FI88398C

FI88398C - Foerfarande foer framstaellning av peptidanaloger

Info

Publication number: FI88398C
Application number: FI844230A
Authority: FI
Inventors: Michael Szelke; David Michael Jones; Martin Andrew Brydson
Original assignee: Thrombosis Res Inst
Priority date: 1983-03-04
Filing date: 1984-10-29
Publication date: 1993-05-10
Also published as: IE56958B1; WO1984003507A1; EP0118280A1; FI844230L; ES8602849A1; FI844230A0; IE840474L; JPS60500870A; AU2651684A; AU596783B2; DK520284D0; ATE44533T1; DE3478928D1; ES530262A0; CA1322078C; US4638047A; EP0118280B1; DK520284A; FI88398B; GB8305985D0

Description

1 88398

Menetelmä peptidianalogien valmistamiseksi

Keksintö koskee menetelmää peptidianalogien valmistamiseksi, joilla on trombiini a estävä vaikutus.

Veren hyytyminen riippuu monimutkaisesta tapahtumasarjasta, 5 joka lopulta johtaa fibriinin lohkeamiseen kiertävästä fibri-nogeenista trombiini-proteaasin vaikutuksesta, jota seuraa ristiinkytkentä pysyvän rakenteen muodostuessa. Trombiinituo-tanto jakautuu kahteen osaan "sisäiseen" systeemiin, joka porusi im kiertäviin vn on komponentteihin, ja "nlkoiseen" pyp-10 toomiin, johon vaikuttavat kurtoskomponentit. Kuminassakin systeemi HRii laj.aliinu joukko reakt ion n, jot ka sarja inaktiivisia "tekijöitä" saa aikaan, jokaisen tekijän muuttnoppa proieo-lyyttisellä reaktiolla vastaavaksi "a"-t.ekijäksi , joka itsessään on seuraavnan vaiheeseen vaikuttava proteolyyttjnen ent-15 syyrr.i.

Sisäisessä systeemissä tapahtuma alkaa kiertävän Haueir.an-tekijän (tekijä XII) joutuessa koniakl iaki ivoinnin alaiseksi, sitoutuessaan vaurioituneille pinnoille tai verlhiutalekasau-tumiin. Kiertävä proteaasi kallikreiini lohkaisee siitä pep-20 tidin, jolloin muodostuu tekijä Xlla. Sen jälkeen tekijä Xlla kiertävän, suuren molekyy]ipainon omaavan kininogeenin (HMW-K) läsnäollessa a) lohkaisee kiertävän plasmatromboplastiinia edeltävän tekijän (tekijä XI), jolloin saadaan itse plasna-tromboplastiini V λ\> (tekijä X I a) , ja b) lohkaisee kiertävän prc-kn 11 1 kre.11 nln (Tre-K; Fletcher-tekijä), jolloin saadaan lisää kallikreiiniä ja siten itse- .·. : kiihtyvä vaikutus.

Kalsiumionien läsnäollessa plasma-tromboplastiini lohkaisee 30 kiertävän Christmas-tekijän (tekijä IX), jolloin muodostuu tekijä lXa. Tekijä JXa yhdessä kiertävän anlihomoi i i) ΐ sen 2 88398 globuliinin (AHG. tekijä VIII) ja kalsiumionien ja verihiutaleiden fosfolipidi-misellien läsnäollessa muodostaa lipopro-teiinikompleksin yhdessä kiertävän Stuart-tekijän (tekijä X) kanssa ja lohkaisee sen, tekijän Xa muodostuessa. Lopuksi te-5 kijä Xa yhdessä kiertävän labiilin tekijän (tekijä V) ja kalsiumionien ja fosfolipidi-misellien läsnäollessa muodostaa lipoproteiini-kompleksin yhdessä protrombiinin (tekijä II) kanssa ja lohkaisee sen, itse trombiinin (tekijä Ha) muodostuessa .

10 Ulkoisessa systeemissä seerumin glykoproteiinin prokonvertii-nin ( tekijä VII) lohkaisevat sisäisen systeemin monet prote-aasit (tekijät Xla ja Xlla ja kallikreiini), jolloin muodostuu tekijä Vila. Tekijä Vila yhdessä kudoslipoproteiinin kanssa, jota kutsutaan kudos-tromboplastiiniksi (tekijä III) , ja 15 kalsiumionien läsnäollessa muodostaa kompleksin edelleen kiertävän tekijän X kanssa ja lohkaisee sen, muodostaen tekijän Xa toisen muodostumislähteen, lisäten siten trombiinituotan-toa.

Lopuksi molemmista muodostumislähteistä saatu trombiini muut-20 taa kiertävän fibrinogeenin fibriinin liukoiseen muotoon, joka itsestään polymeroituu rihmoiksi (filaments) ja sen jälkeen ristiinkytkeytyy entsyymin vaikutuksesta (tekijä XHIa) , joka muodostuu trombiinin vaikuttaessa myös kiertävää fib-riiniä stabiloivaan tekijään (tekijä XIII) .

25 Seuraavassa on taulukon muodossa esitetty edellä kuvatut reaktiot: 3 88398 ηΛ

h Q

HTO

ä3 fÖ ·Η

H H λ; G

s 5ΙίΓ

I 3——>S|3IK

l· I β«~

I j I

0 t g S-7-* -- Ä S t « ί S *3 «e

G + I «Q H H

:!J + H G H H

sä ^ , -öal s s I *_V > W> * ft f ->0 δ ·5 ΐΤλ | I s ip3 lii p c s ^τΐ4-1 & e + H a) <TJ -H (ö + H 4J-ng M /

a f M I j/J

M -r--> ft M Ö 8 -§Q \k-S 3

•n ·> \ -H O <D -H ^ Ή M—""^H +J

•rj >! gh h y y g y m S $fti§3 3 33 3 Tl (P H H 0) H H —' H-t —

t f « I

{ ϋ'π fa (0 »g

ft «I

:iö · >;rt H --j

•H •f H* G S

J* Ai « 05 ·§ I tts . § . 31¾ S3 t * £

•P ^ H H

5i 4« ft G (ö

o) m η~-> ..0) i -H

M -H G_ ^ :«J ¥ 05 -P G ~ H d G S 55 ^ -n Id) m -U m (0 H 3

Q) :<Q tri (G /» H SH S (U > -P I >i(B

G -r -PAi i |h G H 5 05 G H Si cr> 1 ftsft a®0 3 s ss!!° la % , *> s ||.ag e 3 " / Is =* * / p i «iiis 11 / -gn "* h ^ Sj h +j g g

H H f Stl «V W< »-§<3 H

a·t II K lilii il , \ gII i> 0 O U S I0H S & li Q II λ λ H l 3 n m* h

Hl KM-* H

p) 0) m fcLti 4 88398

Paitsi että trombiinilla on keskeinen vaikutus fibriinihyy-tymän muodostumisessa, kuten edellä on esitetty, trombiini on avaintekijä verihiutaleiden kasautumisessa trombogeneesi-tapauksessa, kuten on kuvattu esimerkiksi julkaisuissa 5 H. J. Weiss, "Platelets: Pathophysiology and Antiplatelet Drug Therapy" Ch. 1 (liss, New York, 1982 ) tai D. Ogsten ja B. Bennett (toim.) "Haemostasis: Biochemistry, Physio logy and Pathology" Ch. 13 (Wiley, 1977).

Yksityiskohtia ei täysin tunneta, mutta trombiini on "veri-10 hiutale-reaktion" voimakkain aiheuttaja (muodon muutos, kasautuminen, tiivisjyväisyys ja a-jyväs-eritys) ollen vastuussa primäärisestä hemostaasista (verenvuodon tyrehtyminen). Trombiinin vaikutusta edeltää sen vuorovaikutus spesifisen sidosproteiinin kanssa verihiutalemembraanissa ja myös tämän 15 keksinnön mukaiset inhibiittorit näyttävät häiritsevän tätä sitoutumista.

Täten trombiinin spesifisten inhibiittoreiden odotetaan toimivan erittäin tehokkaina anti-tromboottisinä aineina ja/tai anti-koaguloivina (hyytymistä estävinä) aineina, jol-20 loin saadaan vaihtoehtoisia aineita olemassa oleville terapeuttisille ja profylaktisille aineille. Esimerkiksi hepa-riinia on laajalti käytetty trombooseja vastaan, mutta siihen liittyy suuri verenvuotoriski, se on tehoton monissa olosuhteissa ja antaa vaihtelevan reaktion eri potilailla ja eri 25 aikoina samallakin potilaalla, joten vaaditaan huolellista tarkkailua. Oraaliset, anti-koaguloivat aineet, joita käytetään erityisesti ennalta ehkäisyssä ja laskimotromboosien kontrolloinnissa, tarvitsevat aikaa kehittääkseen vaikutuksensa ja niitä häiritsevät useat muut lääkkeet. Tämän kek-30 sinnön mukaiset inhibiittorit toimivat heti ja niiden spesifisyyden ja kemiallisen luonteen takia voidaan odottaa, ettei niihin liity sivuvaikutuksia tai lääkkeiden kanssa tapahtuvaa vuorovaikutusta. Edelleen toimiessaan vain trombiinin estoaineena verihiutalehyytymisessä, ne jättävät kolia- 5 88398 geenin estoaineen käyttökelpoiseksi suojaamaan verenvuodolta. Annostaminen on yksinkertaista, esimerkiksi ne annostetaan intranasaalisesti.

