CZ369296A3 - Metody a geny virové resistence u rostlin - Google Patents

Description

METODY A GENY VIROVÉ RESISTENCE U ROSTLIN

Ob 1 at vyn á 1 v z u

Předkládaný vynález se týká metod a materiálů pro zlepšení kontroly rostliných patogenů. Přesněji se předkládaný vynález týká sekvence nukleovych kyselin, které kódují N genový protein, rekombinantních polynukleových molekul obsahujících sekvence a jejich užití, zejména užití pro transformaci rostlin z rodiny Solanaceae tak, aby byly resistentní na virus tabákové mozaiky.

Dijsavadn 1. stav techniky

Většina ztrát výnosu plodin a kvanty muže oyt výsledkem infekce plodin rostlinými patogeny včetně virů, bakterií a hub. Virus tabákové mozaiky (TMV) infikuje komerčně významné rostliny včetně tabáku a příbuzných rostlin jako jsou rajčata a pepř. Ačkoliv není letální, poškozuje TMV růst a produktivitu těchto rostlin. Virový patogen se šíří mezi rostlinami ve dvou krocích. Za prvé, virová infekce se vyskytne v místě, kde je virus zaveden do buněk hostitelské rostliny. Za druhé, virová replikace se vyskytne tam, kde se virus znásobuje uvnitř buněk rostliny.

Rostliny mají množství mechanismů, které poskytují přirozenou resistenci na atak patogena. Tyto zahrnují vytvořené struktury a chemické bariery a mechanismy aktivní resistence. Resistence rostlin na choroby způsobené velkým počtem patogenů je kontrolována jednotlivými komplementárními geny v rostlině a patogenů. Geny rostlin jsou nazývány geny resistence a geny patogenů jsou nazývány avirulentními geny. Rostliny nesoucí gen resistence jsou účině chráněny před chorobou způsobenou patogenem nesoucím korespondující avirulentní gen.

Dominantní N lokus tabáku uděluje resistenči na TMV a zprostředkovává lokalizovanou hypersensitivní odpověď (HR) v místě virové infekce a indukci systémové odpovědi získané resistence (SAR) v buňkách sousedících s místem infekce a v celé rostlině. Heterozygotní rostliny tabáku nebo homozygoti pro N lokus jsou resistentní na chorobu způsobenou TMV. HR je komplexní, aktivní odpověď resistence, která je indukována v rostlině v odpovědi na atak patogena po selhání předem vytvořených mechanismů resistence (Keen et al., Biotechnology in Plant Disease Control, Wiley-Liss, lne., str. 65-88 (1993)). HR je charakterizována smrtí buněk (nekrosou) v místě vstupu patogena.

Ačkoliv nekrosa per se nemůže být odpovědná za resistenci na vnikajícího patogena, konkomitantní syntesa antimikrobiálních sloučenin, proteinů týkajících se patogenese, které charakterizují SAR odpověď a ustanovení strukturálních barier je považováno za hlavní úlohu v zabránění šíření patogena. Interakce rostlina-patogen, jejichž výsledkem je resistence, jsou nazývány inkompatibilní, zatímco ty, které vedou k rozvoji choroby, jsou nazývány kompatibilní.

Byly provedeny studie mechanismů, kterými rostliny nesoucí geny resistence na chorobu zjistí přítomnost pronikajícího patogenu a vyvolají HR a SAR. V mnoha případech je HR řízena gene for gene interakcí mezi inkompatibilní rostlinou a kombinacemi patogenu. Model genu, jak navrhl Flor (Journal of Agricultural Research 74:241-262 (1947)) předpokládá, že resistence na chorobu a avirulence patogenu (produkce elicitoru) jsou dominantními rysy. Proto se bude resistence vyskytovat pouze v případech, kde rostlina vlastní specifický gen resistence (R-gen) a patogen vlastní korespondující gen avirulence (Avr gen). Některé Avr geny byly klonovány z bakterií, hub a virů (viz Gabriel et Rolfe, Annual Rev. Phytopathology 28:365-391 (1990) a Keen, Annual Rev. Genet.

24:447-463 (1990)), a v některých případech byla definována přirozená molekula elicitoru (viz. Keen Plant Molecular Biology 19:109-122 (1992)). Gen resistence kukuřice na houby, HMI, (Johal and Briggs, Science 258:985-987 (1992)) a gen resistence rajčat na bakterie, Pto, (G.Martin et al., Science 262: 1432-1436 (1993)) byly popsány. Žádný přirozený gen rostlině resistence na viry nebyl doposud popsán.

Jednoduché genetické vztahy mezi R-geny a jejich korespondujícími Avr geny vedly ke spekulacím o způsobu akce produktů R genu. Jeden model předpokládá, že R geny leží v signální cestě, která je schopná rozpoznat patogen a iniciovat následující signální transdukční kaskádu vedoucí k resistenci (Lamb, Cell 76:419-422 (1994)). Druhý model předpokládá, že produkty R genu jsou transmembránové iontové kanály, které zprostředkují buněčnou smrt nezávislou na jiných událostech v buňce. Nedávné klonování Pto z rajčete, který uděluje resistenci na bakteriální patogen Pseudomonas syringae pathovar tomato (Martin et al., Science 262:1432-1436 (1993)), napovídá, že alespoň první model může být fungující v rostlinách. Sekvenční analýza Pto indikuje, že kóduje serin/threonin kinásu. Je teorie, že tato serin/threonin kinása interaguje přímo nebo nepřímo s molekulou elicitoru a pak fosforyluje následující modulátor odpovědi resistence, a tak iniciuje signál transdukční kaskády.

Byly zmíněny podobnosti mezi hypersensitivní odpovědí resistence rostlin a vrozenou imunitní odpovědí zvířat. Společným tematem je rychlá produkce reaktivních typů kyslíku (ROS), známá jako oxidativní vzplanutí. Příklady ROS jsou superoxidový aniont (0 “) a peroxid vodíku (H₂0₂). Tyto molekuly mohou mít přímý antimikrobiální efekt a jiné protektivní efekty jako je překřížení strukturálních proteinů ve stěně rostlině buňky. Důležité je, že ROS mohou aktivovat expresi obrany se týkajících genů u zvířat a rostlin (Schreck and Baurle, Trends in Cell Biology . 1:39-42 (1991), Chen et al., Science 262:1883-1886 (1993)). U savců jsou ROS silně implikovány jako druhý posel pro cytokiny jako je tumor nekrosis faktor (TNF) a Interleukin 1 (IL-1) ve dráze, kde transkripční faktor NF-kB reguluje expresi imunoglobulinů, interleukinů, a jiných proteinů. Drosophila transkripční faktor (Dif) homologní k NF-kB také aktivuje transkripci antibakteriálních proteinů včetně cecropinů, attacinů, defensinů a lysozymů (Levine and Hultmark, Trends in Genetics, 9:178-183 (1993)). Paralelně je u rostlin indukce patogenese se týkajících proteinů a syntesa antimikrobiálních sloučenin jako jsou phytoalexiny, které mohou být indukovány exogení aplikací H₂0₂.

Důležitým modelem systému pro studium odpovědi resistence u rostlin je systém genu resistence Ν. N lokus je složen z jednotlivých dominantních genů, které zprostředkují indukci nekrotického typu odpovědi a SAR v odpovědi na infekci TMV (Holmes, Phytopatology 28:553-561 (1938)). To bylo původně identifikováno v Nicotiana glutinosa, a bylo to vneseno do N.tabacum. N-gen zprostředkuje hypersensitivní odpověď, která je charakterizována formováním lokálních lézí, ve kterých je lokalizován virus tabákové mozaiky. Toto je ukázáno na Obr.

1A. Tabákové kultivary bez N genu dovolují viru tabákové mozaiky šířit se systémově a vyvinout mozaikové symptomy charakterizované intermitentními oblastmi světle a tmavě zelené tkáně listů (Obr. IB).

Rekombinantní DNA technologie nabízí potenciál pro získání rostlin s geny resistence na patogén k udělení resistence . Tomuto přístupu bránila nedostupnost klonovaných genů přirozené resistence rostlin a neznalost mechanismu resistence.Dosud, nicméně, byly klonované geny resistence nedosažitelné díky nedostupnosti techniky k izolování rostliných genů, pro které není dosažitelná žádná informace týkající se genu nebo jeho produktu. Nedávno byly vyvinuty pro rostliny dvě techniky, a nejsou závislé na znalosti genu nebo biochemické znalosti proteinu, které dovolují izolaci genu těmito technikami. Těmito technikami jsou poziční klonování a transposon tagging (Baker , Schell, Fedoroff, Proceedings of National Academy of Science, USA 83:4844-4848 (1986)).

Podsta ta vyn<41 ezu

Předkládaný vynález zahrnuje DNA sekvence v izolované a purifikované formě, které kódují N-genový protein, kde tento protein zprostředkuje resistenci na TMV v rostlinách syntetizujících N-genový protein. Genomová a cDNA sekvence kódující jednotlivý N-genový protein jsou zde specificky doloženy příklady. Do rozsahu předkládaného vynálezu jsou zahrnuty DNA sekvence kódující N genový protein příklady doložených aminokyselinových sekvencí. DNA sekvence, které specificky hybridizují s N gen kódující sekvencí nebo jejím komplementem za standartních podmínek a které kódují proteiny N genu, jejichž funkcí je zprostředkování resistence na TMV jsou také obsaženy předkládaným vynálezem.

Dalším aspektem vynálezu je zajištění rekombinantní molekuly nukleové kyseliny obsahující sekvenci kódující protein N genu. Taková molekula zahrnuje, například, rekombinantní vektory, jako je klonující, expresní, nebo transformační vektor, které obsahují DNA sekvenci kódující protein N genu.

Dalším aspektem vynálezu je zajištění buněk, které jsou transformovány výše zmíněnými vektory nebo DNA sekvencemi.

Jednotlivým využitím vynálezu je poskytnutí rostlin nebo rostliných buněk transformovaných N gen kódující sekvencí k poskytnutí rostlin majících resistenci na TMV.

Dalším aspektem vynálezu je poskytnutí oligonukleotidových prob schopných detekce N genu nebo jeho funkčního ekvivalentu v rostlinách z rodiny Solanaceae a užití prob k izolování DNA sekvencí kódujících N gen nebo jeho funkční ekvivalent. DNA sekvence, které specificky hybridizují s probami a které kódují funkční protein N genu jsou obsaženy v předkládaném vynálezu.

Užití sekvence N genu usnadňuje izolaci homologních genů z příbuzných a nepříbuzných hostitelů k získání genů, které chrání hostitelské rostliny proti příbuzným virovým patogenům a nepříbuzným patogenům.

V souladu s tímto objevem je předmětem vynálezu poskytnutí genových konstruktů obsahujících DNA sekvenci, která kóduje protein N genu, jehož funkcí je zprostředkovat resistenci na TMV u rostlin syntetizujících protein N genu.

Je také předmětem vynálezu poskytnutí transformujících vektorů obsahujících N genový konstrukt, kde jsou tyto vektory efektivní pro stabilní zavedení N genového konstruktu do rostliny.

Jiným předmětem vynálezu je poskytnutí transgenních rostlin majících resistenci na TMV, kde je tato resistence výsledkem exprese N genového konstruktů.

Jiné objekty nebo výhody tohoto vynálezu se stanou jasnými z následujícího popisu.

PODROBNÝ POPIS OBRÁZKŮ

Obr.l ukazuje fenotyp tabákových listů po inokulaci TMV. Obr.lA ukazuje list z rostliny nesoucí funkční N gen. Obr.lB ukazuje list z rostliny citlivé na TMV. Obr.lC ukazuje list z rostliny vykazující oblasti nekrosy na podkladě citlivosti na TMV(sektorovaný fenotyp). Obr.ID ukazuje list z SRÍ tabáku citlivého na TMV transformovaného pTG38 T-DNA konstruktem.

Obr. 2A-2C ilustrují Southern blot hybridizanční analýzu proby Ntl RFLP markéru a Ac k Dlll populaci. 0br.2A ukazuje výsledky hybridizace Nt-1 proby na genomovou DNA izolovanou z Nicotiana species glutinosa, tomentosiformis, a sylvestris, a kultivarů tabáku Samsun NN a SR 1. Obr. 2B ukazuje výsledky Nt-1 hybridizace na genomovou DNA zpětného křížení rodičů segregující Nt-1 (G) N-navázaný RFLP markér. Obr.2C ukazuje hybridizaci 5-Ac proby na stejnou DNA jako na 0br.2B.

0br.3A ukazuje mapu restrikčních enzymů části divokého typu N-genu a Ac inserčně mutovaný N gen. Obr. 3B-C ukazují Southern blot hybridizační analýzu DNA izolované z rodičovské Nicotiana species a z Ac mutovaných rostlin, sektorovaných rostlin a mutantů nesoucích Ac inserci v divokém typu (WT)

N genu, a gíerminálni revertanty. 0br.3B ukazuje hybridizaci N genové proby N-5 na selektovanou rostlinou DNA.

0br.4A a 4B sumarizují organizaci N genu. 0br.4A ilustruje organizaci N genu s ohledem na relativní posice intronů a exonů, a Obr.4B poskytuje restrikční mapu tří genomových klonů, kde každý obsahuje kompletní délku N genu. Tato mapa byla odvozena ze sekvenční analýzy cDNA klonů C7, C16, a C18 a G38 genomového klonu a ze restrikční digestivní analýzy tří genomových klonů. cDNA C7, nezobrazená, byla identická s cl8 s tou výjimkou, že C7 obsahuje intron II a jeví se částečně zpracovanou zprávou. C18 postrádá 753 bp na 5-konci. Dohromady určují otevřený čtecí rámeček o 3432 párech baží kódující 1144 aminokyselinových polypeptidů. C16 kóduje 652 aminokyselinových proteinů díky tomu, že je do něj započten 70 bp alternativní exon, který mění čtecí rámeček. Všechny tři cDNA klony byly identické ve svých 3-koncích, ale pouze C7 a C16 byly identické v 5-koncích. Obr.4B: genomové kmeny byly tráveny Eco RI(E), Bam Hl(B) a Xho I(X). X indikuje, že tyto Xho I místa byla poskytnuta polylinkerem lambda Gem 11 klonujícího vektoru.

Obr.5 je modelem pro N proteinem zprostředkovaný signál transdukce v odpovědi na TMV infekci.

DETAILNÍ POPIS VYNÁLEZU

O dominantních genech resistence na choroby u rostlin se soudí, že kódují proteiny, které rozpoznají jednotlivé patogeny nebo druhy patogenů a iniciují signální transdukční kaskádu, která vede k expresi resistence na chorobu. TMV vstupuje do rostliny prostřednictvím mechanického poškození rostlině tkáně. Po vstupu do buňky není jeho distribuce a lokalizace uvnitř buňky pochopena. V rostlinách tabáku obsahujících N je předpokládáno, že N protein interaguje přímo nebo nepřímo s některou komponentou TMV. Tato komponenta TMV nebyla doposud definována, ale soudí se, že zahrnuje replikasu (Padgett and Beachy, Plant Cell 5:577-586 (1993)). Při rozpoznání TMV iniciuje N odpověď resistence, která vede k formování lokální lése a indukci vzdálené systémové získané resistence.

předkládaném objevu soudíme, že je první zprávou o klonování, sekvencování a zprostředkování transgenní resistence na virus tabákové mozaiky pro N gen Nicotiana.

Jak je zde definováno označuje protein N genu protein mající schopnost zprostředkovat resistenci na TMV u rostlin syntetizujících protein N genu. N gen obsahuje genomovou sekvenci, která kóduje protein N genu a která přímo reguluje transkripční a translační expresi N kódující sekvence.

Příklady doložené produkty N genu mají předpokládanou molekulární hmotnost okolo 131 kDa a předpokládaná aminokyselinová sekvence je dána SEQ ID NO:4 a Tabulkou 7A. Příklady doložená genomová DNA sekvence, která obsahuje kódující sekvenci pro tento produkt N genu je poskytnuta SEQ ID NO:1. Kompletní cDNA sekvence (z klonu C18) a zeslabená cDNA sekvence (z klonu C16) jsou dány SEQ ID NO:3 a SEQ ID NO:5 v příslušném pořadí.

Degenerace genetického kódu je v oboru dobře známa; proto synonymní kódující sekvence s jednou nebo více substitucemi kodonů bude snadno odborníkem určena. Synonymní kódující sekvence se liší od příklady doložených sekvencí, ale kódují proteiny stejné aminokyselinové sekvence jako ty, které jsou zde specificky poskytnuty.

Specifické provedení nukleotidových sekvencí, které kódují protein N genu, jehož funkcí je zprostředkování resistence na TMV, jsou dána SEQ ID NO:1, 3, a 5.

cDNA sekvence obsahující kompletní N gen je dána SEQ ID No.3. cDNA sekvence je dlouhá 3760 bp. Výsledný otevřený čtecí rámeček (kódující část), začínající básí 60 a končící básí 3494 kóduje protein dlouhý 1144 aminokyselin. Kódovaný protein je popsán v Tabulce 7A a v Příkladu 5.

cDNA sekvence kódující zeslabený protein N genu vztažený k proteinu Tabulky 7A je dána SEQ ID NO:5. Tato cDNA je 3830 bp dlouhá a kóduje protein o 652 aminokyselinách (viz.SEQ ID NO:6).

Genomová DNA sekvence obsahující kompletní N gen ja dána SEQ ID N0:l. Genomová DNA je 7400 bp dlouhá, nukleotidová sekvenční analýza ukazuje pět exonů, které dohromady korespondují s kódující sekvencí v SEQ ID N0:3. Sekvence kódovaného N proteinu je dána SEQ ID NO:2 a SEQ ID N0:4.

Analýza sekvence N proteinu a srovnání s jinými sekvencemi proteinů ukazuje signifikantní sekvenční similaritu k jistým proteinům, které se účastní signální transdukce (viz.také Tabulku 7A a Příklad 5). Protein N genu obsahuje tři funkční domény: signální doménu, ATP/GTP vazebné místo (P-smyčka), a region bohatý na leucin. Takové domény jsou přítomné v proteinech s úlohou v signální transdukci.

Region bohatý na leucin (LRR) je u N složen ze 13 opakujících se sekvencí a nej častěji obsaženou opakující se sekvencí je sekvence LXXLXXLXL (nebo podobná sekvence). Kromě leucinových residuí je dominantním rysem LRR přítomnost prolinu. Námi definované LRR jsou průměrně 25 aminokyselin dlouhé. Prolin byl arbitrážně projektován tak, aby byl první aminokyselinou v každé opakující se sekvenci. Tabulka 7G ukazuje primární strukturu N genu na leucin bohatých opakujících se sekvencí (aminokyseliny (aa) 590-928) a srovnání jeho konsensuální sekvence s LRR konsensem kvasinkové adenylát cyklásy, Drosophila Toll, lidského řetězce Iba glykoproteinu membrány destiček, Htrk, Drosophila Chaoptin, Arabidopsis receptor-like transmembránové kinasy (TMK1) a TMKL1.

O LRR se soudí, že zprostředkují protein-protein interakce ve velkém rozsahu proteinů. Význam LRR ve funkci některých proteinů byl určen mutagenesí nebo izolací mutací podle mutantního fenotypu. U kvasinkové adenylát cyklasy zruší mutace jako je delece dvou aminokyselin v 1 z 26 LRR schopnost být aktivován Ras (Suzuki et al., (1990) Proceedings of the

National Academy of Science USA 87:8711-8715) . Aminokyselinová substituce A156-V v jednom z 6 LRR alfa podjednotky lidského destičkového glykoproteinu lb vede ke krvácivým poruchám (Ware et al., (1993) J.Clin. Invest. 92:1213-1220).

LRR se soudí, že je velmi důležitý v řízení specifických protein- protein interakcí. Bez záměru vazby na jakoukoliv jednotlivou teorii, LRR může interagovat s komponentou TMV. Protože malé změny ve struktuře LRR vedou k drastickým změnám ve funkci proteinu, je možné, že LRR zprotředkuje specifické interakce mezi TMV a N proteinem. Navíc, malé změny v aminokyselinových sekvencích mohou také vést k novým specificitám, které by, z pohledu vývoje, mohly být velmi prospěšné pro rostliny ve vývoji nové resistence k věčně se měnící patogení populaci. Jiná možná role pro LRR je interakce se specifickou efektorovou molekulou jako je kinasa nebo fosfatasa na TMV rozpoznání.

Předpokládaná aminokyselinová sekvence N obsahuje motiv

P-smyček (Tabulka 7A). Sekvence GMGGVGKT (aa 216 až 223 SEQ ID

NO:4) odpovídá konsensuální sekvenci P-smyčky (A/G)XXXXGK(S/T) nalezeně v různých ATP- nebo GTP-vazebných proteinech (Tabulka 7A). Rodina proteinů obsahujících P-smyčku zahrnuje adenylát kinásy, ras rodinu proteinů, elongační faktory, b-podjednotku ATP syntásy, thymidin kinásy a fosfoglycerát kinásy (Saraste, (1990) Trends in Biochemical Sciences 15:430-434). P-smyčka není pravděpodobně zahrnuta v GTP vazbě, protože konsensuální sekvence, DXXG a NXKD, nutné pro GTP vazbu navíc k P-smyčce, nejsou přítomny (Dever et al., (1987) Proceedings of the National Academy of Science USA 84: 1814-1818).

Navíc k P-smyčce se jeví být dva jiné segmenty zahrnuty v ATP vazbě v adenylát kinase a Fl-ATPase (Fry et al., (1986)

Proceedings of the National Academy of Science USA

83:907-911). Inspekce N sekvence napovídá, že tyto segmenty jsou přítomny a ve vlastním rozmístění (podtržená aminokyselinová residua v Tabulce 7A). Segment 2 obsahuje dipeptid (I,A,L,V)(V,I) a N má sekvenci AI v posici 228 a 229 v příslušném pořadí. V 80-100 aminokyselinách z P smyčky byl segment 3 definován jako Glycin (G) následovaný řetězcem 5 hydrofobních aminokyselin a aspartatu (D) . N protein má sekvenci VLIVLDD v aminokyselinách 296-302. Z aminokyselinové sekvence nelze předpovědět, za jakých podmínek je ATP navázána nebo hydrolyzována.

Aminoterminální aminokyseliny (8 až 150) N proteinu jsou podobné jako u cytoplasmatických (signální) domén Drosophila Toll proteinu a lidského receptorů pro interleukin 1 (IL-1R). Seřazení je ukázáno na Tabulce 7B. Orámečkované aminokyseliny indikují regiony, kde byla identifikována sekvence nebo kde byla pozorována substituce. N sekvence obsahuje některé z konzervovaných aminokyselin, které jsou požadovány pro transmisi z cytopiasrny do nukleolu u Toll a ILl-r regulační dráhy (Schneider et al., (1991) Genes and Devolopment

5:797-807, Heguy et al. (1992) J.of Biological Chemistry

267:2605-2609) .

Podobnosti sekvencí mezi aminokoncovým regionem N proteinu a cytoplasmatickou doménou Drosophila Toll a lidského IL-lR vedou ke spekulacím, že při TMV infekci může být N spouštěčem podobného typu intracelulární signální transdukční kaskády (Obr.5). Interakce velkého množství agens jako virů, cytokinů (IL-1, TNF) a mitogenů (phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA), lektinů, a kalcium ianoforů s receptorem prointerleukin 1 (IL-lR) nebo percepce neznámého signálu extracelulární doménou Toll vede k aktivaci a translokaci Rel se týkajících transkripčních faktorů NfkB a dorsal respektivně z cytoplasmy do nukleolu. U savčí imunitní, zánětlivé a akutní fáze odpovědi aktivní transkripční komplex faktorů NF-kb indukuje nebo reprivuje syntesu množství obraných nebo signálních proteinů po vazbě na motiv dekamerické sekvence nazývané kb-vážící motiv (popsáno v Baeuerle, (1991) Biochimica et Biophysica Acta 1072:63-80). Tyto indukované proteiny iniciují všeobecné buněčné obrané mechanismy signalizací přítomnosti patogenů jiným buňkám (Baeuerle and Baltimore, (1988) Science 242:540-546 a Baeuerle , (1991) supra). Oproti tomu u embryí Drosophily reguluje vyšší koncentrace dorsálního proteinu v nukleolu transkripci zygotních genů požadovaných pro určení dorsoventrální polarity embrya (popsáno Johnston and Nusslein-Volhard, Cell 68:201-219 (1992)). Bodové mutace v signální (cytoplasmatické) doméně přirozených recesivních alel Toll (Schneider et al., (1991), supra) a místně řízené bodové mutace v signální doméně IL-lR (Heguy (1992) supra) vedou k selhání translokace jak dorsálního, tak NF-kb do nukleolu.

