CZ309355B6 - Způsob přípravy konjugátů s řízenou rychlostí uvolňování léčiva s nosiči protinádorového léčiva na bázi selektivně oxidovaných polysacharidů - Google Patents

Způsob přípravy konjugátů s řízenou rychlostí uvolňování léčiva s nosiči protinádorového léčiva na bázi selektivně oxidovaných polysacharidů Download PDF

Info

Publication number
CZ309355B6
CZ309355B6 CZ2018461A CZ2018461A CZ309355B6 CZ 309355 B6 CZ309355 B6 CZ 309355B6 CZ 2018461 A CZ2018461 A CZ 2018461A CZ 2018461 A CZ2018461 A CZ 2018461A CZ 309355 B6 CZ309355 B6 CZ 309355B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
polysaccharides
dcc
drug
vector
antitumor drug
Prior art date
Application number
CZ2018461A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ2018461A3 (cs
Inventor
Jan VĂ­cha
Vícha Jan Mgr., Ph.D
Lukáš Münster
Lukáš Ing Münster
Zdeňka Capáková
Capáková Zdeňka Ing., Ph.D
Ivo Kuřitka
Ph.D et Kuřitka Ivo doc. Ing. et Ing. Ph.D
Michal Masařík
Masařík Michal RNDr., Ph.D
Michaela FojtĹŻ
Michaela RNDr Fojtů
Original Assignee
Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně
Masarykova Univerzita
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně, Masarykova Univerzita filed Critical Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně
Priority to CZ2018461A priority Critical patent/CZ309355B6/cs
Priority to PCT/CZ2019/050038 priority patent/WO2020052697A1/en
Publication of CZ2018461A3 publication Critical patent/CZ2018461A3/cs
Publication of CZ309355B6 publication Critical patent/CZ309355B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B15/00—Preparation of other cellulose derivatives or modified cellulose, e.g. complexes
    • C08B15/02—Oxycellulose; Hydrocellulose; Cellulosehydrate, e.g. microcrystalline cellulose
    • C08B15/04—Carboxycellulose, e.g. prepared by oxidation with nitrogen dioxide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/243—Platinum; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B15/00—Preparation of other cellulose derivatives or modified cellulose, e.g. complexes
    • C08B15/02—Oxycellulose; Hydrocellulose; Cellulosehydrate, e.g. microcrystalline cellulose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B15/00—Preparation of other cellulose derivatives or modified cellulose, e.g. complexes
    • C08B15/05—Derivatives containing elements other than carbon, hydrogen, oxygen, halogens or sulfur
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B15/00—Preparation of other cellulose derivatives or modified cellulose, e.g. complexes
    • C08B15/05—Derivatives containing elements other than carbon, hydrogen, oxygen, halogens or sulfur
    • C08B15/06—Derivatives containing elements other than carbon, hydrogen, oxygen, halogens or sulfur containing nitrogen, e.g. carbamates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B30/00—Preparation of starch, degraded or non-chemically modified starch, amylose, or amylopectin
    • C08B30/12—Degraded, destructured or non-chemically modified starch, e.g. mechanically, enzymatically or by irradiation; Bleaching of starch
    • C08B30/18—Dextrin, e.g. yellow canari, white dextrin, amylodextrin or maltodextrin; Methods of depolymerisation, e.g. by irradiation or mechanically
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C08B37/0009—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid alpha-D-Glucans, e.g. polydextrose, alternan, glycogen; (alpha-1,4)(alpha-1,6)-D-Glucans; (alpha-1,3)(alpha-1,4)-D-Glucans, e.g. isolichenan or nigeran; (alpha-1,4)-D-Glucans; (alpha-1,3)-D-Glucans, e.g. pseudonigeran; Derivatives thereof
    • C08B37/0021—Dextran, i.e. (alpha-1,4)-D-glucan; Derivatives thereof, e.g. Sephadex, i.e. crosslinked dextran
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C08B37/0024—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Glucans; (beta-1,3)-D-Glucans, e.g. paramylon, coriolan, sclerotan, pachyman, callose, scleroglucan, schizophyllan, laminaran, lentinan or curdlan; (beta-1,6)-D-Glucans, e.g. pustulan; (beta-1,4)-D-Glucans; (beta-1,3)(beta-1,4)-D-Glucans, e.g. lichenan; Derivatives thereof
    • C08B37/0033—Xanthan, i.e. D-glucose, D-mannose and D-glucuronic acid units, saubstituted with acetate and pyruvate, with a main chain of (beta-1,4)-D-glucose units; Derivatives thereof

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Řešení se týká způsobu přípravy 2,3-dikarboxypolysacharidů s řiditelnou molekulovou hmotností, volitelně modifikovaných biologicky aktivními ligandy použitelných jako nosičů protinádorových léčiv. Těmi jsou protinádorová léčiva založená na přechodných kovech, zejména na bázi bidentátně vázaných sloučenin platiny typu R2PtIIX2, R2PtIVX2L2, komplexů ruthenia typu [Ru(aren)Lx(PTA)y], či monodentátně vázaných látek typu [R3PtIIX]Y.