On tunnettua, että trombiinin useimmat affiniteettikohdat 5 ovat fibrinogeenin N-terminaaleissa (8-20) osassa ja että tämän alueen osittaissekvenssit sitoutuvat lujasti entsyymiin, joka hydrolysoi ne nopeasti. Erityisesti trombiini vaikuttaa fibrinogeenin A a-ketjuun -Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-Arg-Gly-Pro-Arg-Val- 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 16 17

Arg ja Gly välillä, poistaen N-terminaalisen heksadeka-10 peptidiosan (fibrinopeptidi A). Sen jälkeen tapahtuu taas

2 Q

trombiinin vaikutuksesta lohkeaminen tähteiden Arg1^ ja Vai välillä, tämä tapahtuu paljon hitaammin, tripeptidiosan edelleen lohjetessa. Entsyymi poistaa myös fibrinogeenin B^-ket- jun N-terminaalisen tetradekapeptidiosan (fibrinopeptidi B) 14 15 15 hitaan hydrolyysin tapahtuessa tähteiden Arg ja Gly välillä. Tätä fibrinogeenista tapahtuvaa fibrinopeptidien vapautumista seuraa saadun, monomeerisen fibriinin polymeroituminen "liukoisen" fibriinin muodostuessa. Viimeksi mainitun muuttaa tekijä XHIa sen jälkeen pysyväksi, "liukenemat-20 tomaksi" fibriinigeeliksi, joka transamidaatiolla ristiin- kytkee kahden vierekkäisen fibriinimolekyylin a- tai γ-ketjut.

Tämän keksinnön perustana ovat ihmisfibrinogeenin, joka omaa korkean sitoutumistaipumuksen trombiinin, osittaiset sekvenssit. Nämä substraattiosat modifioidaan korvaamalla helposti 25 lohkeava peptidisidos -CO-NH- (t.s. sidos, jonka trombiini tavallisesti lohkaisee) hydrolysoitumattomalla, isosteeri-sellä sidoksella (esim. keto, -CO-Ci^-, hydroksi, -CH(OH)-CH2~ tai pelkistetyllä, -CI^-NH- sidoksella).

Mahdollisesti substraattisekvenssin muita asemia myös modi-30 fioidaan lisääntyneen sitoutumistaipumuksen aikaansaamiseksi,

6 6 8 3 9 S

esim. liittämällä DPhe fibrinogeenin asemaan 14 ja/tai Pro asemaan 15, kuten aiemmin ovat esittäneet M. Pozsgay et ai. Eur. J. Biochem. 115 941 (1981), tai metabolisen stabiili-5 suuden lisäämiseksi, esim. muita peptidisidoksia isosteeri-sesti korvaamalla tai suojaamalla N-pääte ja/tai C-pääte sopivilla suojaryhmillä.

Yleinen viittaus aminohappoihin ja aminoasyylitähteisiin ja 10 sivuketjuihin on sekä selityksessä että vaatimuksissa ymmär rettävä viittauksena sekä luonnossa esiintyviin että ei luonnossa esiintyviin proteiineihin ja sekä D- että L-muo-toihin ja aminohapolla tarkoitetaan myös aminohappoa. Kaikki asymmetriset keskukset voivat olla joko R- tai S-konfiguraa-15 tiossa, ellei toisin esitetä.

Tämän keksinnön mukaisesti valmistettavat yhdisteet, jotka omaavat toivotun anti-tromboottisen tai anti-koaguloivan vaikutuksen, ovat seuraavan yleisen kaavan (I) mukaisia 20 (jossa tähteiden numerointi vastaa ihmisfibrinogeenissa käytettyä keksintöä kuitenkaan rajoittamatta).

X-Y-Z-A-Pro-Arg-B-W (I) 14 15 16, 17 18 19 20 25 jossa X on peptidikemiassa tavanomainen N-suojaryhmä ja W on peptidikemiassa tavanomainen karboksyylisuojaryhmä; Y esiintyessään on glysiini, fenyylialaniini tai muu lipofiilinen aminohappotähde; Z on glysiini, N-metyyli-alaniini, väliini, 30 proliini tai proliinin rengashomologi (esim. atsetidiini-2-karboksyylihappo, piperidiini-2-karboksyylihappo); tai Y:n

ja Z:n välinen sidos on muotoa R

Y-Z

35 X

jossa peptidisidos -CO-NH- Y:n ja Z:n välillä on pelkistetty (ja suojattu) muotoon -CH2-N(X)-, jossa X tarkoittaa edellä määriteltyä suojaryhmää; ί 88398 t A on "hydroksi"- 1 2 13 2

R R R R R

II III

5 (-NH-CH-CH-CH^CH-CO-), "pelkistetty" (-NH-CH-CH -N-CH-CO-) OH

1 2

10 R R

I I

tai mieluimmin "keto"- (NH-CH-C-CH -CH-C0-) -dipeptidiana- II 2 o 15 logitähde, jossa R3 on mikä tahansa edellä määritelty ryhmä X ja R1 ja R2 ovat sellaisia ryhmiä, että dipeptidianalogi-tähteessä ensimmäinen tähde on joko arginiini tai siinä on sivuketjuna arginiinin pääteamidinoryhmä ja toinen on gly-20 siini tai alaniini; Arg tai Pro ja Arg voivat puuttua tai ne voivat olla substituoidussa muodossa; B esiintyessään on D-tai L-valiini tai D- tai L-proliini; ja jossa mahdollisesti pääteryhmät ovat sitoutuneet, peptidisidoksella muodostaen syklisen rakenteen.

25

Yksityiskohtaisemmin kaavassa (I) mieluimmin X = H tai suojaryhmä, mukaan lukien alempialkyyli (C-^Cg) tai aromaattinen asyyli, esim. Ar-(CH2)n-C0- tai Ar-O-(CH2)n-C0-, joissa n = 0-2, ja Ar on fenyyli tai muu (mukaan lukien mo-30 no- tai bisyklinen) aromaattinen ryhmä, joka voi olla subs-tituoitu, erityisesti monosubstituoitu, yhdellä seuraavista ryhmistä, mieluimmin (kun se on fenyyli) 2- tai 4-asemassa: F, Cl, Br, I, -CF3, -OH, -OR tai -R (R = C-j^Cg-alkyyli) tai R-O-CO-, jossa R = tert.-butyyli, Ar-alkyyli (esim. bentsyy-35 li), 2,2,2-trikloorietyyli tai R6-S02-, jossa R6 = Ar (esim. Ph, a-naftyyli, β-naftyyli) tai muu lipofiilinen ryhmä tai yksi tai useampi aminoasyylitähde joko sellaisenaan tai suojatussa muodossa sisältäen edellä esitetyn ryhmän X; 40 Y puuttuu tai on glysiini tai D- tai L-fenyylialaniini tai muu lipofiilinen aminohappotähde (esim. Phg, Cha, α-Nal, β-Nal, p-jodifenyylialanyyli);

Il 88398 Z = L- tai U-proiilni t:ai ptroJiinin renyashoiitoloy i (esim. aleel IdiJ ui.-2-ka iboksyy I i happo, pi per i d i i π i - λ ka i boksyyI i happo) tai ],· tai n-vnlilnl tn 1 N-melyylI-nlan 1in I lal «ily-siitii 5 tai Y ja Z oval. 11

Y-Z

X

10 jossa peptidi sidos -CO-NH- Ytn ja Z:n välillä on pelkistetty (ja suojattu), jolloin saadaan -CII7-N(X)- Xjh tarkoillaessa edellä määriteltyä suojaryhmää, A - (1) R1 R2

I I

-NH-CII-C-CH2-CH-CO- "keto "-isos teeri (II)

* I

0 (2) Rl r2 I * -NII-Cll-CII-Ullj-CII-CO- •livdcokfll'-lsoeteeil (111) * I *

OH

(3) R1 R3r2 -NH-CH-CH2-!i-<!:h-CO- "pelkistetty"-leoeteeri (IV) h * jossa > (i) R1 - -(CII2)n-NH-C-NH2 n - 2-4