Nově byly popsány jiné rel-obsahující geny nazvané Dif (dorsal related imunity) zahrnuté v imunitní odpovědi Drosophily (Ip et al., Cell 75:753-763 (199)). Podobně jako

NFkb a dorsal je normálně Dif protein přítomen v cytoplasmě larválního tělesného tuku, při poškození nebo infekci se translokuje do nukleolu a specificky váže na kb-like motivy v promotorovém regionu různých antimikrobiálních genů (Sun et al., European Journal of Biochemistry, 196:247-254 (1991), Engstrom et al., Journal of Molecular Biology 232:327-333 (1993), a Kappler et al., EMBO J 12:1561-1568 (1993)).

Analogně k výše zmíněným imunitním a vývojovým odpovědím, a bez záměru vázat se na jednotlivou teorii, se produkt TMV (elicitor) váže na LRR nebo jiný region N proteinu (receptor) v cytoplasmě nebo na jiný neznámý protein ultimativně aktivující rel/kb podobný komplex transkripčních faktorů, který je vyžadován pro indukci patogenu se týkajících (PR) genů.

Jednou z primárních výhod vynálezu je to, že může poskytnout metodu pro indukci resistence na TMV u tabáku a příbuzných rostlin jako je rajče a pepř. To je výhodné proto, že N zprostředkovaná resistence na TMV je vysoce efektivní a nebyla dosud narušena běžnými kmeny TMV.

Klonovaný gen přirozané resistence N nabízí výhodu díky nově dostupným technikám pro ochranu rostlin proti TMV. Dva obecně užívané geny pro získání resistence vůči TMV jsou odvozeny od TMV plášťového proteinu (CP) nebo od polymerásového genu. Nevýhodami nové techniky ochrany před TMV jsou ty, že CP-zprostředkovaná resistence se může přerušit za určitou dobu nebo vysokou hladinou inokulace viru, a polymerasou zprostředkovaná resistence je velmi specifická pro virový kmen, ze kterého je polymerasový gen odvozen. Jiný velký nedostatek resistence odvozené od virového genu je riziko nebo možnost evoluce hyperkmenů virů díky rekombinaci mezi přirozenými kmeny a transgeny.Zavedení klonovaných rostlin s geny virové resistence do komerčních kultivarů transformací se vyhýbá výše zmíněným nedostatkům. N gen tabáku uděluje resistenci na všechny známé kmeny TMV s výjimkou j ednoho.

Klonovaný přirozený gen rezistence rostlin na viry také umožňuje fundamentální studie mechanismu resistence gen-patogen rozpoznání a signalizování indukce obrané odpovědi tak jako i identifikaci funkčních domén genu a usnadňuje tak tvorbu resistentních genů se širším spektrem resistence. Toto je první popsání genu rostlině resistence, jehož proteinová sekvence předpokládá putativní ATP/GTP motiv vazebného místa (P-smyčka), a na leucin bohatý region a signální doménu.

Klonování N genu bylo provedeno tranposon tagging s kukuřičnou transposon Ac v N.tabacum. Pozitivní selekce byla vyvinuta proto, aby se vyvinuly izoláty Ac indukovaných mutantů neschopných odpovědi na TMV s HR (HR-mutanty). Jeden z 36 Hr- mutantů nesoucích Ac měl nestabilní mutaci, která korelovala s přítomností jednoho Ac transposonu, označeného AclO. Genomické DNA sekvence doprovázející AclO byly užity k vyšetřování cDNA a genomových knihoven pro klony obsahující kompletní cDNA a genomové DNA N genu. Genomové kmeny obsahující N gen byly izolovány z N.glutinosa genomové knihovny pro použití k transformoání rostlin k vytvoření resistence na TMV. N gen byl klonován do vektoru a použit pro transformování na TMV citlivých rostlin.Transformované rostliny vykazovaly resistenci na TMV.

Jak je zde použito může být molekulou nukleové kyseliny DNA molekula, RNA molekula nebo DNA-RNA hybridní molekula. Přirozeně se nevyskytující molekula nukleové kyseliny je taková, která se nevyskytuje v přírodě. Přirozeně se nevyskytující molekuly nukleových kyselin zahrnují například DNA sekvence, v izolované a purifikované formě, rekombinatní molekuly nukleových kyselin mající heterologní region,což je identifikovatelný segment DNA, který není kovalentně navázán na N gen kódující sekvenci v přírodě, nebo mohou být takové přirozeně se nevyskytující molekuly konstruovány z částí, které byly chemicky syntetizovány; konstrukt, kde se kódující sekvence sama o sobě nevyskytuje v přírodě, například cDNA , kde genomová kódující sekvence obsahuje introny; nebo syntetické sekvence mající kodony, které se liší od kodonů nativního genu. Části z heterologních zdrojů mohou být spojeny prostředky v oboru známými, t.j. ligací in vitro. Alternativně mohou být části spojeny in vivo procesy jako je rekombinace, ale taková rekombinace bude řízena rukou člověka a požadované výsledky budou člověkem identifikovány.

Exemplárními DNA molekulami jsou Nicotiana glutinosa N genové cDNA identifikované nukleotidovou sekvencí danou SEQ ID NO:3 a nukleotidoou sekvencí SEQ ID NO:5. Genomová nukleotidová sekvence obsahující kompletní N.glutinosa N gen je daná SEQ ID No:l.

Vynález zahrnuje také molekuly nukleových kyselin obsahující N gen, které mají nukleotidovou sekvenci s alespoň 70% homologií nukleotidů se SEQ ID NO:1 od asi nukleotidu 1 do přibližně nukleotidu 7400 a kde N genový protein kódovaný molekulou má za funkci zprostředkování resistence na TMV u rostlin syntetizyjících protein N genu. Předkládaný vynález také zahrnuje molekuly nukleových kyselin obsahující protein N genu kódující sekvence , kde kódující sekvence má alespoň 70% homologií se SEQ ID NO:3 od nukleotidu 60 do nukleotidu 3494, kde kódovaný N protein má za funkci zprostředkování resistence na TMV u rostlin syntetizujících tento protein. Homologní sekvence zahrnuté ve vynálezu mohou být identifikovány Southern hybridizačním experimentem za použití podmínek, kde je hybridizace zprostředkována alespoň 70% homologií, v protikladu k nespecifické vazbě (viz. příklad 2 pro diskusy o přísných a nepřísných podmínkách). Homologie, jak je definována, znamená, že nukleotidy pasují po definované délce selektovaného regionu. Hybridizační podmínky jsou popsány v Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) a Ausubel et al., Current protocols in Molecular Biology, Current protocols (1989), které jsou zde uvedeny jako reference.

K identifikaci N genu z jiných Solanaceous species je genomová DNA z rostlin rodiny Solanaceae izolována tak, jak je popsáno. Izolovaná DNA je rozrušena jedním nebo více restrikčními enzymy klonovanými do lambda nebo jiných vhodných vektorů, elektroforesována, a blotován do nylonové membrány jako je Nytran. Bloty jsou probovány probami, které jsou zde popsány. Genomová knihovna vytvořená z těchto cDNA je vyšetřována užitím výše pojmenovaných prob k identifikaci N genu. Je hodnocena aktivita genu, určená exprivováním genu v rotlině druhu solanaceum a hodnocením resistence transformovaných rostlin na TMV, jak je detailně popsáno níže.

Oligonukleotidy derivované ze sekvence N genu mohou také být použity jako primery v polymerasové řetězové reakci (PCR). Tabák obsahuje jeden genomový region kódující N proteiny. Konservované regiony v N genu jsou užitečné v projektování primerů pro zprostředkování a znovuzískání funkčních N homologních genů v rostlinách solanaceum. Dále, protilátky namířené proti doménám N proteinu mohou být užity k vyšetřování expresních knihoven u jiných rostlin solanaceum.

DNA kódující sekvence proteinu N genu může být také připravena synteticky z degenerovaných oligonukleotidů, jejichž sekvence obsahuje kodony pro aminokyselinovou sekvenci proteinu N genu. Takové oligonukleotidy jsou připraveny standartními metodami a jsou shromážděny a použity k izolování požadovaného N genu.

Dostupnost molekul nukleových kyselin kódujících protein N genu tabáku dovolila získání N genové sekvence kódující protein N genu nebo funkčního homologu z jiných rostlin solanaceae.Tabáková genomová nebo cDNA sekvence nebo její části jsou použity jako oligonukleotidové proby k hybridizaci dalších genomových nebo cDNA sekvencí hybridizaci za standartních podmínek. Sekvence, které hybridizují specificky N genovou kódující sekvenci nebo její komplement jak je popsáno výše a které kódují protein N funkčního homologního genu, který zprostředkuje resistenci na TMV u rostlin rodiny Solanaceae jsou zahrnuty v tomto vynálezu. Takové proby zahrnují ty, které obsahují kompletní N gen a které obsahují jednu nebo více následujících domén: 5 a 3' netranslatované regiony, signální doménu (aa 8 až 150), opakující se region bohatý na leucin (aa 591-929) . Takové oligonukleotidy jsou připraveny standartními metodami a shromážděny procedurami známými v oboru. Délka využité proby musí být suficientní pro hybridizaci homologních regionů DNA, kde je hybridizace příslušící alespoň 70% homologii, v protikladu k nespecifické vazbě. Příklady DNA sekvence využitelné jako oligonukleotidové proby jsou dány v Příkladu 5, níže.

Specificky příklady doložený protein N genu Nicotiana glutinosa je charakterizován z hlediska jeho aminokyselinové sekvence v SEQ ID NO:4, a korespondující specificky příklady doložená kódující sekvence je poskytnuta SEQ ID NO:3, od nukleotidu 60 do nukleotidu 3494.

V biologických oborech je dobře známé, že určitá aminokyselinová substituce může existovat v proteinové sekvenci bez narušení funkce proteinu. Všeobecně, konservativní aminokyselinové substituce nebo substituce podobných aminokyselin jsou tolerovány bez narušení funkce proteinu. Podobnými aminokyselinami mohou být ty, které se podobají ve velikosti anebo náboji, například aspartát a glutamát a isoleucin a valin jsou oba páry podobných aminokyselin. Podobnosti mezi páry aminokyselin mohou být hodnoceny v oboru množstvím způsobů. Například Dayhoff et al., (1978) v Atlas of Protein Sequence and Structure, Vol.

5, Supplement 3, Kapitola 22, str 345-352, což je zde uvedeno jako odkaz, poskytuje tabulku frekvence aminokyselinových substitucí, které mohou být využité jako měřítko podobnosti aminokyselin. Dayhoffova tabulka frekvencí je založena na srovnání aminokyselinových sekvencí pro proteiny se stejnou funkcí z množství evolučně odlišných zdrojů.

Aminokyselinová sekvence proteinů může nebo nemusí být identická s aminokyselinovou sekvencí, která se vyskytuje přirozeně v rostlinách solanaceae. Identita proteinů N genu může být potvrzena jeho schopností zprostředkovat resistenci na TMV v rostlinách nebo rostliných buňkách syntetizujících protein N genu. Takový pokus je popsán v Příkladu 1, níže. Stručně, sekvence kódující protein N genu je transformována do rostliny nebo rostlinné buňky mající schopnost syntetizovat protein N genu ze zmíněné sekvence, t.j. do rostliny z rodiny Solanaceae. Transformovaná rostlina nebo rostlinná buňka je infikována TMV. U rostliny je pozorována hypersensitivní odpověď. Jestliže je pozorována resistence, má protein schopnost zprostředkovat resistenci na TMV. Navíc mohou být zahrnuty arteficiální mutace, pokud nepoškozují aktivitu. Mutovaný N protein označuje protein, který má tuto aktivitu, ale který je derivován mutací DNA kódující N protein. Termínem derivován mutací je míněna jak přímá fyzikální derivace od DNA kódující počáteční materiál proteinu N genu, za použití, například, místně specifické mutagenese nebo nepřímá derivace prostřednictvím syntesy DNA mající sekvenci příbuznou, ale záměrně odlišnou, od sekvence N genu. Prostředky pro konstrukci oligonukleotidů požadované délky jsou dosažitelné, takové DNA mohou být konstruovány cele nebo částečně z jejich jednotlivých základních nukleotidů.

Jak bylo zmíněno výše, dostupnost sekvencí kódujících protein N genu tabáku zpřístupnila funkční homology N genu z jiných rostlin solanaceae, což jest gen, který má část kódující N-like protein, a je definován jako polypeptid, který má funkci zprostředkovat resistenci na virové patogeny rostlin, jako je TMV. Tyto N-like geny mohou být identifikovány a izolovány díky jejich podobnosti DNA sekvence (homologii) s N kódující sekvencí tabáku, která je zde poskytnutá. cDNA a/nebo genomové knihovny mohou být vyšetřovány hybridizací pro signifikantně homologní sekvence. Tyto sekvence mohou pak být sekvenovány pro potvrzení přítomnosti kompletních otevřených čtecích forem, klonovány do vektorů tak, aby byly exprivovatelné v rostlinách a tkáně rostlin mohly být transformovány. Transgení rostliny mohou být připraveny užitím v oboru známých technik, a tyto transgení rostliny mohou být testovány pro potvrzení toho, že byla získána resistence na patogen díky zavedení kódující sekvence pro N-like protein. N-like geny zahrnují L gen z pepře, Tm2 a Tm2a z rajčete, a N z Nicotiana sylvestris.

Jiným aspektem vynálezu jsou genetickým inženýrstvím zpracované rekombinatní molekuly nukleových kyselin, preferovaně DNA, obsahující část kódující protein N genu nebo funkční homolog N genu, který má za funkci zprostředkování resistence na TMV v rostlinách syntetizujících N gen nebo funkční homolog, respektive. Rekombinantní DNA molekuly označují hybridní DNA sekvence obsahující alespoň dvě DNA sekvence, kde první sekvence není normálně nacházena v přírodě spolu s druhou. Takové molekuly mohou být získány manipulací s genetickým materiálem užitím restrikcních enzymů, ligás, a podobných rekombinantních technik, které popsal například Sambrook et al., supra., Ausubel et al., supra, a DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (ed.D.N.Glover) IRL Press, Oxford, 1985. Příklady zahrnují rekombinantí vektory, jako jsou klonující nebo expresní vektory, které obsahují DNA sekvenci kódující protein N genu, který je v 5-3(sense) orientaci nebo ve 3-5^x (antisense) orientaci. Příklad 7, níže, popisuje přípravu N gen rekombinantní DNA molekuly. Rekombinantní jak je použito v předkládané aplikaci, neoznačuje přirozeně se vyskytující genetické rekombinace.

Prostředky genetického inženýrství znamená, že výsledek je řízen rukou člověka. Rostlina zpracovaná prostředky genetického inženýrství tak, aby obsahovala jednotlivé DNA molekuly, je ta, do které byla zavedena DNA jakýmikoliv prostředky v oboru známými, včetně, ale ne pouze Agrobacterium - zprostředkované transformace, elektroporace, ostřelování částicemi a pod. Genetickým inženýrstvím zpracovaná DNA molekula je taková, která je produktem molekulárně biologických procesů včetně, ale ne pouze DNA ligace, in vitro mutagenese nebo podobně.

DNA sekvence předkládaného vynálezu jsou užitečné k přípravě rekombinantních DNA expresních molekul klonováním sekvence do jakéhokoliv vhodného expresního vektoru, který je schopný zavést cizorodý gen do heterologního hostitele jeko je bakterie, kvasinka, virus nebo jeho hostitelský organismus, nebo do rostlin. Rekombinantní vektor je konstruován tak, že kódující sekvence je umístěna ve vektoru se vhodnou kontrolní sekvencí a operativně s ní zde asociována, což znamená, že umístění a orientace N gen DNA kódující sekvence s ohledem na kontrolní sekvence je takové, že je kódující sekvence transkribována pod kontrolou kódující sekvence (t.j. RNA polymerasou, která se připevní na DNA molekulu v kontrolních sekvencích). Kontrolní sekvence mohou být ligovány do kódující sekvence před insercí do vektoru. Alternativně může být kódující sekvence klonována přímo do expresního vektoru, který už obsahuje kontrolní sekvenci a vhodné restrikční místo downstream od kontrolní sekvence. Vektor může být vybrán tak, aby měl promotor operabilní v hostitelské buňce, do která má být vektor insertován (to znamená, že promotor by měl být rozpoznán DNA polymerasou hostitelské buňky). Navíc by měl mít vektor region, který kóduje vazebné místo pro ribosom umístěné mezi promotorem a místem, ve kterém je DNA sekvence insertována tak, aby byl operativně asociován s N gen kódující sekvencí jednou připojenou. Vektor by měl být vybrán tak, aby poskytoval region, který kóduje vazebné místo pro ribozom rozpoznávané ribozomy hostitelské buňky, do které má být vektor insertován.

Rekombinantní DNA expresní molekula obsahující sekvenci, která kóduje protein N genu v 5'-3'orientaci je insertována do hostitelské buňky pro expresi proteinu N genu. Množství expresních systémů a hostitelů je známé v oboru produkce proteinů. Příkladem prokaryontního hostitele je E.coli. Velké množství rekombinantních systémů bylo vyvinuto pro expresy v eukaryontních hostitelích, včetně kvasinek, hmyzích buněk, savčích buněk, a rostliných buněk. Tyto systémy jsou dobře charakterizovány a vyžadují ligaci kódující sekvence pod kontrolou vhodného transkripčního iniciačního systému (promotoru) a , je-li to žádoucí terminační sekvence a enhancery. Pro produkci proteinu N genu jsou hostitelské buňky transformováné rekombinantní DNA expresní molekulou kultivovány a protein je izolován z hostitelské buňky.

Selekce vhodných kultivačních podmínek a metod získání je v rozsahu znalostí v oboru.

Dále je doložena příkladem exprese proteinu N genu v Escherichia coli. N gen DNA kódující sekvence je insertována do expresního vektoru jako je pRSET (Invitrogen Corp., CA) nebo pET (Novagen, WI). N gen protein kódující sekvence je pak exprivována pod kontrolou transkripčních a translačních signálů silného bakteriofágu T7.

Zejmena užitečné ve spojení s N geny předkládaného vynálezu jsou expresní systémy, které jsou operabilní v rostlinách. Kódující sekvence pro protein N genu a DNA , která representuje reversní transkript mRNA, který je následně translatován do proteinu N genu, může být zahrnut v expresním systému vhodném pro rostliny. Pro expresi v rostlinách bude rekombinantní expresní kazeta obsahovat navíc k N gen kódující sekvenci rostliný promotor region (jestliže ho sekvence postrádá), transkripční iniciační místo ( jestliže ho kódující sekvence, která má být transkribována postrádá), a transkripční terminační sekvenci. Terminační region může být získán ze stejného genu jako promotorové sekvence nebo může být získán z jiných genů. Jedinečná místa pro restrikční enzym v 5' a 3' koncích kazety jsou typicky zahrnuta, aby umožnila snadnou inserci do pre-existujícího vektoru. Rostlině expresní systémy mohou být systémy, které jsou pod kontrolou tkáňově specifického promotoru, stejně jako ty, které vyžadují promotory, které jsou operabilní ve všech rostliných tkáních.

Transkripční iniciační regiony, například, zahrnují různé opine iniciační regiony, jako je octopin, mannopin, nopalin a pod. Rostlině virové promotory mohou být také použity, jako je 35S promotor viru květákové mozaiky (CaMV). Navíc, rostlině promotory jako je ribulosa-1,3-difosfát karboxylasa, ovoce-specifické promotory, promotory tepelného šoku, semeno specifické promotory atd. mohou být také použity. Jednotlivé vybrané promotory by měly být schopné způsobit dostatečnou expresi, která by vedla k produkci efektivního množství proteinu N genu k navození resistence na infekci TMV u rostliných buněk a rostlin. CaMV 35S promotor vykazuje vysokou aktivitu v mnoha rostliných orgánech a během mnoha stupňů vývoje, je-li integrován do genomu transgeních rostlin. Tkáňově specifické promotory jsou také dobře známé.

Preferovaně jsou v molekulách řídících expresi TMV resistence cestou N genu transkripční terminační signály poskytnuty downstream a operativně navázané na kódující region proteinu N genu. Terminační signály mohou být ty, které jsou normálně přítomny v N genu, nebo může být jeden nebo více k heterologních transkripčních terminačních signálů poskytnut downstream od N kódujícího regionu. Množství transkripčních terminačních signálů je v oboru dobře známé, například ty z Agrobacterium tumefaciens T-DNA genů včetně, ale ne pouze nos.

Výsledný expresní systém nebo kazeta je ligován do nebo konstruována jiným způsobem tak, aby byl obsažen v rekombinantím vektoru, který je vhodný pro transformaci rostlin. Vektor bude také typicky obsahovat selektovatelný markerový gen, podle kterého mohou být transformované rostlině buňky identifikovány v kultuře. Obvykle bude markerový gen kodovat antibiotickou resistenci. Tyto markéry zahrnují resistenci na G418, hygromycin, bleomycin, kanamycin a gentamycin. Po transformování rostliných buněk budou buňky mající vektor identifikovány podle jejich schopnosti růst v mediu obsahujícím jednotlivá antibiotika. Replikační sekvence, bakteriálního nebo virového původu, jsou obyčejně také obsaženy, aby dovolily vektoru být klonován do bakteriálního nebo fágového hostitele, preferovaně je obsaženo široké hostitelské spektrum prokaryotního zdroje replikace. Selektovatelný markér pro bakterie by měl být také obsažen, aby dovolil selekci bakteriálních buněk nesoucích požadovaný konstrukt. Vhodné prokaryontní selektovatelné markéry také zahrnují resistenci na antibiotika jako je kanamycin nebo tetracyklin.

TMV resistence zprostředkovaná N proteinem byla demonstrována u transgeních rostlin, do kterých byl zaveden genomový N klon, kde tyto rostliny byly sensitivní na TMV před genetickou modifikací. Klonování cDNA kódující N protein může být také použito k udělení TMV resistence sensitivním rostlinám solanaceae. cDNA je klonovaná downstream a operativně navázaná na promotor funkční v rostliných buňkách a zavedena do rostliné tkáně a transgení rostliny jsou regenerovány užitím vektorů a technik snadno odborníkům dosažitelných. Virová resistence je potvrzena testem inokulace závažným virem, t.j. TMV. Je-li použita cDNA může být užitečné zavést jak kompletní (SEQ ID N0:3), tak zkrácené (SEQ ID NO:5) cDNA do rostliné tkáně po operativním navázání každé sekvence na transkripční kontrolní sekvence funkční v rostliných buňkách. Znovu je TMV resistence potvrzena testem inokulace TMV.

Jiné DNA sekvence kódující další funkce mohou být také přítomné ve vektoru, jak je v oboru známé. Například, v případě transformace Agrobacterium, budou T-DNA sekvence také zahrnuty pro následný transfer do rostliných chromosomů.

