JPS60156468A - 蛋白質分解性創傷被覆物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は、活性化後にプロテアーゼタイプの酵素が結
合しているポリサッカライドを基礎とする粒子から成る
、蛋白質分解性創傷被覆物に関する・粉末状、又は乾燥
粉末性流体状のバイオポリマー性粉末の創傷用被覆物は
、潰瘍性創傷及び壊死性創傷を被覆しそして治療するた
めに使用される。

（従来の技術） 例えばタルク又は澱粉と活性化合物としてのスルホンア
ミド、抗生物質又は抗マイコプラズマ物質とに基礎を置
く古典的な２成分粉末に加えて、最近においては種々の
バイオポリマー性粉末から成る創傷被覆物が推奨されて
いる。これらの新製品は特に吸着原理又は蛋白質分解原
理、あるいはこれらの原理の組合わせを用いる。吸着効
果は膿物質の液体成分の吸収から成シ、そして蛋白質分
解効果は分泌物中の不所望の蛋白質のＩＩ素的分解から
成る。上記のタイプのバイオＪ　＋、１マー性被覆被覆
物えばＢ、Ｓ、　Ｊａｃｏｂａｓｏｎ等５ｃａｎｄ、　
Ｊ、Ｐｌａｓｔ。

Ｒｅｃｏｎｓｔｒ、　Ｓｕｒｇ、　１０．６５−７２（
１９７６）；　Ｈ−Ｄａｕｔｚｅｎｂｅｒｇ等、チェコ
スロバキア特許出願ｐｖ　４１２９−８２：及びＪ、　
Ｔｏｒｋｏｖａ等、チェコスロバキア特許出願ＰＶ　７
１３８−８３に記載されている。

バイオポリマー性粉末の重要なタイプは、親水性バイオ
ポリマーに基礎を置く製品である。これらの主たる利点
は水不溶性であシ、これによシ外来成分による傷の汚染
が防止されることである。

バイオポリマー性親水性不溶性粉末は、副作用を示さな
いため、生物によシよく耐えられる。これらの効果は、
固相と液相との間、すなわち粉末状粒子と傷の液体成分
との間の相互作用から成る。

この相互作用は接触領域に限定され、そして生物の他の
部位に移らない。２つの種類のバイオーリマー性創傷被
覆物は、相互作用のタイプ−吸着被覆物及び蛋白質分解
性被覆物に従って区別される０前者は物理的に作用し、
後者は化学的に作用する０例えば、デブリサン（Ｄｅｂ
ｒｉｓａｎ　）　（ファルマシア、ウプサラ、スウェー
デン）の名称で販売されている球状架橋デキストランは
、効果的な吸着被覆物である〔さらに、Ｂ、Ｓ、　Ｊａ
ｃｏｂｓｓｏｎ　等。

５ｃａｎｄ、　Ｊ、　Ｐｌａｓｔ、　Ｒｅｃｏｎｓｔｒ
、　Ｓｕｒｇ、１０　。

６５（１９７６）を参照のこと〕。

プロテアーゼを共有結合し、そして凍結乾燥されている
球状セルロースに基礎を置く蛋白質分解性被覆物、及び
その医療的適用ばＪ、　Ｔｕｒｋｏｖａ等、チェコスロ
バキア特許出ｔＪＰＶ７１３８−８３に記載されている
。

両タイプのバイオポリマー被覆物は１．従来使用されて
来た古典的粉末に比べて利点を有するが、しかしまた幾
つかの限界を有する。上記のデキストラン吸着被覆物は
物理的にのみ機能する。すなわち、水及び水溶液又は分
散体を粒子の多孔性材料及び粉末層のすき間に吸収する
。セルロース性蛋白質分解被覆物は、特に酵素的に作用
するが、傷からの液体成分の吸引、すなわち吸着又は吸
収効果カー非常に望まれる。後者の効果を得ることがで
きるが、それはセルロース担体及び被覆物の製造中にお
ける特別な準備によってのみ得られ、これはしばしば複
雑であシそして高価である。

セルロースは、乾燥中に自然に結晶化し、そして低い？
ロシティーを有する構造を形成する傾向がある。高い吸
着能力（高い？ロシティー）を有する被覆物を得ようと
する場合、製造の全段階において特別の乾燥方法を用い
なければならない。

パイオホリマー粉末の他の重要なタイプはキチンに基礎
を置く標品であシ、このものはり、Ｌ。

Ｂａ１ａｓｓａ、複数の特許〔独国１，９０６，１５５
　（１９６９）：独国１，９０６，１５９　（１９７０
）　：英国１，２５２，３７３　（１９７１）　：米国
３，６３２，７５４　（１９７２）　：米国３，９１４
，４１３　（１９７５）　）に記載されて仏る。キチン
粉末は、前記のバイオポリマータイプのものとは全く異
る基礎に基いて作用し、その効果は再生と称することが
できる。

