JPH02191601A - 合成コンドロイチン硫酸プロテオグリカンを含有する組織癒着防止剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の目的］ （産業上の利用分野） 本発明は、コンドロイチン硫酸と血清アルブミンとを化
学的に結合させてなる合成コンドロイチン硫酸プロテオ
グリカン及びその製造法に関するものである。

（従来の技術及び発明が解決しようとする課題）コンド
ロイチン硫酸は、軟骨、気管５皮膚その他の結合支持組
織から分離され、医薬、医用材料の原料として利用され
ている。

しかしながら、生体に広（存在することから予想される
生理作用に比１２５４、コンドロイチン硫酸について臨
床的に認められている薬理効果は少ない。

本発明者らは、コンドロイチン硫酸の薬理作用について
鋭意研究を重ねた結果、コンドロイチン硫酸に血清アル
ブミンを結合せしめることにより、従来コンドロイチン
硫酸については認められていない薬理作用が認められる
ことを見出し本発明を完成するに至った。

［発明の構成１ （課題を解決するための手段及び作用）本発明は、コン
ドロイチン硫酸と血清アルブミンとを化学的に結合させ
てなることを特徴とする合成コンドロイチン硫酸プロテ
オグリカン及びその製造法に関するものである。

本発明に用いるコンドロイチン硫酸としては、特に制限
はなく、例えばコンドロイチン−４−硫酸（コンドロイ
チン硫酸Ａ）、コンドロイチン−〇−硫酸（コンドロイ
チン硫酸Ｃ）、コンドロイチン−４，６−二硫酸、デル
マタン硫酸（コンドロイチン硫酸Ｂ）、コンドロイチン
硫ＨＤ、コンドロイチン硫酸Ｅ、コンドロイチン硫酸Ｋ
、特開昭６３−１０６０１号公報記載のコンドロイチン
硫酸（ナマコ由来）等が挙げられる。

血清アルブミンとしては、例えばヒト血清アルブミン、
ウシ血清アルブミン等が挙げられる。

本発明の合成コンドロイチン硫酸プロテオグリカンは、
前述のコンドロイチン硫酸と血清アルブミンを化学的に
結合させてなるものであり、かかる結合の様式としては
、カルボジイミド縮合法、臭化シアン活性化法（＾ｘｅ
ｎ、　Ｒ，＆　Ｅｒｎｂａｃｋ、Ｓ、；Ｅｕｒ、　Ｊ、
　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｗ、、　１８．３５１．１９７１）又
はプロトン化シッフ塩基に続くイソシアン化合物との反
応によるリアレンジメント（Ｕｇｉ）反応（Ａｘｅｎ、
　Ｒ，ｅｔａｌ、；　Ａｃｔａ　Ｃｈｅｍ、　５ｃａｎ
ｄ、、　２５．１１２９．１９７１）等により得られる
共有結合等が挙げられる。

かかる結合手段としては、水系で反応することを求めら
れる物質の縮合に適用する水溶性カルボジイミドを用い
る方法、多糖類の化学的修飾、活性化を経て酵素蛋白、
抗体蛋白、ペプチド等を高分子担体に結合せしめる固定
化酵素、アフィニティークロマト担体調製の技術を適用
することができる。

カルボジイミド類としては、例えばジエチルカルボジイ
ミド、ジイソプロピルカルボジイミド、メチルプロピル
カルボジイミド、ジシクロへキシルカルボジイミド、ヘ
キサメチレンカルボジイミド、ヘプタメチレンカルボジ
イミド、ｌ−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド、ｌ−シクロへキシル−３−（２−
モルホリノエチル）カルボジイミドメソ−ｐ−トルエン
スルホネート、１−ｔ−ブチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミド、ジフェニルカルボジイ
ミド、４゜４′−ジニトロジフェニルカルボジイミド、
ジーｐ−）リルカルボジイミド、ビス（トリメチルシリ
ル）カルボジイミド等が挙げられる。

本発明の合成コンドロイチン硫酸プロテオグリカンは、
医薬等に適用するには、水溶性であること好ましい。

かかる水溶性の合成コンドロイチン硫酸プロテオグリカ
ンを得るには、該合成プロテオグリカン中のフンドロイ
チン硫酸含量は１．５〜９８１７１％の範囲であること
が好ましい。