Je-li získán vhodný vektor, jsou připraveny transgení rostliny, které obsahují žádoucí expresní systém. Kódující sekvence proteinu N genu jsou insertovány do vhodného rostliného transformačního vektoru pro transformaci v požadovaném rostliném druhu, zejměna, rostlin rodiny Solanaceae, k navození resistence rostlin na TMV. Kromě tabáku (Nicotiana, t.j. N.tabacum a N.glutinosa) jsou v rodině Solanaceae významné potravinové plodiny. Tyto zahrnují rajče (Lysopersion, t.j. L.lysopersicum a L.esculentum), pepř (Capsicum), brambor (Solanum tuberosum, lilek (Solanum melongena).

V oboru je známo množství technik pro transformaci rostlin a rostliných buněk. Pro transformaci zprostředkovanou bakteriální infekcí jsou rostliné buňky infikovány

Agrobacterium tumefaciens nebo A.rhizogenes, které jsou dříve transformované DNA, která má být zavedena. Agrobacterium je representativní rod gram negativní rodiny Rhizobiaceae. Heterologní genetické sekvence mohou být zavedeny do vhodných rostliných buněk prostřednictvím Ti plasmidu A.tumefaciens nebo Ri plasmidu A.rhizogenes. Ti nebo Ri plasmid je přenesen do rostliných buněk infekcí Agrobacterium a je stabilně integrován do rostliného genomu (J.Schell, Science 237:1176-1183 (1987)). Ti a Ri plasmidy obsahují dva regiony, které jsou základní pro produkci transformovaných buněk.

Konstrukce rekombinantních Ti a Ri plasmidů obecně následuje metodu typicky používanou pro nejběžnější bakteriální vektory jako je pUC 19. Existují dvě třídy rekombinantních Ti a Ri plasmidových vektorových systémů, které se nyní používají. V jedné třídě, nazývané kointegrátní,je transportní vektor obsahující požadovaný gen insertován genetickou rekombinací do non-onkogeního Ti plasmidu, který obsahuje jak cis-účinkující , tak trans-účinkujíí elementy požadované pro transformaci rostlin, tak jako to je u pMLJl transportního vektoru DeBlocka et al., EMBO J 3:1681-1689 (1984) a neonkogeního Ti plasmidu pGV3850 popsaného Zambryski et al., EMBO J 2:2143-2150 (1983). Ve druhé třídě nebo binárním systému je požadovaný gen insertován do transportního vektoru obsahujícího cis-účinkující elementy požadované pro transformaci rostlin. Další nezbytné funkce jsou poskytnuty v trans neonkogením Ti plasmidem, jak je doloženo příkladem pBIN19 transportního vektoru, popsaného Bevanem, Nucleic Acid Research 12:8711-8721 (1984) a neonkogeního Ti plasmidu PAL4404 popsaného Hoekema et al., Nátuře 303:179-180 (1983)) . Některé z těchto vektorů jsou komerčně dostupné.

Existují dvě všeobecné cesty pro transformaci rostliných buněk AgrobacterieriT: kokultivace Agrobacteřium s kultivovanými izolovanými protojblasty a transformace in£áktních buněk nebo

2)5 tkání Agrobacterium. První vyžaduje ustanovený kultivační systém, který dovoluje kultivaci protoplastů a následnou regeneraci rostliny z kultivovaných protoplastů. Druhá metoda vyžaduje (a) aby intaktní rostlině tkáně, jako jsou kotyledony , mohly být transformovány Agrobacterium a (b) aby transformované buňky nebo tkáně mohly být indukovány k regeneraci celé rostliny. Nejběžnější druhy mohou být transformovány Agrobacterium,tak jako všechny druhy, které jsou přirozenými hostitely Agrobacterium jsou transformovatelné in vitro.

Jiný postup pro klonování a transormaci zahrnuje klonování N gen kódující sekvence do T-DNA vektoru pMDl mezi CaMV 35S promotor a NOS terminační region. Rostliny nesoucí germinální Ac excisní zásahy jsou transformovány podle Horsche et al., Science 227:1229-1231, (1985) s modifikací (Hehl, Molecular

General Genetics 217:53-59 (1989)). Tento postup je detailně popsán v Příkladu 1, níže.

Agrobacterium tumaficiens zprostředkovaná transformace je známá jako efektivní u členů rostlin rodiny Solanaceae a je zejména využitelná. Jiné transformační metody jako je elektroporace, mikroprojektilová nebo částicová technologie bombardování, liposomy, a chemikálie, které zvyšují vychytávání volné DNA mohou být také použity. Identifikace transformovaných rostlin nebo buněk je obyčejně provedena zavedením selektovatelného markéru do transformujícího vektoru, nebo získáním evidence úspěšné bakteriální infekce. Rostlině buňky, které byly transformovány, mohou také být regenerovány užitím známých technik.

Regenerace rostlin rodiny Solanaceae je detailně popsána Horschem et al., 1985, supra. Regeneraci rostlin z kultivovaných protoplastů popsal Evans et.al.,Handbook of Plant Cell Cultures, Vol.1:(MacMillan Publishing Co. New York, 1983), a Vasil I.R. (ed.), Cell Culture and Somatic Cell

Genetics of Plants, Acad.Press, Orlando, Vol. 1,1984, a Vol.II, 1986). Je známo, že prakticky všechny rostliny mohou být regenerovány z kultivovaných buněk nebo tkání.

Prostředky pro regeneraci se liší druh od druhu rostliny, ale obyčejně je nejprve poskytnuta suspense transformovaných protoplastů nebo petriho miska obsahující transformované explanty. Je formována tkáň kalu a mohou být indukovány výhonky z kalu a následně kořeny. Tato somatická embrya klíčí stejně jako přirozená embrya za formování rostlin. Kultivační medium bude obyčejně obsahovat různé aminokyseliny a rostlině hormony jako jsou auxiny a cytokiny. Dostatečná regenerace bude závislá na mediu, genotypu a na průběhu kultivace.Jestliže jsou tyto tři proměně kontrolovány ,je regenerace obvykle reproducibilní a opakovatelná. Regenerované rostliny jsou přesunuty do standartních půdních podmínek a kultivovány konvenčním způsobem.

Poté, co je expresní kazeta stabilně inkorporována do regenerované transgení rostliny, může být transferována do jiných rostlin pohlavním křížením. Může být použita jakákoliv z množství standartních množících technik, v závislosti na druhzích křížených rostlin. Rostliny jsou pak kultivovány a

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady jsou míněny pouze jako další ilustrace vynálezu a nejsou míněny jako omezení rozsahu vynálezu jako nároky. Příklady využívají množství technik, odborníkům dobře známých a dosažitelných v oboru molekulární biologie, při manipulaci rekombinantní DNA v rostliných tkáních a při kultivaci a regeneraci transgeních rostlin. Enzymy jsou získány z komerčních zdrojů a jsou užity podle doporučení prodejce nebo jiné variace v oboru známé. Reagens, pufry a kultivační podmínky jsou také známé v oboru. Odkazy poskytující standartní molekulárně biologické postupy zahrnují Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning, druhá edice, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY, R. Wu (ed.) (1993) Methods in Enzymology 218, Wu et al., (eds.) Methods in Enzymology 100,101,Glover (ed.) (1985), DNA cloning, Vols. I a II, IRL Press Oxford, UK, a Hames and Higgins (eds.) (1985) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK. Odkazy týkající se manipulace a transformace rostliných tkání zahrnují Kung and Arntzen (eds.) (1989) plant Biotechnology, Butterworths, Stoneham, MA, R. A. Dixon (ed.) (1985) Plant Cell Culture: A Practical Approach, IRL

Press, Oxford, UK, Schuler and Zielinski (1989) Methods in Plant Molecular Biology, Academie Press, San Diego, CA, Weisbach and Weisbach (eds.) (1988) Academie Press, San Diego, CA, I. Potrykus (1991) Ann. Rev. Plant Physiol.Plant Mol. biol. 42:205, Weising et al. (1988) Annu. Rev. Genet.

22:421, van Wordragen et al., (1992) Plant Mol. Biol. Rep.

19:12, Davey et al. (1989) Plant Mol. Biol. 13:273, Walden and Schel (1990) Eur. J. Biochem. 192:563, Joersbo and Brunsted (1991) Physiol. Plant. 81:256 a odkazy citované v těchto odkazech. Zkratky a nomenklatura, které byly použity jsou považovány v této oblasti za standartní a jsou všeobecně užívány v odborných časopisech jako jsou ty, které jsou zde citovány. Všechny odkazy, které jsou citovány v předkládaném vynálezu jsou zde výslovně uvedeny jako odkazy.

PŘÍKLAD 1

Tento příklad popisuje izolaci nestabilního HR-mutantu. Přesněji, byly izolovány mutace N lokusu transposon tagging za užití kukuřičného transposonu Ac. Poté byly mutanty neschopné vykázat TMV dependentní HR izolovány užitím schématu pozitivní selekce, která selektovala TMV infikované N nesoucí rostliny, které ztratily schopnost vykazovat TMV dependentní HR (HR- mutanty). Rostliny homozygotní pro jejich HR- mutace byly identifikovány a byla identifikována mutantní linie mající nestabilní HR-.

Ul kmen TMV (získán od M. Zaitlin) byl propagován do TMV citlivého (nn) tabákového kultivaru (cv) Petite Havana SRÍ, nazývaného SRÍ tabák. S výjimkou inokulace pro vyšetření mutantů (viz níže) byly inokulace TMV provedeny následovně: Inokulum bylo připraveno rozpuštěním mízy macerovaných, TMV infikovaných listů SRÍ tabáku 10 krát ve sterilní vodě. Hubka saturovaná roztokem mízy byla použita k potření horního povrchu listů na rostlinách ve stadiu šesti listů. U rostlin byly počítány po 48 hodinách lokální léze a v intervalech 1 týdne po inokulaci byly prohlíženy známky systémové infekce (mosaiky) a/nebo sektory nekrosy.

K izolaci transgeního tabáku nesoucího aktivní Ac transposony byl TMV resistentní tabák, cv. Samsun NN, transformován pGV3850 HPT::pKU3 (Baker et al., The EMBO Journal 6:1547-1554 (1987)) metodou podle Horsch et al., (Science 227:1229-1231 (1985)) použitím modifikované procedury (Hehl and Baker, Mol Gen. Genet. 217:53-59 (1989)). pGV3850 HPT::pKU3 transformační vektor nesoucí neomycin fosfotransferásu II (NPTII) přerušil Ac. Po zavedení pGV3850 HPT::pKU3 do tabáku, Ac excise z defektivního NPTII genu vedly k NPTII expresi a růstu transformantů na mediu obsahujícím kanamycin.

Stručně, listové disky byly připraveny ze sterilního 6 až 8 týdnů starého TMV resistentního tabáku , cv. Samsun NN rostlin kultivovaných na MS mediu. Listové disky byly inkubovány za přítomnosti Agrobacterium tumefacies obsahujícího pGV3850 HPT::pKU3 nebo kontrolního Ti plasmidového vektoru po 2 až 4 dny.Listové disky byly propláchnuty v MS mediu obsahuj i ím 3% sukrosu a 500 mg/1 Cefotaximu (CalbioChem, La Jolla, CA) a umístěny v MS mediu obsahujícím 3% sukrosu, 0.5 mg/1 BAP (6 benzylaminopurin) ,

0.1 mg/1 NAA (naftalen octová kyselina), 500mg/l Cefotaximu a 200 mg/1 kanamycinu nebo 20 mg/1 hygromycinu. Po 2 až 3 týdnech byly shoots následně znovu transferovány do stejného media obsahujícího 2 mg/1 BAP. Po 1 až 2 týdnech byly shoots znovu transferovány do stejného media, ale bez hormonů pro indukci výhonků. Rostliny byly přesunuty do půdy po 10-15 dnech. Transgení kaly byly regenerovány na 100 mg/1 kanamycinu pro selekci transgeních tkání nesoucích transposing Ac elementy (Baker et al., 1987, supra). Genomová DNA byla izolována z KnR primárně transgeních, nazývaných TO generace.

Ac byl stanoven jako velmi aktivní v rostlinách TO-3 (pGV3850 HPT: :pKU3 ) , vzhledem k resistenci na 100 mg/1 kanamycinu a nárůstu množství Ac kopií, jak bylo určeno Southern hybridizací. Rostliny TO-3 byly kříženy se Samsun NN. Tři TI potomstva vzešlá z křížení, Ti-9, 10, 13 o kterých bylo stanoveno, že mají transposing Ac elementy , byly kříženy s TMV citlivým (nn) tabákovým kultivarem Petite Havana SRÍ (SRÍ) pro generování tří F1 Nn::Ac populací pro vyšetření ztráty TMV dependentní hypersensitivní odpovědi.

Pro stanovení endogení instability N byla také generována Nn populace bez Ac křížením Samsun NN a SRÍ. SRÍ byl použit jako donor pylu ve všeh kříženích.

Pro izolování HR- muantů bylo zaseto přibližně 64000 Nn: :Ac a 29000 Nn semen (viz Tabulka 1) ve stupni asi 2000 semen / misku s hustotou asi 3 semenáčky/cm². Osm týdnů staré semenáčky byly umístěny při 30°C a inokulovány suspensi TMV a Celíte (Fisher, Pittsburgh, PA) užitím vzdušného kartáče (artist air brush) (Paasche VL) (R. W. Fulton, Nicotiana: Procedures for Experimental Use strany 79-86 (1979)).

Koncentrace TMV byla dostatečná proto, aby dávala lokální léze ve zjevné densitě 1.0/cm² na Samsun NN semenáčcích pěstovaných v hustotě -3/cm² a udržované při 24°C. TMV byl izolován z infikovaných SRÍ listů podle Lané (Methods in Enzymology 118:687-691 (1986)).Třetí den po inokulaci (dpi) byly semenáčky přesunuty z 30°C do 2l°C. V 5 dpi byly semenáčky vyšetřovány na přežití, a pak začal druhý a třetí cyklus TMV inokulace a teplotních posunů k potvrzení 100% inokulace.

Tabulka 1 - Izolace HR-mutantů

Křížení	vyšetřované rostliny	HR-mutanty	Frekvence*1
Samsun NNxnn	29000	11	3.8xl04
Tl-9b,10to,13toxnn	64000	36	5.6x10
Celkem	93000	47	5.0xl0“4

** rekvence je kalkulována dělením počtu HR rostlin celkovým množstvím FI rostlin vyšetřovaných pro každé křížení

Samsun NN rostliny nesoucí aktivní Ac transposony

Dvě bakterie patogení pro rostliny, Pseudomonas syringae pv. tomato (P.s.t.) kmen DC3000 a P.s. pv. phaseolicola (P.s.p.) kmen NP 53121, a nepatogení P.s.t. kmen DC 3000 hrpS::Tn5 (získán od B. Staskawicz) byly suspendovány ve dvojnásobně destilované H^O v koncentraci 1 x 10® buněk na ml. Jak bakteriální suspense, tak vodná kontrola byly injikovány 10 ml injekční stříkačkou a 20 kalibrovanou jehlou (Z.Klement, In Methods in Phytobacteriology (Ed. Klement et al.) Akdemiae Kiado, Budapest, Hungary, 101-102 (1990)) do čtyř míst na spodní straně jednotlivého listu. Byly použity tři rostliny od každého z následujících genotypů: Nt-lG/g vlastních semenáčků 9 HR- mutantů, dva TMV sensitivní (SRÍ a Xanthi) a dva TMV resistentní (Samsun NN Xanti nc) tabákové kultivary. Listy byly hodnoceny na jejich odpověď na čtyři odlišná ošetření 48 hodin po inokulaci.

Schéma pozitivní selekce dovoluje izolaci mutantů neschopných vykázat TMV dependentní HR mezi velkou populací Nn semenáčků. Schéma selekce mutantů využívá suprese HR exprese na N nesoucích rostlinách, jsou-li infikovány TMV a udržovány při teplotě vyšší než 28°C. Rostliny nesoucí funkční N gen nevytvářely při teplotě vyšší než 28 °C lokální léze a TMV se šířil v rostlině systémově. Suprese HR je reversibilní a TMV infikované rostliny nesoucí N -vytvářejí systémovou nekrosu (systémovou HR), je-li teplota snížena na permisivních 24°C. Toto je pozitivní selekce mutantů, protože pouze rostliny, které ztratily schopnost vytvářet TMV dependentní HR (HR- mutanty) by měly přežít.

Tak bylo izolováno 47 HR- mutantů z heterozygotních (Nn)

Fl semenáčků produkovaných čtyřmi nezávislými kříženími mezi Samsun NN nebo třemi NN::Ac rodiči a SR tabákem. TMV infikované HR- rostliny byly získány z celkového počtu 93,000 Fl semenáčků. Jedenáct mutantů bylo izolováno z 29,000 semenáčků ze Samsun NN kontrolního křížení, zatímco 36 mutantů bylo izolováno z 64,000 semenáčků ze tří NN::Ac křížení (Tabulka 1). Frekvence ztráty resistence na TMV byla podobná u NN potomků Samsun NN a NN: :Ac při hodnotách 3.8 x l0~⁴ a 5.6 χ 10^-4, příslušně. Možnost získání HR- mutantů ve stejné frekvenci v Nn populaci s a bez Ac indikuje, že stupeň endogeních mutací N je velmi vysoký.

K určení, zda byly HR- mutanty defektní v obecné schopnosti vyjadřovat HR, byly potomci devíti mutantů, včetně C2-2, inokulovány dvěma bakteriálními patogeny, o kterých je známo, že indukují HR u tabáku. Patogení bakterie, Pseudomonas syringae pv. tomato (P.s.t.) kmen DC 3000 a P.s.pv. phaseolicola (P.s.p.) kmen NP 53121, indukovaly HR ve všech případech, zatímco nepatogen P.s.t. kmen DC 3000 hrpS::Tn5, a vodní kontrola nikoliv. Tyto výsledky indikují, še HRmutanty neztrácejí obecnou schopnost vyjadřovat HR na bakteriální patogeny a že HR- fenotyp byl pravděpodobně specifický k odpovědi resistence na TMV.

K identifikaci rostlin homozygotních pro jejich HR- mutace byly mezi sebou křížené potomky 15 mutantů vyšetřeny molekulárně. DNA byla izolována z 27-64 vlastních potomků každého mutantu, trávena EcoRI a hybridizována s N-vázanou RFLP probou (Hehl and Baker, The Plant Cell 27:709-721 (1990)). Nt-1 identifikující RFLP, Nt-IG, která je zavedena do TMV resistentního kultivaru tabáku Samsun NN z N.glutinosa. Nt-IG nahrazuje svůj Nt-IT homolog u Samsun NN a mapuje < 0.25 cM N lokusu. Bylo předpokládáno, že mutantní linie indikované v Tabulce 2 jsou homozygotní pro těsně navázaný Nt-IG markér a že jsou homozygotní pro deleci Nt-IG markéru.

Znamením Ac - indukovaných mutací je to, že jsou často nestabilní. Stabilita HR- fenotypu zkoumána v šelf-křížení potomků 15 homozygotních mutantních linií. Devadesát pět až 150 potomků každé linie bylo inokulováno TMV a prověřováno na jejich fenotyp. Semenáčky jedné mutantní linie, Dll-1, demonstrovaly nestabilitu HR- fenotypu ve vysoké frekvenci. Z 145 prověřovaných Dll-1 rostlin bylo 20 TMV resistentních (TMV^R) a 68 bylo TMV citlivých (TMV^S) . Zajímavé je, že 57 rostlin vykazovalo sektory nekrosy podkladě citlivosti na TMV (TMV^R/S) fenotyp) (Tabulka 2) . Lése mimických mutantů také vykazovaly sektory nekrosy. Nekrosa na lézích mimických mutantů je obyčejně exprivována spontálně za absence abiotických nebo biotických faktorů, které indukují nekrotickou odpověď (V. Walbot et al., Genetic Engineering of Plants str. 431-442 (1983)). Sektory nekrosy pozorované v Dll-1 potomcích a jiných populacích užívaných ve studiích zde popsaných jsou odlišitelné od leze mimického fenotypu, protože jsou závislé na infekci TMV. Identifikace TMV^R a TMV^R/S individuí v této populaci indikuje, že HR- mutace je nestabilní. TMV^R a TMV^R/S fenotypy nebyly pozorovány v semenáčcích jiných 14 mutantních linií (Tabulka 2) .

$

Tabulka 2. Identifikace nestabilní HR- mutantní linie

liniea	mutant rodič13	Fenotyp0
TMVR	TMVR/S	TMV® C	!ELKEMa
D2-2	C3-2	0	0	144	144
D6-2	C3-6	0	0	126	126
D9-2	C1-1	0	0	125	125
D11-1	C2-2	20	57	68	145
D12-6	C2-3	0	0	134	134
D13-3	• C2-5	0	0	149	149
Ď15-3	C2-7	0	0	133	133
D16-3	C2-9	0	0	134	134
D17-2	C2-10	0	0	143	143
D21-1	C2-16	0	0	95	95
D23-5	C2-19	0	0	148	148
D24-2	C2-20	0	0	111	111
D26-2	C2-21	0	0	144	144
D27-2	C2-22	0	0	150	150
D28-2	C2-23	0	o	150	150
Samsun NN na	150	0	0	150
SR1	na	0	0	150	150
na =	není aplikovatelný
s linie testované	v tomto	experimentu byly vlastním potomstvem
Fl, Nn,	mutantů. Tytc	i rostliny jsou	homozygotní	pro N-vázaný
Nt-IG RFLP
to Fl	mutant progenitor. Cl	-X je	z TI-9 x SRÍ,	C3 je z Tl-10 x
SRÍ a C2	!-X jsou z TI-	13 x SRÍ

° Vlastní potomstvo každé homozygotní mutantní linie bylo germinováno v políčkách po 50 semenáčcích. Semenáčky byly přibližně v 6 týdnech věku inokulovány U1 kmenem TMV a skorovány • po 48 hodinách a následně v intervalu 1 týdne po inokulaci na fenotyp. Samsun NN a SR jsou použity jako kontrola pro TMV^R a TMV^S fenotypy, respektive. Fenotypy jsou označeny následovně: TMV^R(TMV resistentní), TMV® (TMV citlivý), TMV^R/S (TMV dependentní sektory nekrosy na podkladě citlivosti na TMV) .

^Λ Celkové množství semenáčků inokulovaných a skorovaných na jejich fenotyp z každé mutantní linie.

Jak je ukázáno na Obr.l, existují tři odlišné fenotypy pozorované v této nestabilní mutantní linii (Dll-1 potomstvo) po inokulaci TMV. List na Obr. 1A vytváří TMV resistentní rostlina a vykazuje charakteristické leze TMV resistentního (HR+) divokého typu nebo revertantních rostlin. List na Obr. 1B vytváří TMV citlivá rostlina a vykazuje oblasti světlé a tmavé zeleně (mozaiky) . List na Obr. ÍC vykazuje TMV^R/S fenotyp, který je definován oblastmi nekrozy a mozaiky. Oproti TMV^R listu nejsou nekrozy TMV^R/S listu omezené na diskrétní léze. Zde ukázaný TMV^R/B list vykazuje malé nekrotické oblasti, nicméně, rostliny byly prohlíženy na to, jestli může nekrosa zaujmout půlky listů, celé listy a šířit se po kmeni. Pozorování TMV^R a TMV^R/s fenotypů v potomstvu Dll-1 demonstrovalo, že HR- mutace v této mutantní linii je nestabilní.

PŘÍKLAD 2

Tento příklad popisuje test pro určení toho, je-li TMV^R/S fenotyp způsoben dvěma Ac transposony, které kosegregují s N-vázaným RFLP markérem Nt-IG.

Pokud není zmíněno jinak, pro DNA - DNA hybridizaci je cílová DNA purifikována a trávena jednou nebo více restrikčními endonukleásami. Natrávená DNA je pak frakcionována podle velikosti agarosovou gelovou elektroforesou, a blotována do Nytran membrány (Schleicher & Schuell, Keene, NH). Hybridizační primery jsou připraveny užitím náhodných hexamerových primerů a značeny [³²P]-dCTP a Klenow polymerasou. Standartní podmínky pro přísnou hybridizaci byly hybridizace při 42°C za přítomnosti 50% formamidu, 5 x SSC, 5 x Denhardtův roztok s promýváním při 65°C užitím 0.1 x SSC, 1% (w/v) dodecyl sulfátu sodného (SDS) .

