DE10319808A1

DE10319808A1 - Verwendung von Polysaccharid-Derivaten als Mittel zur Stimulierung der Zellproliferation

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Publication number: DE10319808A1
Application number: DE10319808A
Authority: DE
Inventors: Thomas Prof. Dr.rer.nat. habil. Heinze; Uwe Prof. Dr.med. habil. Wollina; Kerstin Dipl.-Med. Trier
Original assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Current assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Priority date: 2003-04-28
Filing date: 2003-04-28
Publication date: 2004-11-18

Abstract

Aufgabe war es, biologisch aktive Polymere zu finden, die als Hydrokolloid wirken und eine positive biologische Aktivität hinsichtlich der Stimulierung der Zellproliferation besitzen, die einen effektiven Einsatz bei der Wundheilung gestatten sowie gut verträglich, nicht toxisch, biologisch abbaubar und in einfacher Art herstellbar sind. DOLLAR A Es wurde gefunden, dass Polysaccharid-Derivate, die mit Carboxylgruppen mit einem Substitutionsgrad von 0,1 bis 3.0 substituiert sind, eine zellwachstumsstimulierende Wirkung besitzen. DOLLAR A Die Polysaccharid-Derivate können beispielsweise zur Wundbehandlung in der Medizin und zur Stimulation der Zellbildung eingesetzt werden.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Substanzen auf der Basis von Oligo- und Polysacchariden als Mittel zur Stimulierung der Zellproliferation. Diese proliferationssteigernden Mittel können beispielweise bei der Wundbehandlung in der Medizin, als biologisch aktive Verbindung in Wundverbänden und Pflastern und in pharmazeutischen und kosmetischen Zubereitungen zur Stimulierung der Zellbildung eingesetzt werden sowie bei der Gewinnung von Hautersatzprodukten, in der Zelltherapie und im Tissue Engineering Verwendung finden.
Es ist bekannt, dass die Optimierung der Wundheilung zunehmend sozialmedizinische Relevanz erhält. Zahlreiche Patienten sind aus den verschiedensten Gründen einer primär chirurgischen Therapie von Wunden nicht zugänglich, so dass eine konservative Behandlung versucht werden muss, welche oft sehr zeit- und kostenintensiv ist.
An einen zeitgemäßen Wundverband werden eine Reihe von speziellen Anforderungen gestellt. Er soll bioaktiv reagieren, muss also biologische Prozesse wie Granulation, Epithelisation, immunologische und nichtimmunologische Abwehr, Proliferation, Migration und Differenzierung gezielt beeinflussen und sich an die sich ständig ändernden Gegebenheiten des Wundmilieus anpassen können (Wollina: Die Medizinische Welt 46, 1995, 363).
Carboxylgruppenhaltige Polysaccharide, wie die natürlich vorkommenden Alginate, oder halbsynthetische Produkte, wie Carboxymethylcellulose oder -stärke, und Carboxycellulose sind hinreichend bekannt und werden auf Grund ihrer Fähigkeit, wässrige Systeme in vielfältiger Weise zu beeinflussen, in einer Fülle von Produkten als funktionelle Zusatzstoffe eingesetzt (Feddersen, Thorp: in Industrial gums, polysaccharides and their derivatives; R. L. Whistler, J. N. BeMiller, Eds., Academic Press, Inc., San Diego, Boston, New York, 1993, S. 537 ff.). Durch ihre Hydrokolloidwirkung finden sie zur Steuerung der rheologischen Eigenschaften Anwendung in Nahrungsmitteln sowie in kosmetischen und pharmazeutischen Zubereitungen. Sie werden darüber hinaus als Hydrokolloide in diversen Verbandsmaterialien eingesetzt (Kennedy et al.: in Recent Advances in Environmentally compatible polymers, J. F. Kennedy, G. O. Phillips, P. A. Willliams, H. Hatakeyama, Eds., Woodhead Publ. Ltd., Abington Hall, 2001, S. 97 ff.).
Carboxycellulose, die durch Oxidation von Cellulose gewonnen werden kann, ist bioresorbierbar und weist blutstillende Eigenschaften auf (Kumar, Yang: Carbohydr. Polym. 48, 2002, 403). Darüber hinaus gibt es Hinweise auf eine antibakterielle Wirkung. Pharmakologische und toxikologische Untersuchungen belegen eine physiologische Unbedenklichkeit der Polysaccharide (Ullmann's Enzyklopädie der technischen Chemie, 1975, 4. Aufl., Bd. 9, S. 193).
Der Einsatz von Biopolymeren im biologisch-medizinischen und kosmetischen Bereich ist an sich bekannt. Sie wurden auch für die Wundtherapie und als temporärer Hautersatz vorgeschlagen ( US 6,033,684 ; Kumar, Yang: Carbohydr. Res. 48, 2002, 403).
Carboxymethylcellulose (CMC) wird sehr häufig genutzt und beschrieben. Es ist bekannt, dass man auf dem Gebiet der Pharmazeutik Carboxymethylcellulose als Sprengmittel für Tabletten (beispielsweise Buscopan^® plus Filmtablette, Fa. Boehringer Ingelheim) und als Fließeigenschaften beeinflussender Inhaltsstoff von Augen- und Nasentropfen (z. B. Liquifilm^®, Fa. Pharm-Allergan, Tränenersatzmittel) benutzt. CMC wird auch als Trägergel für topische Anwendungen ( EP 1,057,481 A1 ; RU 2102979 ; WO 95/03786) beispielsweise in Diclofenac^®-Gel, Fa. Novartis Pharma (Mohammed: Drug Dev. Ind. Pharm. 27, 2001, 1083; EP 1,057,481 A1 ) verwendet.
