CZ427498A3 - Oxidované oligosacharidy - Google Patents

Description

Oxidované oligosacharidy

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká oxidovaných oligosacharidů jako jsou oligosacharidy oxidované regenerované celulosy (ORC). Vynález se také týká použití oxidovaných oligosacharidů v materiálech pro krytí ran a jiných lékařských a farmaceutických aplikacích a způsobů pro přípravu oxidovaných oligosacharidů.

Dosavadní stav techniky

ORC je dlouhou dobu vyráběna a používána v lékařství pro dosažení hemostasy a jako ochranný materiál proti vzniku adhesí po chirurgickém zákroku. Klíčovou vlastností ORC je, že je absorbovatelná po implantaci do těla, zatímco celulosa není.

ORC je resorbována hydrolytickým štěpením polymeru za vzniku malých oligosacharidů, které jsou metabolizovány a eliminovány z těla. Oxidace celulosy za vzniku 10 - 21% karboxylových skupin - vzhledem k hmotnosti celulosy - umožňuje v podstatě úplnou absorpci materiálu v průběhu dvou až tří týdnů po implantaci.

ORC je vyráběna expozicí celulosy oxidačnímu činidlu jako je oxid dusičitý, jak je popsáno v US-A-3122479. Fyzikální forma celulosového materiálu není zásadní. Například, oxidován může být celulosový film, papír, tampon nebo tkanina, za vzniku ORC. Nicméně, komerčně výhodným materiálem je tkaná nebo pletená tkanina. ORC ve formě pletené tkaniny je dostupná pod obchodní známkou SURGICEL pro použití jako absorbovatelná hemostatikum, a ORC je také dostupná pod obchodní známkou INTERCEED pro • · • · · • · · · · « · ··· ···· ·· ···· ·· *· použití jako adhesní bariera.

Jiné polysacharidy než celulosa mohou být také oxidovány za vzniku hemostatických materiálů použitelných v lékařství.

Takové polysacharidy zahrnují mikrobiální polysacharidy jako je dextran, gellan guma a xantanová guma; rostlinné polysacharidy, například agar, škrob, konjac, karagén, guarová guma, inulin a pektin; a polysacharidové deriváty jako je karboxymethylcelulosa, methylhydroxypropylcelulosa, celulosa acetat, methylcelulosa a ethylcelulosa.

Byla navržena kombinace ORC s jinými materiály pro použití jako materiál pro krytí ran. Například, US-A-2517772 (Doub et al.) popisují krycí materiály tvořené z ORC impregnované thrombinem. Nicméně, ORC je signifikantně acidická. Povrchové pH plně vodu nasyceného kousku ORC tkaniny může být nízké až 1,7. Mnoho proteinových činidel, jako je trombin, je vysoce citlivých na kyselé prostředí a jsou inaktivovány ihned po kontaktu s takovou matricí. V souladu s tím Doub et al. uvádí, že ORC by měla být neutralizována před impregnací trombinem.Octan vápenatý, dihydrogenuhličitan sodný, amoniak a alkoholický ethylamin jsou uvedeny jako příklady vhodných neutralizačních činidel, ale Doub et al. upozorňuje, že ORC by neměla být neutralizována na takový stupeň, kdy ztrácí svůj vláknitý charakter po umístění do vody z důvodů rozpouštění nebo tvorby gelu a rozpadu.

EP-A-0437095 popisuje, že použití vodného roztoku dihydrogenuhličitanu sodného pro neutralizaci ORC tkaniny vede k tomu, že tkanina je částečně gelovaná, deformuje se její původní velikost a je velmi slabá s malou integritou. Je

«· ftft ·· ft ftftft • · · · · ftft • · ftftftft ftft ftft uvedeno, že pevnost v tahu tkaniny je příliš nízká pro praktické použití, jako například jako hemostatika. Podobné výsledky jsou získány při použití silně bazických vodných roztoků hydroxidu sodného a hydroxidu amonného. EP-A-0437095 popisuje způsob pro přípravu výrobku z oxidované celulosy, který je stabilní při skladování, nedráždivý a terapeuticky použitelný, kdy způsob obsahuje kroky kontaktování kyselého materiálu z oxidované celulosy s alkoholem a vodným roztokem mírně zásadité soli slabé kyseliny bez chloridu pro zvýšení pH celulosy na 5 až 8; promytí celulosového materiálu se zvýšeným pH alkoholem pro odstranění nadbytku soli a vody; a sušení celulosového materiálu pro odstranění alkoholu.