Standartní podmínky pro ne-přísnou hybridizaci byly hybridizace při 35°C za přítomnosti 50% formamidu, 5 x SSC, x Denhardtův roztok s promýváním při 50°C užitím 0.1 x SSC, 1% SDS.

Pro izolaci N-vázaného Nt-IG RFLP byly užity DNA fragmenty izolované jako inserční místa transposovaných Ac elementů z SRÍ pro RFLP analýzu (Hehl and Baker, Mol. Gen. Genet. 217:53-59 (1989), Hehl and Baker, The Plant Cell 2:709-721 (1990)). Jeden DNA fragment, označený jako Nt-1, detekoval RFLP mezi TMV^S tabákem cv SRÍ a TMV^R tabákovým kultivarem Samsun NN. Obr. 2A ukazuje výsledky hybridizace 1.2 kb BglII/HindlII Nt-1 fragmentu na EcoRI trávenou genomovou DNA ze tří diploidních druhů tabáku N.glutinosa (zdroj N genu), N.sylvestris, a N.tomentosiformis (Obr. 2A, linie 1, 4, a 5) a dvou N.tabacum kultivarů Samsun NN a SRÍ (0br.2A, linie 2 a 3). Nt-1 detekuje RFLP specifický pro každý diploidní druh tabáku. 13.1 kb fragment je přítomen v Samsun NN, SRÍ, a N.sylvestris, (Obr. 2A, linie 2, 3 a 4). 15.5 kb fragment je přítomen v N.tomentosiformis a SRÍ (Obr. 2A, linie 5 a 3) a 14.3 kb DNA fragment je přítomen v N.glutinosa a Samsun NN (Obr. 2A, linie 1 a 2). Samsun NN postrádá 15.5 kb N.tomentosiformis RFLP (Nt-IT) , ale nese RFLP identické velikosti jako 14.3 kb RFLP u N.glutinosa (Nt-IG).

Vazba mezi Nt-IG a N byla testována v 420 TMV^S F2 potomstvu křížení mezi Samsun NN a SRÍ tabákem segregujícím 3:1 pro TMV resistenci a citlivost a 1:2:1 pro Nt-IG a Nt-IT RFLP. DNA z TMV citlivých F2 rostlin byla trávena EcoRI a hybridizována Nt-1. Jedna TMV^S rostlina měla Nt-IG RFLP demonstrující, že Nt-IG je velmi těsně navázán na N<0.25 cM.

Dva Ac transposony kosegregovaly s N-vázaným RFLP Nt-IG. Jestliže byl TMV^R/S fenotyp závislý na mutabilní alele N, byla očekávána kosegregace s molekulárním markérem navázaným na N lokus. Byla testována kosegregace TMV^R/S fenotypu s N-vázaným Nt-IG markérem v testovacím křížení potomstva nestabilních HR- mutantů C2-2 a SRÍ tabáku. Potomstvo testovacího křížení (nazývané Dlll populace) bylo inokulováno TMV a vyšetřováno na svůj fenotyp. Z 264 vyšetřovaných Dlll rostlin bylo 164 TMV citlivých (TMV^e), zatímco 80 vykazovalo sektory nekrosy na podkladě citlivosti na TMV. Divoký typ TMV resistentních rostlin nebyl pozorován. DNA 80 Dlll rostlin byla trávena EcoRI a hybridizována s Nt-1. Nt-1 genotyp rostlin byl určen a 39 individuí bylo Nt-lG/T, zatímco 41 bylo Nt-1T/T (Tabulka 3). 26 rostlin, které vykazovaly TMV^R/S fenotyp mělo Nt-IG markér, zatímco Nt-1T/T rostliny byly TMV^B (Tabulka 3) . Tyto výsledky indikují, že nestabilní HRmutace, definovaná schopností vytvářet sektory nekrosy, byla navázána na Nt-IG.

Protože byla nestabilní HR- mutace navázána na Nt-IG, bylo vyšetřováno, zda Ac transposon kosegreguje s Nt-IG RFLP markérem v Dlll populaci. Dlll DNA trávená EcoRI byla hybridizována probou od 5 konce Ac. Byly nalezeny dva Ac hybridizační proužky, označené Ac8 (8.0 kb EcoRI Ac proužek) a AclO (10.2 kb EcoRI Ac proužek), které kosegregovaly s Nt-IG. Třicet Nt-lG/T rostlin mělo jak Ac8, tak AclO, pět mělo Ac*, 3 měly AclO, a 1 rostlina neměla ani jeden element (Tabulka 4) . Ac8 ani AclO nebyly přítomny v 41 Nt-IT/T rostlinách stanovujíc tak, že dva Ac transposony byly navázány na Nt-IG.

Příklad dat Southern hybridizace sumarizovaných v Tabulkách 3 a 4 je ukázán na Obrázku 2B a 2C. Na Obr. 2B je zobrazena hybridizace Nt-1 na EcoRI trávenou DNA 14 Dlll rostlin. Zde ukázané rostliny mají heterozygotní , Nn, Nt-lG/T genotyp jak demonstruje přítomnost 14.3 kb Nt-IG RFLP a 15.5 kb Nt-IT RFLP (linie 2,4-11 a 14). Šest z těchto rostlin má TMV^R/S fenotyp korespondující liniím 2, 4, 7, 9, 11, a 14. Čtyři rostliny^aj i homozygotní, nn, genotyp Nt-IT «Sis*..»— genotyp jak je demonstrováno přítomností 15.5 kb Nt-IT RFLP a absencí 14.3 kb Nt-IG RFLP (linie 1, 3, 12 a 13). Čtyři rostliny Nt-1T/T genotypu neměly TMV^R/S fenotyp. Následně byly tyto DNA hybridizovány s 5' Ac probou jak je ukázáno na Obr. 2C. Všech 10 rostlin Nt-1G/T genotypu nesou 8.0 kb Ac prožek (nazývaný Ac8), zatímco 7 z těchto individuí (linie 2, 4, Ί, 8, 9, 11, a 14) nesou 10.2 kb Ac (nazývaný AclO). Rostliny Nt-1T/T genotypu neobsahují ani 8.0 kb, ani 10.2 kb Ac RFLP, ačkoliv nesou jiné Ac transposony.

Tabulka 3. Nestabilní HR- fenotyp kosegreguje s N-vázaným RFLP, Nt-IG

Nt-1 genotyp13	TMVR	TMV TMV1	fenotyp s TMVS	Celkem
Nt-1G/T	0	26	13	39
Nt-1T/T	0	0	41	41

^a 80 rostlin z křížení nestabilního HR- mutantu, C2-2, a SRÍ tabáku (Dlll populace) bylo inokulováno TMV a skorováno na fenotyp jak je popsáno v Tabulce 2

DNA izolovaná z Dlll rostlin byla trávena EcoRI pro Southern analýzu s Nt-1.

Tabulka 4. Dva Ac transposony kosegregují s Nt-IG

Nt-1 genotyp	AclO/8	Kosegreguj ící	proužky C	a , t> )elkei
AclO	Ac8
Nt-1G/T	30	3	5	1	39
Nt-1T/T	0	0	0	41	41

^a Po Nt-1 hybridizaci byly Southern bloty obsahující Dlll DNA trávené EcoRI vyjmuty a hybridizovány 5-Ac probou .

⁵³ Dva Ac proužky byly identifikovány, že kosegregují s Nt-IG, nicméně většina rostlin měla 3 až 8 kopií Ac

PŘÍKLAD 3

Tento příklad popisuje test pro určení, jestli Ac8 nebo AclO je odpovědný za nestabilní HR- mutaci.

K určení, jestli Ac8 nebo AclO způsobuje nestabilní HRmutaci byly identifikovány germinální revertanty (Dlll-15) z vlastního potomstva HR- mutantů C2-2. D112-15 byl homozygotní pro Nt-IG a nesl jak Ac8, tak AclO. Protože jak Ac8, tak AclO byly přítomny, bylo předpokládáno, že jedna transposon tagged alela N germinálně revertovala na divoký typ, zatímco jiná stále obsahovala Ac a tak měla potenciál revertovat. D112-15 byl křížen s SRÍ kvůli testu, jestli excise Ac8 nebo AclO může být korelována s reversí k resistenci a instabilitě HR- mutace, 0 potomstvu tohoto křížení (E501 populaci) bylo předpokládáno, že segreguje ~1:1 pro TMV^R ku TMV^S + TMV^R/S a má Nt-1G/T genotyp. 0 Ac odpovědném za nestabilní mutace N byla předpokládána absence u všech resistentních offspring tohoto křížení, Devadesát pět E501 rostlin bylo inokulováno TMV a vyšetřováno na svůj fenotyp. Padesát pět bylo TMV^R, nekrotické sektory byly pozorovány na 21 rostlinách, a 20 bylo TMV^S (Tabulka 5) . DNA z těchto rostlin byla trávena EcoRI a probována Nt-l následovanou 5' Ac probou, všech 95 rostlin bylo Nt-1G/T genotypu. Signifikantně, žádná z 54 TMV resistentních individuí neměla 10.2 kb EcoRI Ac proužek, zatímco 8 kb proužek byl přítomen u 52 rostlin (Tabulka 5) , Přítomnost Ac8 a absence AclO v TMV resistentním E5Q1 potomstvu implikovala AclO jako element, který způsobuje nestabilní HR- mutace a tak tagging N.

Tabulka 5 AclO je korelován s HR- mutací

N-vázaný Ac	TMVR	TMV fenotyp e,to
tmvr/s	TMVS
AclO	0	1	1
Acl0/Ac8	0	18	1
Ac8	52	1	18
-	2	1	0

^a 95 rostlin z křížení TMV^R germinálního revertantu, D112-15, a SRÍ tabáku {E501 populace) bylo inokulováno TMV a skorováno na jejich fenotyp jak popisuje Tabulka 2.

¹⁰ DNA izolovaná z E501 rostlin byla trávena EcoRI pro Southern analýzu a hybridizována 5-Ac probou.

Množství Ac kopií je vysoké v Dlll a E501 populacích, a to může, snad, maskovat jiné Ac elementy kosegregující s Nt-lG,

U TMV^S rostlin E501-70, bylo identifikováno, že mají pouze jeden AclO. K potvrzení, že AclO sám může způsobovat nestabilní HR- mutace bylo vlastní potomstvo těchto rostlin (F501 populace) zkoumáno na svůj fenotyp po infekci TMV a analyzováno na přítomnost AclO a jeho Nt-1 genotypu. Sedm TMV^R rostlin bylo získáno z celkem 500 rostlin. Molekulární analýza ukázala, že tři TMV^R rostliny byly heterozygoti pro Nt-IG a neměly AclO hybridizaci, zatímco čtyři TMV^R rostliny byly Nt-IG/G a měly AclO proužek. Jako u D112-15 rostlin bylo předpokládáno, že Ac hybridizace v Nt-IG homozygotech byla. díky přítomnosti mutantní alely N v těchto rostlinách stejně jako u revertantů.

V E501 a F501 populacích je korelace mezi přítomností AclO a TMV^R/S fenotypem. Devatenáct z 21 E501 rostlin TMV^R/S fenotypu mělo Ac hybridizaci, 12 z 12 F501 TMV^R/S rostlin analyzovaných molekulárně mělo 10.2 kb Ac proužek. Tyto výsledky indikují, že přítomnost AclO je pro rostliny nezbytná pro formování sektorů nekrosy a udržuje potenciál revertovat somaticky na resistenci. Tkáně ze sektorovaných rostlin bez Ac hybridizace pravděpodobně mají více excisí, takže 10.2 kb Ac proužek není dále detekovatelný Southern blot hybridizaci.

V Dlll a E501 se 2.3 kb proužek, který hybridizuje na 3Ac probu, chová identicky jako 10.2 kb 5Ac proužek. Je-li dáno, že Ac je 4.6 bp, je určen EcoRi divokého typu, nebo excisní fragment 7.9 kb. 0 tomto fragmentu se očekává, že bude obnoven v TMV^R revertantech. k testování přítomnosti genomické inserce a excisních fragmentů byla izolována genomická sekvence doprovázející AclO pomocí IPCR z rostlin Dlll-95, které obsahují pouze AclO a Ac8 (Obr. 2C, linie 9). (viz. Příklad 4, níže).

Genomické sekvence doprovázející AclO byly izolovány inversní polymerasovou řetězovou reakcí (IPCR). Templátová DNA z rostlin Dlll-95, které nesou pouze Ac8 a AclO byla trávena Hpall, ligována a linearizována Clal. PCR reakce byly provedeny v 50 ul užitím Taq polymerasy (Promega, Madison,

WI) na Perkin-Elmer Thermocycle (Emeryville, CA). Parametry byly 94°C - 1 min., 55°C -1 min.,a 72°C - 2 min, pro 35 cyklů. 419 bp produkt (AclO-l) 5 k AclO byl amplifikován užitím Ac specifického primerů CC28 (5'CACGGATCCATACGATAACGGTCGGTACGGGA-3') a CC32 (5'CACGAATTCGGAAACGGAAACGGTAGAGC-3'). K získání AclO

3'doprovázející sekvence (AclO-2), Dlll-95 DNA byla trávena EcoRI, ligována a linearizována AccI. 122 bp produkt byl amplifikován užitím primerů CC21 (5'CACCTGCAGAGATCTTTACCGACCGTTACCGACCG) a CC30 {CACCTGCAGAGATCTGCAGGCTTATAATATAAGGC- 3 ') . IPCR produkty byly klonovány do TA klonujícího vektoru (Invitrogen, San Diego, CA) .

400 bp produkt IPCR z 5' konce Ac byl izolován (AclO-1). AclO-1 byl klonován do TA klonujícího vektoru a sekvenován. Byly syntetizovány PCR primery pro generování AclO-1 proby bez Ac sekvence k redukci možnosti spuriosní Ac hybridizace. Je-li užita jako proba na tabákovou genomovou DNA, detekuje AclO-1 repetitivní sekvence. Hybridizace na 10.2 kb Ac insertní proužky byla pozorována v DNA Dll-1, nicméně, předpokládaný 7.9 kb EcoRI excisní proužek nebyl rozpoznatelný vzhledem k repetitivní přirozenosti proby. IPCR klon získaný z 3'- konce AclO (AclO-2) byl 1118 bp dlouhý a jevil se nedůvěryhodný jako proba.

Důvěryhodná proba s malým množstvím kopií, N-5, byla získána z 3'konce (base 5020 až 5370) cDNA klonu C7. Toto koresponduje bažím 6587-6600, 6934-6948, a 6977-7270 SEQ ID NO:1. Molekulární analýza E501 a P501 populací pokračovala užitím restrikční endonukleasy EcoRI. DNA z E501 a F501 populací byly tráveny EcoRI a hybridizovány Ac a N-5 probami. Ac proba byla hybridizována na 10.2 kb EcoRI proužek korespondující AclO v E501 a F501 populacích. Ac hybridizace k selekci individuí z každé generace v nestabilní HRmutantní linii je ukázána na Obr.3C. Ac hybridizace nebyla pozorována v kontrolních DNA SRÍ, N.glutinosa, nebo Samsun NN. Originální HR- mutantn C2-2 měl 10.2 kb proužek navíc k alespoň dvěma jiným Ac transposonům. Germinální revertant, D112-15, měl 10.2 kb Ac proužek stejně jako alespoň 10 jiných Acs. E501-70, TMV^S rostlinky D112-15, měly pouze 10.2 kb AclO proužek. Dva germinální revertanty TMV^R rostlinek E501-70, F501-65, a F501-66 neměly 10.2 kb proužek. F501-65 měl novou Ac inserci, zatímco F501-66 neměl dále Ac hybridizací. Sektorované rostliny F501-2, 3, a 4 všechny stále mají AclO inserci. F501-48 a F501-64 jsou dvěma příklady TMV^S rostlin, které také dále nemají AclO hybridizací. F501-48 dále nemá Ac hybridizací, zatímco F501-64 má novou inserci.

Je-li dáno, že Ac je 4.6 kb, pak je určen 7.9 kb EcoRI divokého typu nebo excisní fragment, když je N-5 užita jako proba (viz. Obr.3A) . Příklady proba N-5 hybridizace jsou ukázány na Obr.3B. N-5 hybridizuje k 7.9 kb proužku N.glutinosa a Samsun NN. HR- mutant, C2-2, měl hybridizací na 10.2 kb AclO inserční proužek a slabou hybridizací na 7.9 kb proužek. D112-15 měl jak 10.2 kb, tak 7.9 kb proužek. E501-70 měl 10.2 kb inserční proužek a nějakou hybridizací 7.9 kb proužek. Dva germinální revertanty, F501-65 a F501-66 mají pouze 7.9 kb proužek. Tyto rostliny byly Nt-1G/T, takže nesou pouze jednu alelu N, která je revertována. Jiné revertanty, jako je D112-15, které jsou Nt-IG/G mají jak inserční, tak excisní fragmenty. F501-2, 3, a 4 mají jak 10.2 kb a 7.9 kb RFLP. F501-48 a F501-64 mají pouze 7.9 kb excisní fragment.

Signifikantně, 54 TMV^R E501 potomků D112-15 mělo 7.9 kb EcoRI excisní prožek jako měly 7 TMV^R F501 rostliny. Tyto výsledky indikují, že restaurace genomové DNA sekvence na divoký typ je žádoucí pro reversi resistence. Tyto výsledky také demonstrují, že jedna mutantní alela N byla germinálně revertována v D112-15 a že excise AclO byla odpovědná za restauraci funkce N genu. Tyto výsledky byly potvrzeny v analýze potomstva E01-70, nesoucí pouze AclO, kde všech 7

TMV^R rostlin mělo 7.9 kb excisní proužek. Nt-1G/T rostliny nevykazovaly žádnou AclO hybridizací, a měly 7.9 kb velký genomový fragment divokého typu.

TMV^r/s rostliny, s výjimkou dvou z generace E501, měly jak 10.2 kb, tak 7.9 kb proužky. Společná přítomnost těchto proužků ve stejné tkáni indikuje, že jsou přítomny buňky s umístěním AclO,a AclO excise. Každý proužek indikuje, že některé tkáně budou buď TMS^s nebo potenciálně revertantní. Toto by mělo vysvětlit TMV^R/S fenotyp pozorovaný v těchto studiích.

PŘÍKLAD 4

Tento příklad popisuje analýzu sekvencí genomových insertních a excisních míst.

PCR produkty obsahující Ac excisní místa byly přímo sekvencovány. Použité rostliny jsou ukázány v Tabulce 6. Primery doprovázející excisní místo NG1-5 (base 4477 až 4496 5'- GCCCTCGAGAAATCAAGAAAACAGAGGTC-3) a N7-52 (base 4838 až 4856 5-GCACTCGAGCTTCAAGATTACTACATTG-3) bylu použity k amlifikaci -379 bp produktu. PCR reakce byly provedeny jako při IPCR s výjimkou následujících parametrů: 94°C - 1 min., 55°C - 2min, a 72°C-3 min. pro 25 cyklů. PCR produkty byly purifikovány elektroforesou v agarose s nízkým bodem tání (FMC) následované fenolovou extrakcí. Přibližně 500 fmol každého produktu bylo použito pro sekvencování s fmol DNA Sequencing System (Promega, Madison, WI) užitím primerů N7-52.

Devatenáct z 21 TMV^S E501 rostlin stejně jako čtyři TMV^S F501 rostliny Nt-1G/T genotypu měly excisní proužek a postrádaly AclO (Ac 10(-)). Ac vlastností, která byla konzervována v tabáku je ta nad insercí, je vytvořeno osm párů baží přímé duplikace doprovázející element. Toto bylo potvrzeno v sekvencích AclO-l a AclO-2. AclO je doprovázen 8 bp přímého repeatu 5'- ATTTGCCG-3'. Často je Ac excise nepřesná a footprint je vlevo předním. Footprinty mohou způsobit mutace posunu rámečku a/nebo aminokyselinové delece nebo inserce, které zabraňují produkci funkčního genového produktu.

Tabulka 6

Hilfl .fcypa

-CAT TTG CCG TCTphenotypfl

TMV^R

Ac insertion

-CAT TTG CCG//AC//AT TTG CCG TCTTMV³

Ac excísion

N* footprints

F501-48	-CAT TTG
F501-S4	-CAT TTG
E501-2	-CAT TTG
E501-3	-CAT TTG
E501-9	-CAT TTG
E501-16	-CAT TTG
E501-28	-CAT TTG

CCC TTT GCC GTC	-9	aa- *
CCT GCC GTC	-9	aa- *
CTT TGC CGT	-4	aa- *
CCA TTT TGC CGT	-4	aa- *
CCC—CGT	-4	aa- *
CCC TTT GCC GTC	-9	aa- *
CCC TTT GCC GTC	-9	aa- *

TMV³ TMV³ TMV³ TMV³ TMV³ TMV ³ TMV³

N revertants D112-1Í5 F501-34 F501-45 F501-65 F501-66 F501-e7 F501-68 F501-69

-CAT TTG CCG TCT-CAT TTG CCG TCT-CAT TTG CCG TCT-CAT TTG CCG TCT-CAT TTG CCG TCT-CAT TTG CCG TCT-CAT TTG CCG TCT- CAT TTG CCG TCTtmv^r tmv^r tmv^r tmv^r tmv^r tmv^r tmv^r tmv^r

Tabulka 6 ukazuje sekvenční analýzu Ac cílového místa v N genu a resistentní nebo senzitivní (na TMV infekci) fenotyp asociovaný s jednotlivým genotypem. Při inserci AclO je duplikována 8 bp sekvence divokého typu N sekvence (od nukleotidu 5034 do 5041, ATTTGCCG). Triplety basí v Tabulce 6 indikují kodony bez cDNA sekvence. Další sekvence, které zůstávají v sensitivních rostlinách po excisi AclO jsou podtrženy. Hvězdičky indikují výskyt prematurovaných stop kodonů, které se nevyskytují v ani 9, ani 4 aminokyselinách downstream. E501 jsou potomci zpětného křížení rostlin germinálních revertantů D112-15, a F501 jsou vlastní potomstvo rostlin E501-70. TMV sensitivní a resistentní fenotypy jsou v Tabulce 6 indikovány TMV^S a TMV^R , v příslušném pořadí.

AclO se připojuje k N genu. Excisní místa sedmi AclO(-) TMV^S rostlin byla sekvencována a u každého bylo zjištěno, že má nukleotidové změny ve srovnání s divokým typem excisního místa (Tabulka 6) . Tyto nukleotidové změny demonstrují, že nedokonalá excise AclO vede k footprints, které způsobují rámečkové mutace. Předpokládané polypeptidy jsou terminovány 9 aminokyselinami nebo 4 aminokyselinami downstream od footprints (Tabulka 6).

Kromě toho bylyu sekvencovány excisní místa D112-15 a šesti TMV^S rostlin z F501 generace a bylo zjištěno, že mají divoký typ sekvence (Tabulka 6). Schopnost nalézt revertantní rostliny bez změn baží napovídá, že tento region je velmi důležitý pro funkci proteinů, a že aminokyselinové substituce, adice nebo delece nejsou tolerovány. Nicméně,

TMV^S rostliny s footprint, který by měl dovolovat syntézu kompletního, ale nefunkčního proteinu, nebyly dosud identifikovány. Tyto výsledky zde popsané demonstrují, že AclO je připojen k N genu a napovídají, že přesná excise AclO z N genu je žádoucí pro nastolení HR+ fenotypu.

PŘÍKLAD 5

N cDNA byly izolovány z N.glutinosa cDNA knihovny následovně: Rostliny osm až dvanáct týdnů staré byly infikovány TMV při 32°C. Teplota byla snížena na 24°C 24 hodin po inokulaci. Listy byly sklízeny pro polyadenylovanou (Póly (A)+) RNA izolaci 48 hodin po inokulaci. cDNA byla připravena z 5 ug Póly (A)+RNA užitím lambda-Zap cDNA syntézního kitu (Stratagene, La Jolla, CA). cDNA byla zabalena s Gigapack II Gold balícími extrakty od Stratagene a umístěna v hostitelském kmeni Escherichia coli XL 1-Blue mrf.