キチンは創傷中で非常にゆっく如と分解し、そのモノマ
ー成分が創傷中で効率的に代謝反応に入る。

キチン粉末はこのようにして損傷された皮膚の再生に寄
与する。

キチン粉末の限界はその特別な作用、すなわち再生原理
のみである点に存在する。キチンはその高い結晶性、及
び材料の対応して低いポロシティ−により特徴付けられ
、キチンを基礎とする粉末は小さい吸収効果のみを有す
る。創傷の清浄化のための蛋白質分解原理は、最近のキ
チン粉末には全く適合しない。

（発明が解決しようとする問題点） 親水性不溶性バイオ、／　ＩＪママ−被覆物及びキチン
被覆物の上記の欠点は、この発明の被覆物によυ除去さ
れる。

（問題点を解決するための手段） この発明は、架橋されたデキストラン、キチン及びキト
−サンから成る群から選ばれた化合物であるＩリサッカ
ライドを基礎とする球形粒子から成り、活性化後にプロ
テアーゼタイプの酵素が結合している創傷用被覆物に関
する。

デキストランに基礎を置くこの発明の開隔被覆物は直後
０，０５〜０．５ｗ＋＋の球状粒子から成る。

キチン及びキト−サンに基礎を置くこの発明の創傷被覆
物は０．０１〜０．３簡のサイズの粒子から成る。

この新規な被覆物の顕著な特徴は、プロテアーゼの固定
化のためのバイオポリマー相として架橋デキストランを
使用することである。セルロースト異なり、架橋デキス
トランは特別な準備を必要としないで高い／’ｏシティ
ーを示す。テキストラン担体の多孔質構造は、出発ポリ
マーの架橋の程度によシ広範囲に制御することができる
。セルロースと異なシ、水に膨潤した架橋デキストラン
は乾燥中にポロシティ−を失わず、そして通常の乾燥方
法によって、高水含量に再び膨潤する生成物が得られる
。デキストランを基礎とするこの発明の被覆物は、特別
な準備を必要としないで、蛋白質分解効果のほかに高い
吸着能力を有する。

この新タイプの被覆物を製造するために、粒子サイズが
０，０５〜０．５　ｔａｎの球形架橋デキストランを使
用する。このものは水中で膨潤して、乾燥物質Ｉ１１当
９２〜１０Ｉの含水量となる（この含水量はガラスフィ
ルター上で遠心分離した後の膨潤物中のものである）。

これらの要求は、市販製品デゾリサン（Ｄｅｂ−ｒｉｓ
ａｎ　）　（商標）及び同じ製造者のクロマトグラフ材
料上ファデックス（Ｓａｐｈａｄｅｘ）（商標）、又は
他に由来する対応する材料により満たされる。

多孔性の架橋デキストランは、酵素の結合のために便利
な化学反応性を有し、そしてプロテアーゼを固定化する
ために公知の方法又は変法を用いることができる（例え
ばＨａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　ＥｎｚｙｍｅＢｉｏｔａｅ
ｈｎｏｌｏｇｙ　、　Ａｌａｎ　Ｗｉｓｅｍａｎ、Ｅ、
　Ｈｏｒｗｏｏｄ編、ロンドン、１９７５）。適用の間
に放出されない強く結合した酵素を伴う生成物をもたら
す方法が選択される。好ましくは、生成物を凍結乾燥に
よシ乾燥する。

キチン及びキト−サンを基礎とする被覆物においては、
固定化に先立って、動物又は菌類由来のキチンを粉砕し
そして分画して得たキチン粉末をアルカリ処理する。こ
れにより、Ｎ−アセチルグルコサミン構造単位の部分的
脱アセチル化、及びイオン性アミン基の遊離が起こる。

この方法によシ、キト−サン構造単位をキチン構造に導
入する。

ポリマー構造中に第一アミノ基が存在することによシ、
プロテアーゼ結合のための活性化において、バイオポリ
マーの化学反応性が相当に増強される。

固定化は、例えばＷ、Ｌ、　５ｔａｎｄｌｅｙ等［Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌ。

Ｂｉｏｅｎｇ、　１７　、３１５　（１９７５）　；　
米国特許３．９０９，３５８　（１９７５）　）又はＲ
，Ａ、Ａ、　Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｌ等（Ｃｈｉｔｉｎ、
／＃−ガモンゾレス、オックスフォード、１９７７．１
９９頁）によシ記載された公知の方法によシ行うことが
できる。