Ih tai |ll ) “(cH2 )m--C-NH2 ) ) jossa m * 0-2 NH ) I ) ——-C-WH2 ) tai -(CH2)m—) 9 88398 (ii) R2 = H, alempialkyyli (C^-C^) tai 1-hydroksietyyli

(iii) R3 = mikä tahansa edellä määritelty ryhmä X

(iv) konfiguraatio asymmetriakeskuksissa * on joko R tai S 5

Arg tai Pro ja Arg voivat puuttua, B = D- tai L-valiini tai D- tai L-proliini tai puuttuu, W = -OH sellaisenaan tai suojatussa muodossa, mukaan luki-10 en -OR4, jossa R4 = alempialkyyli (C^-Cg) tai -NH2 sellaisenaan tai suojatussa muodossa, mukaan lukien -NHR5 tai -NR52, joissa R5 = alempialkyyli {C1-C5) tai R52 = sykloalkyyli-(CH2)n" 1 jossa n * 3-5 ja rengas on mahdollisesti substituoi-tu karboksyylillä -COOH ja/tai alkyyli (C^-Cg) - ryhmällä 15 (-ryhmillä), B-W tarkoittaa B:n aminoalkoholijohdannaista sellaisenaan tai suojatussa muodossa tai jäännöstä, jossa esiintyy yksi tai useampi muu aminoasyyliryhmä ja jolloin edelleen maini-20 tuissa, kaavan (I) mukaisissa yhdisteissä (erityisesti niissä, jotka ovat ekvivalentteja heksapeptidin kanssa) kaksi pääteryhmää ovat mahdollisesti sitoutuneet peptidisidoksella muodostaen syklisen rakenteen.

25 Erityisesti edellä esitetyssä yleisessä kaavassa il) ryhmät saavat seuraavat merkitykset: X = H, alempialkyyli (C^-C^) tai muu suojaryhmä, esim. alem-piasyyli tai R-0-C0-, jossa R « tert.-butyyli, bent- 30 syyli, 2,2,2-trikloorietyyli tai aminoasyylitähde, joko sellaisenaan tai suojatussa muodossa, Y = D- tai L-fenyylialaniini tai glysiini 35 Z = L- tai D-proliini tai L- tai D-valiini 8 8 398 10 A:ssa: - R1 = -(CH2)n-NH-C-NH2, jossa n = 2, 3 tai 4

5 NH

- Rz = H, metyyli, isopropyyli, sek.-butyyli, isobutyyli tai 1-hydroksi-etyyli - R3 = H, alempialifaattinen asyyli (Ci-C5) tai alempialkyyli

10 (C]-C5) tai R-O-CO, kuten tähteenä X

- konfiguraatio asymmetriakeskuksessa * on joko R tai S

Pro ja Arg tai Arg yksin voi puuttua tai ne voivat olla substituoidussa muodossa, esim. Pro substituoitu OH:11a tai 15 Arg zSllä (bentsyylioksikarbonyylillä) tai N02:lla, B = D- tai L-valiini tai D- tai L-proliini tai puuttuu, W = OH tai -0R‘, jossa RA = alempialkyyli (Ci-C5), tai -NH2 tai -NHR5 tai -NR52, joissa R5 = alempialkyyli (C^-Cs) tai 20 R52 = alempisykloalkyyli -(CH2)n-, jossa n = 3, 4 tai 5.

Tällaiset peptidianalogit voivat olla niiden fysiologisesti hyväksyttävien happoadditiosuolojen tai muiden johdannaisten muodossa, jotka ovat kehossa muutettavissa aktiiviseksi yh-25 disteeksi (kuten niiden vaikutus osoittaa). Tällaiset fysiologisesti hyväksyttävät johdannaiset kuuluvat yhdisteiden määritelmään tässä esitetyssä selityksessä ja vaatimuksissa.

n 88398

Suojaavat tai substituoituvat ryhmittymät voivat olla mitä tahansa polypeptidialalla tunnetuista, joita esiintyy runsaasti kirjallisuudessa eivätkä vaadi tässä lähempää tarkastelua. Yleensä ryhmien valinta riippuu niiden funktiosta, 5 joidenkin tarkoituksen ollessa ensi sijassa suoja ta ei-toivo- tulta reaktiolta synteesivaiheiden kuluessa, kun taas N- ja C-terminaaliset substituentit ovat esimerkiksi tarkoitetut suojaamaan eksopeptidaasihyökkäykseltä lopputuotteissa tai lisäämään yhdisteiden liukoisuutta tai lipof1 ilisuuLta ja si-10 ten fysiologista hyväksyttävyyttä. Nämä kaikki funktiot esiintyvät yleensä termin "suojaryhmä" tai vastaavan alla sekä selitysosassa että vaatimuksissa.

15 Esimerkit

Seuraavat yksityiskohtaiset esimerkit kuvaavat keksintöä, esimerkkien tekstiä seuraa taulukoidut reaktiokaaviot. Esimerkit I - VI on esitetty yksityiskohtaisesti, joiden jälkeen 20 seuraavat lyhyemmät esimerkit VI1 - XVI.

Esimerkki I , IDLJy

H - 163, Boc - DPhe - Pro - Arg - Gly - Pro - OH

Yhdisteen H-163 synteesi suoritettiin kaavion I mukaisesti. Alleviivatut arabialaiset numerot (esim. 1_) viittaavat raken-25 teisiin näissä kaavioissa. Suluissa olevat arabialaiset numerot esim. (1) viittaavat reaktiovaiheisiin.

ci G G

(1) N -formyyli-N^,N -di(bentsyylioksikarbonyyli)-L-arginii-ni J_ saatiin Na-formyyli-L-arginiinista Smithwickin ja Shu-manin menetelmällä (J. Org. Chem. 1974, 3j), 3441 ), saanto oli 12 ö 8 3 S 8 62 %, tai formyloimalla H-Arg(Z2)_0 K+ muurahaishappo-piva-liinihappoanhydridillä (60%) .

(2) Oksatsoloni 2. HCO-Arg (Z2)-OH (1 mmoolia) liuotettiin kuivaan THF-Cl^C^ :een (1:5) ja syklisoitiin käsittelemällä 5 DPEC1.HCl-suolalla (1,1 mmoolia) 0°:ssa 2 tunnin ajan. Oksatsoloni 2 eristettiin vaalean keltaisena öljynä.

(3) , (4) ja (5) Oksatsoloni 2 (1 mmoolia) kuivassa THF:ssä 0°:ssa asyloitiin meripihkahappohemiesterikloridilla .3 d»1 mmoolia) Et^Nrn (1,2 mmoolia) läsnäollessa. Reaktioseosta 10 hämmennettiin 22°:ssa 2 tunnin ajan, haihdutettiin, jäännös liuotettiin pyridiiniin ja käsiteltiin DMAP:llä (20 mg) 22°: ssa 90 minuutin ajan. Lisättiin AcOH:ta (2,5 ml) ja punainen liuos jätettiin 22°:n lämpötilaan 16 tunnin ajaksi. Haihdutettiin, jonka jälkeen raakatuote uutettiin etyyliasetaatil-15 la, kromatografoitiin piihapolla, eluointiaineena EtOAc-pet-rolieetterillä, jonka jälkeen saatiin puhdas trikloorietyy-liesteri 6 värittömänä öljynä (27 % yhdisteestä 1_) .

(6) Trikloorietyyliesteriryhmä poistettiin yhdisteestä 6 (1,2 mmoolia) käsittelemällä 0°:ssa THFrssä (25 ml) Zn-jau- 20 hoe.I .la (2,4 g) ja kylmällä 1 M Nal^PO^: 1 lä (6,5 ml) 2,5 tunnin ajan. Raakatuote uutettiin EtOAc:lla ja kiteytettiin EtOAc-petrolieetteristä, jolloin saatiin puhdas HCO-Arg(Z2) -Gly-OH 7 (82%).

(7) Suojattu ketoisosteeri 7 (0,189 mmoolia) muutettiin 25 sen Pfp-esteriksi käsittelemällä Pfp-OH:lla (0,2 mmoolia) ja DCCI:llä (0,19 mmoolia) CH2Cl2:ssa (2 ml) 0°:ssa 1,5 tunnin ajan. Tämä Pfp-esteri liitettiin 0°:ssa H-Pro-OMe.HCl-suolaan (1,1 mmoolia) DMF:ssä, joka sisälsi 1Pr2NEt:tä (2,5 ekvivalenttia). Raakatuote kromatografoitiin EtOAc:ssa piiha-

V

30 polla, jolloin saatiin puhdas HCO-Arg(Z^)--Cly-Pro-OMe (8) (80%) värittömänä öljynä.