AclO-l byl použit k vyšetření 1.0 x 10⁶ klonů cDNA knihovny konstruovaných z RNA TMV infikovaných N.glutinosa.

U patnácti klonů bylo identifikováno, že mají homologii k AclO-l, nicméně , pouze jeden (C7) měl 100% identitu sekvence s AclO-1. Proba (N-5) byla odvozena z baží 5020 až 5370 v 3-konci C7, která byla jedinou kopií v tabáku a která hybridizovala na 7.9 kb EcoRI fragment. Následně bylo hybridizováno lxl0^e plaků s N-5 probou. Tři klony (C16, C17, a C18) byly izolovány ve druhém vyšetření a všechny měly 100% identitu sekvence s Acl0-l. Bylu určeny kompletní sekvence cDNA C7, C16, a C18 insertů (viz níže).

Dvouřetězcová plasmidová DNA byla sekvenována dideoxy řetězcovou terminační metodou (Sanger et al., Proč. Nati.

Acad. Sci USA 74:5463-5467 (1977)) užitím Sequenase verse 2.0 systému ( United States Biochemical Corporation, Cleveland,

OH) a pro sekvenování C7 cDNA byly nested delece připraveny Exonucleasa III metodou (Henikoff, Methods in Enzymology 155: 156- 165 (1987)). cDNA C16 a C18 byla sekvenována za použití primerů odvozených d C7 sekvence.

Sekvenční analýza byla provedena užitím GCG sekvenčního programu analýzy (Madison, Wisconsin). Byly odvozeny mapy pro exony a introny kódované genomovým N genem (viz SEQ ID NO:1) ze sekvenční analýzy C7, C16 a C18 cDNA klonů a parciálního sekvencování C38 lambda klonu (0br.4B). Dohromady C7 a C18 určují, že pět exonů je vyříznuto pro vytvoření otevřeného čtecího rámečku 3432 párů basí, který kóduje polypeptid o 1144 aminokyselinách (N). C18 DNA sekvence je přítomna v SEQ ID NO:3. C16 kóduje polypeptid o 652 aminokyselinách (Ntr), protože exon o 70 párech baží je alternativně vyříznut pro vytvoření zkráceného otevřeného čtecího rámečku 1956 bp (Obr. 4A a SEQ ID NO:5). Tento extra exon (EE) může být vyříznut způsobem podobným jako u fibronektin EDA exonu (M.Caputi, Nucleic Acids Research 22:1018-1022 (1994)). Sekvenční motivy uvnitř 70 bp exonu jsou 95% podobné sekvencím EDA exonu, který definuje bipartitní enhancer, který moduluje vyříznutí tohoto 81 bp exonu.

3- konce cDNA se liší v délce, což indikuje, že jsou použity různé polyadenylační signály. Mnohotné potenciální polyadenylační signály jsou nacházeny v pozicích v 3netranslatovaném regionu těchto DNA klonů, což mohou vysvětlit různé události zpracování. C7 má delší 3- terminus a obsahuje sekvence pro zkrácené C16 a C18 3- konce. C7 a C16 jsou identické v 5-konci. C18 sekvence je nalezena celá uvnitř C16 a C7, takže není kompletní cDNA a má kratší 3-konec. C7 obsahuje intron 2 a může být z mRNA , která není plně vyříznuta.

C16 a C18 postrádají intron 2. Přidání 5- 750 bp sekvence C16 nebo C7 k C18 vytváří předpokládaný otevřený čtecí rámeček o 3432 bp kódující polypeptid o 1144 aminokyselinách (Tabulka 7A). Parciální sekvencování G38 lambda klonu ukazuje, že všechny izolované sekvence nezbytné pro nárůst tří typů cDNA jsou přítomné v genomové sekvenci. Tak jsou tyto cDNA kódovány jednotlivým genem.

Předpokládaná molekulární hmotnost předpokládaného N a Ntr proteinu je 131.4 kd a 75.3 kd, v příslušném pořadí. Tabulka 7A ukazuje dedukovanou aminokyselinovou sekvenci pro produkt N genu (viz také SEQ ID N0:4). Potenciální signální (cytoplasmatická) doména je podtržena. Aminokyseliny konzervované mezi ATP/GTP-vazebné místo motivem (P-smyčka) jsou dvojitě podtrženy. Na leucin bohaté opakující se úseky (LRR1 až LRR13) jsou kurzívou. Osm potenciálních N vázaných glykosylačních míst se vyskytuje v aminokyselinové sekvenci N. Tato místa jsou uvedena písmeny výrazného typu v Tabulce 7A a mají konsensuální aminokyselinovou sekvenci NX(S/T). Zkratky použité v Tabulkách 7A-C pro jednopísmený aminokyselinový kód jsou: A, Ala. C, Cys. D, Asp; E, Glu; F, Phe; G, Gly; H, His; I, Ile; K, Lys; L, Leu; M, Met; N, Asn; P, Pro; Q, Gin; R,

Arg; S, Ser; T, Thr; V, Val; W, Trp; a Y, Tyr.

Analýza N proteinové sekvence podle programu ualom ukazuje, že žádný transmembránový region není přítomen v N. Navíc, analýza sekvence N proteinu programem Signalase ukazuje, že žádná signální sekvence není přítomna. Tak, vzhledem k sekvenční analýze, se N jeví být lokalizovaný v cytoplasmě.

Odvozené aminokyselinové sekvence N polypeptidu byly srovnány s Genbank (uvolnění 82.0) užitím BLAST programu (Altschul et al., J.Mol. Biology 215:403-410 (1990)). Předpokládaná aminokyselinová sekvence vykazuje omezenou, ale signifikantní podobnost s proteiny, o kterých je známo, že jsou zahrnuty v signální transdukci.

Předpokládaná aminokyselinová sekvence N obsahuje motiv P-smyčky (Tabulka 7A). Sekvence GMGGVGKT (aa 216-223) odpovídají konsensuální sekvenci P-smyčky (A/G)XXXXGK(S/T) nalezené v různých ATP- nebo GTP- vazebných proteinech (Tabulka 7A). Rodina proteinů obsahujících P-smyčku zahrnuje adenylát kinasy, ras rodinu proteinů, elongační faktory, b-podjednotku ATP-syntetázy, thymidin kinásy a fosfoglycerát kinásy (M.Saraste et al., Trends in Biochemical Sciences

15:430-434 (1990)). Tato jednotlivá P-smyčka je nejpravděpodobněji zahrnuta ve vazbě ATP. Konsensuální sekvence, DXXG a NXKD, pro vazbu GTP navíc k P-smyčce, nejsou přítomny v aa sekvenci (Dever et al., Proceedings of National Academy of Sciences USA 84:1814-1818 (1987)

Kromě P-smyčky definoval Fry et al., (Proceedings of National Academy of Sciences USA 83:907-901(1986)) definoval dva jiné segmenty, které se zdají být zahrnuté v ATP vazbě v adenylát kinase a Fl-ATPase. Inspekce N sekvence napovídá, že tyto segmenty jsou přítomny a ve správném umístění. Segment 2 obsahuje dipeptid (I,A,L,V)(V,I) a N má sekvenci AI v pozicíh 228 a 229, podle příslušnosti (Tabulka 7A). V 80-100 aminokyselinách z P-smyčky byl segment 3 definován jako glucin následovaný úsekem 5 hydrofobních aminokyselin a kyselinou aspartátovou (Tabulka 7A). N má sekvenci VLIVLDD v aminokyselinách 296-302. Z aminokyselinové sekvence není možné předpovědět za jakých podmínek je ATP vázána nebo zda se při vazbě vyskytuje ATP hydrolýza spontálně nebo zda vyžaduje jiné faktory.

Tabulka 7B ukazuje připojení amino terminálních aminokyselin (potenciální signální doménu) (8 až 150 SEQ ID NO:4) s cytoplasmatickou (signální) doménou Drosophila Toll proteinu (aa 804-9996, Yamagata et al., Gene 139:223-228 (1994)) a lidského Interleukin 1 receptorového proteinu (H IL1-R, aa 317-524, Sims et al., Proceedings of the National Academy of Science 86:8946-8950 (1989)). Rámečky indikují, regiony similarity. Použité konzervativní substituce jsou: hydrofobní aminokyseliny = L/I/V/M/A/F, iontové aminokyseliny = K/R/D/E/Q/N/H, aromatické aminokyseliny = F/Y.

N sekvence obsahuje některé konservované aminokyseliny žádoucí pro transmisní signál z cytoplasmy do jádra v Toll a

IL1-R reguůlační dráze (Schneider et al., Genes and

Devolopment 5:797-807 (1991), Heguy et al., Journal of

Biological Chemistry, 267: 2605-2609 (1992)).

Určená aminokyselinová sekvence N od aminokyselin 590 do 928 SEQ ID NO:4 obsahuje na leucin bohatý region složený ze třinácti opakujících se úseků délky přibližně 25 aminokyselin. Tabulka 7C ukazuje primární strukturu na leucin bohatých opakujících se úseků N genu (LRR) (aa 590-928) a srovnání jejich konsensuální sekvence s LRR konsensem kvasinkové adenylát cyklásy (AdCy, Kataoka et al., Cell 43:493-505 (1985)), Drosophila Toll (Hashimoto et al., Cell 52:269-279 (1988)), Iba řetězce lidského destičkového membránového glykoproteinu (H Gplba, Titáni et al., Proceedings of the National Academy of Science 84:5610-5614 (1987)), Drosophila Chaoptinem (Reinke et al., Cell 52:291-301 (1988)) a Arabidopsis receptor- like transmembránovou kinasou (TMK1, Chang et al., Plant Cell 4:1263-1271 (1992)), TMKL1, Valon et al., (Plant Molecular Biology 23:415-421 (1993)), a RLK5, Walker, The Plant Journal 3:451-456 (1993)).

Na leucin bohaté opakující se úseky (LRR) jsou nacházeny ve velké šíři proteinů zahrnutých v signální transdukci, buněčné adhesy, a různých jiných funkcích, a soudí se, že zprostředkuj i protein-protein interakce. Konsensuální sekvence odvozená z připojených LRR je podobná konsensu nacházeném v kvasinkových adenylát cyklázách (Kataoka (1985) supra), Drosophila Toll (Hashimoto et al.,(Hashimoto et al., supra, (1988)), Iba řetězce lidského destičkového membránového glykoproteinu ( Titáni et al.,(1987)supra), Drosophila Chaoptinem (Reinke et al., (1988) supra) a Arabidopsis receptor- like transmembránovou kinasou (Chang et al., (1992) supra), Valon et al., (1993) supra), Walker, (1993) supra). S výjimkou adenylát cyklásy se soudí, že LRR doména je v extracelulární matrix těchto proteinů.

WO 95/35024

PCT/US95/07754

MASSSSSSRW SYDVFLSFRG EDTRKTFTSH LYEVLHDKGI KTFQDDKRLE YGATIPGELC 61 KAIEESQFAI WFSEHYATS RHCLHELVKI HECKTRFKQT VTPIFYDVPP SHVRHQKESF

H

to >3»

W4

K

to

to

t*»

9

H A

q

M

0

0

cu

bS

to

>,

5

q

K

to

5

g

q

q

0

q

X

fe

u

0

qH

X

o

Cu

fe

g

•“n

q

q

q

Ck

V4

q

t4ij

tu

<0

>

to

Cd

q

q

q

q

CS

to

q

co

bS

q

5

►4

fe

q

to

S

Cd

O

q

q

a

X

CS

E

B4

to

to

ζ*

O

m

to

>

>d

>d

H

to

q

H

co

ta

to

to

q

bs

q

X

*>

Cd

=5

CJ

q

ta

q

to

5

w

>4

tn

to

s

0

q

q

Jn

q

q

es

w

u

2

G

o

q

q

tu

q

υ

iď

2

q

p

£·

>

bž

£

o

Q

q

55

X

q

tu

«0

o

s

to

O

U

σ

to

σ

>

fu

q

O

·—

H

X

q

q

υ

q

0

Cu

Cu

q

q

q

tO

řk

w

q

q

»d

P

*4

Λ

2 q

'T

to

0

cí

σ

<

q

H

q

to

£5

q

P

b>

P

q

X

CS

cs

ž

ž

2

*4

to

W

H

£>

q

Q

>1

Cu

q

q

M

S

fe

tn

10

3:

M

q

to

q

q

<

bí

to

to

u q

q

>

«

tu

Ε

q

q

q

q

ta

tu

0

<

q

£

E

tu

»

éc

P-

q

H

P

q

O

q

0

tu

tn

2

to

fe

Ul

G

q

£

iu

b*

tu

q

q

Cí

jT?

o

Ej

o

H

q

tn

P

&4

q

q

rs

c

>4

>

tu

q

tO

tu

W

►4

q

X

u

X

q

to

S

d

X

X

fu

q

bí

>

tu

0

d

a

>

>

P

to

2

O

q

v

—

Cu

q

a

Ď!

T*

j4

to

cd

q

ř-4

Q

q

p

0

β

tu

tu

cu

cs

Uí

cs

2

cu

Cd

u

q

υ

q

2

5

cu

X

**

XI

£

tu

q

q

S

q

Q

3

υ

q

q

fc_»

q

q

2

5

G

M

q

Cd

q

q

cd

H

13

to

2

X

0

<j

»2

2

q

►4

σ

X

X

q

q

to

q

to

0

>

*>

éu

ťO

q

M

q

ps

O

P

q

q

0

to

tu

X

to

tO

tu

2

O

q

3

q

q

q

X

q

q

>

61

X

bs

V

q

a

s

fe

•5*

q

q

q

q

q

bs

to

fe

a

q

£

>4

q

>

a

q

>-

#ĎS

q

«;

q

q

>

ta

k«

q

q

q

q

x

q

0

q

b>

q

tu

cí

0

to

2

tu

q

tu

to

q

Jo

Jo

q

q

•X

X

X

ta

2

2

G

co

K

?

cu

q

3;

q

s

2d

z:

U3

to

cu

ah*

w

*~

q

q

q

o

tu

>

q

g

Ss

to

tc

a

q

5

q

q

q

q

q

to

X

q

z

3

q

bd

55

0

Cd

>4

(J

2

q

q

q

q

Q

υ

SX

q

q

q

7-7

u

CU

2

q

tr>

to

q

0

to

H

ς>

q

Q

*>

tu

tu

0

H4

tu

δ

u

bs

u

q

to

s

q

q

q

q

q

to

Cd

es

>4

►4

2

σ

q

es

U|

q

jo

2

ta

«

·> ·»

q

<0

G

fe

q

q

u

q

es

q

to

2

q

Cu

2

X

q

to

—

Cu

0

X

<0

2

v. ·-»

q

q

q

q

q

►d

o

tu

g

q

£

c q

q

q

q

<a

•C

X

bS

•4

q

H

to

O

j>

q

q

c

q

Jo

>

e;

to

q

tu

σ

e:

ϋ ω

bS

q

q

cu

X

>4

>

H

q

q

>4

tu

q

0

q

tu

2

q

£

υ

fe

q

s*

>*

y

O

>

q

to

to

σ

o

q

řr

’Q

q

P

q

Cí

2

o

Q

q

σ

X

q

q

q

q

5

0

co

é

o

H

s«s

q

bí

q

0

q

q

H

0

Q

q

g

ϋ

*r*

&

o

q

tu

q

σ

T

q

q

ta

q

h4

2

tu

M

O

tu

q

w

q

C

q

q

H

-O

q

G

tu

G

w

iU

O

•xí

•4

q

q

£

5

P

ta

p

q

p

>

Q

to

q

>

q

>4

tu

to

0

>

H

P

q

P

q

O

P

W

H

Cu

0

q

q

fe

q

to

q

>

tu

y

Ξ

p.

>

g

s

Jo

q

es

P

q

to

eu

to

W

δ

id

J>

to

a

P

q

q

q

q

q

H

q

CU

q

δ

[4

K

>

2

tu

q

SX

q

co

q

Ξ

Cu

>4

a

s

tu

bS

a

q

.u

H

Q

p

q

G

·-»

q

10

10

tu

qw

to

q

q

q

0

to

q

P

q

®3

H

X

O

»4

o

ofl

tu

2

£

q

a

q

P

p

q

q

2

P

q

2

¢0

><

<

0

Cd

E-·

q

to

Ό

to

to

q

eo

H

><

q

q

H

^4

τ—1

rU

tH

q

r4

q

q

q

►i

q

q

q

q

CM

«

«»·

o

UJ

CM

0

O

to

S<

co

0

to

CM

<0

X»

q

CJ

n

CO

•n·

tn

kj

to

h>

q

<0

©v

co

0

0

q

q

q

q

SUBSTITUTE SHEET (RULF

WO 95/35024

PCT/US95/07754

TABLE 7C

Cu ca ta ta υ

o ►3

U

Γ- Η r.	H >				(U			31 ta 31 2«
O· &	.2				Cu	31		ca ta ·							cu
Ol				«	O		cu cA							Ou
►3	£ υ	3t *4	31		Cu	O	31	31 iA	►ú		31	31		n w	a	31
CA	u o « F „ W	W> CA	01 U	Cu CA	>	a H	_	O F F >		►ú	1 1	F F	a 1	1 1 1 o	1 o	1 u
►3	tu ÍJ 31	w ť	>3	31	O	31	u	31 31 ·	►ú		31	31	1	31 01	1	01
01	q2 oí		2	W	o		Cu	ca >·		►3	1	1		.1 31	a	31
2	cu Ξ o	O «	Ol	31	2		2	σ ~			2	2	1	2 1	1	1
	F > O	tn 2	υ	F	Cu	υ	2	O M			1	1	=	1 2	2	25
j-	CA M «	O 2	u	O	o	>·	ci	Q Cu			1	01	1	01 1	1	1
CA	F W P· 33 3	oa	01	01	ci	01	01	ta ta			31	31	1	31 1	1	1
►3	2 3t	>	•A	Cu	31	31	31 31	►ú	»4	1	1	a	a 31	34	31
O	5 5 u	·—· jJ	Ol	a	2		Q	Q <			31	31	1	31 1	1	1
>3	2 01 oí U <3		31	Cu	►3	31	31	31 2	►ú	►4	1	t	31	1 31	34	31
	2 O >	O « t_i e_«	01	>	>-U	><	2	Ol 2			1	01	1	1 I	1	Ol
>	οι >> ω	ta £	>	ci	w	ω		σ o			31	31	1	31 1	1	I
31	>3 >3 >3	CU 2	31	31	31	31	31	31 o	►Ú	»3	—	1	31	1 31	31	31
2		ta F	Ol	«*·	ta	Ol	Ol	< >	1	1	1	cu		I 1	1	1
ta	O 2	2 *	X	a		2	Ol	O 2	1	1	1	31		31 1	1	1
»3	h > tn	ca f	►3 31 (3 31	31	31 34	»4	>3	2	1		1 31	31	1
	ca >· ω	o a ca	a	0£		O]	.či ta	I		1	1		1.. 1	1	1
W	ci ω > >· tu	u	o	H	«	O	fč 2	J	1	Cu	31		tu 1	1	1
tu	31 31 2	H H	w	H	H	ω	H	H 31	ti	ti	31	31		1 34	31	H
F	>	oi	cn	ω	cn		ca	cn tú	1	I	1	O		1 1		1
gen	Ol 2 υ	M 01	cn	w	on	>	ta	tn 04	I	s	1	1		1 1		1
tnF	&t dt Cu	CU CU	04	CU	04	Cit	cu	fU fU	tu	04	CU	Cu		cu cu
												X		tí •H
									0			Λ		+1
									tí			rl	Λ	A		H

>1H O H •ti o »4 F ta ta o tn X M Λ >4 O CA

H

K

F

WO 95/35024

TABLE 7B

i 1-1	υ < j	«4 *5 1
σ σ x		» g g[	Itf trf
Cm Cm >		ď ωΓ5Γ	< 1 1

t- 1 1 ití 1 1	A.	cn	z
k	tx	ω|
d |to cn|	u	>	=

E- O O

OJ Μ H, Q QfZ	• f-M li C- |<r=i >
1 (Z1 U	< fo, P«
q |w | ω	|Ξ ] č| x
7Π > ►=	1-qTZ
uť > ,4	<1 d d
H W >	Γμ >4 >
>	|=c ϋ d
m a x	Z 1 1

PCT/XJS95/07754

U X I d σι cu

Lu ΪΠ	>4 M
	M	H
Cm	ÍM	>·
>	*	-i
Q	O	o
	Cu	íh
cn	X	H
1	1«

- «71 PŘÍKLAD 6

Tento příklad popisuje izolaci genomových N genových ekvencí.

K vytvoření genomové knihovny byly DNA připravené z í.glútinosa částečně tráveny Mbol a frakcionovány podle ^relíkosti na gelové elektroforese. DNA fragmenty >12 kb byly igovány do BamHI, tráveny, defosforylovány pomocí >akteriofágu lambda Gem-11 (Promega). Ligace byly packaged ligapack II Gold packaging extrakty (Stratagene, La Jolla, CA) a 1 x 10⁶ plaky formujících jednotek bylo plátováno na SURE E.coli hostitelském kmenu koupeného od GIBCO, BRL., Gaithersburg, MD)

K izolování genomové sekvence N genu byla bakteriofág lambda knihovna Mbol rozrušené DNA N.glutinosa vyšetřována probami N-5 a N-9 (nukleotidy 695-1090 C7). Byly purifikovány tři klony, které hybridizovaly jak na N-5, tak na N-9. Tyto klony (G25, G34 a G38) byly restrikčně mapovány EcoRi, BamHI, a Xhol a charakterizovány Southern analýzou (Obr. 4B). Bylo určeno, že tři klony přesahují a obsahují celý genomový N gen. G34 má o 1.4 kb více DNA upstream od N genu než G38, zatímco G38 je o 5.4 kb delší na 3-konci N genu. Sekvence klonu G25 byla obsažena v G38 klonu.

PŘÍKLAD 7

Tento příklad popisuje citlivé nebo mutantní rostliny transformované genomovým N gen klonem, jehož rostliny byly resistentní na TMV.