Description

Způsob přípravy konjugátů s řízenou rychlostí uvolňování léčiva s nosiči protinádorového léčiva na bázi selektivně oxidovaných polysacharidů
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu přípravy způsobu přípravy konjugátů s řízenou rychlostí uvolňování léčiva s nosiči protinádorového léčiva na bázi selektivně oxidovaných polysacharidů s volitelně snížitelnou hmotnostně střední molekulovou hmotností. Připravené konjugáty jsou charakteristické řiditelnou rychlostí uvolňování léčiva, vysokou efektivitou vázání nad 70 % a s přenosovou kapacitou léčiva až 80 % hmota. Jsou určeny zejména pro terapii nádorových onemocnění prostaty, vaječníků a dělohy, případně také pro terapii nádorových onemocnění plic, hlavy a krku a pro diagnostiku těchto nádorových onemocnění.
Dosavadní stav techniky
Nádorová onemocnění jsou jednou z nej závažnějších chorob a představují celosvětový problém. Přibližně 70 % pacientů diagnostikovaných na rakovinu plic, vaječníků, močového měchýře nebo varlat jev současnosti léčeno sloučeninami platiny v oxidačním stavu II o obecném složení R2PtIIX2,1 kde R2= dva monodentátní či jeden bidentátní dusíkatý ligand, tedy amin, či diamin, např. NH3 či 1,2-diaminocyklohexan, navázané k centrálnímu atomu přes atom dusíku a ve vzájemné jsou vzájemné cis orientaci, X reprezentuje aniontový ligand či dvojici ligandů, které jsou rovněž ve vzájemné cis orientaci, např. halogeny, nitro skupiny, karboxyláty, dikarboxylát.
Nej rozšířenějším a zároveň nejdéle používaným platnatým cytostatikem je cisplatina, cis[Pt(NH3)2Cl2]. Hlavní nevýhodou cisplatiny, stejně jako i dalších generací R2PtnX2 léčiv, jsou vážné vedlejší účinky (neurotoxicita, ototoxicita, nefrotoxicita, myelosuprese), které jsou důsledkem kumulativní toxicity léčiva v organismu a nespecifického mechanismu účinku. Podané léčivo totiž nečilí pouze na nádorové buňky, ale napadá také další rychle se dělicí buňky zdravé tkáně, jako je kostní dřeň, vlasové cibulky nebo spermie. Závažné vedlejší účinky snižují maximální bezpečnou dávku cytostatika, což může vést ke vzniku nádorových buněk rezistentních vůči podávanému léčivu.
Další vývoj léčiv na bázi platiny se proto ubíral různými směry ve snaze snížit nežádoucí účinky existujících cytostatik. Došlo například k vývoji monofúnkčních komplexů platiny, jako je fenanthriplatina, které pracují na principu inhibice topoisomerázy. Tyto látky obecného složení [R3PtnX]Y, kde Rsjsou tři dusíkaté ligandy volitelně různého složení navázané k centrálnímu atomu přes atom dusíku, typicky amin, či diamin, například NH3 či fenanthridin, X je aniontový ligand, typicky halogen, či karboxylát, Y je aniont anorganické či organické kyseliny, např. NO3; jsou získávány ve formě solí, ve kterých platnatý komplex nese kladný náboj.
Další alternativou jsou tzv. proléčiva, tedy sloučeniny založené na mnohem méně toxických platičitých komplexech v oktaedrickém uspořádání sumárního vzorce R2PtIVL2X2, kde R2= dva monodentátní či jeden bidentátní dusíkatý ligand, tedy amin, či diamin, např. NH3 či 1,2diaminocyklohexan, navázané k centrálnímu atomu přes atom dusíku a ve vzáj emné j sou vzáj emné cis orientaci, X reprezentuje aniontový ligand či dvojici ligandů, které jsou rovněž ve vzájemné cis orientaci, např. halogeny, nitro skupiny, karboxyláty, dikarboxylát, a L2 jsou dva axiální trans ligandy volitelně různého složení navázané k centrálnímu atomu přes karboxylovou skupinu, například sukcinát. Proléčivo je redukováno za odštěpení ligandů L2 na aktivní formu R2PtnX2 přímo v nádorových buňkách, což přináší značné snížení vedlejších účinků a zvýšení efektivity viz např. patentová přihláška US 2004/0235712 AI. Ligandy L2 při tom mohou být rovněž biologicky aktivní (terapeutika, biologické vektory).
- 1 CZ 309355 B6
Rada dalších komplexů tranzitních kovů, založených například na bázi osmia, zlata, iridia nebo ruthenia, byla testována jako možná náhrada komplexů platiny. Biologicky aktivní organoruthenité sloučeniny jsou obzvláště zajímavou alternativou s ohledem na jejich specifický profil účinku. Například tzv. RAPTA komplexy, tedy π-aren „piano-stool“ sloučeniny ruthenia s protirakovinnou aktivitou typu [Ru(aren)Lx(PTA)y], kde arén značí aromatický uhlovodík nebo jeho derivát nekovalentně navázaný na ruthenium, např. kumen, Lx je bidentátní ligand či ligandy ve vzájemné cis orientaci, může jít o halogeny, karboxyláty, či dikarboxylát, a PTA je l,3,5-triaza-7fosfatricyklo[3.3.1.1]dekan nebo jeho derivát, vykazují vysokou účinnost vůči metastázám - viz mezinárodní patentová přihláška WO 02/40494 AI. Jejich cytotoxicita navíc roste se zvýšením lipofility aromatického ligandu (arén), ovšem na úkor selektivity. Tyto látky jsou předmětem intenzivního výzkumu, ačkoliv dosud nepřekročily stádium klinických zkoušek.
Kromě modifikace struktury léčiv založených na přechodných kovech lze jejich vlastnosti zlepšit jejich konjugací na makromolekulám! nosič. Tvorba konjugátu přináší řadu výhod v porovnání s podáním samotného léčiva, zejména v oblastech snížení systémové toxicity, prodloužení doby cirkulace v krevním oběhu a zvýšeného vstřebávání buňkami. Další výhodou makromolekulámích nosičů je jejich pasivní akumulace v tumorové tkáni díky tzv. efektu zvýšené permeability a retence (EPR). EPR efekt nastává v oblasti nádoru v důsledku zvýšené propustnosti defektního endotelu, díky čemuž makromolekulámí látky snadněji difundují do oblasti nádoru. Tam se samovolně hromadí v důsledku snížené efektivity mízního systému, způsobené nekontrolovaným buněčným bujením. K uvolňování léčiva z nosiče tak dochází přímo v cílové oblasti.
Další výhodou makromolekulámích nosičů je jejich snadná modifikovatelnost. Díky množství vazebných míst na každé makromolekule lze totiž nosič kromě léčiva vybavit také cílícím vektorem a to beze změny struktury samotného přenášeného léčiva. Biologicky aktivním cílícím vektorem kde vektorem se rozumí látka, která se preferenčně váže na nádorové buňky v důsledku zvýšeného výskytu jejích receptorů v těchto buňkách a která obsahuje ve své stmktuře alespoň jednu karboxylovou skupinu. Typickým příkladem je kyselina listová, jejíž a receptory (FRa) vykazují zvýšený výskyt v řadě nádorových linií, jelikož se spolupodílejí na řízení buněčného dělení. Aktivní cílení receptorů FRa pomocí nosičů dekorovaných kyselinou listovou vede ke značnému zvýšení efektivity vstřebávání daného léčiva do nádorové buňky a tím ke zvýšení jeho efektivity.
Nej důležitějšími charakteristikami makromolekulámích nosičů léčiv jsou kromě biokompatibility a nízké toxicity dobrá rozpustnost, dobře definovatelná molekulární hmotnost, počet funkčních (vazebných) skupin na jednu polymemí jednotku, jejich vzájemná orientace a charakter navázaní léčiva (kovalentní, iontový, jiný). Hustota, pozice a vzájemná orientace funkčních skupin jsou obzvláště důležité, jelikož určují způsob navázání léčiva a tím nepřímo také transportní kapacitu nosiče a částečně také rychlost uvolňování léčiva. V principu totiž nosič může vystupovat vůči léčivu jako mono- či bidentátní ligand. Například nej rozšířenější R2PtnX2 léčiva a R2PtIVL2X2 proléčiva obsahují dvě možná vazebná místa. Jejich bidentátní vázání nosičem umožňuje dosáhnout vyšší efektivity konjugace na nosič a nedochází při něm k nežádoucím intermolekulámím síťovacím reakcím, kdy se komplex naváže postupně na dvě molekuly nosiče. Takovéto zesíťovaní zvyšuje molekulární hmotnost konjugátu, a tím pádem značně snižuje jeho rozpustnost, což ve výsledku vede ke snížení transportní kapacity nosiče.
Mezi slibné makromolekulámí nosiče léčiv patří póly sacharidy. Jejich výhodou je dobrá biokompatibilita, nízká toxicita a snadná modifikovatelnost. To vedlo k širokému využití polysacharidů a na nich založených materiálů, převážně hydrogelů, jako nosičů léčiv - viz např. řešení podle dokumentů US 6338843 Bl, US 4931553 A a US 4793986 A, patentové přihlášky US 2008/300389 AI, mezinárodní patentové přihlášky WO 96/37519 AI, či přihlášky Evropského patentu EP 1722714 AI.
Pro přenos protinádorových léčiv se využívají zejména kyselé polysacharidy, které ve stmktuře obsahují alespoň jednu karboxylovou skupinu. Důvodem je možnost přímého navázání léčiva a
-2CZ 309355 B6 relativně snadné modifikace karboxylátu (esterifikační, amidační reakce). Kyselé polysacharidy mohou být přírodní povahy (kyselina hyaluronová, či alginát) - viz řešení podle dokumentu US 4 95463 A, nebo se muže jednat o běžné sacharidy jako je celulóza nebo dextrin, synteticky modifikované -COOH skupinami. Příkladem může být ester kyseliny jantarové a dextrinu, který byl nárokován v patentu US 6338843 B1 jako nosič organických protinádorových léčiv na bázi doxorubicinu.
Nevýhodou většiny kyselých polysacharidů je poměrně nízká hustota karboxylových skupin. Obvykle se jedná o látky se stupněm substituce >1, tj. obsahujícím jednu či méně -COOH skupin najednu polymemí jednotku. To omezuje množství přenášeného léčiva a dále vede k nízké efektivitě vázání, jelikož se léčivo váže převážně monodentátně a tudíž dochází k výše zmíněným nežádoucím síťovacím reakcím. Například konjugace cisplatiny (CP) na hyaluronovou kyselinu dosahuje efektivity pouhých 30 % a přenosové kapacity kolem 25 % hmota, při výchozím poměru reaktantů 16:10 (CP:HA). Nevýhody plynoucí z tohoto uspořádání lze částečně odstranit pomocí tzv. linkerů, krátkých řetězců aminokyselin či peptidů, které jsou na jedné straně navázány na karboxylovou či hydroxylovou skupinu polysacharidů, a na druhém konci k léčivu pomocí bidentátního ligandu - viz řešení podle patentové přihlášky USA US2008300389. Nevýhodou tohoto řešení je ale vyšší komplexnost syntézy spočívající v dodatečném kroku navázání aminokyseliny na polysacharid a limitace množství přenášeného léčiva počtem možných linkerů, které je závislé na počtu -COOH skupin polysacharidů a efektivitě amidační reakce.
Potenciální řešení spočívající ve využití polysacharidů se stupněm substituce vyšším než 1, tj. s více než jednou -COOH skupinou na polymemí jednotku, jako je například karboxymethylcelulóza nebo neselektivně oxidovaná celulóza, je ovšem problematické. Tyto polysacharidy totiž vykazují kvůli neselektivní povaze oxidačních reakcí nestechiometrické složení, což komplikuje jejich využití jako nosičů léčiv. Kromě toho, sacharidy s vysokým stupněm substituce karboxylovými skupinami a neporušenou strukturou řetězce výrazně podporují buněčnou proliferaci - viz německá patentová přihláška DE 10319808A1, což je činí nevhodnými pro aplikace v protinádorové terapii.