CMC wird als quellfähiger Bestandteil (Hydrokolloid) in diversen Verbänden (z. B. Aquacel^®, Fa. ConvaTec Ltd.) eingesetzt. Diese Wundverbände werden vor allem bei der Therapie moderat bis stark exsudierender Wunden angewendet und zeichnen sich durch eine relativ hohe Sicherheit, Effektivität und gute Toleranz durch die Patienten aus (Piaggesi et al.: Diabet Med. 18, 2001, 320; Williams: Br. J. Nurs. 8, 1999, 676).
Durch die Fähigkeit der CMC zur Gelbildung wird Flüssigkeit immobilisiert ( US 6,033,684 ; US 6,075,177 ; RU 2133627 ; RU 2129181 ), was bei der Wundbehandlung Vorteile bringt (Waring et al.: Biomaterials 22, 2001, 903). Die Carboxymethylcellulose wandelt sich bei Kontakt mit Wundsekret in ein weiches Gel um und erzeugt ein für die Wundheilung ideales feuchtes Milieu. Darüber hinaus vermindert CMC den Flüssigkeitsaustritt an den Wundrändern, so dass eine Mazeration der Wundumgebung durch Wundflüssigkeit deutlich eingeschränkt werden kann. Der Einsatz von CMC in Verbänden kann zur Vermeidung der Wundinfektionen und von Verschorfungen hilfreich sein und es ist keine Fremdkörperreaktion bekannt. Eine optimale Umgebungstemperatur sowie ein angemessener pH-Wert werden garantiert. Ferner erfolgt ein Gasaustausch zwischen Wunde und Umgebung (Wollina: Die Medizinische Welt 46, 1995, 363).
Es ist ebenfalls bekannt, dass sich eine Reihe von Wundauflagen, z. B. Mull, Gaze oder Vliesverbände nicht inert gegenüber den Zellen im Wundgebiet verhalten, Fremdkörperreaktionen induzieren, zytotoxische Effekte aufweisen und die Zellmorphologie verändern. Auch bei auf dem Markt erhältlichen Hydrokolloidverbänden und Hydrogelen konnten Fremdkörperreaktionen beobachtet werden. Speziell Hydrokolloidverbände stellen Mehrkomponentensysteme dar, welche aus quellfähigen Partikeln (Pektin, Cellulose) in einer amorphen Matrix (Mischung aus Polyisobutylenen) sowie einem nach außen abdeckenden Polyurethanfilm aufgebaut sind ( US 6,003,684 ). Bei Zellkontakt kann es zu einer Verteilung partikulären Materials kommen, welches von den Zellen phagozytiert wird (Wollina et al: Skin Pharmacol. 9, 1996, 35).
Alle bisher bekannten Anwendungen von carboxylgruppenhaltigen Polysacchariden in diesem Gebiet basieren auf ihren physikochemischen Eigenschaften, insbesondere auf ihrer Wirkung als Hydrokolloid. Eine positive biologische Aktivität insbesondere eine Stimulierung der Zellproliferation ist nicht bekannt.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, biologisch aktive Polymere zu finden, die als Hydrokolloid wirken und eine positive biologische Aktivität hinsichtlich der Stimulierung der Zellproliferation besitzen, die einen effektiven Einsatz bei der Wundheilung gestatten sowie gut verträglich, nicht toxisch, biologisch abbaubar und in einfacher Art herstellbar sind.
Überraschend wurde gefunden, dass Polysaccharide, wie Polyglucane und chemisch oder enzymatisch partiell hydrolysierte oder anderweitig vorbehandelte Cellulose, bei denen durch chemische Verfahren, beispielsweise Veretherung, Veresterung oder Oxidation, bzw. im natürlichen Bildungsprozess (Biosynthese) Carboxylgruppen mit einem durchschnittlichen Substitutionsgrad (DS) im Bereich von 0,1 bis 3,0, insbesondere mit einem DS im Bereich von 0,4 bis 2,3 in Polysaccharide eingeführt sind, eine zellproliferierende Stimulierungswirkung besitzen. Polysaccharide, auch die natürlich vorkommenden Typen, sind zudem nicht toxisch, biologisch abbaubar und weisen eine ausgeprägte Flüssigkeitsaufnahmekapazität, beispielsweise für Wasser, auf.
Die erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen sind biologisch aktiv und weisen sogar eine außerordentlich hohe Stimulierung der Proliferation von Zellen, insbesondere von humanen Keratinozyten auf. Die Verbindungen besitzen im Vergleich zu den eingangs beschriebenen Produkten eine neue biologische Wirkung und können auf Grund dieser Eigenschaften insbesondere zur Herstellung von Mitteln zur Wundbehandlung dienen. Sie sind darüber hinaus typische Hydrokolloide. Spezielle Verwendungen ergeben sich beispielsweise in Wundverbänden in der medizinischen Praxis. Sie können sowohl allein als auch in Kombination mit anderen biologisch aktiven Stoffen oder mit physiologisch verträglichen Hilfs- und Trägerstoffen angewandt werden. Darüber hinaus sind sie als proliferationssteigernde Bestandteile von kosmetischen Zubereitungen und zur Ausrüstung von textilen Oberflächen, Kunststoffen und Formteilen, die in Kontakt mit Wunden kommen, einsetzbar. Sie können auch vorteilhaft bei der Gewinnung von Hautersatzprodukten, in der Zellbildung und im Tissue Engineering Einsatz finden.