Podstata vynálezu

Nyní bylo zjištěno, že ORC a jiné oxidované oligosacharidy mohou být částečně hydrolyzovány za mírně alkalických podmínek za zisku oligosacharidů, které mají mnoho výhodných vlastností pro lékařské použití.

V souladu s tím předkládaný vynález poskytuje farmaceutický přípravek pro lokální, orální nebo parenterální podání, který obsahuje oxidovaný oligosacharid mající průměrnou molekulovou hmotnost v rozmezí 1000 až 50000 daltonů.

Konkrétně, přípravek oxidovaného oligosacharidů podle předkládaného vynálezu váže terapeuticky použitelná činidla a taková navázaná činidla mohou být potom uvolňována s vysokým ziskem. Farmaceutický přípravek oxidovaného oligosacharidů podle předkládaného vynálezu může být proto použit, například v hojení ran, pro dopravu takových činidel do místa rány.

• · · · ·· ·» · * ·♦ . ........ · ♦ · • · · » · · » · · • · · · · * · ······ φ · · · · · · «ΦΦΦΦΦ·· ·· ···· ·* *·

Terapeuticky užitečná činidla, která jsou vázána oxidovanými oligosacharidy, zahrnují farmaceuticky aktivní peptidy a proteiny, výhodně růstové faktory jako je PDGF AB, PDGF BB, TGF-Ιβ, TGF-2E, TGF-3S, basický FGF, yselý FGF a snad EGF a TGF-α.

Bez vazby na určitou teorii se soudí, že aniontové karboxylatové skupiny na oxidovaných oligosacharidech tvoří komplexy s kationtovými aminovými skupinami na peptidech a proteinech. Tvorba komplexů s terapeuticky aktivními činidly majícími aniontové skupiny může být také snadno dosažena, například pomocí použití polyvalentních iontů kovů jako je Ca²* nebo Zn²* jako iontového zesilovacího činidla.

Další výhodou farmaceutických prostředků podle předkládaného vynálezu je to, že mohou být v těsné kombinaci s jinými materiály jako jsou proteiny a jiné polysacharidy (s nebo bez chemického zesítění) za vzniku přípravků, které mají nové vlastnosti. Například, oxidované oligosacharidy mohou být kombinovány s kyselinou hyaluronovou, chitosanem, nebo alginatem (zejména alginatem sodným, alginatem vápenatým nebo směsí alginat sodný/vápenatý) za vzniku nových hemostatických prostředků. Alternativně, přípravky oxidovaných oligosacharidů s jinými oligosacharidy, polysacharidy nebo proteiny mohou být použity jako matrice s kontrolovaným uvolňováním pro různá terapeutická činidla jako jsou antiseptika, antibiotika, proteinové růstové faktory, protizánětlivá činidla, analgetika, inhibitory proteinas jako je aprotinin nebo hydroxamové kyseliny. Oxidované oligosacharidy přípravků podle předkládaného vynálezu mohou být ombinovány s požadovaným terapeutickým činidlem v roztoku (kdy terapeutické činidlo je v • 4 roztoku nebo v suspenzi) a oligosacharid může být potom odstraněn z roztoku vhodnými prostředky, za zisku materiálu, ve kterém je terapeutické činidlo v podstatě rovnoměrně rozloženo. Alternativně může být odstraněno rozpouštědlo, například sublimací ze zmraženého stavu.