結合に要する縮合剤は、例えば水溶性カルボジイミドに
よる縮合法では、コンドロイチン硫酸とその０．０２〜
ｌＯ倍量の血清アルブミンを、水性溶媒に溶解せしめ、
ｐＨ５付近に調整し、約３〜６℃の冷温下、コンドロイ
チン硫酸に対し０．０５〜５倍量の水溶性カルボジイミ
ドを添加して反応を行うことにより、本発明の合成コン
ドロイチン硫酸プロテオグリカンが得られる。また、臭
化シアン活性化法では、使用するコンドロイチン硫酸重
量の坏以下が好ましい。

合成手法の好ましい態様としては、例えば、臭化シアン
活性化法では、コンドロイチン硫酸を水性溶媒に溶解し
、臭化シアンを前記割合で５〜２０％用い、常法により
活性化し、得られた活性化コンドロイチン硫酸を低温下
アセトニトリル、テトラヒドロフラン等の疎水性溶媒を
用い、−旦沈殿分離し、該溶媒で洗浄後、冷水に再溶解
し、コンドロイチン硫酸量の１〜２０倍の血清アルブミ
ン中性緩衝液溶液を用いて結合反応を行うことにより合
成コンドロイチン硫酸プロテオグリカンが得られる。

以上の結合反応によって得られる合成コンドロイチン硫
酸プロテオグリカンは、常法に従って、透析、アルコー
ル沈殿、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー等に
より精製することができる。

本発明の合成コンドロイチン硫酸プロテオグリカンは、
細胞の接着・伸展を促進する作用を有する糖蛋白質フィ
ブロネクチンに対して拮抗性を示し、組織痣着防止剤と
して有用である。コンドロイチン硫酸、血清アルブミン
それ自体には以上のような効果は認められない。

（発明の実施例） 以下、実施例、試験例により本発明を更に詳細に説明す
るが、これらは本発明の範囲を何ら制限するものではな
い。

実施例１　合成コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの
製造（水溶性カルボジイミド縮 合法） クジラ軟骨由来のコンドロイチン硫酸（タイプΔ）、サ
メ軟骨由来のコンドロイチン硫酸（タイプＣ）、デルマ
タン硫酸（ブタ皮由来；生化学工業■製）を水溶性カル
ボジイミドによる縮合反応によって、ウシ血清アルブミ
ンに結合させた。

前述の各グリコサミノグリカン５ｍｇ及びウシ血清アル
ブミン（以下ｒＢＳＡＪという）Ｚｏ。

ｕｇを水０．５ｍｌに溶解し、０．１Ｍ塩酸でｐＨ５，
０に調整した。この溶液にｌ−エチル−３−（３−ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩２５ｍｇの
水０．５ｍｌ溶液（ｐＨ５，０）を加え、混合物を４℃
で１２時間撹拌した。混合物を２０．ｏｏｏｘｇで１０
分間遠心し、上澄み液を集め、蒸留水に対して完全に透
析した。透析残渣中のグリコサミノグリカン−結合血清
アルブミンを凍結乾燥することによって簗めた。

合成コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの物性を以下
に示す。

コンドロイチン硫酸（以下ｒＣ３Ｊという）（タイプＡ
）由来のプロティグリカ２１合成Ｃ３−ＰＧＩＩＣ５／
ＢＳ八重量比　１．４．３（Ｃ３９３，５％、　ＢＳＡ
　６．５％）Ｓ含量　　６．４２％ ［α］ｏ−２９（Ｃ・ｌ、　Ｈ２Ｏ１ Ｃ５（タイプＣ）由来のプロテオグリカン［合成Ｃ３−
ＰＧ２］ Ｃ５／ＢＳＡＪｔ月１比　　１４．７（ＣＳ　　９５．
４％、　ロＳＡ　　６．５％）Ｓ含量　　６．５９％ ［α］　ｏ　　−１，４（ＣＪ、　Ｂ２０）デルマタン
硫酸（以下ｒＤＳＪという）由来のプロテオグリカン［
合成Ｃ３−ＰＧ３］ ＤＳ／ＢＳＡ重量比　１６．２（ＤＳ　９７．２％、　
ＢＳＡ　６．０％）Ｓ含量　　６．５４％ ［α］　ｏ　　　４２．５　　（Ｃ；ｌ、　　ＨｚＯ）
実施例２　合成コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの
製造（水溶性カルボジイミド縮 合法） ウシ気管軟骨由来のＣ８（分子量１５０００）１００ｍ
ｇ及びＢ５Ａ４４ｍｇ　（０，６７ｕｍｏｌｅ）又は４
．４ｍｇ　（０，０６７μ５ｏｌｅ）をそれぞれ水２０
ｍ１に溶解し、Ｏ，ｌＮ塩酸でｐＨ５，０に調整後、水
冷下ｌ−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド塩酸塩各７　、７　ｍ　ｇ　（４０ｔｔ
　ｍｏｌｅ）を加えた。