Als zur erfindungsgemäßen Verwendung vorgeschlagene Verbindungen werden Polysaccharide, bevorzugt Polyglucane wie Stärke, Amylose, Amylopektin, Lichenan, Pullulan, Dextran und besonders bevorzugt Cellulose, die aus den natürlichen Quellen, wie Holz (in Form von Zellstoff) oder Baumwolle bzw. anderen Einjahrespflanzen, gewonnen werden kann, die biotechnologisch erzeugt (Bakteriencellulose) oder welche durch Nachbehandlungen, wie chemische oder enzymatische Hydrolyse, oder anderweitige Vorbehandlungen, wie Umformung zu partikulären und sphärischen Formkörpern (Perlcellulose) oder zu Fasern und Fliesen, verändert wurden, eingesetzt.
Die Molekulargewichte dieser Polysaccharide liegen im Bereich von 5000–10⁷ g/mol, bevorzugt im Bereich von 10⁴ bis 10⁷ g/mol. Die Anhydroglucose-Wiederholungseinheiten (AGU) können über β – (1 → 4), α – (1 → 4), α – (1 → 3) und β – (1 → 3) Bindungen oder auch Kombinationen davon, wie beispielweise α – (1 → 4) und α – (1 → 6), verknüpft sein. Darüber hinaus können auch weitere funktionelle Gruppen wie Aldehyd- und Carboxyl funktionen oder geringe Mengen an Hemicellulosen, beispielsweise bei technischen Zellstoffen, enthalten sein.
Das Ausmaß der Umsetzung an den Hydroxylgruppen wird durch den durchschnittlichen Substitutionsgrad (DS) beschrieben. Dieser Durchschnittswert gibt ohne jede Differenzierung die Anzahl der funktionalisierten Hydroxylgruppen an und liegt bei den vorgeschlagenen Polysacchariden definitionsgemäß im Bereich von 0 bis 3. Der DS an Carboxylgruppen von den proliferationssteigernden carboxylgruppenhaltigen Polysaccharidderivaten liegt zwischen 0,1 und 3,0, bevorzugt zwischen 0,4 und 2,3.
Die erfindungsgemäß verwendbaren Polysaccharidderivate sind gut verfügbar bzw. können in an sich bekannter Weise gewonnen werden, insbesondere durch Veretherung unter alkalischen Bedingungen mit reaktiven Verbindungen wie Halogenessigsäuren (Iod-, Brom- und Chloressigsäure) oder deren Natriumsalze, Acrylnitril und nachfolgender Verseifung der Nitrilfunktion, durch Veresterung mit Dicarbonsäurederivaten, wie zyklischen Anhydriden, und durch Oxidation beispielsweise mit Distickstofftetroxid oder NaNO₂/H₃PO₄ sowie mit Natriumperiodat und nachfolgend mit Natriumchlorit.
Eine Vernetzung der carboxylgruppenhaltigen Polysaccharidderivate mit bi- oder mehrfunktionellen Reagenzien kann ebenfalls nach die bekannten Verfahren erfolgen.
Der Gehalt an den Carboxylgruppen kann durch die molaren Verhältnisse der Reagenzien und durch eine wiederholte Umsetzung eines bereits carboxylgruppenhaltigen Polysaccharids eingestellt werden. Die Verteilung der funktionellen Gruppen wie die Gewinnung von 2,3-O-CMC (Heinze, et al: Macromol. Rapid Commun. 15, 1994, 311) lässt sich durch Schutzgruppenverfahren und eine nicht-statistische Funktionalisierung durch Reaktionen nach induzierter Phasenseparation kontrolliert steuern (Liebert, Heinze: BioMacromolecules 2, 2001, 1124).
Die Reaktionen zur Herstellung der biologisch aktiven Polysaccharidderivate können auf unterschiedliche und an sich bekannte Weise durchgeführt werden, wobei hohe Gehalte an Carboxylgruppen realisiert werden. Sowohl Suspensionen der Polymere in Alkohol, Natronlauge und Wasser unter heterogenen Bedingungen oder in Natronlauge/Wasser unter Auflösung der Produkte als auch homogene Lösungen der Polysaccharide in dipolaraprotischen Lösemitteln wie Dimethylsulfoxid oder N,N-Dimethylacetamid in Gegenwart von Lithiumchlorid oder weiteren Lösemitteln sind als Reaktionsmedien geeignet. Die Reaktionszeiten liegen zwischen 0,5 h und 48 h, bevorzugt zwischen 2 h und 24 h, und die Temperatur zwischen 30 °C und 130 °C. Durch die eingesetzten Moläquivalente der Reagenzien kann zusätzlich der Substitutionsgrad der Produkte eingesellt und in weiten Grenzen variiert werden. Die Aufarbeitung der Produkte erfolgt mit den üblichen Verfahren der Polymerchemie, wobei niedermolekulare Nebenprodukte oder Reagenzreste durch Waschprozesse, Dialyse oder Umfällen aus Wasser in organische Lösemittel abgetrennt werden.