Alternativou je využití vysoce selektivní oxidace -OH skupin polysacharidů v pozici 2 a 3 na aldehydy pomocí NaIO4 za současného přerušení vazby mezi atomy uhlíku C2 a C3. Lze tak dosáhnout mnohem vyšší hustoty funkčních skupin (2 na každou pyranózovou jednotku). Výsledný dialdehyd je ovšem jako nosič léčiv nevhodný s ohledem na jeho vysoce komplexní strukturu a sklony k degradaci. Přesto byla tato metoda v minulosti použita k aktivaci polysacharidů pro navázání linkerů tvořených aminokyselinami a deriváty dikarboxylových kyselin, na které byla navázána léčiva na bázi Pt(II) a Pt(IV) komplexů, viz řešení podle dokumentu US 4793986 A. Nevýhodou tohoto řešení je diskutabilní toxicita a komplexní struktura dialdehydu, která ještě umocňuje složitost syntézy a použití vysoce toxických solí kyanidu coby redukčních činidel.
Další oxidace dialdehydů pomocí NaC102 vede k přípravě 2,3-dikarboxypolysacharidů. Je-li vstupním materiálem celulóza, výsledným produktem je 2,3-dikarboxycelulóza (DCC). DCC má na rozdíl od běžné oxidované celulózy připravované neselektivní oxidací dobře definované složení a při vyšším stupni oxidace (nad 70 %) je dobře rozpustná ve vodě. Potenciální využití DCC a dalších 2,3-dikarboxypolysacharidů se odvíjelo převážně od jejich polyaniontového charakteru. V minulosti bylo DCC zvažováno jako jedna z možných alternativ alginátů používaných pro přípravu injekčně podávaných biodegradovatelných hydrogelů určených pro dlouhodobé uvolňování proteinů - viz řešení podle patentů US 6432449 Bl a US 6656508 B2, či Evropských patentů EP 1079811 Bl a EP 0975333 Bl. DCC je zde ale pouze navržena jako jedna z možných složek hydrogelové sítě.
Jako možná náhrada modifikovaných alginátů je DCC zmíněna také v mezinárodní patentové přihlášce WO 2005/079703 AI, zabývající se vývojem dvoufázového polymemího systému určeného pro řízené a dlouhodobé uvolňování quinazolinonových derivátů pro léčbu fibrózy. V tomto případě je kladně nabité léčivo v materiálu zadržováno na základě interakcí se záporně nabitým polymerem.
DCC je také okrajově zmíněna v patentové přihlášce US 2005/0208134 AI jako jedna z možných alternativ pro přípravu svrchní hydrofilní vrstvy obalující hydrofobní jádro v systémech určených pro přenos ve vodě nerozpustných látek.
Předmětem značně obecné mezinárodní patentové přihlášky WO 89/10928 AI je příprava konjugátu léčiv na bázi platiny a polykarboxylových kyselin jak syntetického, tak přírodního původu, které obsahují dvě -COOH skupiny na jednu polymemí jednotku. Zmiňují se zde jako jedna z možností nosiče léčiv na bázi platiny také 2,3-oxidované póly sacharidy. Popsaná metoda přípravy nosiče i konjugátů má však řadu nedostatků. Kromě nízkých výtěžků, v průměru okolo 50 %, není možná kontrola molekulové hmotnosti nosiče během syntézy. Účinnost postupu čištění nosičů a jejich konjugátů spočívající v promytí produktů organickým rozpouštědlem (ethanol, methanol, aceton) je pro odstranění nežádoucích produktů a nenavázaných komplexů platiny diskutabilní. Navíc při promytí dochází ke kontaminaci produktů použitými rozpouštědly, která se dají jen velmi obtížně separovat standardními postupy (vakuové sušení) v důsledku tvorby silných vodíkových můstků s polykarboxylovým aniontem.
Z hlediska přenášené látky byl rozsah patentové přihlášky WO 89/10928 AI omezen na kovalentně vázané látky se sumárními vzorci R2PtnX2 a R2PtIVU2X2, přičemž se pozornost věnuje téměř výhradně R2PtnX2 komplexům, kde R2=l,2-diaminocyklohexan. Příprava částečně iontově vázaných konjugátů s monofunkční komplexy platiny [R3PtnX]Y, či jinými kovy než je platina, například [Ru(aren)Ux (PTA)y], nebyla nárokována.
Rovněž možnost přípravy materiálů o dané molekulové hmotnosti a různé rychlosti uvolňování léčiva, ani modifikace póly sacharidů cílícími vektory, či jinými látkami s terapeutickým nebo diagnostickým efektem nebyly v patentové přihlášce řešeny. Celulózajako výchozí materiál je zde zmíněna pouze okrajově, pozornost je věnována v základu dobře rozpustným póly sacharidům jako je dextran/dextrin.
Ve zkratce, polysacharidy určené pro přenos metaloléčiv by měly mít dobře definovanou strukturu a složení, jednoduchou a snadno kontrolovatelnou syntézu, dobře definovanou (a definovatelnou) molekulovou hmotnost a vysokou rozpustnost. Měly by také být netoxické, biodegradovatelné, či alespoň biokompatibilní. Zároveň by měly mít co nej vyšší hustotu vhodných vazebných skupin (-COOH) ve vzdálenosti a orientaci vhodné pro chelaci kovových iontů a nést další funkční skupiny vhodné pro navázání cílících vektorů a dalších biologických látek, a to ideálně v pozici, která neomezuje množství přenášeného léčiva.
Podstata vynálezu
K vyřešení výše uvedených problémů přispívá do značné míry způsob přípravy selektivně oxidovaných póly sacharidů jako nosičů protinádorových léčiv podle vynálezu. Tento způsob je, obdobně jako postupy již známé, založen na tom, že u polysacharidu s alespoň jedním pyranózovým cyklem nesoucím hydroxylové skupiny v poloze 2 a 3 v základní strukturní jednotce se tyto hydroxylové skupiny alespoň částečně, avšak nejlépe zcela selektivně oxidují v prvním stupni na aldehydy působením jodistanu alkalického kovu za vzniku dialdehydu polysacharidu a následně pak ve druhém stupni na karboxyly působením chloritanu alkalického kovu v prostředí kyseliny octové za vzniku dikarboxypolysacharidu. Při tom je pro úplnou konverzi na aldehydy třeba použít molámí poměr jodistanu alkalického kovu ku polysacharidu 1,0 až 1,5 : 1 a dobu reakce v rozmezí 24 až 72 hodin, a následně pak ve druhém stupni převedeny na karboxyly působením chloritanu alkalického kovu v kyselém prostředí za vzniku 2,3dikarboxypolysacharidu, přičemž pro kvantitativní konverzi na karboxyly je třeba použít molámí poměr modifikovaného polysacharidu ku chloritanu alkalického kovu a ku kyselině octové 1:2:
-4CZ 309355 B6 až 1 : 8 : 4 a dobu reakce alespoň 7 hodin. Po skončení oxidačních reakcí reakční směs dialyzuje proti destilované vodě, titruje roztokem alkalického hydroxidu na neutrální pH, přefiltruje a lyofilizuje.
Podstata vynálezu spočívá vtom, že ke snížení molekulové hmotnosti Mw výchozího 2,3dikarboxypolysacharidu až na 25 % původní hodnoty se před započetím druhého stupně oxidace přidá do reakční směsi kyselina amidosulfonová, díky čemuž je možné snížit Mw výsledného produktu při současném zachování či snížení indexu polydispersity, což lze stanovit s výhodou pomocí gelové permeační chromatografie.
Takto připravený 2,3-dikarboxypolysacharid se dále může modifikovat navázáním cílícího vektoru, tj. látky která se preferenčně váže na nádorové buňky v důsledku zvýšeného výskytu jejích receptorů v těchto buňkách a která obsahuje ve své struktuře alespoň jednu karboxylovou skupinu pro připojení na 2,3-dikarboxypolysacharid, např. kyseliny listové, buď přímo nebo prostřednictvím spaceru pomocí biokonjugační reakce, při níž nejprve dochází k aktivaci -COOH skupiny vektoru pomocí karbodiimidu jako je EDC (l-ethyl-3-(3dimethylaminopropyl)karbodiimid) a NHS (N-hydroxysukcinimidu), a následně k amidační reakci s aminoskupinou spaceru (NH2-PEG-COOH). Molámí poměr jednotlivých látek je vektor : EDC : NHS : spacer 1 : 1 : 1 :1 až 1 : 10 : 1 : 10, pokud vektor obsahuje jedinou-COOH skupinu nebo 1 : 0,1 : 1 : 0,1 až 1: 0,99 : 1 : 0,99, obsahuje-li vektor více -COOH skupin. Snížením molámího poměru vektrou : EDC : spaceru pod 1 : 1 : 1 je omezen vznik nežádoucích vedlejších produktů. Ve druhém kroku je -COOH skupina spaceru nesoucího vektor opět aktivována pomocí karbodiimidu (EDC) a za přítomnosti DMAP (4-dimethylaminopyridinu) jako katalyzátoru (EDC : DMAP 10 : 1 až 100 : 1) dochází k esterifikační reakci s hydroxylovou skupinou 2,3dikarboxypoly sacharidu.
Pro přímé navázání vektoru obsahujícího -COOH skupinu, např. kyseliny listové, na polysacharid se tato -COOH skupina aktivuje pomocí karbodiimidu (EDC), a za přítomnosti DMAP (4dimethylaminopyridinu) jako katalyzátoru dochází k esterifikační reakci s hydroxylovou skupinou 2,3-dikarboxypolysacharidu.
Způsob přípravy konjugátů s řízenou rychlostí uvolňování léčiva spočívá v tom, že na připravený nosič se přes -COOH skupinu či skupiny v poloze 2 a 3 konjuguje protinádorové léčivo založené na přechodných kovech, zejména na bázi bidentátně vázaných sloučenin platiny typu R2PtnX2 či R2PtIVX2L2, kde R2= dva monodentátní či jeden bidentátní dusíkatý ligand, tedy amin či diamin, např. NH3 či 1,2-diaminocyklohexan, navázané k centrálnímu atomu přes atom dusíku, přičemž tyto atomy jsou ve vzájemné cis orientaci, X reprezentuje aniontový ligand či dvojici ligandů, které při konjugaci odstupují a které jsou rovněž ve vzájemné cis orientaci, např. halogeny, nitro skupiny, karboxyláty, dikarboxylát, dále pak π- sloučeniny ruthenia s protirakovinnou aktivitou typu [Ru(aren)Lx(PTA)y], kde arén značí aromatický uhlovodík nebo jeho derivát nekovalentně navázaný na ruthenium, např. kumen, Lx je odstupující bidentátní ligand či ligandy ve vzájemné cis orientaci, může jít o halogeny, karboxyláty, či dikarboxylát, a PTA je (1,3,5-triaza-7fosfatricyklo[3.3.1.1]dekan) nebo jeho derivát, a dále na bázi monodentátně vázaných látek typu [R3PtnX]Y, kde Rsjsou tři dusíkaté ligandy volitelně různého složení navázané k centrálnímu atomu přes atom dusíku, typicky amin, či diamin, například NH3 či fenantridin, X je aniontový ligand odstupující při konjugaci, typicky halogen, či karboxylát, Y je aniont anorganické či organické kyseliny, např. NOf. Řízení rychlosti uvolňování léčiv z konjugátu je dosaženo využitím nosiče o různé molekulové hmotnosti a použitím různého hmotnostního poměru mezi léčivem a nosičem v rozmezí 1:100 až 10:1 během přípravy. Vzniklý konjugát může tak mít různou střední molekulovou hmotnost, za předpokladu, že je tato nižší než ta u výchozího polysacharidu, a různou rychlost uvolňování léčiva danou reakčním poměrem mezi léčivem a nosičem.
Použitým 2,3-dikarboxypolysacharidem může být netoxický a biokompatibilní polysacharid, jehož struktura umožňuje selektivní oxidaci hydroxylových skupin na uhlících C2 a C3 pyranózového cyklu na aldehydy pomocí NaIO4 a jejich následnou oxidaci na karboxylové kyseliny pomocí
-5CZ 309355 B6