SRÍ tabák a TMV sensitivní rostliny F501-48 a F501-64 nesoucí germinální Ac excise byly transformovány buď pTG34 nebo pTG38. pTG34 a pTG38 byly konstruovány subklonováním 12.0 kb nebo 10.6 kb Xhol fragmentu z přesahujících DNA klonů G34 nebo G38 do T-DNA vektoru, pOCA28 (Olscewski et al., Nucleic Acids Researh 16:10765-10781 (1988)), který byl linearizován

WO 95/35024

PCT/US95/07754

ATG

CAT

TCT

TTG

CAA

AAT

GCC

CTT

CTC

TCT

GAA

cn

nA

AGG

GAA

AAA

1345

Met

His

Ser

Leu

Gin

Asn

Ala

Leu

Leu

Ser

Glu

Leu

Leu

Arg

Glu

Lys

260

265

270

GCT

AAT

TAC

AAT

AAT

GAG

GAG

GAT

GGA

AAG

CAC

CAA

ATG

GCT

AGT

AGA

1393

Ala

Asn

Tyr

Asn

Asn

Glu

Glu

Asp

Gly

Lys

His

Gin

Met

Ala

Ser

Arg

275

280

285

290

CTT

CGT

TCG

AAG

AAG

GTC

CTA

ATT

GTG

cn

GAT

GAT

ATA

GAT

AAT

AAA

1441

Leu

Arg

Ser

Lys

Lys

Val

Leu

Ile

Val

Leu

Asp

Asp

Ile

Asp

Asn

Lys

•

295

300

305

GAT

CAT

TAT

TTG

GAG

TAT

TTA

GCA

GGT

GAT

cn

GAT

TGG

τη

GGT

AAT

1489

Asp

His

Tyr

Leu

Glu

Tyr

Leu

Ala

Gly

Asp

Leu

Asp

Trp

Phe

Gly

Asn

310

315

320

GGT

AGT

AGA

ATT

ATT

ATA

ACA

ACT

AGA

GAC

AAG

CAT

nc

ATA

GAG

AAG

1537

Gly

Ser

Arg

Ile

Ile

Ile

Thr

Thr

Arg

Asp

Lys

His

Leu

Ile

Glu

Lys

325

330

335

AAT

GAT

ATA

ATA

TAT

GAG

GTG

ACT

GCA

CTA

CCC

GAT

CAT

GAA

TCC

An

1585

Asn

Asp

Ile

Ile

Tyr

Glu

Val

Thr

Ala

Leu

Pro

Asp

His

Glu

Ser

Ile

340

345

350

CAA

HG

nc

AAA

CAA

CAT

GCT

nc

GGA

AAA

GAA

Gn

CCA

AAT

GAG

AAT

.1633

Gin

Leu

Phe

Lys

Gin

His

Ala

Phe

Gly

Lys

Glu

Val

Pro

Asn

Glu

Asn

355

360

365

370

TTT

GAG

AAG

CTT

TCA

TTA

GAG

GTA

GTA

AAT

TAT

GCT

AAA

GGC

cn

CCT

1681

Phe

Glu

Lys

Leu

Ser

Leu

Glu

Val

Val

Asn

Tyr

Ala

Lys

Gly

Leu

Pro

375

380

385

TTA

GCC

CTC

AAA

GTG

TGG

GGT

TCT

nG

CTG

CAT

AAC

CTA

CGA

nA

ACT

1729

Leu

Ala

Leu

Lys

Val

Trp

Gly

Ser

Leu

Leu

His

Asn

Leu

Arg

Leu

Thr

390

395

400

GAA

TGG

AAA

AGT

GCT

ATA

GAG

CAC

ATG

AAA

AAT

AAC

TCT

TAT

TCT

GGA

1777

Glu

Trp

Lys

Ser

Ala

Ile

Glu

His

Met

Lys

Asn

Asn

Ser

Tyr

Ser

Gly

405

410

415

ATT

ATT

GAT

AAG

CTC

AAA

ATA

AGT

TAT

GAT

GGA

TO

GAG

CCC

AAA

CAA

1825

Ile

Ile

Asp

Lys

Leu

Lys

Ile

Ser

Tyr

Asp

Gly

Leu

Glu

Pro

Lys

Gin

42Q

425

430

CAA

GAG

ATG

TTT

HA

GAT

ATA

GCA'

TGC

nc

nG

CGA

GGG

GAA

GAA

AAA

1873

Gin

Glu

Met

Phe

Leu

Asp

Ile

Ala

Cys

Phe

Leu

Arg

Gly

Glu

Glu

Lys

435

440

445

450

GAT

TAC

ATC

CTA

CAA

ATC

CTT

GAG

AGT

TGT

CAT

An

GGA

GCT

GAA

TAC

1921

Asp

Tyr

Ile

Leu

Gin 455

Ile

Leu

Glu

Ser

Cys 460

His

Ile

Gly

Ala

Glu 465

Tyr

GGG

TTA

CGT

ATT

TTA

ATT

GAC

AAA

TCT

cn

GTG

nc

ATC

TCT

GAA

TAT

1969

Gly

Leu

Arg

Ile

Leu

Ile

Asp

Lys

Ser

Leu

Val

Phe

Ile

Ser

Glu

Tyr

470

475

480

WO 95/35024

PCT/US95/07754

ATT TTA lle Leu

CGA Arg

CCT CCG TCT TCC ATC ATA CGC TTG AAC AAA CTT ATA ATC

5616

Pro Pro Ser Ser lle lle Arg

Leu Asn

Lys

Leu

lle 810

lle

800

. 805

TTG

ATG

TTT

CGA

GGC

TTC

AAA

GAT

GGA

GTG

CAC

TH

GAG

HC

CCT

CCT

5664

Leu

Met

Phe

Arg

Gly

Phe

Lys Asp

Gly

Val

His

Phe

Glu

Phe

Pro

Pro

815

820

825

GTG

GCT

GAA

GGA' TTA

CAC

TCA TTG

GAA

TAT

CTG

AAT

CTC

AGT TAC

TGC

5712

Val

Ala

Glu

Gly Leu

His

Ser

Leu

Glu

Tyr

Leu

Asn

Leu

Ser

Tyr Cys

830

835

840

AAT

CTA ATA

GAT GGA

GGA

CTT

CCG

GAA

GAG

AH

GGA

TCC

HA

TCC TCT

5760

Asn

Leu

lle Asp Gly Gly

Leu

Pro

Glu

Glu

lle

Gly

Ser

Leu

Ser Ser

-

845

850

855

TTG

AAA

AAG

TTG

GAT

CTC

AGT AGA

AAT

AAT

TH

GAG

CAT

HG

CCT TCA

5808

Leu

Lys

Lys

Leu

Asp

Leu

Ser

Arg

Asn

Asn

Phe

Glu

His

Leu

Pro

Ser

860

865

870

875

AGT

ATA

GCC

CAA

CH

GGT

GCT

CH

CAA TCC

HA

GAC

HA

AAA

GAT TGC

5856

Ser

lle

Ala

Gin

Leu

Gly Ala

Leu

Gin

Ser

Leu

Asp

Leu

Lys Asp

Cys

880

885

890

CAG

AGG

CTT

ACA

CAG

CTA

CCA

GAA

CH

CCC

CCA

GAA

HA

AAT

GAA

HG

59.04

Gin

Arg

Leu

Thr

Gin

Leu

Pro

Glu

Leu

Pro

Pro

Glu

Leu

Asn

Glu

Leu

895

900

905

CAT

GTA

GAT

TGT

CAT ATG

GCT

CTG

AAA

TTT

ATC

CAT TAT

HA

GTA

ACA

5952

His

Val

Asp

Cys

His

Met

Ala

Leu

Lys

Phe

lle

His

Tyr

Leu

Val

Thr

910

915

920

AAG

AGA

AAG

AAA

CTA

CAT AGA

GTG

AAA

CH

GAT

GAT

GCA

CAC

AAT

GAT

6000

Lys Arg

Lys

Lys

Leu

His

Arg

Val

Lys

Leu

Asp Asp

Ala

His

Asn

Asp

925

930

935

ACT ATG

TAC

AAT

HG

TTT

GCA

TAT

ACC

ATG

HT

CAG

AAT

ATC TCT

TCC

6048

Thr

Met

Tyr

Asn

Leu

Phe

Ala

Tyr

Thr

Met

Phe

Gin

Asn

lle

Ser

Ser

940

945

950

955

- ATG

AGG

CAT

GAC

ATC

TCT

GCT

TCA

GAT

TCC

HG

TCA

CTA

ACA

GTA TH

6096

Met

Arg

His

Asp

lle

Ser

Ala

Ser Asp

Ser

Leu

Ser

Leu

Thr

Val

Phe

-

960

965

970

—

ACC

GGT

CAA

CCG

TAT

CCT

GAA AAG, ATC

CCG

AGT

TGG

HC

CAC

CAT

CAG

6144

Thr

Gly

Gin

Pro

Tyr.

Pro

Glu

Lys lle

Pro

Ser

Trp

Phe

His

His

Gin

975

980

985

GGT

TGG

GAT AGT AGT

GTA TCA

GTC AAT TTG

CCT

GAA AAT TGG TAT ATA

6192

Gly

Trp Asp

Ser

Ser

Val

Ser

Val

Asn

Leu

Pro

Glu Asn Trp Tyr lle

990

995

1000

CCT

GAT AAA

TTC

TTG

GGA

TTT

GCT

GTA

TGT TAC TCT CGT AGC HA AH

6240

Pro

Asp Lys

Phe

Leu

Gly

Phe Ala

Val

Cys Tyr Ser Arg Ser Leu

lle

1005

1010

1015

r*i incriTi nrr pi ir

WO 95/35024

PCT/US95/07754

GAC ACA Asp Thr 1020	ACA GCT CAC TTG ATT CCC GTA TGT GAT GAC AAG ATG TCG CGC
Thr Ala	His	Leu Ile Pro Val Cys Asp Asp Lys Met Ser Aro
1025	1030	1035
ATG ACC	CAG AAA	cn	GCC TTA TCA	GAA TGT GAT ACA	GAA TCA TCC AAC
Met Thr	Gin Lys	Leu	Ala Leu Ser	Glu Cys Asp Thr	Glu Ser Ser Asn
		1040	1045	1050
TAT TCA	GAA TGG GAT	ATA CAT TTT TTC TTT GTA CCT	TTT GCT GGC TTA
Tyr Ser	Glu Trp Asp	Ile His Phe	Phe Phe Val Pro	Phe Ala Gly Leu
	1055		1060	1065
. TGG GAT	ACA TCT AAG	GCA AAT GGA AAA ACA CCA AAT	GAT TAT GGG ATT
Trp Asp	Thr Ser	Lys	Ala Asn Gly Lys Thr Pro Asn	Asp Tyr Gly Ile
	1070		1075	1080
ATT AGG	CTA TCT	TTT TCT GGA GAA GAG AAG ATG TAT	GGA CH CGT nG
Ile Arg	Leu Ser	Phe	Ser Gly Glu	Glu Lys Met Tyr	Gly Leu Arg Leu
1085		1090	1095
TTG TAT	AAA GAA	GGA	CCA GAG GTT AAT GCC TTG TTA	CAA ATG AGG GAA
Leu Tyr	Lys Glu	Gly	Pro Glu Val	Asn Ala Leu Leu	Gin Met Arg Glu
1100			1105	1110	1115
AAT AGC	AAT GAA	CCA ACA GAA CAT	TCC ACT GGG ATA	AGG AGG ACT CAA
Asn Ser	Asn Glu	Pro Thr Glu His	Ser Thr Gly Ile Arg Arg Thr Gin
		1120	1125	1130
TAT AAC	AAC AGA	ACT TCC TTT TAT	GTAAGTCTCT ACTTCTATTA GCTACAAAGT
Tyr Asn	Asn Arg	Thr Ser Phe Tyr
	1135

CTTCTTCCAA AATCAATACT CCATCCGTTC CAGTTTATGT GAACCTATTT TTTGTTCGTC CATTCTAAAA AGAATGACCC CTTTCTAAAT HGGAAATAA TTTTGGnAA AOTATAAn

CTACCATTAA CGAGAAGCH KATAACCAC ACAAATATTC TGGGGCCCK TTTGAATTGT . TTAGGACCAT AAATTCCAAA AGTCCTCAK TTTTCnAAA CTCCGTGCCC AATCAAACAA

GTTCACGTAA AKGGAACGG AGGGAATATA ITTTTTCTTC TCAKCTÍTT CCCCTATTTA

CAG GAG CTC ATC AAT GGG TGATGTACAT ATCAACAACG AGTTTTAAAG Glu Leu Ile Asn Gly 1140 114

GATTCCAACA AGTATAACTT TTTATGCTCA AATCAGCTCC TTGTATTGTG GAGAAAGCTG AGTACGAGAT GAAGTTGACG TCCGTTATCC TTTATGATCT CTCTGTTCTT TGTGTTAACT TGCCTACTTC ATCAGATGAA TAACAGAAGC CCGTTCCTCT CATTCTCAAC ACTGTTTGCA CGTCTGTTGT TACTTGTTAA AATGGATCTT GATAAAGTAA TAACATCTCT ATATTACTTA TAAGTGGTTT TAACAAGTTC ACTCTTTTGC TTTTGCAGTT CAAATGGGAA CACAATGTAT AHGAGAACT AGAACAATGA CACTGCATAT ATATATATAT ATGTATGTAT GTAAHCTCG

6288

6336

6384

6432

6480

6528

6576

6630

6690

6750

6810

6870

6930

6978

7038

7098

7158

7218

7278

7338

WO 95/35024 PCI7US95/07754

TCTTTTGGAC TAGAATACCT TGTTTCATTA T6AAATGAAT TAACATCTTC GCCTTTGCTG 7398

AC

7400

WO 95/35024

PCT/US95/07754

Gly Arg Ser Ser

Thr His 565

Tyr Ala Ile Asp 570

Tyr Leu Pro Asn

Asn Leu 575

Arg

Cys

Phe

Val

Cys

Thr

Asn

Tyr

Pro

Trp

Glu

Ser

' Phe

: Pro

Ser

Thr

580

585

590

Phe

Glu

Leu

Lys

Het

Leu

Val

His

Leu

Gin

Leu

Arg

His

Asn

Ser

Leu

595

•

600

605

Ai*g

His

Leu

Trp

Thr

Glu

Thr

Lys

His

Leu

Pro

Ser

Leu

Arg Arg

Ile

610

615

620

Asp

Leu

Ser

Trp

Ser

Lys Arg

Leu

Thr

Arg

Thr

Pro

Asp

Phe

Thr

Gly

625

630

635

640

Het

Pro

Asn

Leu

Glu

Tyr

Val

Asn

Leu

Tyr

Gin

Cys

Ser

Asn

Leu

Glu

645

650

655

Glu

Val

His

His

Ser

Leu

Gly Cys Cys

Ser

Lys

Val

Ile

Gly

Leu

Tyr

660

665

670

Leu

Asn

Asp Cys

Lys

Ser

Leu

Lys Arg

Phe

Pro

Cys

Val

Asn

Val

Glu

675

680

685

Ser

Leu

Glu

Tyr

Leu

Gly

Leu

Arg

Ser

Cys

Asp

Ser

Leu

Glu

Lys

Leu

690

695

700

Pro

Glu

Ile

Tyr Gly Arg

Het

Lys

Pro

Glu

Ile

Gin

Ile

His

Het

Gin

705

710

715

720

Gly

Ser

Gly

Ile

Arg

Glu

Leu

Pro

Ser

Ser

Ile

Phe

Gin

Tyr Lys

Thr

725

730

735

His

Val

Thr

Lys

Leu

Leu

Leu

Trp

Asn

Het

Lys

Asn

Leu

Val

Ala

Leu

740

745

750

Pro

Ser

Ser

Ile

Cys Arg

Leu

Lys

Ser

Leu

Val

Ser

Leu

Ser

Val

Ser

755

760

765

Gly Cys

Ser

Lys

Leu Glu

Ser

Leu

Pro

Glu

Glu

Ile

Gly Asp

Leu

Asp

770

775

780

Asn

Leu

Arg

Val

Phe Asp Ala

Ser Asp

Thr

Leu

Ile

Leu

Arg

Pro

Pro

785

790

•

«

795

800

Ser

Ser

Ile

Ile

Arg

Leu

Asn

Lys

Leu

Ile

Ile

Leu

Het

Phe Arg Gly

805

810

815

Phe

Lys Asp Gly

Val

His

Phe

Glu

Phe

Pro

Pro

Val

Ala

Glu Gly Leu

820

825

830

His

Ser

Leu

Glu

Tyr

Leu

Asn

Leu

Ser

Tyr Cys

Asn

Leu

Ile Asp Gly

835

840

845

Gly

Leu

Pro

Glu

Glu

Ile

Gly

Ser

Leu

Ser Ser

Leu

Lys

Lys Leu Asp

850

855

860

WO 95/35024

PCT/US95/07754

Leu Ser Arg Asn 865	Asn	Phe 870	Glu	His	Leu Pro Ser Ser Ile Ala Gin Leu
875	880
Gly Ala Leu Gin	Ser	Leu	Asp	Leu	Lys Asp Cys	Gin Arg Leu Thr Gin
	885				890	. 895
Leu Pro Glu Leu	Pro	Pro	Glu	Leu	Asn Glu Leu	His Val Asp Cys His
900					905	910
Het Ala Leu Lys	Phe	Ile	His	Tyr	Leu Val Thr	Lys Arg Lys Lys Leu
915				920		925
His Arg Val Lys	Leu.	Asp Asp	Ala	His Asn Asp	Thr Het Tyr Asn Leu
930			935			940
Phe Ala Tyr Thr	Het	Phe	Gin	Asn	Ile Ser Ser	Het Arg His Asp Ile
945		950			955	960
Ser Ala Ser Asp	Ser	Leu	Ser	Leu	Thr Val Phe	Thr Gly Gin Pro Tyr
	965				970	975
Pro Glu Lys Ile	Pro	Ser	Trp	Phe	His His Gin	Gly Trp Asp Ser Ser
980					985	990
Val Ser Val Asn	Leu	Pro	Glu	Asn	Trp Tyr Ile	Pro Asp Lys Phe Leu
995				1000	1005
Gly Phe Ala Val	Cys Tyr	Ser	Arg	Ser Leu Ile	Asp Thr Thr Ala His
1010			1015		1020
Leu Ile Pro Val	Cys Asp Asp	Lys	Het Ser Arg	Het Thr Gin Lys Leu
1025		1030		1035 1040
Ala Leu Ser Glu	Cys Asp	Thr	Glu	Ser Ser Asn	Tyr Ser Glu Trp Asp
	1045 .			1050	1055
Ile His Phe Phe	Phe	Val	Pro	Phe Ala Gly Leu	Trp Asp Thr Ser Lys
1060				1065	1070
Ala Asn Gly Lys	Thr	Pro	Asn	Asp Tyr Gly Ile	Ile Arg Leu Ser Phe
1075				1080	: 1085
Ser Gly. Glu Glu	Lys	Het	Tyr	Gly Leu Arg Leu	Leu Tyr Lys Glu Gly
• 1090			1095		1100
Pro Glu Val Asn	Ala	Leu	Leu	Gin Het Arg Glu	Asn Ser Asn Glu Pro
1105		1110		1115 1120
Thr Glu HisSer	Thr Gly Ile Arg Arg Thr Gin Tyr Asn Asn Arg Thr
	1125			1130	1135

Ser Phe Tyr Glu Leu Ile Asn Gly 1140

WO 95/35024

PCT/TJS95/07754

ha

AAT

GAA

GCG

GCC

AAT

CTC

AAA

GGC

TCC

TGT

GAI

' AAT

CGT GAC

: AAG

539

Leu

Asn

Glu

Ala

Ala

Asn

Leu

Lys

Gly

Ser

Cys

Asp

i Asn

Arg Asp

i Lys

145

150

155

160

ACT

GAT

GCA

GAC

TGT

ATT

CGA

CAG

AH

GH

GAC

CAA

, ATC

TCA TCC

AAA

587

Thr

Asp

Ala

Asp

Cys

lle

Arg

Gin

lle

Val

Asp

Gin

lle

Ser Ser

Lys

165

170

175

TTA

TGC

AAG

ATT

TCT

HA

TCT

TAT

HG

CAA

AAC

AH

GH

GGA ATA

GAT

635

Leu

Cys

Lys

lle

Ser

Leu

Ser

Tyr

Leu

Gin

Asn

lle

Val

Gly lle

Asp

180

185

190

ACT

CAT

TTA

GAG

AAA

ATA

GAA

TCC

HA

CTA

GAG

ATA

GGA

ATC AAT

GGT

683

Thr

His

Leu

Glu

Lys

lle

Glu

Ser

Leu

Leu

Glu

lle

Gly

lle Asn

Gly

195

200

205

GTT

CGG

ATT

ATG

GGG

ATC

TGG

GGA

ATG

GGG

GGA

GTC

GGT

AAA ACA

ACA

731

Val

Arg

lle

Met

Gly

lle

Trp

Gly

Met

Gly

Gly

Val

Gly

Lys Thr

Thr

210

215

220

ATA

GCA

AGA

GCT

ATA

ITT

GAT

ACT

CH

HA

GGA

AGA

ATG

GAT AGT

TCC

779

lle

Ala

Arg

Ala

lle

Phe

Asp

Thr

Leu

Leu

Gly

Arg

Met

Asp Ser

Ser

225

230

235

240

TAT

CAA

TTT

GAT

GGT

GCT

TGT

HC

CH

AAG

GAT

AH

AAA

GAA AAC

AAA

827

Tyr

Gin

Phe

Asp

Gly

Ala

Cys

Phe

Leu

Lys

Asp

lle

Lys

Glu Asn

Lys

245

250

255

CGT

GGA

ATG

CAT

TCT

HG

CAA

AAT

GCC

CH

CTC

TCT

GAA

CH HA

AGG

875

Arg

Gly

Met

His

Ser

Leu

Gin

Asn

Ala

Leu

Leu

Ser

Glu

Leu Leu

Arg

260

265

270

GAA

AAA

GCT

AAT

TAC

AAT

AAT

GAG

GAG

GAT

GGA

AAG

CAC

CAA ATG

GCT

923

Glu

Lys

Ala

Asn

Tyr

Asn

Asn

Glu

Glu

Asp

Gly

Lys

His

Gin Met

Ala

275

280

285

AGT

AGA

CTT

CGT

TCG

AAG

AAG

GTC

CTA

AH

GTG

CH

GAT

GAT ATA

GAT

971

Ser

Arg

Leu

Arg

Ser

Lys

Lys

Val

Leu

lle

Val

Leu

Asp

Asp lle

Asp

290

295

300

AAT

AAA

GAT

CAT

TAT

HG

GAG

TAT

HA

GCA

GGT

GAT

CH

GAT TGG

TH

1019

Asn

Lys

Asp

His

Tyr

Leu

Glu

Tyr

Leu

Ala

Gly

Asp

Leu

Asp Trp

Phe

305

310

-

315

320

GGT

AAT

GGT

AGT

AGA

AH

AH

ATA'

ACA

ACT

AGA

GAC

AAG

CAT HG

ATA

1067

Gly

Asn

Gly

Ser

Arg

lle

lle

lle

Thr

Thr

Arg

Asp

Lys

His Leu

lle

325

330

335

GAG

AAG

AAT

GAT

ATA

ATA

TAT

GAG

GTG

ACT

GCA

CTA

CCC

GAT CAT

GAA

1115

Glu

Lys

Asn

Asp

lle

lle

Tyr

Glu

Val

Thr

Ala

Leu

Pro

Asp His

Glu

340

345

350

TCC

ATT

CAA

TTG

TTC

AAA

CAA

CAT

GCT

HC

GGA

AAA

GAA

GH CCA

AAT

1163

Ser

lle

Gin

Leu

Phe

Lys

Gin

His

Ala

Phe

Gly

Lys

Glu

Val Pro .