Die Carboxylgruppen können unterschiedliche Kationen enthalten, bevorzugt sind Natriumionen, wobei auch andere ein- und mehrwertige Metallkationen sowie organische Kationen, wie Ammoniumionen, gebunden sein können. Durch die Wahl der Anionen kann sogar die Quellfähigkeit der Polysaccharid-Derivate zusätzlich gezielt eingestellt werden.
Die Charakterisierung der Produkte mittels NMR- und IR-Spektroskopie belegt die Strukturen. Die Substitutionsgrade wurden mittels ¹H- und ¹³C-NMR-Spektroskopie der intakten und hydrolytisch depolymerisierten Polymere sowie im Falle der Carboxymethylcellulose durch HPLC nach vollständiger Depolymerization mit Säuren bestimmt.
Mit diesen Methoden erfolgt auch die Ermittlung der Verteilung der Carboxylgruppen.
Die folgenden Ausführungsbeispiele sollen die Erfindung näher erläutern, jedoch in keiner Weise einschränken.
Es zeigen:
1: Proliferation von Zellen in Abhängigkeit von Carboxymethylcellulose (CMC, DS 0,7), vgl. Ausführungsbeispiel 2
2: Proliferation von Zellen in Abhängigkeit von zugesetzter CMC, DS 0,9 vgl. Ausführungsbeispiel 3
3: Proliferation von Zellen in Abhängigkeit von einem CMC-Zusatz, DS 0,8 vgl. Ausführungsbeispiel 4
4: Proliferation von Zellen in Abhängigkeit von einem CMC-Zusatz, DS 1,7 vgl. Ausführungsbeispiel 5
5: Proliferation von Zellen in Abhängigkeit von einem CMC-Zusatz, DS 2,3 vgl. Ausführungsbeispiel 6
Ausführungsbeispiel 1:
Bestimmung des Proliferationsverhaltens von HaCaT-Zellen (= Human adult low Calcium high temperature keratinocytes) nach Zugabe von Carboxymethylcellulose (CMC)
Für die Bestimmung des Proliferationsverhaltens humaner Keratinozyten wurden ca. 15 000 Zellen/Well in 500 ml Dulbecco's modified eagles medium (DMEM) und 2,5 ml fetalem Kälberserum (FKS) in Mikrotiterplatten eingesät und 24 h im Brutschrank bei 37°C und 6% CO₂ inkubiert. Danach wurde das überschüssige DMEM aus den 96 Wells der Mikrotiterplatten abpipettiert und die in serumfreiem Medium (SFM) gelösten carboxylgruppenhaltigen Polysaccharide in unterschiedlichen Konzentrationen aufgebracht.
Parallel dazu wurden jeweils ein Platten-Leerwert sowie sieben Kontrollen mit SFM pur mitgeführt. Danach erfolgte eine weitere Inkubation der Platten im Brutschrank bei 37°C und 6% CO₂ über 24 h bzw. 48 h.
Der Überstand an Polysaccharid-Derivat-haltigem SFM in den 96 Wells der Mikrotiterplatte wurde nach 24 h bzw. 48 h abpipettiert, für weitere Untersuchungen in Teströhrchen gefüllt und bei –80°C gelagert.
Danach erfolgte eine zweimalige Spülung der Mikrotiterplatte mit Phosphat buffered saline (PBS).
Zur Quantifizierung wurde eine Lösung von 5 mg des Farbstoffs 33342 der Fa. Hoechst in 10 ml PBS-Puffer verwendet. Der Fluoreszenzfarbstoff bindet selektiv an Adenin-Thymin-Basenpaare mit einer Linearität zwischen 5 × 10³ und 5 × 10⁵ Zellen/Well. Jeweils 100 μl der Farbstoffstammlösung wurden in die Wells pipettiert und die Mikrotiterplatte 30 min im Brutschrank bei 37°C und 6% CO₂ inkubiert. Das Proliferationsverhalten der HaCaT-Zellen wurde mit Hilfe des Fluoreszenz-Messsystems CytoFluor 2300 der Fa. Millipore (Fluoreszenzwellenlängen: Extinktion 360 nm, Emission 460 nm) beurteilt.
Ausführungsbeispiel 2:
Proliferationsverhalten humaner Keratinozyten in Gegenwart von Carboxymethylcellulose (CMC)
Nach 48 h Anwachsen der Zellen in DMEM und 24 h sowie 48 h Inkubation mit einer CMC mit einem durchschnittlichen Substitutionsgrad (DS) von 0,7 (aus Holzzellstoff) in SFM erfolgt eine signifikante Proliferationssteigerung bis zu 344 ± 9% wie in 1 detailliert dargestellt.
Ausführungsbeispiel 3:
Proliferationsverhalten humaner Keratinozyten in Gegenwart von CMC
Nach 48 h Anwachsen der Zellen in DMEM und 24 h sowie 48 h Inkubation mit einer CMC mit einem DS von 0,9 (aus Mikrokristalliner Cellulose, gewonnen durch Hydrolyse mit Säure) in SFM erfolgt eine signifikante Proliferationssteigerung bis zu 293 ± 3% (siehe 2).
Ausführungsbeispiel 4:
Proliferationsverhalten humaner Keratinozyten in Gegenwart von CMC
Nach 48 h Anwachsen der Zellen in DMEM und 24 h sowie 48 h Inkubation mit einer CMC mit einem DS von 0,8 (hergestellt aus Fichtensulfitzellstoff) in SFM wurde eine signifikante Proliferationssteigerung bis zu 577 ± 2% ermittelt (siehe 3).