この混合物を各々４℃で１２時間撹拌した後、２０．０
００Ｘｇで２０分間遠心し、上澄み液を集め、蒸留水に
対して透析した。透析液を０１１Ｍ食塩を含む０．０４
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐ）Ｉ７．４）で平衡化したＤＥ
ＡＥ・セルロファイン力ラム（１，５ｘ５．６ｃｒｎ）
にアプライし吸着させた。同緩衝液１００ｍ１で洗浄し
て未反応のＢＳＡを除去した後、０．１Ｍから１．０Ｍ
の食塩を含む緩衝液各２００ｒｎｌの直線濃度勾配によ
り溶出した。求める両分を集め、透析し、エタノールを
加え沈殿させ、沈殿をエタノールで洗浄後、再び水を加
えて凍結乾燥することによりＣ３−ＢＳＡ結合物をそれ
ぞれ７８．７ｒｎｇ及び６９．４ｍｇ得た。Ｂ５Ａ４４
ｍｇ使用系の生成物を［合成Ｃ３−ＰＧ４］とし、Ｂ５
Ａ４．４ｍｇ使用系の生成物を［合成Ｃ３−ＰＯ２：ｌ
とした。

Ｃ３／ＢＳＡ重量比 ＢＳＡ使用量４４ｍｇ　　４．２　（Ｃ５８０，９％、
　ＢＳＡ　Ｉ９．１％）４．４ｍｇ　１４．０　（Ｃ３
９３，３％、　ＢＳＡ　６．７％）Ｓ含量 ＢＳＡ使用ｍ　４４＋ｎｇ　　６．３８％４゜４ＩＩ１
ｇ６．７７％ ［αＩ。

ＢＳ＾使用量４４Ｉｌ１ｇ　　−２０（Ｃ−１，Ｂ２０
）４．４ｍｇ　　　−１４（Ｃ＝１．　　ＨｘＯ）実施
例３　合成コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの製造
（水溶性カルボジイミド縮 合法） 実施例１に準じて、サメ軟骨由来のＣ３（分子量３００
００　；タイプＣ）、クジラ軟骨由来のＣ５（分子量３
５０００　；タイプＡ）から、下記の比率で合成コンド
ロイチン硫酸プロテオグリカンを調製した。

表１ ＣＳタイプＣ由来の生成物を［合成Ｃ３−ＰＧ６］とし
、ＣＳタイプＡ由来の生成物を［合成Ｃ５−ＰＧ７］と
した。得られた生成物の物性を以下に示す。

［合成ＣＳ−ＰＧ６］ Ｃ３／ＢＳＡ重量比　１０．０（Ｃ３９０，９％、　Ｂ
ＳＡ９．１％）Ｓ含量　　６．６４％ ［α］　ｏ　　−１５，６（Ｃ−１，ＨｔＯ）［合成Ｃ
Ｓ−ＰＧ７１ Ｃ３／ＢＳ八重量比　８．８（ＣＳ　８９．８％、　Ｂ
ＳＡ　１０．２％）Ｓ含量　　６．６２％ ［α］　ｏ　　　−１６，０（Ｃ＝１．　ＨｔＯ）実施
例４　合成コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの製造
（臭化シアン活性化法） クジラ軟骨由来のＣＳ１．ｏｇ及びＢＳＡＯ，１ｇをＯ
，ＬＭ炭酸水素ナトリウム水溶液１００ｍ１に溶解し、
臭化シアン０．２ｇを加えて４℃で１７時間反応させた
。反応液にエタノールアミン０．１ｍｌを加えて室温で
２時間反応後、０．ＩＮ塩酸でｐＨ７，０として、流水
中で２時間透析した。透析内液にエタノールを加えて沈
殿させ、沈殿物を遠心で集めてエタノールで洗浄して乾
燥させた。得られた白色沈殿物［合成（：５−ＰＧ８］
の物性を以下に示す。