Oxidované oligosacharidy mohou být také zasíťovány, takže tvoří trojrozměrné struktury. Například, oxidované oligosacharidy mohou být rozpuštěny ve vodě, do které je přidána velmi nízká koncentrace pepsinem solubilizovaného kolagenu. Pokud se potom přidá karbodiimid jako zesíťovací činidlo, tak kolagen působí jako přemosťující skupina mezi oligosacharidy, takže při sublimaci ze zmraženého stavu může být získána trojrozměrná struktura.

Oxidované oligosacharidy přípravků podle předkládaného vynálezu mají výhodně molekulovou hmotnost nejméně 1000 daltonů, a obyčejně méně než 100000. Častěji bude molekulová hmotnost menší než 5000 až 30000 daltonů (Mělo by být jasné, že oxidované oligosacharidy podle předkládaného vynálezu budou obyčejně ve formě smísené populace molekul různé velikosti. V souladu stím, pokud je zde uvedeno, že oxidované oligosacharidy mají molekulovou hmotnost v určitém rozmezí, tak to znamená, že alespoň 90% hmotnosti molekul spadá do uvedeného rozmezí).

V jednom provedení jsou oligosacharidy pro použití v přípravcích podle předkládaného vynálezu odvozeny z nerozpustných oxidovaných polysacharidů a mají takovou molekulovou hmotnost, že jsou rozpustné při neutrálním a alkalickém pH, ale nerozpustné při kyselém pH. Takové oligosacharidy mohou být snadno získány z roztoku pouze • · t

000 00* • 0

0 0

0 0 00 0000 00 snížením pH, což způsobí vysrážení oligosacharidů. Nicméně, alternativně mohou být oxidované oligosachařidy získány z roztoku jeho přenesením do roztoku, který neobsahuje žádné jiné netěkavé sloučeniny a potom odpařením rozpouštědla. Například, oxidované oligosachařidy mohou být izolovány za použití iontoměničové kolony s extrakcí na pevné fázi (jako je kolona s kyselinou fenylboritou jako pevnou fází, předem aktivovaná methanolem a uvedená do rovnováhy ředěnou kyselinou octovou), a potom mohoou být eluovány ředěným (například 0,1 M) roztokem hydroxidu amonného.

Výhodně mají oxidované oligosachařidy použité v přípravcích podle předkládaného vynálezu obsah karboxylové skupiny od 5 do 25% hmotnosti, a lépe od 8 do 14% hmotnosti. Obsah karboxylové skupiny v oligosacharidů je určen následujícím způsobem:

Vzorek oxidovaného oligosacharidů (přibližně 0,2 g) se rozpustí v 0,5 M hydroxidu sodném (5 ml) a přidá se pár kapek 0,1% fenolftaleinového indikátorového roztoku. Nadbytek hydroxidu sodného se zpětně titruje 0,1 M HCI do odbarvení fenolftaleinu (červená na čirou barvu). Nulová hodnota je určena titrací 5 ml 0,1 M hydroxidu sodného s 0,1 M HCI.

Hodnota pro obsah karboxylové skupiny je vypočítána za použití rovnice:

4,5 x (B-S) χ M C = W kde

C = procentuální obsah karboxylu

B = objem standardu HCI pro titraci prázdného vzorku (ml) ·· » 1 «

S = objem standardu HCl pro titraci vzorku (ml)

M = molarita standardu HCl

W = suchá hmotnost vzorku (g) (4,5 = hmotnost karboxylu v miliekvivalentech x 100)