Ausführungsbeispiel 5:
Proliferationsverhalten humaner Keratinozyten in Gegenwart von CMC
Nach 48 h Anwachsen der Zellen in DMEM und 24 h sowie 48 h Inkubation mit einer CMC mit einem DS von 1,7 (hergestellt aus Fichtensulfitzellstoff durch zweimalige Carboxymethylierung) in SFM wurde eine signifikante Proliferationssteigerung bis zu 188 ± 2% ermittelt, wie aus 4 ersichtlich wird.
Ausführungsbeispiel 6:
Proliferationsverhalten humaner Keratinozyten in Gegenwart von CMC
Nach 48 h Anwachsen der Zellen in DMEM und 24 h sowie 48 h Inkubation mit einer CMC mit einem DS von 2,3 (hergestellt aus Fichtensulfitzellstoff durch dreimalige Carboxymethylierung) in SFM wurde keine signifikante Proliferationssteigerung ermittelt, wie aus 5 ersichtlich ist.
Ausführungsbeispiel 7:
Proliferationsverhalten humaner Keratinozyten in Gegenwart von 6-Carboxycellulose
Nach 48 h Anwachsen der Zellen in DMEM und 48 h Inkubation mit einer Lösung von 6-Carboxycellulose, Natriumsalzform (10% in SFM), DS von 0,7, hergestellt durch Oxidation von Baumwoll-Linters in 85%iger Phosphorsäure mit Natriumnitrit, wurde eine signifikante Proliferationssteigerung von 250 ± 5% gefunden.
Ausführungsbeispiel 8:
Proliferationsverhalten humaner Keratinozyten in Gegenwart von 2,3-Carboxymethylcellulose
Nach 48 h Anwachsen der Zellen in DMEM und 48 h Inkubation mit einer Lösung von 2,3-Carboxymethylcellulose (10% in SFM), DS von 1,0 wurde eine signifikante Proliferationssteigerung von 510 ± 3% gefunden.
Ausführungsbeispiel 9:
Proliferationsverhalten humaner Keratinozyten in Gegenwart von nichtstatistisch funktionalisierter Carboxymethylcellulose
Nach 48 h Anwachsen der Zellen in DMEM und 48 h Inkubation mit einer Lösung von nichtstatistisch funktionalisierter Carboxymethylcellulose (10% in SFM) mit einem DS von 1,6 wurde eine signifikante Proliferationssteigerung von 260 ± 4% gefunden.
Ausführungsbeispiel 10:
Proliferationsverhalten humaner Keratinozyten in Gegenwart von 2,3-Carboxycellulose
Nach 48 h Anwachsen der Zellen in DMEM und 48 h Inkubation mit einer Lösung von 2,3-Carboxycellulose (702 mmol/100g; 10% in SFM) wurde eine signifikante Proliferationssteigerung von 180 ± 3% gefunden.
Ausführungsbeispiel 11:
Prüfung des zytotoxischen Potentials der Carboxymethylcellulose
Die Prüfung des zytotoxischen Potentials der carboxylgruppenhaltigen Polysaccharidderivate erfolgte durch quantitative Bestimmung des Kernmatrixprotein Nuclear matrix protein 41 (NMP 41) mit dem enzymatischen Immunoassay Matri-Tect^TM NMP 41^TM Cell Death Test Kit.
Es wurden ca. 15 000 HaCaT-Zellen/Well in 500 ml DMEM und 2,5 ml FKS in Mikrotiterplatten eingesät, 24 h im Brutschrank bei 37°C und 6% CO₂ inkubiert, anschließend der Überstand an DMEM aus den 96 Wells der Mikrotiterplatten abpipettiert und die in SFM gelöste Carboxymethylcellulose, DS 0,7, jeweils in sechs unterschiedlichen Konzentrationen aufgebracht.
Parallel dazu wurden jeweils ein Platten-Leerwert sowie sieben Kontrollen mit SFM pur mitgeführt. Nach 24 h bzw. 48 h Inkubation der Platten bei 37°C und 6% CO₂ wurden die Zellkulturüberstände, getrennt nach der jeweiligen CMC-Konzentration, abpipettiert.
Vor Versuchsbeginn wurden die bei den vorangegangenen Proliferationsbestimmungen gewonnenen Zellkulturüberstände für die quantitative Messung des Kernmatrixproteins NMP 41 vorsichtig durchmischt.
In die Wells einer Mikrotiterplatte wird ein Capture-Antikörper für NMP 41 gegeben, welcher sich nach einer Stunde Inkubation an die Well-Oberflächen bindet. Nach einem Waschvorgang, der überschüssiges Material wieder entfernt, werden die Standards und die zu untersuchenden Zellkulturüberstände in die Mikrotiterplatte pipettiert. Während einer weiteren Stunde Inkubation bei Raumtemperatur bindet sich das in den Kulturüberständen enthaltene NMP 41 an den Capture-Antikörper, danach wird erneut gewaschen und Digoxigenin-anti-NMP 41-Antikörper zugegeben. Darauf folgt eine Stunde Inkubation, in der dieser Antikörper an das bereits gebundene NMP 41 andockt, bevor durch einen Waschvorgang nicht gebundener Antikörper wieder entfernt wird.