キチン粉末に典型的な再生効果は、この新タイプのバイ
オポリマー被覆物においても保持される。

プロテアーゼの固定化に必要な構造単位の置換の程度が
比較的低いこと、及びこれによって所望の酵素活性が達
成されることは、バイオポリマーの構造中に大部分の構
造単位が変化しないで残留すること、及びこの構造単位
が酵素的分解によって徐々に放出され、そして皮膚組織
の再生に寄与することを意味する。新しい及び古い治癒
しつつある創傷の中にはキチン構造を酵素的に開裂する
のに十分な量のリゾチームが存在する。放出された七ツ
マ一単位はへキソサミンの代謝に関与し、そしてコラ−
ダンを生成せしめそして架橋する。ウリジンジホスホー
Ｎ−アセチルグルコサミンが、コンドロイチンサルフェ
ート、ヒアルロン酸及ヒ糖蛋白質の生合成における鉢物
質であることも知られている。これらの過程が皮膚組織
の再生を伴う。

この機構に関して、粉末の０．０１ｗｎよシ小さい微細
画分もまた、血液循環への侵入を伴わないで有利に使用
することができる。

この新規な被覆物の医療における適用は、チェコスロバ
キア特許出願ＰＶ７１３８−８３に記載されているのと
同様である。

次に、この発明の被覆物の調製方法を例によシ示す。但
し、これによってこの発明の範囲を限定するものではな
い。

製造 球状粒子の直径０．０５〜０．５ｍを有するセファデッ
クスＧ−１００（商標）（ファルマシア、ウプサラ、ス
ウェーデン）の架橋デキストランを担体として使用し、
モして２−アミノ−４，６−ジクロロ−８−）リアジン
をその活性化のために使用した。架橋デキストランを、
７，５ｇの乾燥物に相当する量において、水中で膨潤せ
しめた。活性化剤を５０℃において７５０ｄのア七トン
に溶解し、そしてこの温度において同容量の水で稀釈し
た。架橋デキストランを、３００ＴｒＬｌの活性化溶液
と共に５０℃にて５分間攪拌した。６０７ｎｌの１Ｍ塩
酸と共に１００ＴＬｌの水中で１５ｇの炭酸す）ＩＪウ
ムを混合することによシ調製した溶液を１２０Ｔ／Ｌｌ
（５０℃）の量で、活性化混合物に加え、次にこれを５
０℃にてさらに５分間攪拌した。塩酸を加え４・ことに
よシ、活性化混合物の−を急速に７以下に下げ、そして
活性化生成物を濾過し、５０チ水性アセトン及び水で洗
浄し、そしてＰＨ６，６，２℃にて０．１Ｍ燐酸緩衝液
中に貯蔵した。

キモトリプシンを、ｐＨ８，７５の０．２Ｍ硼酸緩衝液
中の１．５係溶液から２４℃において、活性化担体に固
定化した。１２時間後、担体１１Ｉ当シ１９５すの酵素
が固定化された。結合したキモ）　ＩＪプシンを伴う架
橋デキストランを、１Ｍ塩化ナトリウムを含有する０、
１Ｍ硼酸緩衝液（ＰＨ８）及び１Ｍ塩化ナトリウムを含
有する０、１Ｍ酢酸緩衝液により交互に、溶出液の蛋白
質分解活性が０になるまで洗浄した。最後に、サンプル
を０．２５Ｍ硼酸緩衝液（ｐｌ（８’）で洗浄し、そし
て凍結乾燥した０例２．固定化パパインを有する被覆物
の製造球状粒子の直径０．０５〜０．５　Ｗａｎを有す
るデブリサン（Ｄｅｂｒｉｓａｎ　）　（商標）（ファ
ルマシア、ウプサラ、スエーデン）の架橋デキストラン
を、イミドカーゴネート基の導入によシ活性化し、そし
て担体として使用した。

架橋デキストラン（１ｇ）を、２４℃、−１１において
６分間、シアノダンプロミド（４ｏｄ）と接触せしめる
ことにより活性化した。次に生成物を、炭酸水素ナトリ
ウムの冷０．１Ｍ溶液（５００ｒｎｌｌ　）により７分
間、水及び０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，６）により洗
浄した。

・母パインを、０，１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，６）から
、周囲温度において１６時間、活性化担体に結合せしめ
た。

最後に、生成物を例１の場合と同様に処理した。　□す
なわち、前記緩衝液を交互に用いて、溶出液が蛋白質分
解活性を示さなくなるまで洗浄し、そして凍結乾燥した
。

例３．固定化トリノシンを有する被覆物の製造球状粒子
の直径０．０５〜０．５　ｍｍを有する七フ丁デックス
Ｇ５０（商標）（ファルマシア、ウプサラ、スエーデン
）の架橋デキストランを、チオホスダンを用いてイソチ
オシアナート基を導入することによって活性化し、担体
として使用した。