Předkládaný vynález také obsahuje způsob pro přípravu oxidované celulosy, který obsahuje ošetření oxidované celulosy mající molekulovou hmotnost alespoň 50000 (lépe alespoň 100000, například více než 30000) vodným alkalickým roztokem při teplotě a po dobu dostatečnou pro vznik částečné hydrolýzy uvedené oxidované celulosy a potom získání vzniklé oxidované celulosy z roztoku, například pomocí úpravy pH na 7 nebo méně. Alkalickým roztokem je výhodně hydroxid alkalického kovu nebo hydrogenuhličitan, například hydroxid sodný nebo hydrogenuhličitan sodný, ačkoliv jiná alkalická činidla (například vodný hydroxid amonný) mohou být také použita. Je jasné, že podmínky reakce (a zejména pH) jsou závislé na požadovaném rozmezí molekulové hmotnosti pro vzniklý produkt. Nicméně, vhodné podmínky mohou být snadno určeny v jakémkoliv jednotlivém případě rutinním experimentováním. Například, oxidovaná regenerovaná celulosa může být hydrolyzována v 1M až 8M hydroxidu sodném při teplotě od 0 °C do 50 °C po dobu 5 až 120 minut za zisku oligosacharidů s molekulovou hmotností v rozmezí 1000 až 20000 daltonů, nebo s 0,01 až l M hydrogenuhl ič i taném sodným při 0 °C až 50 °C po dobu 10 hodin až 10 dnů za zisku oligosacharidů s molekulovou hmotností v rozmezí 7000 až 50000 daltonů.

Hydrolytická reakce může být ukončena přidáním kyseliny, jako je minerální kyselina, tak, aby roztok dosáhl přibližně neutrality. Výhodně může být použita koncentrovaná kyselina • · · ··· ··»

Φ· *··· ·· chlorovodíková.

Vynález je dále popsán pomocí následujících příkladů.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Roztok ORC byl připraven rozpuštěním Surgicel™ tkaniny v koncentraci 20 mg/ml v 6M hydroxidu sodném.

Roztok se inkuboval při 37 °C po dobu 45 minut, po kterých byla reakce ukončena přidáním 6 M HCl, dokud neproběhlo vysrážení a pH bylo změněno z alkalického na pH 7 nebo méně. Sraženina se nechala usadit přes noc a potom se odstranil nadbytek kapaliny. Sraženina se dialyzovala proti vodě v trubicích s hranicí molekulové hmotnosti 1000 a potom byla sušena sublimací ze zmraženého stavu za zisku prášku.

Molekulová velikost oligosacharidu, určená gelovou elektroforesou a kapalinovou chromatografií s vysokou rozlišovací schopností, vykazovala rozmezí od přibližně 1000 do přibližně 15000 daltonů.

Příklad 2

Roztok ORC byl připraven rozpuštěním Surgicel™ tkaniny v koncentraci 10 mg/ml v 0,1 M hydrogenuhličitanu sodném. Roztok se inkuboval při 37 °C po dobu několika dní (2 - 3), dokud nebyla rozpuštěna veškerá ORC. Reakce byla ukončena přidáním 6 M HCl, dokud neproběhlo vysrážení a pH bylo změněno

9 99

9 · • · 0

999 999

9

99

9 991 z alkalického na pH 7 nebo méně. Sraženina se nechala usadit přes noc a potom se odstranil nadbytek kapaliny. Sraženina se dialyzovala proti vodě v trubicích s hranicí molekulové hmotnosti 1000 a potom byla sušena sublimací ze zmraženého stavu za zisku prášku.

Molekulová velikost oligosacharidu, určená způsobem popsaným výše, vykazovala rozmezí od přibližně 1000 do přibližně 30000 daltonů.

Příklad 3

Tampon z oxidované karboxymethylcelulosy byl připraven následujícím způsobem:

Do 500 g vody se přidá za míchání 7,5 gramu karboxymethylcelulosy (CMC) od Aqualon Corporation. Po rozpuštění polymeru se roztok nechá přes noc odvzdušnit pro odstranění zachycených vzduchových bublin. Roztok se nalije do misky 3x4x14 palce a suší se sublimací ze zmraženého stavu v lyofilizačním přístroji. Měkké, bílé, ve vodě rozpustné tampony z ORC jsou získány tímto postupem.

Oxidace CMC tamponů je provedena umístěním 5,8 g suchých tamponů do nádoby ze syntetické pryskyřice, na kterou je připojena malá nádobka obsahující 8 g oxidu dusičitého. Oxid dusičitý se nechá odpařit z malé nádobky do nádoby ze syntetické pryskyřice a obalí CMC tampony v atmosféře plynu. Tampony jsou ponechány v nádobě ze syntetické pryskyřice po dobu 48 hodin a potom se plyn odsaje do lapače s hydroxidem sodným a tampony se odeberou a umístí se v 500 ml vody.