Asn

355

360

365

ITE SHEET (RULL2

WO 95/35024

PCIYUS95/07754

GAG

AAT

T77

GAG

AAG

cn

TCA

nA

, GAG

GTA

GTA

. AAI

' TAI

' GCT

AAA

. GGC

1211

Glu

Asn

Phe

Glu

Lys

Leu

Ser

Leu

Glu

Val

Val

Asn

Tyr

Ala

Lys

Gly

370

375

380

cn

CCT

TTA

GCC

CTC

AAA

GTG

TGG

GGT

TCT

nG

CTG

CAT

AAC

CTA

CGA

' 1259

Leu

Pro

Leu

Ala

Leu

Lys

Val

Trp

Gly

Ser

Leu

Leu

His

Asn

Leu

Arg

385

390

395

400

ΠΑ

ACT

GAA

TGG

'AAA

AGT

GCT

ATA

GAG

CAC

ATG

AAA

AAT

AAC

TCT

TAT

1307

Leu

Thr

Glu

Trp

Lys

Ser

Ala

Ile

Glu

His

Met

Lys

Asn

Asn

Ser

Tyr

405

410

415

TCT

GGA

ATT

ATT

GAT

AAG

CTC

AAA

ATA

AGT

TAT

GAT

GGA

nA

GAG

CCC

1355

Ser

Gly

Ile

Ile

Asp

Lys

Leu

Lys

Ile

Ser

Tyr

Asp

Gly

Leu

Glu

Pro

420

425

430

AAA

CAA

CAA

GAG

ATG

ITT

nA

GAT

ATA

GCA

TGC

nc

ne

CGA

GGG

GAA

1403

Lys

Gin

Gin

Glu

Met

Phe

Leu

Asp

Ile

Ala

Cys

Phe

Leu

Arg

Gly

Glu

435

440

445

GAA

AAA

GAT

TAC

ATC

CTA

CAA

ATC

cn

GAG

AGT

TGT

CAT

An

GGA

GCT

1451

Glu

Lys

Asp

Tyr

Ile

Leu

Gin

Ile

Leu

Glu

Ser

Cys

His

Ile

Gly

Ala

450

455

460

GAA

TAC

GGG

TTA

CGT

An-

nA

An

GAC

AAA

TCT

cn

GTG

nc

ATC

TCT

1499

Glu

Tyr

Gly

Leu

Arg

He

Leu

Ile

Asp

Lys

Ser

Leu

Val

Phe

Ile

Ser

465

470

475

480

GAA

TAT

AAT

CAG

GTT

CAA

ATG

CAT

GAC

nA

ATA

CAG

GAT

ATG

GGT

AAA

1547

Glu

Tyr

Asn

Gin

Val

Gin

Met

His

Asp

Leu

Ile

Gin

Asp

Met

Gly

Lys

485

490

495

TAT

ATA

GTG

AAT

TTT

CAA

AAA

GAT

CCC

GGA

GAA

CGT

AGC

AGA

nA

TGG

1595

Tyr

Ile

Val

Asn

Phe

Gin

Lys

Asp

Pro

Gly

Glu

Arg

Ser

Arg

Leu

Trp

500

505

510

CTC

GCC

AAG

GAA

GTC

GAA

GAA

GTG

ATG

AGC

AAC

AAC

ACA

GGG

ACC

ATG

1643

Leu

Ala

Lys

Glu

Val

Glu

Glu

Val

Met

Ser

Asn

Asn

Thr

Gly

Thr

Met

-

515

520

525

GCA

ATG

GAA

GCA

ATT

TGG

cn

TCT

TCT

TAT

TCT

AGT

ACT

CTA

CGC

τη

1691

Ala.

Met

Glu

Ala

Ile

Trp

Val

Ser

Ser

Tyr

Ser

Ser

Thr

Leu

Arg

Phe

-

530

535

•

540

AGC

AAT

CAG

GCC

GTG

AAA

AAT

ATG

AAA

AGG

cn

AGG

GTA

ητ

AAC

ATG

1739

Ser

Asn

Gin

Ala

Val

Lys

Asn

Met

Lys

Arg

Leu

Arg

Val

Phe

Asn

Met

545

550

555

560

GGG

AGG

TCG

TCG

ACA

CAT

TAT

GCC

ATC

GAT

TAT

CTG

CCC

AAC

AAC

nc

1787

Gly

Arg

Ser

Ser

Thr

His

Tyr

Ala

Ile

Asp

Tyr

Leu

Pro

Asn

Asn

Leu

565

570

575

CGT

TGT

ΊΓΓΤ

GTT

TGC

ACT

AAC

TAT

CCT

TGG

GAG

TCA

ητ

CCA

TCT

ACA

1835

Arg

Cys

Phe

Val

Cys

Thr

Asn

Tyr

Pro

Trp

Glu

Ser

Phe

Pro

Ser

Thr

580

585

590

WO 95/35024

PCT/US95/07754

τη

GAA

CTC

AAA

ATG

cn

cn

CAC

CTC CAA

CTC

CGA

CAC

AAT TC1

' CTG

Phe

Glu

Leu

Lys

Met

Leu

Val

His

Leu Gin

Leu

Arg

His

Asr

i Ser

• Leu

595

600

605

CGT

CAT

.TTA

TGG

ACA

GAA

ACA

AAG

CAT nG

CCG

TCT

CTA

CGG

í AGG

, ATA

Arg

His

Leu

Trp

Thr

Glu

Thr

Lys

His Leu

Pro

Ser

Leu

Arg

1 Arg

Ile

610

615

620

GAT

CTC

AGC

TGG

TCT

AAA

AGA

nG

ACG CGA

ACA

CCA

GAT

nc

ACG

GGG

Asp

Leu

Ser

Trp

Ser

Lys

Arg

Leu

Thr Arg

Thr

Pro

Asp

Phe

Thr

Gly

625

630

635

640

ATG

CCA

AAT

TTG

GAG

TAT

GTG

AAT

nG TAT

CAA

TGT

AGT

AAT

cn

GAA

Met

Pro

Asn

Leu

Glu

Tyr

Val

Asn

Leu Tyr

Gin

Cys

Ser

Asn

Leu

Glu

645

650

655

GAA

GTT

CAC

CAT

TCC

CTG

GGA

TGT

TGC AGC

AAA

GTC

An

GGT

nA

TAT

Glu

Val

His

His

Ser

Leu

Gly

Cys

Cys Ser

Lys

Val

Ile

Gly

Leu

Tyr

660

665

670

TTG

AAT

GAT

TGT

AAA

AGC

cn

AAG

agg τη

CCA

TGT

Gn

AAC

GTG

GAA

Leu

Asn

Asp

Cys

Lys

Ser

Leu

Lys

Arg Phe

Pro

Cys

Val

Asn

Val

Glu

675

680

685

TCT

cn

GAA

TAT

CTG

GGT

CTA

AGA

AGT TGC

GAT

AGT

nA

GAG

AAA

nG

Ser

Leu

Glu

Tyr

Leu

Gly

Leu

Arg

Ser Cys

Asp

Ser

Leu

Glu

Lys

Leu

690

695

700

CCA

GAA

ATC

TAC

GGG

AGA

ATG

AAG

CCG GAG

ATA

CAG

An

CAC

ATG

CAA

Pro

Glu

Ile

Tyr

Gly

Arg

Met

Lys

Pro Glu

Ile

Gin

Ile

His

Met

Gin

705

710

715

720

GGC

TCT

GGG

ATA

AGG

GAA

CTA

CCA

TCA TCT

An

τη

CAG

TAC

AAA

ACT

Gly

Ser

Gly

Ile

Arg

Glu

Leu

Pro

Ser Ser

Ile

Phe

Gin

Tyr

Lys

Thr

725

730

735

CAT

GTT

ACC

AAG

CTA

nc

nG

TGG

AAT ATG

AAA

AAC

cn

GTA

GCT

cn

His

Val

Thr

Lys

Leu

Leu

Leu

Trp

Asn Met

Lys

Asn

Leu

Val

Ala

Leu

740

745

750

CCA

AGC

AGC

ATA

TGT

AGG

nG

AAA

AGT nG

Gn

AGT

CTG

AGT

GTG

TCG

Pro

Ser

Ser

Ile

Cys

Arg

Leu

Lys

Ser Leu

Val

Ser

Leu

Ser

Val

Ser

755

-

760

765

GGT

TGC

TCA

AAA

cn

GAA

AGC

ns'

CCA GAA

GAG

ATA

GGG

GAT

nA

GAC

Gly

Cys

Ser

Lys

Leu

Glu

Ser

Leu

Pro Glu

Glu

Ile

Gly

Asp

Leu

Asp

770

775

780

AAC

TTA

CGG

GTG

τη

GAT

GCC

AGT

GAT ACT

CTA

An

nA

CGA

CCT

CCG

Asn

Leu

Arg

Val

Phe

Asp

Ala

Ser

Asp Thr

Leu

Ile

Leu

Arg

Pro

Pro

785

790

795

800

TCT

TCC

ATC

ATA

CGC

nG

AAC

AAA

cn ATA

ATC

nG,

ATG

m

CGA

GGC

Ser

Ser

He

Ile

Arg

Leu

Asn

Lys

Leu Ile

Ile

Leu i

Het

Phe

Arg

Gly

805

810

815

1883

1931

1979

2027

2075

2123

2171

2219

2267

2315

2363

2411

2459

2507

• WO 95/35024

PCT/US95/07754

TTC AAA GAT GGA GTG CAC TTT GAG ne CCT CCT GTG GCT GAA GGA TTA	2555
Phe	Lys	Asp Gly Val 820	His	Phe Glu Phe Pro Pro Val Ala Glu Gly Leu
825	830
CAC	TCA	TTG GAA TAT	CTG	AAT CTC AGT TAC TGC AAT CTA ATA GAT GGA	2603
His	Ser	Leu Glu Tyr	Leu	Asn Leu Ser Tyr Cys Asn Leu	Ile Asp Gly	Cw v W>J
		835		840 845
GGA	cn	CCG GAA GAG	An	GGA TCC nA TCC TCT nG AAA	AAG nG GAT	2651
Gly	Leu	Pro Glu Glu	Ile	Gly Ser Leu Ser Ser Leu Lys	Lys Leu Asp
	850			855 860
CTC	AGT	AGA AAT AAT TTT	GAG CAT nG CCT TCA AGT ATA	GCC CAA cn	2699
Leu	Ser	Arg Asn Asn	Phe	Glu His Leu Pro Ser Ser Ile	Ala Gin Leu
865			870	875	880
GGT	GCT	CTT CAA TCC	nA	GAC nA AAA GAT TGC CAG AGG	cn ACA CAG	2747
Gly Ala	Leu Gin Ser	Leu	Asp Leu Lys Asp Cys Gin Arg	Leu Thr Gin
		885		’ 890	895
CTA	CCA	GAA CH CCC	CCA	GAA nA AAT GAA nG CAT GTA	GAT TGT.CAT	2795
Leu	Pro	Glu Leu Pro	Pro	Glu Leu Asn Glu Leu His Val	Asp Cys His
		900		905	910
ATG	GCT	CTG AAA Tn	ATC	CAT TAT nA GTA ACA AAG AGA	AAG AAA CTA	2843
Met	Ala	Leu Lys Phe	Ile	His Tyr Leu Val Thr Lys Arg Lys Lys Leu
		915		920 925
CAT	AGA	GTG AAA Cn	GAT	GAT GCA CAC AAT GAT ACT ATG	TAC AAT nG	2891
His	Arg	Val Lys Leu	Asp Asp Ala His Asn Asp Thr Met	Tyr Asn Leu
	930			935 940
TTT	GCA	TAT ACC ATG ITT	CAG AAT ATC TCT TCC ATG AGG	CAT GAC ATC	2939
Phe	Ala	Tyr Thr Met	Phe	Gin Asn Ile Ser Ser Met Arg	His Asp Ile
945			950	955	960
TCT	GCT TCA GAT TCC	nG	TCA CTA ACA GTA Tn ACC GGT	CAA CCG TAT	2987
Ser	Ala	Ser Asp Ser	Leu	Ser Leu Thr Val Phe Thr Gly Gin Pro Tyr
		965		970	975
CCT	GAA AAG ATC CCG	AGT	TGG nC CAC CAT CAG GGT TGG GAT AGT AGT	3035
Pro	Glu Lys Ile Pro	Ser	Trp Phe His His Gin Gly Trp Asp Ser Ser
		980		.985	990
GTA TCA GTC AAT TTG CCT	GAA AAT TGG TAT ATA CCT GAT AAA nC nG	3083
Val	Ser Val Asii Leu	Pro	Glu Asn Trp Tyr Ile Pro Asp Lys Phe Leu
		995 •		1000 1005
GGA TTT GCT GTA TGT TAC	TCT CGT AGC nA An GAC ACA ACA GCT CAC	3131
Gly Phe Ala Val Cys Tyr	Ser Arg Ser Leu Ile Asp Thr Thr Ala His
	1010			1015 1020
TTG ATT CCC GTA TGT GAT	GAC AAG ATG TCG CGC ATG ACC CAG AAA Cn	3179
Leu	Ile Pro Val Cys Asp Asp Lys Met Ser Arg Met Thr Gin Lys Leu
1025			1030	1035	1040

WO 95/35024

PCT/US95/07754

GCC KA	TCA Ser	GAA TGT GAT ACA GAA TCA TCC AAC TAT TCA GAA TGG GAT
Ala	Leu	Glu Cys Asp 1045	Thr	Glu Ser	Ser Asn Tyr Ser Glu Trp Asp
1050	1055
ATA	CAT	TTT	TTC TTT GTA	CCT	TTT GCT	GGC KA TGG	GAT ACA TCT AAG
Ile	His	Phe	Phe Phe Val	Pro	Phe Ala	Gly Leu Trp Asp Thr Ser Lys
			1060		1065	1070
GCA AAT	GGA	AAA ACA CCA	AAT	GAT TAT	GGG ATC AK	AGG CTA TCT KT
Ala	Asn	Gly Lys Thr Pro	Asn	Asp Tyr Gly Ile Ile	Arg Leu Ser Phe
		1075		1080		1085
.TCT	GGA	GAA GAG AAG ATG	TAT	GGA CTT	CGT KG KG	TAT AAA GAA GGA
Ser	Gly	Glu	Glu Lys Met	Tyr Gly Leu	Arg Leu Leu	Tyr Lys Glu Gly
	1090		1095 '	1100
CCA	GAG	GTT AAT GCC KG	KA	CAA ATG	AGG GAA AAT	AGC AAT GAA CCA
Pro	Glu	Val	Asn Ala Leu	Leu	Gin Met	Arg Glu Asn	Ser Asn Glu Pro
1105		1110		1115	. 1120
ACA	GAA	CAT	TCC ACT GGG	ATA	AGG AGG	ACT CAA TAT	AAC AAC AGA ACT
Thr	Glu	His	Ser Thr Gly	Ile	Arg Arg Thr Gin Tyr	Asn Asn Arg Thr
			1125			1130	1135.
TCC	TTT	TAT	GAG CTC ATC	AAT	GGG TGATGTACAT ATCAACAACG AGTTTTAAAG
Ser	Phe	Tyr	Glu Leu Ile	Asn	Gly

1140

3227

3275

3323

3371

3419

3467

3521

GAKCCAACA AGTATAACK TKATGCTCA AATCAGCTCC KGTAKGTG GAGAAAGCTG 3581

AGTACGAGAT GAAGKGACG TCCGTTATCC TTTATGATCT CTCTGKCK TGTGKAACT 3641

TGCCTACTTC ATCAGATGAA TAACAGAAGC CCGTTCCTCT CATTCTCAAC ACTGTKGCA 3701

CGTCTGKGT TACKGKAA AATGGATCK GATAAAGTAA TAACATCTCT ATAKACK 3760 ' WO 95/35024

PCT/US95/07754 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:4:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LEHGTH: 1144 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:4:

'Met Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Arg Trp Ser Tyr Asp Val Phe Leu 15 10 15

‘Ser Phe Arg Gly

Glu Asp Thr Arg Lys Thr Phe Thr Ser His

Leu

Tyr

20

25

30

Glu

Val

Leu

Asn

Asp Lys Gly

Ile

Lys

Thr

Phe

Gin

Asp Asp Lys Arg

35

40

45

Leu

Glu

Tyr Gly Ala

Thr

Ile

Pro

Gly

Glu

Leu

Cys

Lys

Ala

Ile

Glu

50

55

60

Glu

Ser

Gin

Phe

Ala

Ile

Val

Val

Phe

Ser

Glu

Asn

Tyr

Ala

Thr

Ser

65

70

75

80

Arg Trp

Cys

Leu

Asn

Glu

Leu

Val

Lys Ile Met

Glu

Cys

Lys

Thr

Arg

85

•90

95

Phe

Lys

Gin

Thr

Val

Ile

Pro

Ile

Phe

Tyr Asp

Val

Asp

Pro

Ser

His

100

105

110

Val

Arg

Asn

Gin

Lys

Glu

Ser

Phe

Ala

Lys

Ala

Phe

Glu

Glu

His

Glu

115

120

125

Thr

Lys Tyr Lys Asp Asp

Val

Glu

Gly

Ile

Gin Arg Trp Arg

Ile

Ala

130

135

140

Leu

Asn

Glu

Ala Ala Asn

Leu

Lys

Gly

Ser

Cys Asp

Asn

Arg Asp

Lys

145

150

155

160

Thr Asp

Ala

Asp Cys

Ile

Arg

Gin

Ile

Val

Asp

Gin

Ile

Ser

Ser

Lys

165

•

170

175

Leu

Cys

Lys

Ile

Ser

Leu

Ser

Tyr

Leu

Gin

Asn

Ile

Val

Gly

Ile

Asp

180

185

190

Thr

His

Leu

Glu

Lys

Ile

Glu

Ser

Leu

Leu

Glu

Ile

Gly

Ile Asn

Gly

195

200

205

Val Arg Ile Met Gly Ile Trp Gly Met Gly Gly Val Gly Lys Thr Thr 210 215 220

Ile Ala Arg Ala Ile Phe Asp Thr Leu Leu Gly Arg Met Asp Ser Ser

225	230	235		240
Tyr Gin	Phe Asp Gly Ala Cys	Phe Leu Lys Asp Ile Lys Glu	Asn	Lys
	245	250	255

WO 95/35024

PCT/US95/07754

Arg

Gly

Met

His

Ser

Leu

Gin

Asn

Ala

Leu

Leu

: Ser

Glu

Leu

Leu

Arg

260

265

270

Glu

Lys

Ala

Asn

Tyr

Asn

Asn

Glu

Glu

Asp

Gly

Lys

His

Gin

Het

Ala

275

280

285

Ser

Arg

Leu

Arg

Ser

Lys

Lys

Val

Leu

Ile

Val

Leu

Asp

Asp

Ile

Asp

290

295

300

Asn

Lys

Asp

His

Tyr

Leu

Glu

Tyr

Leu

Ala

Gly

Asp

Leu

Asp

Trp

Phe

305

310

315

320

Gly

Asn

Gly

Ser

Arg

Ile

Ile

Ile

Thr

Thr

Arg

Asp

Lys

His

Leu

Ile

325

330

335

Glu

Lys

Asn

Asp

Ile

Ile

Tyr

Glu

Val

Thr

Ala

Leu

Pro

Asp

His

Glu

340

345

350

Ser

Ile

Gin

Leu

Phe

Lys

Gin

His

Ala

Phe

Gly

Lys

Glu

Val

Pro

Asn

355

360

365

Glu

Asn

Phe

Glu

Lys

Leu

Ser

Leu

Glu

Val

Val

Asn

Tyr

Ala

Lys

Gly

370

375

380

Leu

Pro

Leu

Ala

Leu

Lys

Val

Trp

Gly

Ser

Leu

Leu

His

Asn

Leu

Arg

385

390

395

400

Leu

Thr

Glu

Trp

Lys

Ser

Ala

Ile

Glu

His

Met

Lys

Asn

Asn

Ser

Tyr

405

410

415

Ser

Gly

Ile

Ile

Asp

Lys

Leu

Lys

Ile

Ser

Tyr

Asp

Gly

Leu

Glu

Pro

420

425

430

Lys

Gin

Gin

Glu

Het

Phe

Leu

Asp

Ile

Ala

Cys

Phe

Leu

Arg

Gly

Glu

435

440

445

Glu

Lys

Asp

Tyr

Ile

Leu

Gin

Ile

Leu

Glu

Ser

Cys

His

Ile

Gly

Ala

450

455

460

Glu

Tyr

Gly

Leu

Arg

Ile

Leu

Ile

Asp

Lys

Ser

Leu

Val

Phe

Ile

Ser

465

470

475

480

Glu

Tyr

Asn

Gin

Val

Gin

Het

His

Asp t

Leu

Ile

Gin

Asp

Met

Gly

Lys

485

490

495

Tyr-

Ile

Val

Asn

Phe

Gin

Lys

Asp

Pro

Gly

Glu

Arg

Ser

Arg

Leu

Trp

500

505

510

Leu

Ala

Lys

Glu

Val

Glu

Glu

Val

Het

Ser

Asn

Asn

Thr

Gly

Thr

Het

515

520

525

Ala

Het

Glu

Ala

Ile

Trp

Val

Ser

Ser

Tyr

Ser

Ser

Thr

Leu

Arg

Phe

530

535

540

Jer

Asn

Gin

Ala

Val

Lys

Asn

Het

Lys

Arg

Leu

Arg

Val

Phe

Asn

Het

,45

550

555

560

SUBSTITUTE SHEET (RULE 2>

WO 95/35024

PCT/US95/07754

Gly

Arg

Ser

Ser

Thr

His

Tyr

Ala

Ile

Asp

Tyr

Leu

Pro

Asn

Asn

Leu

565

570

575

Arg

Cys

Phe

Val

Cys

Thr

Asn

Tyr

Pro

Trp

Glu

Ser

Phe

Pro

Ser

Thr

580

585

590

Phe

Glu

Leu

Lys

Het

Leu

Val

His

Leu

Gin

Leu

Arg

His

Asn

Ser

Leu

595

600

605

Arg

His

Leu

Trp

Thr

Glu

Thr

Lys

His

Leu

Pro

Ser

Leu

Arg

Arg

Ile

610

615

620

Asp Leu Ser Trp Ser Lys

Arg

Leu Thr

Arg Thr Pro Asp 635

Phe

Thr

Gly 640

6Z5

630

Het

Pro

Asn

Leu

Glu

Tyr

Val

Asn

Leu

Tyr

Gin

Cys

Ser

Asn

Leu

Glu

645

650

655

Glu

Val

His

His

Ser

Leu

Gly Cys Cys Ser

Lys

Val

Ile

Gly

Leu

Tyr

660

665

670

Leu

Asn

Asp

Cys

Lys

Ser

Leu

Lys Arg

Phe

Pro

Cys

Val

Asn

Val

Glu

675

680

685

Ser

Leu

Glu

Tyr

Leu

Gly

Leu

Arg

Ser

Cys

Asp

Ser

Leu

Glu

Lys

Leu

690

695

700

Pro

Glu

Ile

Tyr Gly Arg

Het

Lys

Pro

Glu

Ile

Gin

Ile

His

Het

Gin

705

710

715

720

Gly

Ser Gly

Ile

Arg

Glu

Leu

Pro

Ser

Ser

Ile

Phe

Gin

Tyr Lys

Thr

725

730

735

His

Val

Thr

Lys

Leu

Leu

Leu

Trp Asn

Het

Lys

Asn

Leu

Val

Ala

Leu

740

745

750

Pro

Ser

Ser

Ile

Cys Arg

Leu

Lys

Ser

Leu

Val

Ser

Leu

Ser

Val

Ser

755 760 765

Gly

Cys

Ser

Lys

Leu

Glu

Ser

Leu

Pro

Glu

Glu

Ile

Gly

Asp

Leu

Asp

770

775

780

Asn

Leu

Arg

Val

Phe

Asp

Ala

Ser

•Asp «

Thr

Leu

Ile

Leu

Arg

Pro

Pro

785

790

•

795

800

Ser

Ser

Ile

Ile

Arg

Leu

Asn

Lys

Leu

Ile

Ile

Leu

Het

Phe

Arg

Gly

805

810

815

Phe

Lys

Asp

Gly

Val

His

Phe

Glu

Phe

Pro

Pro

Val

Ala

Glu

Gly

Leu

820

825

830

His

Ser

Leu

Glu

Tyr

Leu

Asn

Leu

Ser

Tyr

Cys

Asn

Leu

Ile

Asp

Gly

835

840

845

Gly

Leu

Pro

Glu

Glu

Ile

Gly

Ser

Leu

Ser

Ser

Leu

Lys

Lys

Leu

Asp

850

855

860

WO 95/35024

PCT/US95/07754

Leu Ser Arg Asn Asn 865	Phe 870	Glu His	Leu Pro Ser Ser Ile Ala Gin Leu
875	880
Gly Ala Leu Gin Ser	Leu	Asp Leu	Lys Asp Cys Gin Arg	Leu Thr Gin
885			890	895
Leu Pro Glu Leu Pro	Pro	Glu Leu	Asn Glu Leu His Val	Asp Cys His
900			905	910
Met Ala Leu Lys Phe	Ile	His Tyr	Leu Val Thr Lys Arg Lys Lys Leu
915		920	925
His Arg Val Lys Leu	Asp Asp Ala	His Asn Asp Thr Met	Tyr Asn Leu
930		935	940
Phe Ala Tyr Thr Met	Phe	Gin Asn	Ile Ser Ser Met Arg	His Asp Ile
945	950		955	960
Ser Ala Ser. Asp Ser	Leu	Ser Leu	Thr Val Phe Thr Gly	Gin Pro Tyr
965			970	975
Pro Glu Lys Ile Pro	Ser	Trp Phe	His His Gin Gly Trp Asp Ser Ser
980			985	990
Val Ser Val Asn Leu	Pro	Glu Asn	Trp Tyr Ile Pro Asp Lys Phe Leu
995		100C	1 1005
Gly Phe Ala Val Cys Tyr	Ser Arg	Ser Leu Ile Asp Thr Thr Ala His
1010		1015	1020
Leu Ile Pro Val Cys Asp Asp Lys	Met Ser Arg Met Thr	Gin Lys Leu
1025	1030	' 1035	1040
Ala Leu Ser Glu Cys Asp	Thr Glu	Ser Ser Asn Tyr Ser	Glu Trp Asp
1045		1050	1055
Ile His Phe Phe Phe	Val	Pro Phe Ala Gly Leu Trp Asp	Thr Ser Lys
1060			1065	1070
Ala Asn Gly Lys Thr	Pro	Asn Asp Tyr Gly Ile Ile Arg	Leu Ser Phe
1075		1080	1085
Ser Gly Glu Glu Lys	Met	Tyr Gly Leu Arg Leu Leu Tyr.Lys Glu Gly
1090		1095	1100
Pro Glu Val Asn Ala	Leu	Leu Gin Met Arg Glu Asn Ser Asn Glu Pro

1105 1110 1115 1120

Thr Glu His Ser Thr Gly Ile Arg Arg Thr Gin Tyr Asn Asn Arg Thr 1125 1130 1135

Ser Phe Tyr Glu Leu Ile Asn Gly 1140 ~ WO 95/35024

PCT/US95/07754 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:5:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 3830 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULĚ TYPE: cDNA to mRNA (vi) ORIGINÁL SOURCE:

(A) ORGANISM: Nicotiana glutinosa (F) TISSUE TYPE: leaf (ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: COS (B) LOCATION: 60..2018 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:5:

GGCACGAGAT THHCACAT ACAGTHCH ACTCTTTTCA GAGAATTAAC GTTGAGTCC 59

ATG GCA TCT TCT TCT TCT TCT TCT AGA TGG AGC TAT GAT GIT TTC HA 107

Met Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Arg Trp Ser Tyr Asp Val Phe Leu

5 10, 15

AGT

TH

AGA

GGC

GAA

GAT

ACT

CGA

AAA

ACG

TH

ACA

AGT

CAC

HA

TAC

155

Ser

Phe

Arg

Gly

Glu

Asp

Thr

Arg

Lys

Thr

Phe

Thr

Ser

His

Leu

Tyr

20

25

30

GAA

GTC

HG

AAT

GAT

AAG

GGA

ATA

AAA

ACC

TH

CAA

GAT

GAT

AAA

AGG

203

Glu

Val

Leu

Asn

Asp

Lys

Gly

lle

Lys

Thr

Phe

Gin

Asp

Asp

Lys

Árg

35

40

45

-

CTA

GAG

TAC

GGC

GCA

ACC

ATC

CCA

GGT

GAA

CTC

TGT

AAA

GCT

ATA

GAA .