Ｃ５／ＢＳＡ重量比　１０．３（Ｃ３９２，１％、　Ｂ
ＳＡ８．９％）Ｓ含量　　６．８％ ［α］　ｆｉ　　−１５，５１Ｃ＝ｌ、　ＨよＯ）実施
例５　合成コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの製造
（臭化シアン活性化法） サメ軟骨由来のＣ５１，Ｏｇを５Ｍリン酸カリウム緩衝
液（ｐＨ１１，９）に溶解し、４℃に冷却した後、臭化
シアンのアセトニトリル溶液（１００ｍｇ／ｍｌ）２ｍ
ｌを加えて１０分間反応させた。次いで、反応液の５倍
量のアセトニトリルを加えて沈殿物を得た。沈殿物をア
セトニトリルで充分に洗浄し、速やかに０．１Ｍ炭酸水
素ナトリウム溶液に溶解した。この水溶液にＢＳＡ水溶
液（０，１５ｇ／１００ｍ１）を加えて４℃で１７時間
反応させた。反応液にエタノールアミン０．１ｍｌを加
えて室温で２時間反応し。

０．１Ｎ塩酸でｐＨ７，０として後、エタノールを加え
て沈殿させ、沈殿物を遠心で集めてエタノールで洗浄し
て乾燥させた。得られた白色沈殿物［合成Ｃ３−ＰＧ９
１の物性を以下に示す。

ＣＳ／ＢＳ八重量比へ７．０（ＣＳ　８７．４％、　Ｂ
ＳＡ　１２．６％）Ｓ含量　　６．６％ ［’２］　ｅ　　−１７（Ｃ：１．　ＨｔＯ）実施例６
　合成コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの製造（水
溶性カルボジイミド縮 合法） ブタ皮由来のＣＳ（タイプＢ）５０ｍｇ及びヒト血清ア
ルブミン（以下ｒＨ３ＡＪという）２２ｍｇを水１０ｍ
１に溶解し、Ｏ，ＩＮ塩酸でｐＨ５，０に調整後、水冷
下ｌ−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミド塩酸塩７．７ｍｇ　（４０ｕａ＋ｏｌｅ）
を加えた。この混合物を４℃で１２時間撹拌した後、２
０，０００ｘｇで２０分間遠心し、上澄み液を集め、蒸
留水に対して透析した。透析液をＯ，１Ｍ食塩を含む０
．０４Ｍ）−リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）で平衡化し
たＤＥＡＥ・セルロファイン力ラム（１，５Ｘ５．６ｃ
ｍ）にアプライし吸着させた。同緩衝液１００ｍ１で洗
浄して未反応のＢＳＡを除去した後、Ｏ，１Ｍから１．
ＯＭの食塩を含む緩衝液各２００ｍ１の直線濃度勾配に
より溶出した。求める画分を集め、透析し、凍結乾燥す
ることによりＣ３（タイプＢ）　−Ｈ５Ａ結合物［合成
Ｃ５−ＰＧＩＯＩ　３５　、９　ｍ　ｇを得た。

Ｃ５／ＢＳＡ重量比　３．９（Ｃ５７９，６％、　ＢＳ
Ａ２０，４％）Ｓ含量　　６．２％ ［α］　Ｄ−５８（Ｃ＝ｌ、　　Ｈ２Ｏ）試験例１　フ
ィブロネクチンを予め塗布した培養皿に塗布した合成フ
ンドロイチン硫酸 プロテオグリカンのＢＨＫ細胞の接着 に対する効果 ９６穴培養皿をヒト血漿フィブロネクチン５μｇ　／　
ｍ　ｌで塗布した後、実施例１で得た各種合成コンドロ
イチン硫酸プロテオグリカンを第１図に示す各濃度で塗
布した。

別に、１００ｍｒｎ径の培養皿に集密状態になるまで培
養したＢｌ’（Ｋ細胞（新生ハムスター腎細胞）と０、
ｆｒｏｇ／ｒｒ＋１の濃度のトリプシン５ｍｌを加え、
３７℃で５分間処理した。次いで、ｌ　ｍ　ｇ／　ｍ　
ｉの大豆トリプシンインヒビター５ｍｌを加え、トリプ
シンを不活性化した後、遊離した細胞を遠心により集め
た。

細胞はトリプシンインヒビターを含む溶液で２回洗浄後
、単一細胞懸濁液として、細胞数をカウントした。

得られた単一細胞懸濁液１００μｌ　（１×１０４個細
胞）を、的記フィブロネクチンと合成プロテオグリカン
を塗布した培養皿に加え、３７℃で２時間処理した。接
着しなかった細胞を洗除した後、接着した細胞を２％ホ
ルムアルデヒドで固定し１％トルイジンブルーで染色し
、て、その細胞数をカウントした。