Nach Zugabe von HRP-gebundener-Schaf-Digoxigenin-Antikörperlösung und einer weiteren Stunde Inkubation wird gewaschen und eine O-Phenyl-diamin-Farbstofflösung (OPD) in die Wells pipettiert, welche dort 20 min verbleibt. Mit einer Stopplösung wird der Farbumschlag beendet, und es kann bei einer Wellenlänge von 490 nm die Menge an NMP 41 quantitativ bestimmt werden.
NMP 41 war in keinem der Zellkulturüberstände in messbaren Konzentrationen nachweisbar. Demnach ist Carboxymethylcellulose kein Auslöser für Apoptosevorgänge und verfügt über kein zytotoxisches Potential.
Ausführungsbeispiel 12:
Messung von Freien Sauerstoffradikalen (ROS)
Freie Sauerstoffradikale (Reactive Oxygen Species = ROS) sind wichtige Zwischenprodukte sowohl im physiologischen als auch im pathologischen oxidativen Zellstoffwechsel. Bei einer Überproduktion tragen sie zur Zellzerstörung durch Lipidperoxidation sowie zur Zerstörung von Proteinen und Enzymen bei. Außerdem gelten sie als Second messengers bei der Aktivierung von Enzymen und Transkriptionsfaktoren, bei Differenzierungsvorgängen während des Zellwachstums und bei der Apoptose. Stehen die Zellen eines Organismus unter Stress, z. B. bei ionisierender/ultravioletter Bestrahlung, Ischämie oder bei Entzündungen, kommt es zur exzessiven Bildung von freien Sauerstoffradikalen.
Die Umwandlung von nicht-fluoreszierendem 2',7'-Dichlorfluorescein-Diacetat (DCFH-DA) in die fluoreszierende Verbindung 2',7'-Dichlorfluorescein (DCF) wurde als Monitor für die Produktion von ROS in Zellen genutzt (Keston et al: The fluorometric analysis of ultramicroquantities of hydrogen peroxide. Anal. Biochem. 11 ,1965, 1; Cathcart et al: Detection of picomole levels of hydrogenperoxide using a fluorescent dichlorofluorescein assay. Anal. Biochem. 134 ,1983, 111). Die Bildung freier Sauerstoffradikale wurde durch Anwendung der Fluoreszenzmethode evaluiert (LeBel et al: Evaluation of the probe 2',7'-dichlorofluorescein as an indicator of reactive oxygen species formation and oxidative stress. Chem. Res. Toxicol. 5, 1992, 227-231; Hipler et al: Fluorescence analysis of reactive oxygen species (ROS) generated by six isolates of Aspergillus fumigatus, in: Proceedings of 10^th International Symposium on Bioluminiscence and Chemiluminiscence 2000, 411).
Das nicht-fluoreszierende DCFH-DA wird mit H₂O₂ in Anwesenheit einer Peroxidase in mehreren Schritten in die fluoreszierende Verbindung DCF umgewandelt (Goldman et al: Generation of reactive oxygen species in a human keratinocyte cell line: role of calcium. Arch Biochem Biophys 350, 1998, 10). DCFH-DA wird dazu durch die Zellmembran hindurch transportiert und durch Esterasen in das nicht-fluoreszierende DCFH deacetyliert. Die gebildete Verbindung bleibt im Zellinneren eingeschlossen. Durch die Einwirkung von Peroxiden (H₂O₂) wird DCFH in DCF umgewandelt. Mit dem Fluorometer FLUOstar (Fa. BMG Labtechnologies, Germany) erfolgt die quantitative Messung von DCF, welche Rückschluss auf die Menge der gebildeten ROS erlaubt.
Es wurden ca. 15 000 HaCaT-Zellen/Well in 500 ml DMEM mit 2,5 ml FKS in Mikrotiterplatten eingesät und inkubiert. Dann wurde der Überstand an DMEM in den 96 Wells der Mikrotiterplatten abpipettiert und die in SFM gelösten Carboxymethylcellulosen jeweils in den sechs bereits beschriebenen Konzentrationen aufgebracht.
Parallel dazu wurden jeweils ein Platten-Leerwert sowie sieben Kontrollen mit SFM pur mitgeführt.
Nach 24 h bzw. 48 h Inkubation der Platten bei 37°C und 6% CO₂ wurde die Anzahl der HaCaT-Zellen in den Wells der Mikrotiterplatten mit Hilfe des Fluoreszenz-Messsystems CytoFluor 2300 der Fa. Millipore unter Verwendung des Farbstoffs 33342 der Fa. Hoechst beurteilt (Fluoreszenzwellenlängen: Excitation 360 mm, Emission 460 nm), um später Aussagen über das Verhältnis zwischen der Zellzahl und der Menge an produzierten ROS treffen zu können.
2',7'-DCFH-DA wurde in Ethanol gelöst, vor der Messung mit NaOH und PBS versetzt und der pH-Wert der Lösung auf 7,4 eingestellt. Zur Erstellung einer Standardkurve verwendeten wir 2',7'-Dichlorfluorescein.