NaC102. Nutnou podmínkou je tedy přítomnost alespoň jednoho pyranózového cyklu nesoucího CHOH skupiny v poloze 2 a 3 v základní strukturní jednotce polysacharidu. Obecný strukturní vzorec 2,3-dikarboxypolysacharidu je na obr. 1, kde R= -OH, -COOH, -OCH2CO2H, cílící vektor, případně další funkční skupiny vyplývající ze složení zdrojového polysacharidu.
Mezi takové materiály patří mimo jiné celulóza, amylóza, škrob, pektin, dextrin, dextran, xanthan, nebo kyselý polysacharid, např. kyselina hyaluronová, karboxymethylcelulóza, karboxymethyldextran, chondroitin nebo alginát a další, přičemž preferovaným materiálem je celulóza. Materiál může být oxidován zcela nebo částečně, přičemž vyšší stupně oxidace jsou preferovány z hlediska rozpustnosti a vyšší přenosové kapacity, zatímco nižší stupně oxidace mohou přispět ke zlepšení biokompatibility a degradability nosiče v organismu, je-li to vyžadováno.
2,3-dikarboxypolysacharidy mohou být dekorovány dalšími skupinami či ligandy pro zlepšení jejich vlastností, přičemž je vhodné cílit substituci na hydroxylovou, karboxylovou, či jinou vhodnou funkční skupinu na uhlíku C6 pyranózového cyklu, je-li tato ve struktuře polysacharidu přítomna. Substituce v této pozici má totiž minimální vliv na tvorbu konjugátu s biologicky aktivní látkou probíhající v poloze 2 a 3.
Konjugovaným protinádorovým léčivem se rozumí terapeuticky využitelný neutrální či kladně nabitý komplex přechodného kovu, který se k nosiči váže buď kovalentně, nebo na základě iontových interakcí či kombinací obou možností. Pro kovalentní vázání je nutná přítomnost minimálně jednoho (monodentátní vázání), nejlépe však dvou snadno odstupujících aniontových ligandů X ve vzájemné cis orientaci (bidentátní vázání). Takovým ligandem jsou typicky anionty anorganických či organických kyselin (halogenidy, karboxyláty). Dvojice odstupujících ligandů může být nahrazena jediným bidentátním ligandem, např. dikarboxylátem. Základní podmínkou je dostatečná labilita těchto ligandu(ů), jelikož během tvorby konjugátu dochází k jejich substituci karboxylovou skupinou či skupinami nosiče. Substituce pak může probíhat spontánně. Alternativně lze využít aktivačních činidel jako je dusičnan stříbrný, je-li odstupujícím ligandem halogenid. V případě kombinovaného či iontového vázání musí být látka kladně nabitá s ohledem na polyaniontový charakter nosiče.
Vhodnými protinádorovými léčivy splňujícími výše uvedené podmínky jsou mimo jiné sloučeniny platiny s protinádorovým účinkem o obecném složení R2PtnX2, R2= dva monodentátní či jeden bidentátní dusíkatý ligand, tedy amin, či diamin, např. NH3 či 1,2-diaminocyklohexan, navázané k centrálnímu atomu přes atom dusíku a ve vzájemné jsou vzájemné cis orientaci, X reprezentuje aniontový ligand či dvojici ligandů, které jsou rovněž ve vzájemné cis orientaci, např. halogeny, nitro skupiny, karboxyláty, dikarboxylát, dále proléčiva na bázi platiny R2PtIVL2X2, kde R2= dva monodentátní či jeden bidentátní dusíkatý ligand, tedy amin, či diamin, např. NH3 či 1,2diaminocyklohexan, navázané k centrálnímu atomu přes atom dusíku a ve vzáj emné j sou vzáj emné cis orientaci, X reprezentuje aniontový ligand či dvojici ligandů, které jsou rovněž ve vzájemné cis orientaci, např. halogeny, nitro skupiny, karboxyláty, dikarboxylát, a L2 jsou dva axiální trans ligandy volitelně různého složení navázané k centrálnímu atomu přes karboxylovou skupinu, například sukcinát, odstupující během redukce platičitého komplexu na platnatý. Ligand L2 může být biologicky aktivní (protinádorová léčiva, biologické vektory), či využitelný pro diagnostiku (fluorescenční barviva), případně jejich kombinace.
Dále se může jednat o komplexy platiny R3PtnX]Y, kde R3 jsou tři dusíkaté ligandy volitelně různého složení navázané k centrálnímu atomu přes atom dusíku, typicky amin, či diamin, například NH3 či fenanthridin, X je aniontový ligand, typicky halogen, či karboxylát, Y je aniont anorganické či organické kyseliny, např. NO3·. |R,PtX| komplex nese kladný náboj.
Mimo komplexy platiny se může jednat například o π-aren „piano-stool“ sloučeniny ruthenia s protirakovinnou aktivitou typu [Ru(aren)Lx(PTA)y], kde arén značí aromatický uhlovodík nebo jeho derivát nekovalentně navázaný na ruthenium, např. kumen, Lx je bidentátní ligand či ligandy
-6CZ 309355 B6 ve vzájemné cis orientaci, může jít o halogeny, karboxyláty, či dikarboxylát, a PTA je (1,3,5-triaza7-fosfatricyklo[3.3.1.1]dekan) nebo jeho derivát.
Řešení podle vynálezu umožňuje připravit nosiče protinádorových léčiv založených na přechodných kovech o vysoké čistotě a volitelné střední molekulové hmotnosti (Mw), je-li tato nižší než Mw vstupního póly sacharidu. Oproti jiným nosičům léčiv, založených na polysacharidech, předkládané řešení umožňuje přenos širokého spektra metaloléčiv, včetně neplatinových cytostatik, přináší vyšší efektivitu vázání léčiva díky možnosti bidentátního vázání a vysokou přepravní kapacitu (vysoká hustota vazebných skupin), a to při zachování dobré rozpustnosti. Umožňuje také pokročilé cílení léčiv díky kombinaci pasivního (EPR efekt) a aktivního cílení tumorů (cílící vektory) a řiditelné rychlostí uvolňování léčiva. Finální produkt není kontaminován organickými rozpouštědly, protože není používána metoda vysrážení produktu alkoholem a případné kontaminanty včetně nenavázaného léčiva jsou z finálního produktu odstraněna pomocí dialýzy.
Objasnění výkresů
K bližšímu objasnění podstaty vynálezu přispívají přiložené výkresy, kde představuje:
Obr. 1 - Znázornění obecné struktury 2,3-dikarboxypolycharidu
Obr. 2 - Část Ή NMR spektra DCC připraveného postupem podle příkladu 1 (25 °C, D2O). Stupeň oxidace 95 %
Obr. 3 - Schéma oxidace a modifikace celulózy a přípravy konjugátu cisplatina-DCC (CP-DCC). R=0H, OOC-PEG-F
Obr. 4 - Znázornění struktury CPDCC vytvořené na základě spektroskopických analýz
Obr. 5 - a) Efektivita navázání cisplatiny jako funkce poměru reaktantů
b) Rychlost uvolňování cisplatiny z nosiče o různé molekulové hmotnosti pro různá přenášená množství cisplatiny
Obr. 6 - Rychlost uvolňování aktivní látky (PhPt2+) v závislosti na postupu přípravy
Obr. 7 - a) Strukturní vzorec sloučeniny RAPTA-C
b) Model předpokládané struktury konjugátu RAPTA-C a DCC (R-DCC)
Obr. 8 - Univarietní křivka přežití myší léčených CP (modrá barva) a CP-DCC (červená barva), Mw nosiče 18 kDa, 44 % hmota. CP)
Obr. 9 - Distribuční mapy ilustrují relativní zastoupení platiny v nádorové tkáni myší, kterým byla administrována CP (Obr. 9a) nebo CP-DCC (Obr. 9b).
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1
Příprava 2,3-oxidovaných polysacharidů na příkladu dikarboxylcelulózy (DCC)
Detailní popis přípravy vysoce čistých, selektivně 2,3-oxidovaných polysacharidů pro účely přenosu léčiv řešení je demonstrován na příkladu 2,3-dikarboxycelulózy, lze jej však aplikovat na jakékoliv jiné vhodné polysacharidy uváděné výše. Postup vychází ze známých metod přípravy
-7 CZ 309355 B6
2,3-dikarboxycelulózy, je však doplněn o metodu dosažení plně oxidovaného materiálu, řízení molekulové hmotnosti produktu a o postup modifikace nosiče biologicky či diagnosticky aktivní látkou a další kroky nutné k přípravě vysoce čistého materiálu pro biologické aplikace.
Vstupním materiálem pro syntézu je polysacharid o vysoké čistotě, ke kterému je přidán roztok jodistanu sodného jako oxidačního činidla. Molámí poměr reaktantů a doba oxidace závisí na požadovaném stupni konverze a typu polysacharidu. Pro kvantitativní konverzi byla použita oxidace při molámím poměru reaktantů (NaIO4 : sacharid) 1.2 : 1 probíhající po dobu 72 hodin. Použitím těchto podmínek lze z celulózy při teplotě 30 °C a za nepřístupu světla připravit dialdehyd celulózy (DAC) o stupni konverze nad 90 %. Oxidační reakce byla ukončena po uplynutí požadované reakční doby přídavkem ethylenglykolu. Meziprodukt byl následně zbaven zbytků oxidačních činidel a dalších nečistot pomocí filtrace a centrifůgace a jeho stupeň konverze stanoven pomocí oximační reakce a alkalimetrické titrace.
Takto připravený dialdehyd polysacharidu byl dále oxidován pomocí NaC102 v přítomnosti kyseliny octové, v optimálním molámím poměru reaktantů (-CHO : NaC102: CH3COOH) 1:4: 2. V případě celulózy je reakce kvantitativně dokončena po 7 h při 30 °C za nepřístupu světla. Dobu reakce a reakční poměr reaktantů lze upravit v závislosti na konkrétním materiálu a požadovaných vlastnostech produktu.
Reakce byla následně zastavena pomocí přídavku vhodné báze (konkrétně roztok NaOH) a reakční směs byla dialyzována proti destilované vodě po dobu minimálně 48 hodin nebo do vyrovnání pH. Následně byl produkt titrován roztokem NaOH na neutrální pH a výsledný roztok sodné soli 2,3dikarboxypolysacharidu přefiltrován a lyofilizován.
Takto byl připraven vysoce čistý produkt se stupněm oxidace >95 % o molekulové hmotnosti (Mw) odpovídající vstupnímu materiálu, jelikož k degradaci polymemích řetězců při oxidaci prakticky nedochází (viz část Ή NMR spektra DCC na obr. 2. Neoznačené signály nízké intenzity patří neoxidovaným anhydroglukózovým jednotkám celulózy).
Příklad 2
Příprava 2,3-oxidovaných polysacharidu o nižší molekulové hmotnosti než výchozí polysacharid na příkladu dikarhoxylcelulózy (DCC)
Pro přípravu materiálů o nižší molekulové hmotnosti než výchozí polysacharid byl před započetím druhého stupně oxidace přidán do reakční směsi roztok kyseliny amidosulfonové. Kromě potlačení vzniků nežádoucích chlornanů v reakční směsi ovlivňuje přítomnost této látky přímo molekulovou hmotnost oxidovaného polysacharidu. Střední molekulová hmotnost (Mw) výsledného produktu je totiž nepřímo závislá na molámím množství kyseliny amidosulfonové v reakční směsi.
V případě připraveného dialdehyducelulózy (DAC) o Mw 76 kDa vedlo přidání 0,25 molámího ekvivalentu (vůči stanovenému množství -CHO skupin) kyseliny amidosulfonové během sekundární oxidace ke snížení Mw na 55 kDa (70%), zatímco přidání 0,5 molámího ekvivalentu vedlo k materiálu s Mw 18 kDa (25%), přičemž distribuce molekulových hmotností byly stanoveny za pomocí gelové permeační chromatografie (měřeno na Waters HPLC systému s kolonou Tosoh TSKgel GMPWxl, mobilní fáze 0,lM NaNO3 a 0,05 M Na2HPO4.12H2O).
To umožňuje přípravu nosičů s různou rychlostí uvolňování léčiva za použití stejného výchozího materiálu. Na rozdíl od dalších metod snižování molekulové hmotnosti, jako je například rozvařování, nedochází tímto postupem k nekontrolovanému nárůstu indexu polydispersity (PDI) produktu. PDI takto připravených produktů je stejný jako v případě materiálů připravených bez přídavku kyseliny amidosulfonové a může být i lepší než u výchozího materiálu. V případě oxidované celulózy se PDI pohyboval mezi 1,6 - 1,7. Distribuci molekulových hmotností nosiče lze nadále snížit např. pomocí HPLC v separačním módu.