13 6 8 δ 9 8 (8), (9) Yhdisteen ί) (0,13 ramoolia) formyylisuojaryhmä poistettiin käsittelemällä 1 M !ICl/MeOH:lla (30 ml) 22°:ssa 16 tunnin ajan. Haihduttamalla saatiin H-Arg(Z2)-Gly-Pro-OMe. HC1,_9 , joka liuotettiin DMF:ään ja liitettiin Boc-DPHe-Pro-5 OPfp:hen (0,144 mmoolia) 0°:ssa 1Pr2NEt:n (0,27 mmoolia) läsnäollessa. Käin muodostunut raaka metyyliesteri Y2 puhdistettiin kromatograafisesti piihapolla EtOAc:ssä ja saatiin väritön öljy (70 %).

(10), (11) Metyyliesteri V2 (0,04 mmoolia) MeOH:ssa (0,9 10 ml) käsiteltiin 1 M KOH:lla (0,1 ml) 1,5 tunnin ajan 22°: ssa,esteriryhmän ja toisen Z-suojaryhmän poistamiseksi.

*

Raakatuote puhdistettiin HPLC:llä, Lichroprep RP18, gra-dienttina MeOH ja 5 % AcOH, jolloin saatiin puhdas peptidi-happo JT3 (26 mg). Viimeksi mainittu liuotettiin MeOH-AcOH-15 K20-seokseen (5:1:1) ja hydrattiin 5 % Pd/C:llä, jolloin saatiin puhdas H-163-yhdiste. TLC ja HPLC osoittavat, että läsnä on kaksi epimeeriä. TCL piihapolla CHCl^-MeOH-AcOH-seoksessa (6:2:1) R^ 0,19 ja 0,22. Aminohappoanalyysi, sen jälkeen kun yhdistettä on hydrolysoitu 110 /18 tuntia 6 N 20 HC1:llä: Pro, 2,0; Phe 0,99.

Esimerkki II

(DL)

H - 173, H-DPhe - Pro - Arg - Gly - Pro - OH

(katso kaavio I).

(12) Na-Boc-suojattu peptidi H-163 käsiteltiin vesipitoisella 2 M HC1:llä 2 tunnin ajan 22°:ssa. Muodostunut, suojaa-25 maton peptidi H-173 saatiin lyofilisoimalla. Analyysi:

Pro 2,05; Phe 0,95.

Esimerkki III

H—170, Boc - DPhe - Pro - Arg - Gly - Pro - NHEt (D) (katso kaaviot II, V) 14 88 39 8 (1) Suojattu ketoisosteeri 1_ (0,189 mmoolia) muutettiin sen Pfp-esteriksi ja liitettiin H-Pro-NHEt:hen (1,1 ekvivalenttia) Selmalla tavalla kuin edellä esitettiin metyyliesterille esimerkissä I, vaiheessa (7), saatiin etyyliamidi J_5, saan- 5 non ollessa 95ö.

(2) , (3) Yhdisteestä J_5 poistettiin formyylisuojaryhmä käsit- telemällä 1 M HCl/MeOH:11a ja muodostunut N -suojaamaton pep-tidiamidi 1_6 asyloitiin Pfp-esterillä J_1_, kuten esimerkin I vaiheissa (8) ja (9), jolloin saatiin epimeerien 17a ja 17b 10 seos (136 mg, 75%).

(4) Viimeksi mainitut erotettiin kromatograafisesti piihapol-la 5 % MeOH-EtOAc:ssä, jolloin saatiin 56 mg nopeammin liikkuvaa epimeeriä 17a (R^ 0,35, piihappo-TLC-levyllä, MeOH-

EtOAcrssä 1:10) ja 60 mg hitaampaa epimeeriä 17b (R^ 0,30).

15 Yhdisteen _1_7 synteesi riippumattomalla tavalla, joka säilyttää optisen yhtenäisyyden L-arginiinin a-hiiliatomissa (katso kaavio V), antaa tulokseksi hitaasti liikkuvan epimeerin 17b, mahdollistaen epimeerien 17a (nopeasti liikkuva, sisältää D-arginiinin) ja 17b (hitaasti liikkuva, sisältää L-argi-20 niinin) konfiguraation määrittämisen. Yhdisteen 17a hydraus 5% Pd/C.llä tuotti Boc-suojatun pentapeptidietyyliamidin H-170. TLC piihapolla CHCl.j-MeOH-AcOH-seoksessa (6:2:1) R^ 0,39. Aminohappoanalyysi, sen jälkeen kun on hydrolysoitu 110°/18 tuntia 6 N HCl:llä: Pro 2,04; Phe 0,96.

25 Esimerkki IV:

K

H - 179, H - DPhe - Pro - Arg - Gly - Pro- NHEt ^ (katso kaavio II) (4) Yhdisteen li-170 synteesin vaiheessa (3) saadun , hitaasti liikkuvan epimeerin 17b hydraus tuotti Boc-pentapeptidi-amidin H-171. Viimeksi mainittu käsiteltiin 2 N HCl:lla 22°: 30 ssa 2 tuntia ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin yhdiste H-179.

'5 88398 TLC piihapolla CHCl-j-MeOH-AcOH-seoksessa (6:2:1) Rf 0,15. Aminohappoanalyysi: Pro 2,00; Phe 1,00.

Esimerkki V

K

K - 200, I-I-DPhe - Pro - Arg - Gly - Pro - Arg - Val - NHEt (L) 5 Tämän yhdisteen synteesi suoritettiin kaavion mukaisesti.

(1) H-Val-NHEt.HC1 (3 mmoolia) C^Cl^sssa 0°:ssa, asyloitiin Boc-Arg(Z2Ϊ-OPfp:llä (2 mmoolia) 1Pr2NEt:n (2 mmoolia) läsnäollessa, jolloin saatiin, tavanomaisen työskentelyn jälkeen, suojattu dipeptidietyyliamidi 2J3 (98 %) .

10 (2), (3) Yhdisteestä 2J3 (1,87 mmoolia) poistettiin suojaus käsittelemällä HCl/EtOAc:11a ja asyloitiin Boc-Pro-OPfp:llä (3 mmoolia) DMF:ssä 0°:ssa ^T^NEt^ (1,87 mmoolia) läsnäollessa. Työskentelemällä tavanomaiseen tapaan, saatiin suojattu tripeptidietyyliamidi 2T_ (80 %).

15 (4), (5) Yhdisteestä 27 (0,587 mmoolia) poistettiin suojaus HCl/EtOAc:llä ja saatettiin reagoimaan DMF-liuoksessa 0°:ssa 1Pr2NEt:n läsnäollessa Pfp-esterin 2J3 kanssa (valmistettiin yhdisteestä 7 DCCI:llä), jolloin saatiin suojattu pentapep-tidietyyliamidi 3Ό (95%).

20 (6), (7) Yhdiste 3^) (0,17 mmoolia) deformyloitiin 1 N IICL/

MeOH:lla ja hydrokloridisuola 3_1_ eristettiin haihduttamalla ja kuivaamalla KOH-rakeiden päällä. Sen jälkeen yhdiste saatettiin DMF:ssä 0°:ssa reagoimaan Pfp-esterin 1_1[ kanssa 1Pr2 NEt:n (2 ekvivalenttia) läsnäollessa. Epimeerien 32a ja 32b 25 seos eristettiin reaktiosta, käyttäen standardimenetelmiä.

(8), (9) Epimeerit 32a ja 32b erotettiin kromatograafisesti piihapolla MeOH-EtOAc-seoksessa (1:40) ja L-epimeeri 32a hydrattiin MeOH-AcOH-f^O-seoksessa (5:1:1) 5 % Pd/C:llä, jolloin saatiin Boc-suojattu heptapeptidietyyliamidi 33a.

is 8 8 393 (10) Yhdiste 33a käsiteltiin 2 N HCl:llä 22°:ssa 2 tuntia. Lyofilisoimalla saatiin puhdas H-200. TLC piihapolla: R^ 0,10 CHCl-j-MeOH-AcOH-seoksessa (6:2:1). Analyysi: Arg 1,10; Phe 0,99: Pro 2,07; Vai 0,83.

5 Esimerkki VI

<L)

R

H-172, Boc - DPhe - Pro - Arg - Gly - Pro - OH

Tämä yhdiste valmistettiin kaavion IV mukaisesti (1) Yhdisteen Boc-Arg (Z2) _H 1_8 synteesi suoritettiin menetelmän mukaan, jonka ovat esittäneet A. Ito et ai., Chem.

10 Pharm. Bull. 1 975, 2_3 3081), pelkistämällä Boc-Arg (Z2) -OMe di-isobutyyli-aluminiumhydridillä (1Bu2ÄlH) tolueenissa. Puhdas aldehydi J1_8 saatiin kun yhdiste puhdistettiin kroma-tografoimalla nopeasti piihapolla, saanto oli 50 %.