架橋デキストラン（２０，１ｉ’）を２０ｍのトルエン
中４−ニトロフェニルグリシジルエーテル（４１りと共
に攪拌し、そして水酸化ナトリウムの溶液（８０ｍｌ）
を加えた。懸濁液を７０℃にて１８時間加熱した。担体
を洗浄し、１００Ｔｎｌの水中で膨潤せしめ、４０ｉｎ
の５　ＮＮａＯＨ及び２ｇのジチオニドナトリウムを加
え、そして反応混合物ヲ６５℃にて１時間加熱した。生
成物を洗浄し、３．５Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ６，８）中で
膨潤せしめ、四塩化炭素中チオホスゲンの１０係溶液と
反応せしめ、洗浄し、そして乾燥した。

トリプシンを、０．０５Ｍ硼酸緩衝液（ＰＨ８，６）中
１．８係溶液から、５℃において窒素雰囲気下で、活性
什和体に結合せしめた。１５時間後、担体当、１）２０
０■の酵素が固定化された。

生成物を、例１の場合と同様に緩衝液を交互に使用する
ことにより、溶出液中の蛋白質分解活性が０になるまで
洗浄し、同じ硼酸緩衝液で飽和し、そして凍結乾燥した
。

例４．動物性キチンからの被覆物の製造カニの殻から分
離し、粉砕し、そして０．０５〜０．１５ｍｍの粒子サ
イズに分画したキチン（ｘｏｏ＃）を、２１の４０　％
　ＮａＯＨと共に１１５℃において６時間窒素の雰囲気
下で攪拌した。反応混合物を冷却し、生成物をＦ遇し、
そして中性反応になるまで水で洗浄した。この条件下で
キチンを約７０係脱アセチル化した。

１５１！の乾燥物に相当する量の加水分解された生成物
を、カラムに充填し、そしてｐＨＢ、　５の燐酸緩衝液
によシ、溶出液のｐｉ−１が溶離緩衝液のＰＩｌ値にな
るまで洗浄した。１５Ｔｎｌの上記緩衝液、１５ｄのキ
モトリジシン溶液（０，１ｇのキモトリプシンを含有）
及び１５プの４俤グルタルアルデヒド水溶液の混合物を
カラム上に注入し、ベッドを通してゆっくシと流し、次
にカラムを１時間放置した。

固定化が完了した後、ベッドを、５００ｍ１の上記緩衝
液で洗浄し、そして次にアルカリ性緩衝液及び酸性緩衝
液を用いて（すなわち、ＩＭＮａＣｔを含有するＰＨ９
の０．１Ｍ硼酸緩衝液及びＩ　Ｍ　ＮａＣｔを含有する
ＰＨ４，５の０，１Ｍ酢酸緩衝液を用いて）交互に、未
結合酵素が完全に溶出するまで洗浄した。溶出液の蛋白
質分解活性がＯに達するまで洗浄を続けた。最後に、生
成物を、ＰＩＩ８の０．２５Ｍ硼酸緩衝液によシ洗浄し
、そしてこの緩衝液中の懸濁液から凍結乾燥した。

例５．１類ギチンからの被覆物の製造 カビであるＲニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉ
ｌｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ　）の菌糸（イニシ
リン製造の副産物）を用いて被覆物を製造した。

菌糸材料を殺菌し、そして周囲温度でクロロホルムによ
り抽出することによって脂質成分、特に脂肪を除去した
。イ４られた生成物を室温において１８時間Ｉ　Ｎ　Ｎ
ａＯＨと混合し、ＨＣｔで酸性化し、そして透析により
精製した。キチン材料を粒子サイズ０．０５〜０．８　
ｍに湿粉枠した。加水分解、固定化及び最終処理を例４
と同様にして行った。

特許出願人 チェスコスロペンスカ　アカデミエ　ヘト特許出願代理
人 弁理士　青　木　朗 弁理士　西　舘　和　之 弁理士　福　本　積 弁理士　山　口　昭　之 弁理士　西　山　雅　也

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、架橋されたデキストラン、キチン及びキト−サンか
   ら成る群から選ばれた化合物である／ＩＪサツカライド
   を基礎とする粒子から成り、活性化後にプロテアーゼタ
   イプの固定化酵素を担持する１ＡＩＪ湯用被覆物。 ２、球状粒子が０．０５〜０．５簡の直径を有する架橋
   デキストランを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
   創傷用被覆物。 ３、粒子が０，０１〜０．３＋ｎｍＯサイズを有するキ
   チン及びキト−サンを特徴とする特許請求の範囲第１項
   記載の創傷用被覆物。