-8CZ 309355 B6
Takto připravené sodné soli 2,3-dikarboxypolysacharidů je možné použít přímo k tvorbě konjugátů s metaloléčivy, či je dále modifikovat biologicky aktivními látkami pro lepší cílení tumorů či látkami určenými pro diagnostické účely.
Příklad 3
Příprava částečně oxidovaných 2,3-oxidovaných polysacharidů na příkladu dikarhoxylkarhoxymetylcelulózy (DCCMC)
Pomocí karboxymethyl celulózy (CMC) je demonstrován postup částečné oxidace kyselého polysacharidů dobře rozpustného ve vodě. K vodnému roztoku CMC byl přidán jodistan sodný molámím poměru reaktantů 1,2 : 1 (NaIO4 : CMC) jako oxidační činidlo a reakce probíhala při teplotě 30 °C a za nepřístupu světla po dobu 5 h. Částečně oxidovaná CMC dále vstoupila do sekundární oxidace s upravenou stechiometrií reakce definovanou molámím poměrem CMC ku chloritanu alkalického kovu a ku kyselině octové 1:2:2a dobou reakce 3,5 h.
V rámci přípravy nosiče lze využít roztok amidosulfonové kyseliny k dalšímu řízení molekulové hmotnosti vzhledem k užitným vlastnostem jako kinetika uvolňování.
Další postup byl identický s přípravou DCC. Výtěžek 94 %, stupeň oxidace: 55 %.
Příklad 4
Příprava 2,3-oxidovaných polysacharidů na příkladu dextran, dextrin a xanthan
Postupem analogickým k příkladu č. 3 lze připravit nosiče protinádorových léčiv i z dalších polysacharidů dobře rozpustných ve vodě - konkrétně např. z dextranu, dextrinu a xanthanu. Pro úplnou konverzi je třeba prodloužit dobu primární oxidace na min. 24 h a sekundární na 7 h, jako v příkladu č. 2.
Příklad 5
Modifikace polysacharidů biologicky aktivními látkami
Biologicky či diagnosticky aktivní látku lze na nosič navázat buď přímo, nebo přes tzv. spacer, což je (makro)molekulámí řetězec o vhodné délce, například modifikovaný polyethylenglykol (PEG) o Mw 100 až 20 000 Da. Jedinou podmínkou je přítomnost karboxylové skupiny ve struktuře vázané látky. První, jednodušší, možnost je vhodná pro navázání látek, které přímo neinteragují s živým organismem, např. fluorescenčních činidel. Druhý způsob je preferovaný u cílících vektorů, jelikož díky přítomnosti spáčem dochází ke snížení sterického bránění biologického vektom makromolekulámím řetězcem nosiče a vektor se tak může snadněji navázat na receptor cílové buňky.
Obecně, postup přípravy vektorem modifikovaného 2,3-polysacharidů se opírá o využití tzv. biokonjugačních reakcí, zde optimalizovaných pro modifikace 2,3-polysacharidů. V prvním kroku dochází k aktivaci -COOH skupiny vektom pomocí l-ethyl-3-(3dimethylaminopropyl)karbodiimidu (EDC) a N-hydroxysukcinimidu (NHS) a následné amidační reakci s aminoskupinu spáčem (NH2-PEG-COOH). Ve druhém krokuje pomocí EDC selektivně aktivována karboxylová skupina spáčem za přítomnosti DMAP (4-dimethylaminopyridin) jako katalyzátom a dochází k esterifikační reakci s hydroxylovou skupinou 2,3dikarboxypolysacharidu. Pro přímé navázání se lze karboxylovou skupinu vektom rovnou aktivovat pomocí EDC a v přítomnosti DMAP nechat reagovat s 2,3-dikarboxypolysacharidem.
-9CZ 309355 B6
Celý postup je detailně popsán na příkladu kyseliny listové navázané přes modifikovaný polyethylenglykol NH2-PEG-COOH k -OH skupině 2,3-dikarboxycelulózy (DCC), označované jako F-DCC. Selektivní oxidace hydroxylových skupin polysacharidů na uhlíkových atomech C2 a C3 má za následek substituci téměř výhradně na uhlíku C6. Dochází tak k minimálnímu ovlivnění množství přenášeného léčiva.
Kyselina listová byla při syntéze F-DCC rozpuštěna v suchém DMSO, smíchána s 1 molámím ekvivalentem NHS a aktivována přídavkem EDC. S ohledem na přítomnost dvou -COOH skupin ve folátu bylo vhodné předejít vzniku vedlejších produktů snížením molámího ekvivalentu EDC vůči substrátu na 0,95 či méně a prodloužit dobu reakce na 6 hodin. Bylo tak dosaženo vyšší čistoty meziproduktu výměnou za drobné snížení výtěžku. Pokud by byla v cílové molekule přítomna jen jedna karboxylová skupina, bylo by vhodné použít větší množství EDC (nejlépe >1,2 ekvivalent) a kratší dobu aktivace. Aktivovaný folát byl následně vysrážen směsí acetonu a etheru 1:3, zfiltrován, promyt, vysušen a čistý produkt znovu rozpuštěn v suchém DMSO. K reakční směsi byl přidán 0,95 molámí ekvivalent NH2-PEG-COOH o vhodné Mw a směs byla jemně míchána při 40 °C po dobu 18 hodin za nepřístupu světla pod inertní dusíkovou atmosférou. Následně pak byla reakční směs dialyzována pomocí membrány s MWCO (molecular-weight cut-off) , 1,5 kDa vůči destilované vodě. Výsledný produkt (F-PEG) byl získán lyofilizací.
F-PEG byl následně rozpuštěn v suchém pyridinu a aktivován pomocí 0,95 ekvivalentu EDC po dobu 24 hodin a do reakční směsi byl následně přidán DMAP (4-dimethylaminopyridin) jako katalyzátor esterifikačních reakcí (molámí poměr EDC : DMAP se může pohybovat v rozmezí 10 : 1 až 100 : 1) a 2,3-dikarboxycelulóza rozpuštěná v suchém DMSO. Molámí poměr F-PEG : DCC závisí na požadovaném stupni substituce. Vliv folátu na biologickou efektivitu nosiče byl zaznamenán už při 5% a nižší substituci. Reakce byla ukončena po 24 hodinách přidáním vody. Následovala dialýza (MWCO 14 kDa), během které byl odstraněn nezreagovaný F-PEG, a lyofilizace. Zastoupení folátu ve výsledném materiálu lze stanovit pomocí UV/VIS spektroskopie.
Příklad 6
Příprava konjugátů s komplexy přechodných kovů na příkladu konjugátu cisplatiny s DCC a FDCC
Obecně se 2,3-dikarboxypolysacharid o zvolené Mw rozpustí v destilované vodě a za stálého míchání se k němu po kapkách přidává roztok biologicky aktivního komplexu přechodného kovu, obsahující minimálně jeden snadno odstupující ligand.
Je-li labilita odstupujícího ligandu dostatečná, reakce probíhá spontánně. Poměr reaktantů závisí na požadovaném množství přenášené látky a ovlivňuje také rychlost jejího počátečního uvolňování. Typicky se může jednat o hmotnostní poměry látka : nosič od 1 : 100 až po 10 : 1.
Reakční směs byla poté šetrně míchána za nepřístupu světla. Pro dosažení kvantitativního průběhu reakce je možné prodloužit reakční dobu až na 96 hodin. Reakci lze provádět při teplotě mezi 0 až 50 °C v závislosti na reaktivitě léčiva. Snížením teploty je možné zabránit nežádoucímu vysrážení produktů, ke kterému dochází kvůli přesycení řetězců nosiče v důsledku příliš vysoké reaktivity léčiva a nerovnoměrného průběhu reakce.
V případě nízké lability odstupujících ligandů je možné léčivo aktivovat, a to buď jejich eliminací ligandů, či jejich substitucí za labilnější. Jsou-li odstupujícími ligandy halogenidy, je možné použít aktivaci pomocí dusičnanu stříbrného. Po filtraci/centrifugaci vysrážené stříbrné soli je roztok aktivovaného komplexu smíchán s roztokem nosiče, jak je popsáno výše. Po ukončení reakce jsou nenavázané komplexy odstraněny dialýzou.
-10 CZ 309355 B6
Doba dialýzy by měla odpovídat 4 až 8 násobku doby, za kterou přes dialyzační membránu projde nenavázaná látka. Typicky se jedná o 2 až 4 hodiny. Delší doba dialýzy vede ke zbytečným ztrátám, zatímco kratší doba nezaručuje dostatečně vysokou čistotu konjugátu.
Celý proces přípravy nosiče a konjugátu dekorovaného folátem je schematicky znázorněn na obr. 3 na příkladu DCC a cisplatiny.
Vodný roztok cisplatiny (2 mg/ml) byl za laboratorní teploty a stálého míchání postupně přidáván k rozpuštěnému DCC nebo F-DCC (2 mg/ml) a reakční směs byla za nepřístupu světla míchána 72 hodin. Po uplynutí této doby byl roztok dialyzován po dobu 4 hodin vůči destilované vodě (MWCO membrány 3,5 kDa) a následně lyofilizován. Reakce byly prováděny s DCC o Mw 18 a 76 kDa a F-DCC o Mw 18 kDa. Testovaný poměr reaktantů (CP : DCC) se pohyboval mezi 4 : 10 až 12 : 10 (28 až 55 % hmota.). Tvorba konjugátu (CPDCC) byla sledována pomocí infračervené spektroskopie ve vzdálené oblasti (FIR), 13C a195Pt NMR spektroskopie a rentgenové fluorescenční spektroskopie (XRF). Ve FIR spektrech došlo během konjugace k zániku pásů při 315 a 323 cm1 odpovídajících Cl-Pt-Cl vibracím cisplatiny, za současného vzniku pásů při 338 a 387 cm1, které odpovídají O-Pt-O vibracím. Ve 13C NMR spektrech se tvorba konjugátu projevila vznikem širokého signálu karboxylových skupin při 175.3 ppm, který byl přiřazen uhlíkům C2 a C3 nesoucím navázaný cisplatinový zbytek. Bidentátní koordinace CP byla pak doložena 195Pt NMR spektry, ve kterých došlo během konjugace k posunu signálu cisplatiny z -2149 ppm na -1605 ppm, tedy do oblasti, kde typicky rezonují čtvercově planámí komplexy platiny koordinované dvojicí atomů dusíku a dvojicí atomů kyslíku.
Model předpokládané struktury konjugátu, optimalizované za pomocí teorie funkcionálu hustoty (DFT) s využitím ΡΒΕ0 funkcionálu a tzv. split-valence bázového setu, je znázorněn na obr. 4.
Množství cisplatiny navázané v konjugátu bylo stanoveno pomocí XRF spektroskopie. Efektivita navázání cisplatiny neklesla pod 90 % ani při poměru reaktantů 12:10. Efektivita navázání cisplatiny jako funkce poměru reaktantů je znázorněna na obr. 5a.
Dále je možné v závislosti na obsahu cisplatiny a střední molekulové hmotnosti (Mw) nosiče řídit rychlost uvolňování aktivní látky v rozsahu od <10 %/24 h až do >70 %/24 h. Vybrané příklady jsou znázorněny na obr. 5b. Rychlost uvolňování cisplatiny byla sledována následujícím způsobem: 20 mg CP-DCC o různé molekulové hmotnosti a obsahu cisplatiny bylo rozpuštěno při 37 °C v 5 ml fosfátového pufru (PBS) o pH 7,4 nebo 5,5 a dialyzováno proti 95 ml stejného média (MWCO membrány 3,5 kDa). V určených časových intervalech byly odebírány alikvotní vzorky (5 ml) a obsah platiny v nich byl analyzován pomocí XRF. Po každém odběru bylo přidáno 5 ml PBS pro zachování konstantního objemu.
Jednoduchou modifikací syntézy tak lze připravit materiál s dlouhodobým a téměř lineárním průběhem uvolňování aktivní látky (nosič o Mw > 70 kDa, poměr CP : DCC od 1:10 do 6 : 10), stejně tak systém s vysokou rychlostí počátečního uvolňování (nosič o Mw <25 kDa, vysoký obsah přenášené látky, poměr CP : DCC od 6 : 10). Rychlost uvolňování je také závislá na pH, např. v případě CP-DCC s Mw 76 kDa se po 8 h při pH 5,5 uvolní téměř dvojnásobek aktivní látky než při pH 7,4 (viz obr. 5b). To přispívá k lepšímu cílení léčiva a snížení vedlejších účinků, jelikož se aktivní látka může uvolňovat v kyselém mikroprostředí tumorů o poznání rychleji než v jiných tkáních.
Příklad 7
Příprava konjugátu fenanthriplatiny s DCC a F-DCC