(2) Yhdisteen H-Gly-Pro-OBzl 1_9 valmistus. Boc-Gly-OH lii-15 tettiin seka-anhydridin kautta (valmistettiin isobutyyliklo- roformiaatista ja NMM:stä) proliini-bentsyyliesteriin. Saatu Boc-Gly-Pro-OBzl käsiteltiin HCl/EtOAc:llä Boc-ryhmän poistamiseksi ja näin muodostunutta, yhdisteen _19_ HCl-suolaa käytettiin pelkistävässä alkylointivaiheessa (3).

R

20 (3) Boc-Arg (Z2)-Gly-Pro-OBzl, 2JD. Aldehydin J1J3 (3 mmoolia) ja H-Gly-Pro-OBzl:n 1_9 (3 mmoolia, saatiin HCl-suolasta NMM:llä) annettiin reagoida kuivassa THF:ssä 5 A molekyyli-seulan (10 g) läsnäollessa -10°:ssa 4 tunnin ajan. Näin muodostunut Schiffin emäs pelkistettiin NaCNBH^lla (3 mmoolia) 25 metanolissa -10°:ssa. Puhdas tuote 2£ eristettiin kromato-grafoimalla piihapotta EtOAcrssä saannon ollessa 44 %.

(4) Boc-Arg-(Z„) —-Gly-Pro-OBzl, 2K Pelkistetty peptidi ^ 1

Troc 20 (0,6 mmoolia) TUFrssä (40 ml) asyloitiin 2,2,2-trikloori-etoksikarbonyylikloridilla (Troc-Cl, 0,7 mmoolia) NMM:n (0,7 17 8 8 399 mmoolia) läsnäollessa -15°:ssa. Raakatuotteen piihappogeeli-kromatografointi EtOAcissä tuotti puhtaan yhdisteen 21, saannon ollessa 58 %.

(5) Boc-DPhe-Pro-Arg(Z~)--Gly-Pro-OBzl, 23. Suojattu,

* I

Troc 5 pelkistetty tripeptidi 2_1_ käsiteltiin IICl/EtOAc: llä Boc-suo-jaryhmän poistamiseksi ja saatu N-suojaamaton yhdiste Z2 (0,32 mmoolia) asyloitiin Boc-DPhe-Pro-OPfp:llä (0,32 mmoolia) kuivassa DMF:ssä ‘''P^NEtzn (0,32 mmoolia) läsnäollessa. Raakatuotteen piihappokromatografointi EtOAc-bentseenissä 10 tuotti puhtaan yhdisteen Z3 (45%) .

(6) Troc-ryhmän poistaminen yhdisteestä 2^3 antaa tulokseksi välituotteen 2£. Täysin suojattu, pelkistetty pentapeptidi 23 (0,03 mmoolia) liuotettiin jääetikkaan (0,8 ml) ja käsiteltiin sinkkijauheella (0,6 mmoolia), typpiatmosfäärissä 15 3 tunnin ajan. Kromatografoimalla raakatuote piihapolla saatiin puhdas yhdiste 24^, saannon ollessa 47%.

(7) Yhdisteen H-172 valmistus. Vaiheessa (6) saatu yhdiste 24 liuotettiin MeOH-AcOH-H-O-seokseen (5:1:1) ja hydrat- ^ * tiin 5 % Pd/C:llä 3 tunnin ajan. Raakatuotteen HPLC Partisil 20 10 ODS II:lla 64 %:ssa MeOH-H20-seoksessa, joka sisälsi 0,2 % muurahaishappoa, tuotti puhtaan yhdisteen H-172. TLC piihapolla Et0Ac-Py-Ac0H-H20-seoksessa (30:20:6:11) R^-arvo = 0,25. Hydrolysoitiin 110°/18 tuntia 6 N HCl:llä, saatiin Phe 0,96; Pro 2,04.

25 Esimerkki VII

40 H-DPhe-Pro-Apa —-— Gly-Pro-NHEt i 2-(4 -amidinofenyyli)-alaniini (Apa) valmistettiin soveltaen menetelmää, jonka ovat esittäneet G. Wagner et ai. (Pharma-zie, 1981, J6, 597) ja muutettiin tavanomaisilla menetelmil-30 lä U)N-bentsyylioksikarbonyyli-aN-formyyli-johdannaiseksi .

18 8 8 393

Viimeksi mainitulle yhdisteelle suoritettiin reaktiot, jotka on kuvattu vastaavalle arginiinijohdannaiselle kaavioissa I ja II, jolloin saatiin yhdiste 4JK Vaihtoehtoisesti reaktiot voidaan suorittaa 3- tai 4-syanofenyylialaniinille ja vii-5 meksi mainitun yhdisteen sivuketju muutetaan Apa- tai Amp-sivuketjuksi synteesin lopussa VJagner-menetelmällä.

Esimerkki VIII

4 1 8Nas-Pro-Arg—-—Gly-'Pro-NHEt

Naftaleeni-2-sulfonyylikloridi (8Nas-Cl) saatettiin reagoi-10 maan L-proliinin natriumsuolan kanssa Schotten-Baumann- reaktio-olosuhteissa, saatiin ^Nas-Pro-OH. Viimeksi mainittu yhdiste muutettiin pentafluorifenyyliesteriksi ja saatettiin reagoimaan osittain suojatun tripeptidianalogin J_6 kanssa. (Kaavio II), saatiin yhdiste 41.

15 Esimerkki IX _ 42 H-Ipa-Pro-Arg —--Gly-N \

Tert-butyylioksikarbonyyli-4-L-iodofenyylialaniini(Boc-Ipa- OH) liitettiin L-proliini-natriumsuolaan pentafluorifenyyli-

aktiivi esterin kautta ja sen jälkeen saatu Boc-Ipa-Pro-OH

K

20 liitettiin H-Arg(Z2)-Gly-piperididiin. Tuotteen L-epimeeri (Arg a-hiiliatomissa) erotettiin kromatografisesti ja suojaus poistettiin, ensin hydraamalla palladium-hiilikataly-saattorin läsnäollessa, jonka jälkeen käsittelemällä 2 M HC1: llä, saatiin yhdiste 42.

25 Esimerkki X

43 PhOCH2CO-Pro-Arg ——Gly-Pro-NHEt L-proliini N-asyloitiin fenoksiasetyylikloridilla ja asyyli-yhdiste liitettiin, pentafluorifenyyliesterin kautta, yhdisteeseen J_6 (kaavio II), kuten esitettiin esimerkissä VIII.

19 88 393

Esimerkki XI

44 H-DPhg-Pro-Arg—-—Gly-Pro-NHEt Tämä yhdiste valmistettiin menetelmällä, joka on kuvattu esimerkin IV kaaviossa II, paitsi että tert.butyylioksikarbo-5 nyyli-D-fenyyliglysiini-pentafluorifenyyliesteriä (Boc-DPhg-OPfp) käytettiin Boc-DPhe-OPfp:n sijasta.

Esimerkki XII

45 Ac-NHCH2CH2-N(COPh)-CH(1Pr)-CO-Arg-^-Gly-Pro-NHEt Tämä analogi syntetisoitiin kaaviossa VI esitetyn menetelmän 10 mukaisesti.

Esimerkki XIII

46 H2N-CH2CH2-N(^Nas)-CH(iPr)-CO-Arg—Gly-N

CiOOH

Ylläoleva yhdiste syntetisoitiin kaavion VII mukaisesti. Esimerkki XIV

47 DPhe-Pro-Arg-^-Gly-Pro-NH-CH2-CD

Tämän syklisen peptidiunalogin synteesi on esitetty kaaviossa VIII.

Esimerkki XV

48 «<Nal-Val-Arg—Gly-Pro-NH-CH2CH2-CO

Tämän syklisen peptidianalogin valmistus on kuvattu kaaviossa IX.

20 883S8

Esimerkki XVI

OH

H-248 H-DPhe-Pro-Arg—-—Gly-Pro-NHEt (L)

Edellä esitetty analogi, jolla uskotaan olevan S-konfiguraa-tio hiiliatomissa, johon hydroksyyliryhmä liittyy, valmistetaan esimerkin IV yhdisteestä H-179 pelkistämällä ketoryh-mä natriumsyanoboorihydridillä ja erottamalla saatu R- ja S-5 epimeerien seos.