0« » 0 0 »

0

0 0000 0000

00 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0

Oxidované CMC tampony nejsou rozpustné ve vodě. Jsou promyty vodou po dobu 15 minut a potom se umístí do čerstvé vody pro další promytí. Toto promývání oxidovaných tamponů se opakuje, dokud není pH vyplachovací vody vyšší než 3. Bílé tampony z oxidované karboxymethylcelulosy jsou sušeny za pomoci umístění ve 100% isopropylalkoholu na dobu 15 minut. Toto se opakuje celkem dvakrát a potom se tampony nechají uschnout na vzduchu. Tampony z oxidované CMC j sou měkké a tvárné a budou absorbovat 14-ti násobek své hmotnosti izotonického roztoku. Jsou rozpustné v 0,5 N hydroxidu sodném a jsou charakterizovány svým obsahem karboxylových kyselin, který je podle titrace 26,3%.

Roztok oxidované karboxymethylcelulosy se připraví rozpuštěním tampónového materiálu v koncentraci 10 mg/ml v 0,1 M hydroxidu amonném. Roztok se inkubuje při 37 °C po dobu 2 hodin a reakce se ukončí přidáním 6 M HCl, dokud neproběhne vysrážení. Sraženina se odebere a dialyzuje se důkladně proti vodě v trubicích s hranicí molekulové hmotnosti 1000 a potom se suší sublimací ze zmraženého stavu za zisku prášku.

Molekulová velikost oligosacharidu byla určena gelovou elektroforesou a bylo zjištěno, že je 1000 a 30000 daltonů.

Příklad 4

Methylcelulosa byla oxidována postupem analogickým s postupem popsaným v příkladu 3 a roztok byl připraven rozpuštěním oxidovaného materiálu v koncentraci 20 mg/ml v 6 M hydroxidu sodném a inkubací při 37 °C po dobu 45 minut. Roztok se centrifugoval pro odstranění jakéhokoliv nerozpuštěného ·»· φφφ • φ φ φ · φ · φφφφ · · φφ materiálu a oligosacharidy byly vysráženy z roztoku přidáním 6 M HCI. Sraženina byla odebrána a důkladně dialyzována proti vodě v trubicích s hranicí molekulové hmotnosti 1000.

Molekulová velikost oligosacharidu byla určena gelovou elektroforesou a bylo zjištěno, že je mezi 1000 a 5000 daltonů.

Příklad 5

Extrakční kolona s kyselinou fenylboritou (PBA) jako pevnou fází (Bond Elut, Varian Associates), obsahující 100 mg sorbentního materiálu s 10 ml zásobníkem, byla aktivována za použití 10 ml methanolu pro navlhčení kolony a potom 10 ml 0,1 M kyseliny octové pro uvedení kolony do rovnováhy při správném pH.

ORC roztok byl připraven rozpuštěním 1 g Interceed^ materiálu ve 100 ml 6 M roztoku hydroxidu sodného. Po úplném rozpuštění Interceed materiálu byl roztok okyselen na pH 3,0 a jakákoliv sraženina byla odstraněna centrifugací. Odebral se supernatant a 2 ml se nechaly projít přes aktivovanou PBA kolonu. Kolona byla potom promyta 2 ml 0,1 M kyseliny octové a 4 x 2 ml objemy destilované vody pro odstranění jakékoliv soli nebo jiného endogenního materiálu. ORC oligosacharidy byly eluovány z kolony za použití 2 x 2 ml objemů 0,1 M hydroxidu amonného. Díly byly shromážděny, zmrazený a lyofilizovány za vzniku prášku. Po separaci oxidovaných oligosacharidů iontoměničovou chromatografií ukázala analýza hmotnostní spektrometrií, že mají molekulovou hmotnost v rozmezí 600 až 1200 daltonů.