Fenanthriplatina, c/5-[Pt(NH3)2-(fenanthridin)Cl]NO3, PhPt, byla rozpuštěna ve vodě při 0 °C (0,8 mg/ml) a pozvolna přikapávána do roztoku DCC (0 °C, 1 mg/ml). Reakční směs byla za opatrného míchání a bez přístupu světla ponechána v izolované nádobě pozvolna temperovat na
-11 CZ 309355 B6 laboratorní teplotu po dobu 96 hodin. Roztok byl následně dialyzován a lyofilizován za stejných podmínek jako v případě CP-DCC. Testovaný poměr reaktantů (PhPt: DCC) se pohyboval mezi 2 : 10 až po 8 : 10.
Alternativní způsob přípravy využíval aktivaci PhPt pomocí 0,95 molámího ekvivalentu AgNOs při 50 °C po dobu 16 hodin. Roztok byl následně zchlazen na 0 °C, vysrážený AgCl separován pomocí filtrace a centrifugace a roztok obsahující aktivovaný PhPt2+použit pro přípravu konjugátu (PhDCC), jak je popsáno výše. Tento postup byl použit i pro přípravu konjugátu s F-DCC (Mw 76 kDa).
Vzniklý konjugát byl charakterizován pomocí 13C NMR spektroskopie a XRF. Částečně kovalentní charakter konjugace dokládá vznik signálu C2 a C3 karboxylových skupin nesoucích PhPt2+ při 171 ppm. Efektivita vázání PhPt na DCC je o něco nižší než u bidentátně vázané cisplatiny, ale stéle dosahuje vysokých 87 % při reakčním poměru 4 : 10 a 77 % při poměru 8 : 10 (PhPt: DCC).
Rychlost uvolňování aktivní látky závisí v tomto případě kromě množství přenášené látky a molámí hmotnosti nosiče také na způsobu přípravy konjugátu (viz obr. 6). Zatímco z konjugátu připraveného přímou reakcí PhPt s DCC se během první hodiny uvolní přes 20 % aktivní látky, u konjugátu připraveného pomocí aktivace AgNCL jsou to pouhá 3 %, pravděpodobně kvůli vyššímu zastoupení kovalentně vázané PhPt2+ v konjugátu připraveném aktivací AgNOs. Opožděné uvolňování léčiva přináší potenciál pro snížení vedlejších účinků, protože je omezeno jeho předčasné uvolňování mimo cílovou tkáň.
Příklad 8
Příprava konjugátu RAPTA-C s DCC
Komplex RAPTA-C, Ru11 komplex reprezentující neplatinová protirakovinná léčiva (viz strukturní vzorec a model předpokládané struktury na obr. 7), nese chloridové ligandy navzájem svírající úhel Cl-Ru-Cl » 90° (cis orientace) a ve vzájemné vzdálenosti Cl - Cl 3.3 Á, podobně jako je tomu u cisplatiny. Ligandy se tedy nacházejí v ideální pozici pro substituci karboxylovými skupinami nosiče.
S ohledem na obecně vyšší reaktivitu komplexů ruthenia byl konjugát DCC a RAPTA-C, R-DCC připraven za snížené teploty a za stejných podmínek jako v případě PhDCC, s využitím nižšího vstupního poměru reaktantů 4:10 (RAPTA-C : DCC).
Množství navázaného ruthenia bylo stanoveno pomocí XRF analýzy. Efektivita reakce dosahovala 80 %. Uvolňování RAPTA-C komplexu z R-DCC je rychlejší než v případě cisplatiny (85 %/24 h), což je způsobeno vyšší labilitou vazeb Ru-O.
Příklad 9
Biologické testy - In vitro studie
Biologické testy byly provedeny in vitro na řadě buněčných linií reprezentující zdravé tkáně, primární a metastatické nádorové buňky. Cytotoxicita testovaných látek vůči jednotlivým buněčným liniím byla stanovena pomocí metabolické testu MTT. Ten je založen na principu redukce tetrazoliové soli MTT (3-(4,5-dimethyl-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromid) mitochondriálními reduktázami na nerozpustný barevný formazan. Po rozpuštění formazanu v organickém rozpouštědle je možno spektrofotometricky kvantifikovat buněčnou viabilitu, neboť ke konverzi MTT na formazan dochází pouze v metabolicky aktivních, tedy živých buňkách.
Zdravé tkáně jsou reprezentovány liniemi NIH/3T3 (myší embryonální fibroblasty), HFF (lidské fibroblasty) a PNT1A (zdravé prostatické buňky). Primární lidské nádorové linie: A2780 (ovariální
-12 CZ 309355 B6 karcinom), A2780/CP (ovariální karcinom rezistentní vůči cisplatině), A549 (plicní karcinom), 22RV1 (prostatický karcinom). Metastatické nádorové linie: H1299 (plicní), PC-3 (prostatické). Folátem značené konjugáty byly navíc testovány na myší 4T1 a lidské MCF-7 prsní nádorové linii.
S ohledem na pozvolné uvolňování léčiva byla doba inkubace během MTT prodloužena na 48 hodin, výjimku tvoří folátem značené nosiče, u nichž se aktivní biologické cílení projevilo vyšší efektivitou již po 24 hodinách. Uvedené koncentrace odpovídají koncentraci podaného či přenášeného léčiva, které inhibuje viabilitu buněk z 50 % (IC50).
Testování DCC (připravené podle příkladu 2) a CP-DCC (připraveného podle příkladu 6)
Samotná DCC byla necytotoxická v celém rozsahu testovaných koncentrací, a to jak u zdravých, tak nádorových linií, bez ohledu na jeho molekulovou hmotnost či stupeň oxidace. Výsledky prezentované v tabulce 1 byly získány pro DCC o Mw 18 kDa. Terapeutické koncentrace konjugátu CP-DCC (Mw nosiče 18 kDa, 44 % hmota. CP) a volné cisplatiny (CP) jsou řádově nižší (tabulka 1). Vliv cytotoxicity nosiče je tak v reálném systému zanedbatelný.
Tabulka 1: Hodnoty IC50 pro čistou DCC (Mv = 18 kDa), volnou cisplatinu (CP) a konjugát cisplatiny a DCC (CP-DCC, Mw nosiče 18 kDa, 44 % hmotn. CP) na zdravých (NIH/3T3, HFF, PNT1A) primárních nádorových (A2780, A2780/CP, A549) a metastatických (H1299, 22RV1) buněčných liniích.
Linie
DCC CP
CPDCC
NIH/3T3 >500 12,0 105,0
HFF >300 70,0 190,0
PNT1A >500 5,0 14,7
A2780 >500 9,4 20,4
A2780/CP >500 4,7 9,3
A549 >500 32,1 52,4
PC-3 >500 20,5 17,5
H1299 >500 53,4 66,9
22RV1 >500 8,0 11,3
Cytotoxicita CP-DCC vůči zdravým buňkám je 3 až 9x nižší (3-9x vyšší inhibiční koncentrace, IC50) než je tomu u volné CP. Naopak cytotoxicita CP-DCC vůči primárním a metastatickým nádorovým buněčným liniím jev průměru pouze o 40 % nižší než u volné CP. V některých případech (linie PC-3, tabulka 1) je dokonce mírně vyšší. O 40 % nižší cytotoxicita koresponduje s rychlostí uvolňování léčiva z konjugátu, která v tomto případě dosahuje 60 až 70 % za 48 hodin (viz obr. 5b).
Ze získaných dat lze vyvodit, že v případě ekvitoxické dávky CP-DCC dosáhne výrazně vyšší cytotoxicity vůči nádorovým buňkám, než je tomu u volné cisplatiny.
Testování PhPt a Ph-DCC (připraveného podle příkladu 7)
Hodnoty IC50 vůči zdravým buňkám pro PhPt a Ph-DCC (Mw nosiče 76 kDa, 26 % hmotn. PhPt) jsou přibližně srovnatelné, Ph-DCC je ovšem v průměru efektivnější vůči nádorovým liniím než volné PhPt. V případě linie A549 je IC50 Ph-DCC dokonce několikanásobně nižší, viz tabulka 1. Vyšší účinnost Ph-DCC v porovnání s volným léčivem, tedy opačný trend než v případě CP a CPDCC, koreluje s rychlejším uvolňováním aktivní látky z Ph-DCC v porovnání s CP-DCC, viz obr. 5b a 6.
-13 CZ 309355 B6
Tabulka 2: Hodnoty IC 50 pro volnou fenanthríplatínu (PhPt), konjugát fenanthriplatiny a DCC (Ph-DCC, Mw nosiče 76 kDa, 26 % hmotn. PhPt) na zdravých (NIH/3T3, PNT1A), primárních nádorových (A2780, A2780/CP, A549) a metastatických (22RV1) nádorových buněčných liniích.
Linie PhPt Ph-DCC
NIH/3T3 >10 >10
PNT1A 3,3 2,4
A2780 1 1
A2780/CP 1,8 2,6
A549 2,4 0,4
22RV1 2 1,8
Testování F-DCC (připr. podle příkladu 5), CP-F-DCC (příklad 6) a Ph-F-DCC (příklad 7)
Zvýšení efektivity konjugátů s aktivním cílením (CP-F-DCC a Ph-F-DCC) v porovnání s CP-DCC a Ph-DCC je pozorovatelné na myších (4T1) i lidských (MCF-7) prsních nádorových liniích, viz Tabulka 3. Výhoda aktivního cílení se projevuje již během prvních 24 hodin, kdy dochází v některých případech až k několikanásobnému snížení IC50 v porovnání s nemodifikovaným konjugátem, viz tabulka 3.
Tabulka 3: Hodnoty IC50 pro konjugát CP-DCC (Mv nosiče 18 kDa, 44 % hmotn. CP) a jeho folátem dekorovaný ekvivalent CP-F-DCC. Ph-DCC (Mv nosiče 76 kDa, 26 % hmotn. PhPt) a jeho folátem dekorovaný ekvivalent Ph-F-DCC, na myších (4T1) a lidských (MCF-7) prsních nádorových liniích.
IC50 (24 h)
Linie CP-DCC CP-F-DCC
4T1 45,7 31,6
MCF-7 42,2 36,7
Ph-DCC Ph-F-DCC
4T1 >10 3,7
MCF-7 1,3 3,6
In vivo experimenty
In vivo testování CP a konjugátu CP-DCC (Mw nosiče 18 kDa, 44 % hmotn. CP) bylo provedeno podle experimentálního plánu schváleného Etickou komisí na ochranu zvířat (Lékařská fakulta, Masarykova univerzita, Brno) na 10 samicích athymických myší Nu/Nu o váze 19,7 až 25,9 g a stáří 8 týdnů. Indukce nádorů byla provedena s.c. injekcí buněk karcinomu ovaria A2780 v interskapulámí oblasti (200 pl, 5TO6 buněk/myš v 100 ml PBS). Po 25 dnech od indukce, kdy nádory dosáhly průměrné velikosti cca 6x6 mm, byly myším dvakrát týdně i.v. administrovány CP a konjugát CP-DCC o koncentraci 1,5 mg/ml a 3 mg/ml (v tomto pořadí) v 200 μΐ fyziologického roztoku, což odpovídá stejné výsledné koncentraci účinné látky.
Na základě log-rank testu (viz obr. 8) byl zjištěn statisticky významný rozdíl v přežívání mezi skupinami, kterým byla administrována CP, anebo CP-DCC (p = 0.008). Doba přežití u myší léčených CP-DCC byla výrazně delší než v případě těch, kterým byla administrována volná CP (viz obr. 8).
Na obr. 8 je znázorněna univarietní křivka přežití myší léčených CP (modrá barva) a CP-DCC (červená barva, Mw nosiče 18 kDa, 44 % hmotn. CP). Multivarietní analýza byla provedena s užitím Coxova proporcionálního rizikového modelu.
-14 CZ 309355 B6
Stanovení distribuce platiny v nádoru
Distribuce platiny v nádorové tkáni byla stanovená s použitím LA-ICP-MS systému UP 213 (NewWave, USA), který se skládá z Q-Switch Nd:YAG laseru o vlnové délce 213 nm a šířce pulzu 4,2 nm a z pohyblivé ablační cely (SeperCellTM, promývací čas 1.04 s). Ablace materiálu byla provedena v heliové atmosféře s průtokem 1,0 1/min do kvadrupólu ICP-MS 7500ce (Agilent Technologies, Japonsko) vybaveným kolizní celou v módu He (2,3 ml/min) za účelem minimalizace možných polyatomických interferencí a kvadrupólovým analyzátorem. Argon byl přimíchán ještě před vstupem do ICP plamene (0,6 1/min). Bylo sledováno zastoupení izotopu platiny 195Pt, integrační čas 0,3 s. S přihlédnutím k velikosti vzorku byl průměr laserového paprsku nastaven na 100 pm a skenovací rychlost na 200 pm/s. Parametry laserového paprsku jako fluence a laser repetition rate byly nastaveny na 8 J/cm2 a 10 Hz, v tomto pořadí.
Heaúnapy na obr. 9 ilustrují relativní distribuci platiny (lokální koncentrace platiny) v nádorové tkáni myší, kterým byla administrována CP (obr. 9a) nebo CP-DCC (obr. 9b).
Stanovená barevná škála odpovídá průměrné koncentraci platiny (pg/g) a má rozsah 0 až 18 pg/g (obr. 9a) a 0 až 25 pg/g (obr. 9b). V případě myší, kterým byla administrována CP, tedy dosahovala koncentrace platiny v maximech pouze 18 pg/g, zatímco u myší, léčených CP-DCC, byla akumulace výrazně vyšší, až 25 pg/g. Konjugace CP na DCC tedy výrazně zvyšuje akumulaci platiny v nádorové tkáni.