結果を第１図に示す。第１図において、（・）は［合成
Ｃ３−ＰＣＩＩ　）、（０）　ｉｉ　（合成Ｃ５−Ｉ”
Ｇ２１の、（Δ）は［合成Ｃ３−ＰＧ３１の、各濃度に
おける細胞接着の変動を示す。値は、２回の測定の平均
を表す。

第１図から、本発明の合成コンドロイチン硫酸プロテオ
グリカンは、フィブロネクチンの細胞接着促進作用を阻
害することがオ）かる。

なお、ｌ−エチル−３−（３−ジメチルアミ７ノプロビ
ル）カルボジイミドとともにインキュベートしたフンド
ロイチン硫酸Ｃで培養皿を同様に処理した対照では、細
胞接着は認められなかった。

試験例２　各種培養細胞の細胞接着物質に対する合成コ
ンドロイチン硫酸プロテオグリ カンの接着阻害効果 （１１ＢＨＫ２１細胞と細胞接着物質に対する効果実施
例２で得た合成コンドロイチン硫酸プロテオグリカンに
ついて、Ｂ　ＨＫ　２１細胞（新生ハムスター腎細胞）
とフィブロネクチン、ラミニン、■ｑコラーゲン及びビ
トロネクチンとの接着に対する阻害効果を検討した。

８５μｇ　／　ｍ　ｌのヒト血漿フィブロネクチン、マ
ウスｒｘｕｓ腫！細胞由来ラミニン、ラット鍵由来Ｉ型
コラーゲン及びウシ血清ビトロネクチンをそれぞれ９６
穴培養皿に塗布し、試験例１と同様にして、合成コンド
ロイチン硫酸（タイプＡ）プロテオグリカンを塗布した
後、ＢＨＫ２ｍ細胞の単一細胞懸濁液１００μｌを加え
、細胞接着の変動を見た。対照として合成コンドロイチ
ン硫酸プロテオグリカンを処理しないものを用いた。結
果を表２に示す。

なお、表中で相対接着細胞数として、全くあるいは殆ど
細胞接着しなかった場合を−、１０〜２０％の細胞が接
着した場合な＋、７０〜８０％の細胞が接着した場合な
＋＋＋＋、９０〜１００％の細胞が接着した場合を＋＋
＋＋＋と半定量的に表した。

表　　２ （２）ＣＥＦ細胞と細胞接着物質に対する効果実施例３
で得た合成コンドロイチン硫酸プロテオグリカンについ
て、ＣＥＦ細胞にワトリ胚繊維芽細胞）とヒト血漿フィ
ブロネクチン、Ｅ　ｉ（Ｓ腫瘍マウスラミニン、ラット
艇Ｉ　？！ｌ′！コラーゲン及びウシ血清ビトロネクチ
ンとの接着に対する阻害効果を検討した。

処理方法及び測定法は（１）と同様に行った。結果を表
３に示す。

表 表３ 果 実施例４．５で得た合成コンドロイチン硫酸プロテオグ
リカンについて、Ｃｌ−１０−Ｋ　ｌ細胞（チャイニー
ズハムスター細胞）とヒト血漿フィブロネクチン及びＥ
Ｈ３Ｈ３腫瘍マウスラミニン接着に対する阻害効果を検
討した。

処理方法及び測定法は（１）と同様に行った。結果を表
４に示す。

果 実施例６で得た合成コンドロイチン硫酸プロテオグリカ
ンについて、Ｂ１６ＦＩＯ細胞（高転移性メラノーマ細
胞）とヒト血漿フィブロネクチン及びＥＨ８腫瘍マウス
ラミニンとの接着に対する阻害効果を検討した。

処理方法及び測定法は（１）と同様に行った。結果を表
５に示す。

表５ ［発明の効果］ 本発明によれば、フィブロネクチンの細胞接着促進作用
を阻害し１組織！ｉ着防止剤として有用な合成コンドロ
イチン硫酸プロテオグリカンを提供することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、グリコサミノグリカン−結合血清アルブミン
についての各濃度における細胞接着の変動を示す図であ
る。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）コンドロイチン硫酸と血清アルブミンとを化学的
   に結合させてなることを特徴とする合成コンドロイチン
   硫酸プロテオグリカン。
2. （２）コンドロイチン硫酸及び血清アルブミンを、カル
   ボジイミド縮合法、臭化シアン活性化法又はＵｇｉ反応
   に従って共有結合せしめることを特徴とする合成コンド
   ロイチン硫酸プロテオグリカンの製造法。