Synteesikaaviot 21 88399 KAAVIO I (Esimerkit 1, 2, 7)

R . -(CH2)3-N(Z)-C=NH

NH-Z

R H

* DPECI rt/10 HCO-NH-CH-CO K —-- Yi l (2) 2 CH_-COCl I 2 (3) '

CH2-C02CH2CC13, Et N

(katso alla- R C0CH2CH2C02CK2CC13 r olevaa)

Xo DMÄ/Py li " ΠΠ Jl-ö H ' H ' 5 (5) py·Ac0H» Δ ^ (6)

R Zn/THF- H

HCO-KH-CH-COCH--CH_CO_CK_CCl Ν*Η2ΡΟ** HCO-NH-CH-CQCHo-CH,,C0 11 . 22223 222

6 DL 27% yhdisteestä 2 ~100^ -HCO-ArsiZgJ^Gly-OH

**“ · D,t

Yhdisteen 3 synteesi

O

rA 100o CH -CO H (C0C1) I O ♦ Cl CCH OH —^ | 2 3 ch2-co2ch2cci3--- 2 o 75* 92?; 22 8 8 398 KAAVIO I (jatkuu) f»

Boc-DPhe-OPfp H-Pro-0"Na+ H C O - Ai- g—G1 y - OH

V" 1

(i) PfpOH/DCCI

(ii) H-Pro-OMe l2

Boc-DPhe-Pro-OH HCO-Xrg^Cly-Pro-OMe 12 8

Pfp-OH/DCCI lM HCl/MeOH

(8) f* '

Boc-DPhe-Pro-OPfp H-Arg^ily--Pro-OMe — 1 ί2κ

Boc-DPhe-Pro-Ar g—Gly-Pro-CMe 12a ♦ 12b (10) OH"

Z

I K

Boc-DPhe-Pro-Arg—Gly-Pro-OH

Hi * Π* (11) VPd k H*

Boc-DPhe-Pro -A-rg—Gly-Pro-OH -·- H- 17 3 (12) ΤΓ

H-163 DL

23 88393 KAAVIO II f Esimerkit 3, 4, 7, 8, 10, 11) \ .

Boc-DPbo-OPfp H-Pro-0 N· HCO-Arj-Gly-OH

V 2 O,L I(1) PfpOH/DCCX

tl) (ii)H-Pro-NHEt

h I

Boc-DPh·-Pro-OH HCO-Arg-Gly-Pro-NHEt 11

JO Pfp-OH/OCCI lMHCl/HtOH

** I

Boc-DPh·-Pr©-OPfp H-Arf-Gly-Pro-NHEt 11 li I2

Boc-DPhe-Pro-Arj-Gly-Pro-NHEt 17« ♦ 12b (D,L) (i)(epimeerien erottaminen) i4) (ll)He/rd

Boc-DPhe-Pre* Ar g*Cly-Pro-NHEt Boo-DPb·-Pro-Arf^Gly-Pr ©-NMEt H-170 (l>) H-171

Vi HCl/HjO (5> 2M HCI/HjO

.

H-DPh·«Pr©-Ar I y-Pro-NHE t M DPh*-Pro-Ar*-Gly-Pr· -NfMlFi.

**>» (L) »->78 E 179

KSBM5C

24 8 8398 KAAVIO III (Esimerkki 5) I2

Boc-Arg-OPfp H-Val-NHEt

Boc-Arg-Val-NHEt 15 981 H + (2) ' > I2 .

Boc-Fro-OPfp H-Arg-Va1-NHEt 26 (3i l·

Boc-Pro-Arg-Val-NHEt 27 80S' 1 H + (¾) Z2 Z2 |2 I2 HCO-Arg-Gly-OPfp Η-Pro-Arg-Val-NHEt 28 29 (5) Z2 " Z2 I |2 HCO-Arg^Gly-Pro-Arg-Val-NHEt

:<DL) »X

25 883S8 KAAVIO III (jatkuu) 20

(6) LMHCl/MeOH

2? Zc Cl" + I2 X i2

Boc-DPhe-Pro-OPfp H ^ - Ar g-Gly-Prc- Ar g - V a 1 - N7i E t 11 \y/ 21 <0 L) (7) aPr2NEt U * ?2

Boc-DPhe-Pro-Arg-Gly-Pro-Arg-Val-NKEt 22* ♦ 22b (L) (D) (gj Epimeerien erottaminen piihappogeeIillä

A

32a(L) 32b(D)

(9) H2/Pd-C

• -

K

Boc-DPhe-Pro-Ar g-Gly-Pr o-Arg-Va1-NH£ t m 22*. (l) (10) 2MHC1/H20

♦ K

H^-DPhe-Pro-Arg-Gly-Pro-Arg-Val-NH£t Cl ~ H-200 »l -epimeeri 26 88398 KAAVIO IV (Esimerkki 6)

Boc-Arg-OH

(L) I2

Boc—Arg—OH Boc-Gly—OH Η-Pro—OBzl CH _N„ H-A.

2 2 I2 1

Bo=-Arg-OMe Boc-Gly-Pro-OBzl (1) i + aBu2AlH (2) H+ I2

Boc-Axg-H H-Gly-Pr o-OBzl :8 50% r9 (i) molekyyliseula (3)

(ii) NaCNBH

<1 J

l· E

Boc-Arg-Gly-Pro-OBzl

(20) kW

(¾) Troc-Cl/NMM

Z2 T I R

Boc-Arg—1t—G ly-Pro-OBzl 21 Troc |, Z2 I « H-Arg—r—Gly-Pro-OBzl 22(L)Troc 27 8 8 398 KAAVIO IV (jatkuu) i2 I . jj

Boc-DPhe-Pro-OPfp H-Arg-j— Gly-Pro-OBzl 11 22 Troc (5) iPr2NEt,

DMF

t2 R

Boc-DPbe-Pro-Arg-y—Gly-Pro-OBzl ^5* yhdisteestä 2χ & y ^°C \H2N-Et (6>/ X z yS En/AcOH ^ j2 ^ Boc-D?he-Pro-Arg—Gly-Pro-NHEt Z - Troc

I R

Boc-DPhe-Pro-Arg-Gly-Pro-OBzl Cd/AcOH

2¾ h?X

Ϊ2 R

(7) H_/Pd Boc-DPhe-Pro-Arg—Gly-Fro-f’HEt

Boc-DPhe-Pro-Arg—Gly-Pro-OH Hg/Pd (L) *0* H 172 -H+ Boc-DPhe-Pro-Arg—Gly-Pro-NHEt " Η-DPhe-Pro-Arg—Gly-Pro-OH H* Η-DPhe-Pro-Arg—Gly-Pro-NHEt 28 88398 KAAVIO V (esimerkki 3) Z HoCiCOOBu1^, Z9 CO Bu1 |2 N«H I* 1 *

Troc-Arg-CH^Br -ϋί2-- Tree-Arj-Cl^-CH

tm \ C0_ Bu 2k (L) 22. 2 H*

Pfp-OH z

?2K DCCI ,2 K

Troc-Arg-Gly-OPfp —- Troc-ArS-Gly-OH

il li

HproNHEt Z g Zn, 2 2

Troc-Ärg-Gly-ProNHEt —-- H-Arg-Gly-ProNHEt li li /Bo e—DPhe -Pr o -OPf p 11

Ϊ* K

Boc-DPhe-Pro- Arg-Gly-Pro-NHEt 17¾ (L) 29 8 8 398 KAAVIO VI (Esimerkki 12) Yhdisteen £5 synteesi

Ac-dH-CH^-CED E-Val-OTce

1) -HjO

2) NaCTIEEj ipr i

Ac-flH-CE^CH^-ilE-CH-COOTce 1) FhCOCl

2) Zn/AcQH

^ Z7 i 12 r

Ac^E-CE^CE^—5-CH-COCB E-Ars — Gly-Prc-ί,ΈΖΐ COPh DCCl/EDBt *Pr Z2 i r _

Ac-EE-CEg-CEg-S-CE-CO-Ars — Gly-Pra-iiESt COPh

E^/Pd-C

• lr

Arg· — Gly-Pro-JIEEt COPh 30 8 8 39 3 KAAVIO VII (Esimerkki 13) Yhdisteen 4j> synteesi Z—H-Val-OTce -^0 2) NaCNBHj

Sr i Z-NH-CE2CE2-NH-CE-COOTce 1) ^Nas-Cl

2) Za/AcOH

Sr ?2 Z-^iH-CH^C^-H-is-COOH E-Arg — H'aa ' COOBzl DCCl/HOBt S* z2 I r ^

Z-NH-CHgCE^-N-CH-CO-Arg — Gly-N I

. H1*3 COOBzl

H^/Pd-C

Sr H^N-CH^CH^-N-CH-CO-Axg — Gly-N^j

ft-Nas I

1 COOH

4§ 31 88398 KAAVIO VIII (Esimerkki 14) Yhdisteen AJ_ synteesi ?* *

Bo c -Arg — Gly-OE E-Pro -Gly-OTc e

Pfp-OS/DCCI

Z2 I ^ j

Boc-Arg — Gly-Pro-Gly-OTce ECl/dioksaani ' r

Bo c -BPhe -Pro -0?f p E-Arg — Gly-Pro -Gly-OTc e

Et fc t

Bo c-DFhs-Pro -Arg — Gly-Pro-Gly-OTce

1) Zn/AcOH

2) Pfp-OB/DCCI

f* *

Bo c -BPhe -Pro-Arg — Gly-Pro-Gly-OPfp

1) TFA

2) Et^N, suuri laimennus

3) Hg/Pd-C

E

47 HFhe-Pro-Arg—Gly-Pro-Gly

“ I_I

32 68 398 KAAVIO IX (Esimerkki 15)

Yhdisteen 4j} synteesi h t

Boc-Arg — Gly-OH E-?ro-ÄAla~OTce

?fp-OE/DCCI

h e

Boc-Arg — Gly-Pro-AAla-OTce

El/dioksaani h z öoc-7al-0?fp E-Axg— Gly-?rc-f‘>Ala-CTce

EtjH

2) ECl-dioksaani

Ϊ* E

Boc-Hal-OPfp E-Val-Axg—Gly-?ro-/lAla-OTce

EtjN

i» K

Boc-Sal-Val-Axg — Gly-Pro—/Ula-OTce

1) Zn/AcOH

2) PfpOE/DCCI 4) EtjN, suuri laimennus

3) TFA 5) Hj/Pd-C

9 43 Kal-Val-Axg —Gly-Pro-f Ala

“ I_I

·.