Claims (2)

PATENTOVÉ NÁROKY
1. Způsob přípravy konjugátů s řízenou rychlostí uvolňování léčiva, vysokou efektivitou vázání protinádorových léčiv nad 70 % a s přenosovou kapacitou léčiva až 80 % hmoto., na bázi nosičů protinádorových léčiv zejména pro terapii nádorových onemocnění prostaty, vaječníků a dělohy, vyznačující se tím, že se
a) nejprve připraví nosič protinádorového léčiva na bázi selektivně oxidovaných polysacharidů s alespoň jedním pyranózovým cyklem nesoucím hydroxylové skupiny v poloze 2 a 3 v základní strukturní jednotce, dále označované jako polysacharidy, tak, že tyto polysacharidy jsou alespoň částečně selektivně oxidovány v prvním stupni na aldehydy působením jodistanu alkalického kovu za vzniku dialdehydu daného polysacharidu a následně jsou pak ve druhém stupni převedeny na karboxyly působením chloritanu alkalického kovu v kyselém prostředí za vzniku 2,3dikarboxypolysacharidu, po skončení oxidačních reakcí se reakční směs dialyzuje proti destilované vodě pro odstranění reakčních činidel, titruje roztokem alkalického hydroxidu na neutrální pH, přefiltruje a lyofilizuje, přičemž ke snížení Mw výchozího 2,3-dikarboxypolysacharidu až na 25 % původní hodnoty se před započetím druhého stupně oxidace přidá do reakční směsi kyselina amidosulfonová, sumárního vzorce H3NSO3 s tím, že na připravený 2,3-dikarboxypolysacharid lze potom pro zvýšení biologické efektivity přímo nebo prostřednictvím spaceru, s výhodou derivátu polyethylenglykolu s obecným vzorcem NH2-PEG-COOH o Mw 100 až 20 000 Da, navázat vektor, s výhodou kyselinu listovou, s tím, že pro přímé navázání vektoru se jeho -COOH skupina aktivuje pomocí karbodiimidu, s výhodou l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimidu, EDC, a za přítomnosti 4-dimethylaminopyridinu, DMAP, jako katalyzátoru se naváže esterifikační reakcí na volnou hydroxylovou skupinu 2,3-dikarboxypolysacharidu, zatímco pro navázání prostřednictvím spaceru se v prvním kroku karboxylová skupina daného vektoru v přítomnosti Nhydroxysukcinimidu, NHS, aktivuje karbodiimidem, s výhodou EDC, a následnou amidační reakcí se připojí na aminoskupinu spaceru s tím, že molámí poměr jednotlivých látek je vektor : EDC : NHS : spacer 1:1:1:1 až 1:10:1:10, pokud vektor obsahuje jedinou -COOH skupinu nebo 1 : 0,1 : 1 : 0,1 až 1: 0,99 : 1 : 0,99, obsahuje-li vektor více -COOH skupin, načež je pak ve druhém kroku -COOH skupina spáčem nesoucího vektor opět aktivována pomocí karbodiimidu, s výhodou EDC, a za přítomnosti DMAP jako katalyzátom dochází při použití reakčního poměru EDC : DMAP 10 : 1 až 100 : 1 k esterifikační reakci s hydroxylovou skupinou 2,3-dikarboxypolysacharidu, načež se
b) na takto připravený nosič protinádorového léčiva dále naváže komplex přechodného kovu s cytostatickou aktivitou, tj. protinádorového léčiva, kde protinádorovým léčivem se rozumí čtvercově-planámí sloučeniny platiny s protirakovinnou aktivitou typu R2PtnX2, kde R2 = dusíkaté ligandy, s výhodou NH3, které jsou ve vzájemné cis orientaci, X reprezentuje odstupující aniontové ligandy, které při konjugaci odstupují a které jsou rovněž ve vzájemné cis orientaci, s výhodou Cl, dále se protinádorovým léčivem rozumí π-aren komplexy mthenia s protirakovinnou aktivitou typu [Ru(aren)Lx(PTA)y], kde arén značí aromatický uhlovodík nekovalentně navázaný na mthenium, s výhodoup-cymen, Lx značí odstupující ligandy ve vzájemné cis orientaci, s výhodou Cl, a PTA je l,3,5-triaza-7-fosfatricyklo[3.3.1.1]dekan, a dále se může jednat o čtvercově-planámí sloučeniny s protirakovinnou aktivitou typu [R3PtnX]Y, kde Rsjsou tři dusíkaté ligandy olitelně různého složení, s výhodou dvojice NH3 a fenanthridin, X je aniontový ligand odstupující při konjugaci, s výhodou Cl, a Y je aniont kyseliny, s výhodou NOf. s tím, že při vázání dochází k substituci nejméně jednoho ligandu X arboxylovou skupinou či skupinami nosiče protinádorového léčiva.
2. Způsob přípravy konjugátů s řízenou rychlostí uvolňování léčiva podle nároku 1, vyznačující se tím, že nosiče protinádorového léčiva na bázi selektivně oxidovaných polysacharidů s volitelně snížitelnou hmotnostně střední molekulovou hmotností, dále značenou jako Mw, s alespoň jedním pyranózovým cyklem nesoucím hydroxylové skupiny v poloze 2 a 3 v základní strukturní jednotce, především pak celulózy, amylózy, škrobu, pektinu, dextrinu, dextranu, xanthanu, nebo kyselého polysacharidu jakým je kyselina hyaluronová, karboxymethylcelulóza, karboxymethyldextran, chondroitin nebo alginát, dále označované jako polysacharidy, se připraví tak, že uvedené polysacharidy se nejprve v prvním stupni alespoň částečně selektivně oxidují na aldehydy
- 16CZ 309355 B6 působením jodistanu alkalického kovu za vzniku dialdehydu daného polysacharidů, s tím, že pro úplnou konverzi na aldehydy je třeba použít molámí poměr jodistanu alkalického kovu ku polysacharidů 1,0 až 1,5 : 1 a dobu reakce v rozmezí 24 až 72 hodin, a následně se pak ve druhém stupni převedou na karboxyly působením chloritanu alkalického kovu v kyselém prostředí za vzniku 5 2,3-dikarboxypolysacharidu, s tím, že pro kvantitativní konverzi na karboxyly je třeba použít molámí poměr dialdehydu polysacharidů ku chloritanu alkalického kovu a ku kyselině octové 1 : 2 : 1 až 1 : 8 : 4 a dobu reakce alespoň 7 hodin a ke snížení Mw výchozího 2,3-dikarboxypolysacharidu až na 25 % původní hodnoty se před započetím druhého stupně oxidace přidá do reakční směsi kyselina amidosulfonová sumárního vzorce H3NSO3.
CZ2018461A 2018-09-10 2018-09-10 Způsob přípravy konjugátů s řízenou rychlostí uvolňování léčiva s nosiči protinádorového léčiva na bázi selektivně oxidovaných polysacharidů CZ309355B6 (cs)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2018461A CZ309355B6 (cs) 2018-09-10 2018-09-10 Způsob přípravy konjugátů s řízenou rychlostí uvolňování léčiva s nosiči protinádorového léčiva na bázi selektivně oxidovaných polysacharidů
PCT/CZ2019/050038 WO2020052697A1 (en) 2018-09-10 2019-09-03 Procedure for the preparation of selectively oxidized polysaccharides as anticancer-drug carriers