·· 44 4» 44 ·· *♦ • ••4 «44 4 4 44 4

4 44 4 4444

4 44 4 4 4 444 44«

4 4 4 4 4 4

4444 444» 44 4444 44 4«

Příklad 6

Kolagenový/ORC oligosacharidový tampon byl připraven následujícím způsobem. Vápnem zpracovaná kolagenní vlákna (0,8 g) byla zpracována na kaši ve 160 ml 0,01 HCl (pH 3,0) a do ní bylo přidáno 0,16 g ORC oligosacharidu, připraveného podle příkladu 2. Směs byla homogenizována podobu 15 sekund, byl přidán HMDI (10% hmot./hmot. kolagenu) a kaše byla homogenizována po dalších 2 x 15 sekund. Kaše byla zbavena plynu, byla nalita do dvou Petriho misek o průměru 9 cm, byla zmrazená a sušena sublimací ze zmraženého stavu za použití teplot rostoucích od -30 °C do 70 °C v průběhu 72 hodin.

Kolagenní/ORC oligosacharidový tampon byl potom testován na svou schopnost vázat růstový faktor odvozený od destiček (PDGF). Pro účely srovnání bylo také testováno Interceed™ vlákno a prostý kolagení tampon (připravený způsobem pospaným výše, ale bez přidání ORC oligosacharidu). V každém případě byla malá část testovaného materiálu (čtverce přibližně 1 cm² Interceed™ vlákna a řezy přibližně 1 cm x 0,5 cm x 0,4 cm tamponu) zvážena aponořena do 100 mM dibazického pufru fosforečnanu sodného obsahujícího 150 mM chloridu sodného (celkový objem 1 ml) po dobu alespoň jedné hodiny při pokojové teplotě. Vzorky byly potom inkubovány s 2% hovězím sérovým albuminem (BSA) ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku (PBS) po dobu 2 hodin při pokojové teplotě. 25 ng PDGF bylo potom přidáno do každého vzorku ve 250 μΐ PBS obsahujícím 2% BSA a vzorky byly potom inkubovány další hodinu při 37 °C.

Každý vzorek byl potom promyt třikrát 250 μΐ PBS a potom zvyšujícími se koncentracemi chloridu sodného. Nakonec byl každý

0« • · · · • 0 • · • 0 ·· • 0 0 0 • · 0 · 0

0 0 • 0 0 0 · 0

0» 00

0 0 ·

0 0 0

000 000 0 0 • 0 00 vzorek promyt 4,0 M močovinou. Při ELISA analýze původních PDGF přípravků a různých výplachů ze vzorků byly získány následující výsledky:

Tabulka 1 - Vazba PDGF-AB

Vzorek	Kolagen	Kolagen/ORC	Interceed
Původní	100%	100%	100%
Nenavázaný	20,6%	22,9%	15,4%
PBS výplach	1,8%	11,1%	7,5%
0,3 M NaCl	4,5%	12,3%	1,9%
0,5 M NaCl	22,0%	22,2%	7,7%
1,0 M NaCl	11,9%	15,2%	11,2%
2,0 M NaCl	3,0%	5,1%	7,8%
3,0 M NaCl	0%	4,3%	3,4%
4,0 M NaCl	0%	4,0%	9,7%
Zpětně získáno	63,8%	97,1%	64,6%

Výsledky ukazují, že všechny tři testované materiály vázaly podobná množství PDGF, ale nejvyšši zpětný zisk PDGF umožňoval tampon z kolagenu/ORC oligosacharidu.

Vazebné charakteristiky jsou také jedinečně odlišné pro materiály z kolagenu/ORC oligosacharidu ve srovnání s jednotlivými srovnávacími materiály. Tato pozorování naznačují, že komplex má jedinečnou vazbu PDGF, která může být využita jak pro exogenní vazbu, tak pro endogenní vazbu a uvolňování růstového faktoru.

Claims (18)

1. Farmaceutický protředek pro parenterální podání v y z n a č u obsahuje oxidovaný oligosacharid mající průměrnou molekulovou hmotnost v rozmezí 1000 až 50000 daltonů.