Zu den HaCaT-Zellen in den Wells der Mikrotiterplatten wurden jeweils 100 μl 2',7'-DCFH-DA (0,4 nM/ml) pro Well gegeben. Nach abgelaufener Inkubationszeit (Versuchsansatz 1 mit 24 h CMC-Inkub.: 60 min, 75 min, 120 min, 165 min, 225 min; Versuchsansatz 2 mit 48 h CMC-Inkub.: 60 min, 90 min, 12 h, 14 h) wurden die Mikrotiterplatten für mindestens drei Minuten auf Eis gelegt, bevor die quantitative DCF-Messung durch Fluoreszenzmessung (Extinktion 485 nm, Emission 538 nm) mit dem Fluorometer FLUOstar (Fa. BMG Labtechnologies, Offenburg) erfolgen konnte. Der Gehalt an DCF korreliert mit der Menge an gebildeten ROS.
Die Ergebnisse der Messung von freien Sauerstoffradikalen zeigen, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen keine Bildung von ROS hervorrufen und dementsprechend bei der Anwendung keine negativen Einflüsse erwartet werden können. Sie sind nicht schädlich.
Ausführungsbeispiel 13:
Carboxymethylierung von Cellulose in Isopropanol/Wasser
In einem typischen Beispiel werden 5 g lufttrockener Fichtensulfitzellstoff in 150 ml Isopropanol suspendiert und unter heftigem Rühren 13,3 ml 15%ige wässrige NaOH-Lösung innerhalb von 10 min bei Raumtemperatur zugetropft. Man rührt eine Stunde bei Raumtemperatur und gibt dann 4 g Monochloressigsäure zu. Die Reaktionsmischung wird 5 h bei 55°C gerührt. Die Isolierung des Produktes erfolgt durch Filtration. Das Polymer wird in 300 ml 80%igem wässrigen Methanol suspendiert und mit verdünnter Essigsäure neutralisiert. Anschließend wäscht man dreimal mit 80%igem wässrigen Methanol, einmal mit Ethanol und trocknet bei 60 °C.
DS_CM: 0,8 (HPLC-Messung)
FTIR (KBr): 1630, 1410 cm^–l (ν COONa)
Ausführungsbeispiel 14:
Synthese von nichtstatistisch funktionalisierter Carboxymethylcellulose durch Carboxmethylierung von Cellulose gelöst in N,N-Dimethylacetamid/LiCl
In einer repräsentativen Synthese werden 1 g getrockneter Fichtensulfitzellstoff (1 h bei 105°C) und 60 ml DMA 2 h bei 130°C behandelt und nach dem Abkühlen der Suspension auf 100°C 3 g wasserfreies LiCl portionsweise zugegeben. Die Cellulose löst sich während des weiteren Abkühlens auf Raumtemperatur und Stehen über Nacht vollständig auf. Zur Carboxymethylierung wird nun eine Suspension von NaOH-Pulver (10 mol/mol AGU) in 20 ml DMA (Phasenseparation erfolgt!) und anschließend eine Suspension von Monochloressigsäure (3 mol/mol AGU) in 20 ml DMA unter heftigem Rühren zugefügt. Die Reaktionsmischung lässt man 48 h bei 70°C reagieren und gibt sie nach Abkühlen auf Raumtemperatur in 300 ml Ethanol. Das Produkt wird in 75 ml Wasser gelöst, mit verdünnter Essigsäure neutralisiert und in 300 ml Ethanol gefällt. Nach Filtration, Waschen mit 80%igem wässrigen Methanol und mit Ethanol trocknet man das Polymer bei 50°C im Vakuum.
DS_CM: 1,6 (HPLC-Messung)
FTIR (KBr): 1630, 1410 cm^–l (ν COONa)
Ausführungsbeispiel 15:
Herstellung von 6-Carboxycellulose
In einem 1,5 l-Kolben suspendiert man jeweils 5,0 g Ausgangscellulose in 200 ml 85%iger H₃PO₄, lässt 2 h bei Raumtemperatur stehen und trägt innerhalb von 15 min unter kräftigem Rühren 5,0 g feingepulvertes NaNO₂ ein. Ohne weiteres Rühren bildet sich innerhalb von 5 h ein stabiler Schaum, der anschließend durch Rühren zerstört wird. Danach fügt man weitere 5,0 g NaNO₂ zu. Nach 3 h wird die Zugabe wiederholt und nach einer Gesamtzeit von 10 h zerstört man überschüssiges Oxidationsmittel durch Zugabe von 50 ml 85%iger HCOOH. Die entstehenden Gase vernichtet man durch Einleiten in Ethanol.
Das mit 800 ml eiskaltem Aceton ausgefällte Polymer wird abgetrennt, portionsweise bis zur neutralen Reaktion der Waschflüssigkeit mit ca. 1 l destilliertem Wasser, mit 0,5 l 50%igem wässrigen Ethanol und anschließend mit 0,5 l Ethanol gewaschen und bei 60°C getrocknet.
Ausbeute: 5,0 g
FTIR (KBr): 1740 cm^–l (ν C=O).
4,0 g 6-Carboxycellulose werden innerhalb von 3 h zu einer 10%igen wässrigen NaBH₄-Lösung (100 ml) unter Rühren zugegeben. Nach Stehen über Nacht wird das Reaktionsgemisch mit verd. HCl neutralisiert, der sich dabei bildende Niederschlag durch Zentrifugieren (15 min, 2000 g) abgetrennt und die erhaltene klare Polymerlösung in 600 ml Aceton gefällt. Das Polymer wird abgetrennt, mehrmals mit Aceton gewaschen und im Vakuum bei 50°C getrocknet.