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2018461A CZ309355B6 (cs) 2018-09-10 2018-09-10 Způsob přípravy konjugátů s řízenou rychlostí uvolňování léčiva s nosiči protinádorového léčiva na bázi selektivně oxidovaných polysacharidů

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2018461A3 CZ2018461A3 (cs) 2020-03-18
CZ309355B6 true CZ309355B6 (cs) 2022-09-28

Family

ID=69772689

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2018461A CZ309355B6 (cs) 2018-09-10 2018-09-10 Způsob přípravy konjugátů s řízenou rychlostí uvolňování léčiva s nosiči protinádorového léčiva na bázi selektivně oxidovaných polysacharidů

Country Status (2)

Country Link
CZ (1) CZ309355B6 (cs)
WO (1) WO2020052697A1 (cs)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR3116820B1 (fr) 2020-12-02 2023-12-29 Centre Technique Du Papier Procede de solubilisation et de regeneration de la cellulose
CN114369176B (zh) * 2022-01-24 2023-03-31 北京林业大学 一种木聚糖纳米晶及其制备方法
CN114957510B (zh) * 2022-07-19 2023-07-04 西安超磁纳米生物科技有限公司 一种功能化修饰的聚葡萄糖山梨醇羧甲醚及制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999001143A1 (en) * 1997-07-03 1999-01-14 Orquest, Inc. Cross-linked polysaccharide drug carrier
DE10319808A1 (de) * 2003-04-28 2004-11-18 Friedrich-Schiller-Universität Jena Verwendung von Polysaccharid-Derivaten als Mittel zur Stimulierung der Zellproliferation
WO2012168562A1 (en) * 2011-06-09 2012-12-13 Upm-Kymmene Corporation Method for catalytic oxidation of cellulose and method for making a cellulose product
WO2015015056A1 (en) * 2013-07-29 2015-02-05 Upm-Kymmene Corporation Method for catalytic oxidation of cellulose and method for making a cellulose product

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4931553A (en) * 1988-05-11 1990-06-05 Gill Devinder S Platinum-polymer complexes and their use as antitumor agents

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999001143A1 (en) * 1997-07-03 1999-01-14 Orquest, Inc. Cross-linked polysaccharide drug carrier
DE10319808A1 (de) * 2003-04-28 2004-11-18 Friedrich-Schiller-Universität Jena Verwendung von Polysaccharid-Derivaten als Mittel zur Stimulierung der Zellproliferation
WO2012168562A1 (en) * 2011-06-09 2012-12-13 Upm-Kymmene Corporation Method for catalytic oxidation of cellulose and method for making a cellulose product
WO2015015056A1 (en) * 2013-07-29 2015-02-05 Upm-Kymmene Corporation Method for catalytic oxidation of cellulose and method for making a cellulose product

Non-Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. Jeanes and H. S. Isbell: "Chemical reactions of the chlorites with carbohydrates" Research Papers RP 1408, Part of Journal of Research of the National Bureau of Standards, 27, 125-142 (1941) *
Anonym: http://shodhganga.inflibnet.ac.in/bitstream/10603/133224/12/10_experimental%20section.pdf (6.3.1975) *
E. Maekawa a T. Koshijima: „Properties of 2,3-Dicarboxy Cellulose Combined with Various Metallic Ionts" Journal of Applied Polymer Science, Vol. 29, str. 2289-2297 (1984) *
I.M. Popa et al: „Preparation of 2,3 dicarboxycellulose microspheres containing antitumor agent as a drug carrier" Cellulose Chemistry and Technology 30 (1), 33-38 (1996) *
J. Münster et al: „Stability and aging of solubilized dialdehyde cellulose" Cellulose (2017) 24: 2753-2766 *
J.E.Scott a R.B. Harbinson: „Periodate oxidation of acid polysaccharides. II. Rates of oxidation of uronic acids in polyuronides and acid mucopolysaccharides" Histochemie 19, 155-161 (1969) *
L. Münster et al: „Dialdehyde cellulose crosslinked poly(vinyl alcohol) hydrogels: Influence od catalyst and crosslinker shelf life" Carbohydrate polymers 198, 181-190 (2018) *
Münster: „Dialdehyde cellulose preparation, characterization and utilization as crosslinkung agent for PVA, Doctoral Thesis, August 2018 Tomas Bata Univerzity in Zlín *
S. Meng et al: „Oxidizing Cellulose to 2,3-Dialdehyde Cellulose by Sodium Periodate" Transactions of Tianjin University 11(4) 250-254 (2005) *
S. Vicini et al: "Thermal analysis and characterisation of cellulose oxidised with sodium methaperiodate" Thermochimica Acta 418, 123-130 (2004) *
U. J. Kim et al: „Periodate oxidation of crystalline cellulose" Biomacromolecules 2000, 1 (3), 488-492 *

Also Published As

Publication number Publication date
CZ2018461A3 (cs) 2020-03-18
WO2020052697A1 (en) 2020-03-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Tawfik et al. Naturally modified nonionic alginate functionalized upconversion nanoparticles for the highly efficient targeted pH-responsive drug delivery and enhancement of NIR-imaging
Xiao et al. The use of polymeric platinum (IV) prodrugs to deliver multinuclear platinum (II) drugs with reduced systemic toxicity and enhanced antitumor efficacy
Yang et al. Platinum (IV)-coordinate polymers as intracellular reduction-responsive backbone-type conjugates for cancer drug delivery
Ferruti et al. Synthesis, characterisation and antitumour activity of platinum (II) complexes of novel functionalised poly (amido amine) s
Park et al. A highly tumor-specific light-triggerable drug carrier responds to hypoxic tumor conditions for effective tumor treatment
Chen et al. Reactive oxygen species-activated self-amplifying prodrug nanoagent for tumor-specific Cu-chelate chemotherapy and cascaded photodynamic therapy
Bouramtane et al. Porphyrin-xylan-coated silica nanoparticles for anticancer photodynamic therapy
Li et al. Acetylated hyaluronic acid/photosensitizer conjugate for the preparation of nanogels with controllable phototoxicity: synthesis, characterization, autophotoquenching properties, and in vitro phototoxicity against HeLa cells
Sathyan et al. Developing Pd (ii) based amphiphilic polymeric nanoparticles for pro-drug activation in complex media
Li et al. Acid-sensitive dextran prodrug: A higher molecular weight makes a better efficacy
CZ309355B6 (cs) Způsob přípravy konjugátů s řízenou rychlostí uvolňování léčiva s nosiči protinádorového léčiva na bázi selektivně oxidovaných polysacharidů
Zhang et al. Poly (β-cyclodextrin)/platinum prodrug supramolecular nano system for enhanced cancer therapy: Synthesis and in vivo study
Du et al. Nanoparticle delivery of photosensitive Pt (IV) drugs for circumventing cisplatin cellular pathway and on-demand drug release
US20170100485A1 (en) Metal-polysaccharide conjugates: methods for cancer therapy
Nabipour et al. The development of a bio-based metal-organic framework coated with carboxymethyl cellulose with the ability to deliver curcumin with anticancer properties
Paleos et al. Carboxylated hydroxyethyl starch: a novel polysaccharide for the delivery of doxorubicin
Huang et al. Bortezomib prodrug catalytic nanoreactor for chemo/chemodynamic therapy and macrophage re-education
Quilez-Alburquerque et al. Hyaluronic acid-poly (lactic-co-glycolic acid) nanoparticles with a ruthenium photosensitizer cargo for photokilling of oral cancer cells
Lan et al. CD44-targeted photoactivatable polymeric nanosystem with on-demand drug release as a “photoactivatable bomb” for combined photodynamic therapy–chemotherapy of cancer
NO316688B1 (no) Komplekser av metallcorrinoider og nitrogenoksid, fremstilling derav, anvendelse derav for fremstilling av medikament og sammensetning omfattende kompleksene
US10117837B2 (en) Methods of preparing stimuli-responsive multifunctional nanoparticles
Serag et al. Metal–organic framework MIL-101 (Fe) functionalized with folic acid as a multifunctional nanocarrier for targeted chemotherapy–photodynamic therapy
Zhang et al. A versatile method to deliver platinum (II) drugs via thiol-ene/yne click reaction of polypeptide
Kenawy et al. Schiff bases of cellulose: Synthesis, characterization, and anticancer potency against hepatocellular carcinoma
RU2619934C2 (ru) Гидрофильный конъюгат производного крахмала и 2,6-диизоборнил-4-метилфенола и способ его получения