2. Farmaceutický prostředek podle nároku 1 vyznačující se tím, že je odvozen od oxidovaného bakteriálního nebo rostlinného polysacharidu.

3. Farmaceutický prostředek podle nároku 1 vyznačující se tím, že je odvozen od oxidovaného živočišného polysacharidu nebo oxidovaného syntetického polysacharidu.

4. Farmaceutický prostředek podle nároku 1 vyznačující se tím, že je odvozen od oxidované celulosy nebo oxidovaného derivátu celulosy.

5. Farmaceutický prostředek podle nároku 1 vyznačuj ícísetím, že je odvozen od oxidovaného derivátu dextranu, gellan gumy, xanthanové gumy, agaru, škrobu, konjac, karagénu, guarové gumy, pětinu, karboxymethylcelulosy, methylhydroxypropylcelulosy, acetatu celulosy, methylcelulosy, fosfátu celulosy, ethylcelulosy nebo inulinu.

6. Farmaceutický prostředek podle jakéhokoliv z předcházejících nároků vyznačující se tím, že má průměrnou molekulovou hmotnost v rozmezí 5000 až 25000 daltonů.

• · · · · · • · • ·

7. Farmaceutický prostředek podle jakéhokoliv z předcházejících nároků vyznačující se tím, že přípravek oxidovaného oligosacharidu je navázán na farmakologicky aktivní peptid nebo protein.

8. Farmaceutický prostředek podle nároku 7 vyznačující se tím, že peptid nebo protein je růstový faktor.

9. Použití farmaceutické přípravku podle jakéhokoliv z nároků 1 až 8 pro přípravu prostředku pro použití jako krytí ran nebo při krytí ran.

10. Použití podle nároku 9, kde je farmakologicky aktivní činidlo distribuováno v podstatě rovnoměrně v uvedeném prostředku pro krytí ran.

11. Použití podle nároku 10, kde farmakologicky aktivní činidlo je antibiotikum, antiseptikum nebo proteinový růstový faktor.

12. Způsob pro přípravu oxidované celulosy vyznačuj ící se t £ m, že obsahuje kroky:

a) ošetřeni oxidované celulosy mající průměrnou molekulovou hmotnost alespoň 5000 vodným alkalickým roztokem při teplotě a po dobu dostatečnou pro částečnou hydrolýzu uvedené oxidované celulosy; a

b) získání vzniklé oxidované celulosy z uvedeného roztoku.

13. Způsob podle nároku 12 vyznačuj ící se tím, ·· t* e>« • ft·· ···· ft··· že alkalický roztok je roztok hydroxidu nebo hydrogenuhličitanu alkalického kovu.

14. Způsob podle nároku 12 nebo 13 vyznačuj ící se tím, že oxidovaná celulosa je získána z uvedeného roztoku upravením pH na 7 nebo méně za použití kyseliny.

15. Způsob podle nároku 14 vyznačující se tím, že kyselina je koncentrovaná minerální kyselina.

16. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 12 až 15 vyznačující se tím, že obsahuje kroky:

a) poskytnutí alkalického roztoku uvedené oxidované celulosy;

b) rozpuštění nebo rozptýlení terapeuticky aktivního činidla v uvedeném alkalickém roztoku; a

c) redukci pH uvedeného roztoku nebo disperze tak, že uvedená oxidovaná celulosa se vysráží.

17. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 12 až 15 vyznačující se tím, že obsahuje kroky:

a) poskytnutí alkalického roztoku uvedené oxidované celulosy;

b) rozpuštění nebo rozptýlení terapeuticky aktivního činidla v uvedeném alkalickém roztoku; a

c) odstranění rozpouštědla z uvedeného roztoku nebo disperze.

·· ·· » · · · k · · · * · · · · · • · • 4

18. Způsob podle nároku 17 vyznačující se tím, že rozpouštědlo je v kroku c) odstraněno sublimací ze zmraženého