33 88398

Biologinen aktiviteetti

Yhdisteet testattiin in vitro seuraavien aktiviteettien määrittämiseksi käyttäen standardimenetelmiä: (a) Kromogeenlsta substraattia S-2238 hydrolysoivan ihmis- 5 trombiinin inhibitio (menetelmän yksityiskohdat, katso M. F. Scully ja V. V. Kakkar, Clin. Chim. Acta, 1977. 79.595) ♦ Mittaussarjät suoritettiin käyttäen useita erilaisia inhi-biittorikonsentraatioita ja ainakin kahta erilaista substraat-tikonsentraatiota. Inhibiittorivakio K.^ määritettiin graafi-10 sesti käyttäen Dixon-käyrää (M. Dixon, Biochem. J. 1953, 55. 170) (b) Kaoliini-kefaliini-koaguloitumisajän pidentyminen (KCCT; menetelmä katso D.E. G. Austen ja I. L. Rhymes: "Laboratory Manual of Blood Coagulation", Blackwell, Oxford 1975). Tulok- 15 set on ilmoitettu inhibiittorin molaarisena konsentraationa, joka vaaditaan kaksinkertaistamaan KCCT.

(c) Trombiini-indusoidun verihiutalekasautumisen inhibitio (menetelmä, katso G.V.R. Born, Nature 1962. 194.927).

Esimerkkejä I - VI edustavat tulokset on esitetty seuraavassa 20 taulukossa

TAULUKKO

Koodi-I Esim. |Ki ihmistrcm- itans. KCCT:n Ki tranbiinille, joka indu-n:o 1 nro biinille 501 H-163 I 120 226 H-170 III 68 21 0.3 H-172 VI 112 I 813 f H-173 II 30 i 28

. I

H-179 IV 6 j 15

H-200 V 3 I

34 68398

Eräät tässä julkaisussa esitetyt yhdisteet on testattu in vivo, niiden koaguloitumisaikaa pidentävän kyvyn toteamiseksi ja niiden on havaittu omaavan huomattavan aktiivisuuden. Nämä testit suoritettiin kaniineilla, käyttäen 0,1 - 4 mg/kg 5 inhibiittoria ja vertaamalla KCCT:tä tai trombiinin koaguloi-misaikaa verinäytteissä, jotka oli otettu ennen inhibiitto-reiden annostamista ja eri aikavälein annostamisen jälkeen. Yhdiste H-179 esimerkiksi pidentää trombiinin koaguloimis-aikaa 25 sekunnistä 220 sekuntiin annoksella 2,35 mg/kg ja 10 25 sekunnista 280 sekuntiin annoksella 4,7 mg/kg ja on ver rattavissa hepariiniin sekä tehokkuudessa että in vivo puo-liintumisajassaan plasmassa (18 minuuttia; hepariini 15 minuuttia) .

Kuten edellä jo huomautettiin tämän keksinnön mukaisia yh~ 15 disteitä voidaan käyttää ennalta ehkäistäessä tai hoidettaessa sairauksia, joihin liittyy ei-toivottua trombogeneesia, esimerkiksi hyvin tunnetun hepariinin käytön sijasta. Annokset vaihtelevat inhibiittorin tehokkuuden ja toivotun vaikutuksen mukaan, ja annostusfrekvenssi riippuu inhibiittorin 20 kestoajasta kehossa, mutta annokset ovat mieluimmin 0,01 -10 mg/kg, esimerkiksi 0,75 mg:n - 0,75 g:n annosyksikköinä. Erityisesti esimerkiksi yhdistettä H-179 voidaan antaa 1 mg:n annoksina joko parenteraalisesti tai oraalisesti.

Käytetyt lyhenteet

AcOH etikkahappo

Boc tert.-butyylioksikarbonyyli 1Bu2A1H di-isobutyyli-aluminiumhydridi

Bzl bentsyyli DCCI N,N'-disykloheksyyli-karbodi-imidi DCU N,N’-disykloheksyyliurea DMAP 4-dimetyyliamino-pyridiini DMF dimetyyliformamidi DPECI N-dimetyyliaminopropyyli-N’-etyyli-karbodi- imidi 35 8 8 398

Ettrietyyliamiini

EtOAc etyyliasetaatti HPLC korkeapainenestekromatografia K keto-isosteeri -COCH2- M.A. seka-anhydridi

MeOH metanoli NMM N-metyyliniorf Oliini nmr ydinmagneettinen resonanssi petrolieetteri petrolieetteri 60-80°

Pfp pentafluorifenyyli 1Pr2NEt di-isopropyyli-etyyliamiini

Py pyridiini R pelkistetty-isosteeri -CH2-NH- TLC ohutlevykromatografia

Troc 2,2,2-trikloorietoksikarbonyyli bentsyylioksikarbonyyli (yksinkertaisesti Z esimerkeissä)

Amp 3-(31-amidinofenyyli)-alaniini

Apa 3-(4'-amidinofenyyli)-alaniini

Ar aryyli: aromaattinen ryhmä, mono- tai bisyklinen

Cha 3-sykloheksyyli-alaniini HOBt 1-hydroksi-bentsotriatsoli aNal 3-(1'-naftyyli)-alaniini 8Nal 3-(21-naftyyli)-alaniini

