялась по концентрации вещества, которая необходима для увеличения времени свертывания фибриногена, индуцированное тромбином, в 10 раз. Антитромбиновая активность определялась непосредственно после приготовления раствора исследуемого соединения в трис/НС1-буфере (рН 7,4) и через 20 ч. Активность 1)-РНе-Ь-Рго-Ь-Аг§(СООН)-Н принята на 100%.

Полученные результаты представлены в таблице.

Как видно из данных, приведенных в таблице, предлагаемые соединения превосходят по антитромбиновой активности известные и сохраняют свою

366062 ⁸

активность практически неизменной в течение 20 ч в буферном растворе с рН 7,4, в то время как активность известных соединений в этих условиях снижаются на 10-20%.

10

20

25

30

35

40

45

Кроме того, в опытах ΐπ νίνο ^а примере О-фенилаланил-Ь-пролил-Ν -карбокси-Ь-аргинин-альдегида изучена антитромбиновая активность соединений общей формулы. Исследования проводились на мышах, крысах, кроликах, собаках и обезьянах. В результате проведенных исследований установлено, что ϋ-фенилаланил-Ь-пролил-Ν -карбокси-Ъ-аргинин-альдегид обладает антитромбиновой активностью не только при внутривенном, внутримышечном и подкожном введении, но и при пероральном введении. При введении собакам в доз(= 50 мг/кг ϋ-фенилаланил-Ъ-пролил-Ν -карбокси-Ь-аргинин-альдегид перорально вызывает повышение времени свертывания крови в 4-6 раз. Время свертывания крови измерено на тромбоэластографе Ηβΐΐϊ§е (Австрия). Известные соединения при пероральном введении в дозах 50 мг/кг не оказывали практически никакого влияния на время свертывания крови.

Острая токсичность соединений общей формулы была изучена на мышах.

В результате проведенных исследований установлено, что эти соединения являются малотоксичными: для П-РНе-Ъ-Рго-Ъ-Аг§(СООН)-Н 113^ = 1200 мг/кг, а для Вос-П-РНе-Ъ-Рго-Ъ-Аг§(СООН)-Н 1300 мг/кг.

Claims (1)

1. Формула изобретения

   Способ получения производных пептидил-Ν -карбокси-аргинин-альлегидов общей формулы

   (О,5НС1)_П Х-Ό-РНе-Ь-Рго-Н- СН Н~С

   I Υ "та-соон н

   он

   НН

   (0,5Η0ΐ)_η·Χ-ϋ-РНе-Ь~Рро-НН“СН НН-С^

   \но НН- С О ОН

   9 1366062 10

   где η = 0, 1, если X - водород и отличающийся тем, что

   η = 0, если X - трет-бутил- соединение общей формулы

   оксикарбонил,

   Η'Ί _ΖΜΗ

   Х^Б-РЬе-Е-Рго-ΝΗ-СН N11-, сно ™-С-ОСН₂С_вН₈

   θ

   где X] - бензилоксикарбонил, трет- низшего спирта и воды при объемном

   бутилоксикарбонил, соотношении 3:1 с последующим выдеподвергают каталитическому гидроге- лением целевых продуктов в свободном

   нолизу в присутствии Ρά/С в смеси 15 виде или в виде хлоргидратов.

   Пример Соединение Количество вещества, необходимого для увеличения времени свертывания фибриногена, индуцированного тромбином, в 10 раз, мкг/мл непосредственно ' после растворения соединения через 20 ч мкг/мл Относительная активность, % мкг/мл Относительная активность, % 1 П-РЬе-Ь-Рго-Ь-Агё(СООН)-Н 0-,275 100 0,300 92 2 0-РЬе-Ь-Рго-Ь-Агё(С00Н)-Н 0,5НС1 0,050 550 0,350 79 3 Вос-0-РЬе-Ь-Рго-Ь-Аг§(СООН)-Н 0,425 . 65 0,450 61 ϋ-РНе-Ь-Рго-Ь-Аге-Н· НС1 0,35-0,95 79-29 6,0 5 О-РЬе-Ь-Рго-Ь-Агё-Н·2СН₃ СООН 0,37-1,25 73-22 6,2 4