Auswaage: 4,5 g
FTIR (KBr): 1630-1580 und 1400 (ν COONa) cm^–1
DS: 0,7
Ausführungsbeispiel 16:
Synthese von 2,3-Dicarboxycellulose (Na-Salz) über 2,3-Dialdehydcellulose
9,0 g Cellulose (Fichtensulfitzellstoff, 0,06 mol) werden in 250 ml einer 0,25 M wässrigen NaIO₄-Lösung (13,4 g, 0,06 mol) unter Lichtausschluss 3 h bei 60°C gerührt. Nach Zersetzung des überschüssigen Periodates durch Zugabe von 30 ml Ethylenglykol und 1 h rühren filtriert man das Produkt ab, wäscht gründlich mit dest. H₂O (2 l) und mit Ethanol (250 ml) und trocknet bei 50°C im Vakuum.
Auswaage: 7,8
CHO-Gehalt: 713 mmol/100 g
FTIR (KBr): 1728 (ν C=O) cm^–1
10,0 g der 2,3-Dialdehydcellulose (0,06 mol, 713 mmol CHO/100 g) werden in 200 ml dest. H₂O suspendiert und abwechselnd eine Lösung von 34,2 g Natriumchlorit (0,38 mol) in 150 ml H₂O und 10,8 ml Essigsäure (Kontrolle des pH-Wertes) innerhalb 1 h bei Raumtemperatur unter Rühren langsam zugetropft. Im Verlaufe der Reaktion wird eine Farbveränderung von grünlich-gelb nach orange und Freisetzung beträchtlicher Mengen an Chlordioxid (!) beobachtet, die man vorteilhafter Weise durch Einleiten in Eiswasser vernichtet. Nach einer Reaktionszeit von 6 h stellt man pH 11 ein (Zugabe von 40 ml einer 10 M wässrigen NaOH-Lösung). Unter Anlegen eines leichten Vakuums und starkem Rühren treibt man das gelöste Chlordioxid aus, wobei sich die Lösung entfärbt. Zur Fällung des oxidierten Polymers wird die nun farblose Lösung unter Rühren portionsweise in Ethanol (1,5 l) gegeben. Das Produkt wird abgetrennt, aus H₂O in Ethanol umgefällt, anschließend abfiltriert und bei 50°C im Vakuum getrocknet.
Auswaage: 11,9 g
COOH-Gehalt: 702 mmol COOH/100 g
FTIR (KBr): 3408 (ν OH), 1650 und 1416 (ν COONa) cm^–1

Claims

Verwendung von Polysacchariden, die mit Carboxylgruppen mit einem Substitutionsgrad von 0,1 bis 3,0 substituiert sind, zur Stimulierung der Zellproliferation.
Verwendung von Polysacchariden gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Polysaccharide mit einem Substitutionsgrad 0,4 bis 2,3 zum Einsatz kommen.
Verwendung von Polysacchariden gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Polysaccharide Polyglucane, wie Cellulose, Stärke, Amylose, Amylopektin, Lichenan, Pullulan und Dextran, eingesetzt werden.
Verwendung von Polysacchariden gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Polysacchariden um Cellulose aus Holz (Zellstoff), Baumwolle bzw. anderen Einjahrespflanzen, biotechnologisch erzeugte Cellulose (Bakteriencellulose), chemisch oder enzymatisch partiell hydrolysierte oder anderweitig vorbehandelte Cellulose in beliebiger physikalischer Form handelt.
Verwendung von Polysacchariden gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Polysaccharide Cellulosederivate mit Carboxylgruppen, die durch Veretherung, Versterung oder Oxidation in die Cellulose eingeführt werden, eingesetzt werden.
Verwendung von Polysacchariden gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Polysaccharide Carboxycellulose und Carboxymethylcellulose verwendet werden.
Verwendung von Polysacchariden gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Polysaccharide Lösungen oder gequollene Gele der Polysaccharide mit einer Konzentration von 0,5% bis 20%, bevorzugt 0,5% bis 10%, in Wasser oder wasserhaltigen Medien zum Einsatz kommen.
Verwendung von Polysacchariden gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Polysaccharide ein Molekulargewicht im Bereich von 5000–10⁷ g/mol, vorzugsweise im Bereich von 10⁴–10⁷ g/mol, aufweisen.
Verwendung von Polysacchariden gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Anhydroglucose-Wiederholungseinheiten (AGU) der Polysaccharide über β – (1 → 4), α – (1 → 4), α – (1 → 3) und β – (1 → 3) Bindungen oder auch Kombinationen davon, wie beispielweise α – (1 → 4) und α – (1 → 6), verknüpft sind.
Verwendung von Polysacchariden gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Polysaccharide in Kombination mit anderen biologisch aktiven Stoffen und/oder mit Hilfs- sowie Trägerstoffen Anwendung finden.
Verwendung von Polysacchariden gemäß Anspruch 1 zur Behandlung von Wunden.
Verwendung von Polysacchariden gemäß Anspruch 1 für den Einsatz in kosmetischen und pharmazeutischen Produkten, insbesondere zur Stimulation der Hauszellbildung.
Verwendung von Polysacchariden gemäß Anspruch 1 als proliferationssteigernder Bestandteil von Materialien, beispielsweise Textilien, Kunststoffen und Formteilen, die in Kontakt mit Wunden kommen.
Verwendung von Polysacchariden gemäß Anspruch 1 als proliferationssteigernder Bestandteil zur Herstellung von Produkten für Hautersatz, Zellbildung und/oder im Tissue Engineering.