Phg 2-fenyyliglysiini TFA trifluorietikkahappo

Tee 2,2,2-trikloorietyyli

Tos tosyyli THF tetrahydrofuraani β-Nas naftaleeni-2-sulfonyyli

Ipa 4-jodifenyylialaniini

Claims

36 B 8 39 8
1. Menetelmä peptidianalogien valmistamiseksi, joilla on trombiinia estävä vaikutus ja joilla on kaava (I)
5 X-Y-Z-A-Pro-Arg-B-W (I) 14 15 16, 17 18 19 20 jossa X on peptidikemiassa tavanomainen N-suojaryhmä ja W on peptidikemiassa tavanomainen karboksyylisuojaryhmä; Y 10 esiintyessään on glysiini, fenyylialaniini tai muu lipofii- linen aminohappotähde; Z on glysiini, N-metyyli-alaniini, väliini, proliini tai proliinin rengashomologi (esim. atse- tidiini-2-karboksyy1ihappo, piperidi ini -2 -karboksyy1ihap- po); tai Y:n ja Z:n välinen sidos on muotoa: R
15 Y-Z X jossa peptidisidos -CO-NH- Y:n ja Z:n välillä on pelkistet-20 ty (ja suojattu) muotoon -CH2-N(X)-, jossa X tarkoittaa edellä määriteltyä suojaryhmää; A on "hydroksi"- R1 R2 R1 R3R2 25 | | III (-NH-CH-CH-CH2-CH-CO-), "pelkistetty" (-NH-CH-CH2-N-CH-CO-) OH
30 R1 R2 I I tai mieluimmin "keto"- (NH-CH-C-CH,-CH-CO-) -dipeptidiana- II o 35 logitähde, jossa R3 on mikä tahansa edellä määritelty ryhmä X ja R1 ja R2 ovat sellaisia ryhmiä, että dipeptidianalogi-tähteessä ensimmäinen tähde on joko arginiini tai siinä on sivuketjuna arginiinin pääteamidinoryhmä ja toinen on gly-40 siini tai alaniini; Arg tai Pro ja Arg voivat puuttua tai ne voivat olla substituoidussa muodossa; B esiintyessään on D- tai L-valiini tai D- tai L-proliini; ja jossa mahdollisesti pääteryhmät ovat sitoutuneet peptidisidoksella muodostaen syklisen rakenteen, tunnettu siitä, että 45 menetelmässä dipeptidianalogin, jolla on kaava X-A-W, 37 8 8 398 jossa X, A ja W ovat kuten edellä, annetaan reagoida peräjälkeen aminoasyyli- tai aminoasyylianalogitähteiden kanssa, yksittäin tai kahden tai useamman tähteen esisyntetoidun yksikön kanssa, kunnes kaavan (I) yhdiste on muodostunut. 5
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sillä valmistetaan polypeptidianalo-geja, joilla on kaava (I) l o X-Y-z-A-Pro-Arg-B-W (i) 14 15 16, 17 18 19 20 jossa X = H tai suojaryhmä, mukaan lukien alempialkyyli (Cx-C5) tai aromaattinen asyyli, esim. Ar-(CH2)n-CO- tai Ar-O-15 (CH2)n-CO-, joissa n = 0-2, ja Ar on fenyyli tai muu (mukaan lukien mono- tai bisyklinen) aromaattinen ryhmä, joka voi olla substituoitu, erityisesti monosubstituoitu, yhdellä seuraavista ryhmistä, mieluimmin (kun se on fenyyli) 2- tai 4-asemassa: F, Cl, Br, I, -CF3, -OH, -OR tai -R (R = Cj^-Cg-20 alkyyli) tai R-O-CO-, jossa R = tert.-butyyli, Ar-alkyyli (esim. bentsyyli), 2,2,2-trikloorietyyli tai R6-S02-, jossa R6 Ar (esim. Ph, a-naftyyli, β-naftyyli) tai muu lipofii-linen ryhmä tai yksi tai useampi aminoasyylitähde joko sellaisenaan tai suojatussa muodossa sisältäen edellä esitetyn 25 ryhmän X; Y puuttuu tai on glysiini tai D- tai L-fenyylialaniini tai muu lipofiilinen aminohappotähde (esim. Phg, Cha, α-Nal, S-Nal, p-jodifenyylialanyyli); 30 Z = L- tai D-proliini tai proliinin rengashomologi (esim. atsetidiini-2-karboksyylihappo, piperidiini-2-karboksyyli-happo) tai L-tai D-väliini tai N-metyyli-alaniini tai glysiini : 35 t:ai Y:n ja Z:n välinen sidos on muotoa R Y-Z X - 40 38 8 8 398 jossa peptidisidos -CO-NH* Y:n ja Z:n välillä on pelkistetty (ja suojattu) muotoon -CH2-N(X)-, jossa X tarkoittaa edellä määriteltyä suojaryhmää,
5 A - (1) R1 R2 I I -NH-CH-C-CH2-CH-CO- "keto"-isosteeri (II) * Il o 10 (2) R1 R2 I * I -NH-CH-CH-CH2-CH-CO- "hydroksi"-isosteeri (III) 15 * | * OH (3) R1 R3R2 I I I
20 -NH-CH-CH2-N-CH-CO- "pelkistetty"-isosteeri (IV) * * jossa: 25 (i) R1 = - (CH,)_-NH- C-NH, n = 2-4 II NH 30 tai _ NH ) - (^),^0 V_C-NH2 ) '-' ) jossa m = 0-2
35 NH ) Il ) -^-'C-NH2 ) 4Q ^ -<CH2)m—/O/ > (ii) R2 - H, alempialkyyli (Cx-C4) tai 1-hydroksietyyli (iii) R3 = mikä tahansa edellä määritelty ryhmä X (iv) konfiguraatio asyrametriakeskuksissa * on joko R tai S
45 Arg tai Pro ja Arg voivat puuttua tai ne voivat olla substi-tuoidussa muodossa, B = D- tai L-valiini tai D- tai L-proliini tai puuttuu, W = -OH sellaisenaan tai suojatussa muodossa, mukaan luki-50 en -OR4, jossa R4 = alempialkyyli (C^-Cg) tai -NH2 sellaise- 39 88398 naan tai suojatussa muodossa, mukaan lukien -NHR5 tai -NR52, joissa R5 = alempialkyyli (C^-C5) tai R52 « sykloalkyyli-(CH2)n-, jossa n = 3-5 ja rengas on mahdollisesti substituoi-tu karboksyylillä -COOH ja/tai alkyyli (C^Cg)-ryhmällä (-ryh-5 millä), B-W tarkoittaa B:n aminoalkoholijohdannaista sellaisenaan tai suojatussa muodossa tai jäännöstä, jossa esiintyy yksi tai useampi muu aminoasyyliryhmä ja jolloin edelleen maini-10 tuissa, kaavan (I) mukaisissa yhdisteissä (erityisesti niissä, jotka ovat ekvivalentteja heksapeptidin kanssa) kaksi pääteryhmää ovat mahdollisesti sitoutuneet peptidisidoksella muodostaen syklisen rakenteen.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että valmistetaan polypeptidianalogeja, joissa: X = H, alempialkyyli (C^Cg) tai muu suojaryhmä, esim. alem-20 piasyyli (C^-Cg) tai R-O-CO-, jossa R = tert.-butyyli, bent-syyli, 2,2,2-trikloorietyyli tai aminoasyylitähde, joko sellaisenaan tai suojatussa muodossa, Y = D- tai L-fenyylialaniini tai glysiini 25 Z = L- tai D-proliini tai L- tai D-valiini A:ssa: - R1 = - (CH2)n-NH- C-NH2, jossa n = 2, 3 tai 4
30 H NH - R2 = H, metyyli, isopropyyli, sek.-butyyli, isobutyyli tai 1-hydroksi-etyyli
35. R3 = H, alempialifaattinen asyyli (Cx-Cs) tai alempialkyyli «VCg) tai R-O-CO, kuten tähteessä X - konfiguraatio asymmetriakeskuksessa * on joko R tai S « 88398 Pro ja Arg tai Arg yksin voi puuttua tai ne voivat olla substituoidussa muodossa, esim. Pro substituoitu OH:11a tai Arg Z^-tllä (bentsyylioksikarbonyylillä) tai N02:lla, B = D- tai L-valiini tai D- tai L-proliini tai puuttuu, 5 W = OH tai -OR4, jossa R4 = alempialkyyli (C^-Cg), tai -NH2 tai -NHR5 tai -NR52, joissa R5 = alempialkyyli (C^-Cg) tai R52 = alempisykloalkyyli -(CH2)n-, jossa n = 3, 4 tai 5.
4. Minkä tahansa edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan poly-peptidianalogeja, joissa A on "keto"-isosteeri (II).
5. Minkä tahansa edellisen patenttivaatimuksen mukainen 15 menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan poly- peptidianalogeja, jotka on muunnettu korvaamalla isosteeri-sesti yksi tai useampi jäljellä olevista peptidisidoksista "keto"-, "hydroksi"- tai "pelkistetyllä" isosteerisellä sidoksella. 20
6. Minkä tahansa edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan poly-peptidianalogeja, jotka ovat suojatussa muodossa yhdessä tai useammassa jäljellä olevassa amino-, imino-, amidi- (mukaan 25 lukien peptidi-), guanidino-, hydroksyyli-, karboksyyli- tai muissa funktionaalisissa ryhmissä.
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sillä valmistetaan seuraavia polypep- 30 tidianalogeja: (DL) K Boc-DPhe-Pro-Arg——Gly-Pro-OH tai 35 (DL) K H-DPhe-Pro-Arg—Gly-Pro-OH tai : 40 K Boc-DPhe-Pro-Arg-Gly-Pro-NHEt tai (D) 41 88398 κ H-DPhe-Pro-Arg-Gly-Pro-NHEt tai (L) 5 K H-DPhe-Pro-Arg-Gly-Pro-Arg-Val-NHEt tai (h)
10 R Boc-DPhe- Pro-Arg-Gly- Pro-OH (L)
8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että sillä valmistetaan seuraavia polypep-tidianalogeja: K
20 H-DPhe-Pro-Ara-Gly-Pro-NHEt tai K SNas- Pro-Arg-Gly-Pro-NHEt tai 25 K / \ H - Ipa - Pro - Arg-Gly-N N tai 30 ' ' K PhOCH2CO - Pro - Arg-Gly-Pro-NHEt tai
35 K H - DPhg - Pro - Arg-Gly-Pro-NHEt tai K
40 Ac-NHCH2CH2-N(COPh)-CH(1Pr)-CO-Arg-Gly-Pro-NHEt tai K / H2N-CH2CH2-N(6Nas)-CH(1Pr)-CO-Arg-Gly-Nv tai 45 \_ COOH K DPhe - Pro - Arg-Gly-Pro-NH-CH2-CO tai 50________| K aNal-Val-Arg-Gly-Pro-NH-CH,CH,-CO tai . .·. 55__^z z j 42 88398 OH H - DPhe - Pr o - Arg-Gly - Pro - NHE t (L) 5