251

Leu

Glu

Tyr

Gly

Ala

Thr

lle

Pro

Gly

Glu

Leu

Cys

Lys

Ala

lle

Glu

50

55

60

GAG

TCT

CAA

TH

GCC

AH

GH

GH

HC

TCA

GAG

AAT

TAT

GCA

ACA

TCA

299

Glu

Ser

Gin

Phe

Ala

lle

Val

Val

Phe

Ser

Glu

Asn

Tyr

Ala

Thr

Ser

65

70

75

80

AGG

TGG

TGT

HG

AAT

GAA

CTA

GTG

•AAG

ATC

ATG

GAA

TGC

AAA

ACT

CGA

347

Arg

Trp

Cys

Leu

Asn

Glu

Leu

Val

Lys

lle

Met

Glu

Cys

Lys

Thr

Arg

85

90

95

TH

AAG

CAA

ACT

GH

ATA

CCG

ATA

HC

TAT

GAT

GTG

GAT

CCA

TCA

CAT

395

Phe

Lys

Gin

Thr

Val

lle

Pro

lle

Phe

Tyr

Asp

Val

Asp

Pro

Ser

His

100

105

110

GH

CGG

AAC

CAA

AAG

GAG

AGC

TH

GCA

AAA

GCC

HT

GAA

GAA.

CAT

GAA

443

Val

Arg

Asn

Gin

Lys

Glu

Ser

Phe

Ala

Lys

Ala

Phe

Glu

Glu

His

Glu

115

120

125

ACA

AAG

TAT

AAG

GAT

GAT

GH

GAG

GGA

ATA

CAA

AGA

TGG

AGG

AH

GCT

491

Thr

Lys

Tyr

Lys

Asp

Asp

Val

Glu

Gly

lle

Gin

Arg

Trp

Arg

lle

Ala

130

135

140

WO 95/35024 PCT/US95/07754

ΠΑ Leu 145

AAT GAA

GCG Ala

GCC AAT CTC AAA GGC TCA TGT GAT AAT CGT GAC AAG

539

Asn

Glu

Ala

Asn 150

Leu

Lys Gly Ser Cys 155

Asp

Asn Arg Asp Lys 160

ACT

GAT

GCA

GAC

TGT

An

CGA

CAG

An

Gn

GAC

CAA ATC

TCA

TCC

AAA

587

Thr

Asp

Ala

Asp

Cys

Ile

Arg

Gin

Ile

Val

Asp

Gin

Ile

Ser

Ser

Lys

165

170

175

TTA TGC

AAG

ATT

TCT

nA

TCT

TAT

nc

CAA

AAC

An

Gn

GGA

ATA

GAT

635

Leu

Cys

Lys

Ile

Ser

Leu

Ser

Tyr

Leu

Gin

Asn

Ile

Val

Gly

Ile

Asp

180

185

190

ACT

CAT

TTA

GAG

AAA ATA

GAA

TCC

nA

CTA

GAG

ATA

GGA

ATC

AAT

GGT

683

Thr

His

Leu

Glu

Lys

Ile

Glu

Ser

Leu

Leu

Glu

Ile

Gly

Ile

Asn

Gly

195

200

205

GTT

CGG

ATT

ATG

GGG

ATC

TGG

GGA

ATG

GGG

GGA

GTC

GGT

AAA

ACA

ACA

731

Val

Arg

Ile

Met

Gly

Ile

Trp

Gly

Met

Gly Gly

Val

Gly

Lys

Thr

Thr

210

215

220

ATA

GCA

AGA

GCT ATA

τη

GAT ACT

cn

nA

GGA

AGA

ATG

GAT AGT TCC

779

Ile

Ala

Arg Ala Ile

Phe

Asp

Thr

Leu

Leu

Gly Arg

Met

Asp Ser

Ser

225

230

235

240

TAT

CAA

TTT

GAT GGT

GCT

TGT

nc

cn

AAG

GAT

An AAA

GAA AAC

AAA

827

Tyr

Gin

Phe

Asp Gly Ala

Cys

Phe

Leu

Lys Asp

Ile

Lys

Glu

Asn

Lys

245

250

255

CGT

GGA ATG

CAT TCT nc

CAA AAT

GCC

cn

CTC

TCT

GAA

cn

nA

AGG

875

Arg Gly Met

His

Ser

Leu

Gin

Asn

Ala

Leu

Leu

Ser

Glu

Leu

Leu

Arg

260

265

270

GAA

AAA

GCT

AAT

TAC

AAT

AAT

GAG

GAG

GAT

GGA

AAG

CAC

CAA

ATG

GCT

923

Glu

Lys

Ala

Asn

Tyr

Asn

Asn

Glu

Glu

Asp

Gly

Lys

His

Gin

Met

Ala

275

280

285

AGT

AGA

cn

CGT

TCG

AAG

AAG

GTC

CTA

An

GTG

cn

GAT

GAT

ATA

GAT

971

Ser

Arg

Leu

Arg

Ser

Lys

Lys

Val

Leu

Ile

Val

Leu

Asp

Asp

Ile

Asp

290

295

300

AAT

AAA

GAT

CAT

TAT

nG

GAG

TAT

nA

GCA

GGT

GAT

cn

GAT

TGG

τη

1019

Asn

Lys

Asp

His

Tyr

Leu

Glu

Tyr

Leu

Ala

Gly

Asp

Leu

Asp

Trp

Phe

305

310

•

315

320

GGT

AAT

GGT

AGT

AGA

An

An

ATA

ACA

ACT

AGA

GAC

AAG

CAT

nc

ATA

1067

Gly

Asn

Gly

Ser

Arg

Ile

Ile

Ile

Thr

Thr

Arg

Asp

Lys

His

Leu

Ile

325

330

335

GAG

AAG

AAT

GAT

ATA

ATA

TAT

GAG

GTG

ACT

GCA

CTA

CCC

GAT

CAT

GAA

1115

Glu

Lys

Asn

Asp

Ile

Ile

Tyr

Glu

Val

Thr

Ala

Leu

Pro

Asp

His

Glu

340

345

350

TCC

An

CAA

nG

nc

AAA

CAA

CAT

GCT

nc

GGA

AAA

GAA

cn

CCA

AAT

1163

Ser

Ile

Gin

Leu

Phe

Lys

Gin

His

Ala

Phe

Gly

Lys

Glu

Val

Pro

Asn

355

360

365

WO 95/35024

PCT/US95/07754

GAG AAT TTT GAG AAG CTT TCA TTA GAG GTA GTA AAT TAT GCT AAA GGC Glu Asn Phe Glu Lys Leu Ser Leu Glu Val Val Asn Tyr Ala Lys Gly

370 375 380

cn CCT nA GCC CTC AAA GTG TGG GGT
Leu 385	Pro Leu	Ala	Leu Lys 390	Val Trp Gly
nA ACT	GAA	TGG	AAA	AGT	GCT ATA GAG
Leu	Thr	Glu	Trp Lys	Ser Ala	Ile Glu
				405
TCT	GGA An	An	GAT AAG	CTC	AAA ATA
Ser	Gly	Ile	Ile	Asp	Lys	Leu	Lys	Ile
			420					425
AÁA	CAA	CAA	GAG	ATG	τη	nA	GAT ATA
Lys	Gin	Gin	Glu	Met	Phe	Leu	Asp	Ile
		435					440
GAA	AAA	GAT	TAC	ATC	CTA	CAA	ATC	cn
Glu	Lys Asp Tyr	Ile	Leu	Gin	Ile	Leu
	450					455
GAA TAC	GGG	nA	cgt An nA	An	GAC
Glu	Tyr Gly	Leu	Arg	Ile Leu	Ile	Asp
465				470
GAA	TAT AAT	CAG	cn	CAA ATG	CAT	GAC
Glu	Tyr	Asn	Gin	Val	Gin	Met	His	Asp
				485
TAT	ATA	GTG	AAT τη	CAA AAA	GAT	CCC
Tyr	Ile	Val	Asn	Phe	Gin	Lys Asp	Pro
			500					505
:tc	GCC	AAG	GAA	GTC	GAA	GAA	GTG	ATG
eu	Ala	Lys	Glu	Val	Glu	Glu	Val	Met
		515					520
l CA ATG	GAA	GCA An TGG	Gn	TCT	TCT
la	Met	Glu	Ala	Ile	Trp	Val	Seř	Ser
	530				535
1 C	AAT	CAG	GCC	GTG	AAA AAT ATG	AAA
lr	Asn	Gin	Ala	Val	Lys Asn	Met	Lys
15					550
1 1	AGG	TCG	TCG	ACA	CAT TAT	GCC ATC
1 /	Arg	Ser	Ser	Thr	His Tyr	Ala	Ile
			565
	TGT	τη	cn TGC	ACT AAC	TAT	CCT
	Cys	Phe	Val Cys	Thr Asn	Tyr Pro
			580					585

TCT	nG	CTG	CAT	AAC	CTA	CGA	1259
Ser	Leu	Leu	His	Asn	Leu	Arg
	395					400
CAC	ATG	AAA	AAT	AAC	TCT	TAT	1307
His	Met	Lys	Asn	Asn	Ser	Tyr
410					415
AGT	TAT	GAT	GGA	nA	GAG	CCC	1355
Ser	Tyr	Asp	Gly	Leu	Glu	Pro
				430
GCA	TGC	nc	ne	CGA	GGG	GAA	1403
Ala	Cys	Phe	Leu	Arg	Gly	Glu

445

GAG AGT TGT CAT An GGA GCT	1451
Glu	Ser	Cys 460	His	Ile Gly.Ala
AAA	TCT	cn	GTG	nc	ATC TCT	1499
Lys	Ser	Leu	Val	Phe	Ile Ser
475					480
nA	ATA	CAG	GAT	ATG	GGT AAA	1547
Leu	Ile	Gin	Asp	Met	Gly Lys
490					495
GGA	GAA	CGT	AGC	AGA nA TGG	1595
Gly	Glu	Arg	Ser	Arg Leu Trp
				510
AGC	AAC	AAC ACA	GGG ACC	ATG	1643
Ser	Asn	Asn Thr	Gly Thr	Met
			525
TAT TCT AGT ACT	CTA CGC	m	1691
Tyr	Ser	Ser	Thr	Leu Arg	Phe
		540
AGG	cn	AGG	GTA Tn AAC	ATG	1739
Arg	Leu	Arg	Val	Phe	Asn	Met
555				560.	·,·
GAT TAT	CTG	CCC	AAC	AAC	nG	1787
Asp Tyr	Leu	Pro	Asn	Asn	Leu
570					575
TGG	GAG	tca ητ	CCA TCT ACA	1835
Trp	Glu	Ser Phe	Pro Ser Thr
			590

WO 95/35024

PCT/US95/07754

TH GAA CTC AAA

ATG CTT GTT CAC CTC CAA CTC CGA CAC AAT TCT CTG

Phe Glu Leu

Lys

Met

Leu

Val His 600

Leu Gin

Leu Arg His 605

Asn Ser

Leu

595

CGT

CAT

TTA

TGG

ACA

GAA

ACA

AAG

AAG

AAG

AAC

AAT

AH

GCA

GAG

AAA

Arg

His

Leu

Trp

Thr

Glu

Thr

Lys

Lys

Lys

Asn

Asn

lle

Ala

Glu

Lys

610

615

620

GAG

GGA

GAT

GGA'

AH

CH AH

GAA TH

TGG

GGC

GAT

HA

CAA

TGG

GCA

Glu

Gly

Asp Gly

lle

Leu

lle

Glu

Phe

Trp

Gly Asp

Leu

Gin

TrD Ala

625

630

635

640

TH

GCC

GTC TCT

ACG

GAG

GAT

AGA

TCT

CAG

CTG GTC

TAAAAGAHG

Phe

Ala

Val

Ser

Thr

Glu

Asp Arg

Ser

Gin

Leu

Val

645

650

ACGCGAACAC

AGTAATCHG

HGAATGAH

CTGGGTCTAA

CCGGAGATAC

CAGTACAAAA

CCAAGCAGCA

CHGAAAGCT

GATACTCTAA

ATGTTTCGAG

CACTCATTGG

GAGAHGGAT

HGCCHCAA

AGGCHACAC

ATGGCTCTGA

CHGATGATG

ATCTCTTCCA

GGTCAACCGT

GTATCAGTCA

TGHACTCTC

VTGTCGCGCA

CAGATTTCAC

AAGAAGHCA

GTAAAAGCCT

GAAGHGCGA

AGATTCACAT

CTCATGHAC

TATGTAGGH

TGCCAGAAGA

TTTTACGACC

GCTTCAAA6A

AATATCTGAA

CCHATCCTC

GTATAGCCCA

AGCTACCAGA

AATHATCCA

CACACAATGA

TGAGGCATGA

ATCCTGAAAA

ATTTGCCTGA

GTAGCTTAAT

TGACCCAGAA

GGGGATGCCA

CCATTCCCTG

TAAGAGGHT

TAGTTTAGAG

GCAAGGCTCT

CAAGCTATTG

GAAAAGHTG

GATAGGGGAT

TCCGTCTTCC

TGGAGTGCAC

TCTCAGTTAC

HTGAAAAAG

ACHGGTGCT

ACHCCCCCA

TTATTTAGŤA

TACTATGTAC

CATCTCTGCT

GATCCCGAGT

AAAHGGTAT

TGACACAACA

ACHGCCHA

AATTTGGAST

GGATGHGCA

CCATGTGHA

AAATTGCCAG

GGGATAAGGG

HGTGGAATA

GTTAGTCTGA

HAGACAACT

ATCATACGCT

THGAGTTCC

TGCAATCTAA

HGGATCTCA

CTTCAATCCT

GAAHAAATG

ACAAAGAGAA

AATHGHTG

TCAGATTCCT

TGGTTCCACC

ATACCTGATA

GCTCACHGA

TCAGAATGTG

ATGTGAATTT

GCAAAGTCAT

ACGTGGAATC

AAATCTACGG

AACTACCATC

TGAAAAACCT

GTGTGTCGGG

TACGGGT6TT

TGAACAAACT

CTCCTGTGGC

TAGATGGAGG

GTA6AAATAA

TAGACHAAA

AAHGCATGT

AGAAACTACA

CATATACCAT

TGTCACTAAC

ATCAGGGTTG

AATTCTTGGG

HCCCGTATG

ATACAGAATC

GTATCAATGT

TGGTTTATAT

TCHGAATAT

GAGAATGAAG

ATCTATTTTT

TGTAGCTCn

HGCTCAAAA

TGATGCCAGT

TATAATCTTG

TGAAGGAHA

ACTTCCG6AA

TTHGAGCAT

AGAHGCCAG •AGAHGTCAT

TAGAGTGAAA

GTTTCAGAAT

AGTATHACC

GGATAGTAGT

ATTTGCTGTA

TGATGACAAG

ATCCAACTAT

1883

1931

1979

2025

2085

2145 .2205

2265

2325

2385

2445

2505

2565

2625

2685

2745

2805

2865

2925

2985

3045

3105

3165

3225

3285

WO 95/35024

PCT/US95/07754

TCAGAATGGG ATATACATTT TTT C TTT GTA CCTTTTGCTG GCTTATGGGA TACATCTAAG GCAAATGGAA AAACACCAAA TGATTATGGG ATTATTAGGC TATCTTTTTC TGGAGAAGAG AAGATGTATG GACTTCGTTT GTTGTATAAA GAAGGACCAG AGGTTAAT6C CTTGTTACAA ATGAGGGAAA ATAGCAATGA ACCAACAGAA CATTCCACTG GGATAAGGAG GACTCAATAT AACAACAGAA CTTCCTTTTA TGAGCTCATC AATGGGTGAT GTACATATCA ACAAC6AGTT TTAAAG6ATT CCAACAAGTA TAACTTTTTA TGCTCAAATC AGCTCCTTGT ATTGTGGAGA ÁAGCTGAGTA CGAGATGAAG TTGACGTCCG TTATCCTTTA TGATCTCTCT GTTCTTTGTG TTAACTTGCC TACTTCATCA GATGAATAAC AGAAGCCCGT TCCTCTCATT CTCAACACTG

TTTGCACGTC TGTTGTTACT TGnAAAATG GATCTTGATA AAGTAATAAC ATCTCTATAT

3345

3405

3465

3525

3585

3645

3705

3765

3825

TÁCU

3830

WO 95/35024

PCT/US95/07754 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:6:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 652 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:6:

Met Ala Ser Ser Ser Ser Ser

Ser Arg Trp 10

Ser Tyr Asp Val

Phe 15

Leu

1

5

Ser

Phe

Arg Gly

Glu

Asp

Thr

Arg Lys

Thr

Phe

Thr

Ser His

Leu

Tyr

20

25

30

Glu

Val

Leu

Asn

Asp

Lys

Gly

Ile

Lys

Thr

Phe

Gin

Asp Asp

Lys

Arg

35

40

45

Leu

Glu

Tyr Gly Ala

Thr

Ile

Pro

Gly

Glu

Leu

Cys

Lys Ala

Ile

Glu

50

55

60

Glu

Ser

Gin

Phe

Ala

Ile

Val

Val

Phe

Ser

Glu

Asn

Tyr Ala

Thr

Ser

. 65

70

75

80

Arg Trp

Cys

Leu

Asn

Glu

Leu

Val

Lys

Ile

Met

Glu

Cys Lys

Thr

Arg

85

90

95

Phe

Lys

Gin

Thr

Val

Ile

Pro

Ile

Phe

Tyr Asp

Val

Asp Pro

Ser

His

100

105

110

Val

Arg

Asn

Gin

Lys

Glu

Ser

Phe

Ala

Lys

Ala

Phe

Glu Glu

His

Glu

115

120

125

Thr

Lys Tyr Lys Asp Asp

Val

Glu

Gly

Ile

Gin

Arg Trp Arg

Ile

Ala

130

135

140

Leu

Asn

Glu

Ala Ala

Asn

Leu

Lys Gly

Ser

Cys Asp

Asn Arg Asp Lys

145

150

155

-

160

Thr

Asp

Ala

Asp Cys

Ile

Arg

Gin

Ile

Val

Asp

Gin

Ile Ser Ser Lys

165

170

175

Leu

Cys

Lys

Ile

Ser

Leu

Ser

Tyr- Leu

Gin

Asn

Ile

Val Gly Ile Asp

180

185

190

Thr

His

Leu

Glu

Lys

Ile

Glu

Ser Leu

Leu

Glu

Ile

Gly Ile Asn Gly

195

200

205

Val

Arg

Ile

Met

Gly

Ile

Trp

Gly Met Gly Gly

Val

Gly Lys

Thr Thr

210

215

220

Ile

Ala

Arg

Ala

Ile

Phe Asp

Thr

Leu Leu Gly Arg Met Asp

Ser

Ser

225

230

235

240

Tyr Gin Phe Asp Gly Ala Cys Phe Leu Lys Asp Ile Lys Glu Asn Lys 245 250 255

WO 95/35024

PCT/US95/07754

Gly

Arg Ser Ser Thr 565

His

Tyr

Ala Ile Asp Tyr Leu Pro Asn Asn Leu

570

575

Arg Cys

Phe

Val

Cys

Thr

Asn

Tyr

Pro

Trp

Glu

Ser

Phe

Pro

Ser

Thr

580

585

590

Phe

Glu

Leu

Lys

Het

Leu

Val

His

Leu

Gin

Leu

Arg

His

Asn

Ser

Leu

595

600

605

Arg

His

Leu

Trp

Thr

Glu

Thr

Lys Lys Lys

Asn

Asn

Ile Ala

Glu

Lys

610

615

620

Glu

Gly Asp Gly

Ile

Leu

Ile

Glu

Phe Trp Gly Asp

Leu Gin

Trp Ala

625

630

635

640

Phe

Ala

Val

Ser

Thr

Glu

Asp Arg

Ser Gin

Leu

Val

645

650

PI .rrr ,n, „ r

Claims (31)

1. Izolovaná a purifikovaná molekula nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci kódující protein N genu vybraná ze skupiny sestávající z:

(a) nukleotidové sekvence kódující protein N genu jak je daná SEQ ID NO:3 od nukleotidu 60 do nuklotidu 3494, (b) nukleotidové sekvence kódující protein N genu s aminokyselinovou sekvencí jak je daná SEQ ID N0:4.

(c) DNA sekvence se 70% homologií nuklotidové sekvence se SEQ ID NO:3 od asi nukleotidu 60 až do nuklotidu 3494, a kde zmíněný kódovaný protein N genu má za funkci zprostředkování resistence na virus tabákové mozaiky v rostlinách syntetizujících zmíněný protein N genu.

(d) nukleotidové sekvence kódující protein N genu jak je daná SEQ ID N0:l od nukleotidu 1 do nuklotidu 7400, a (e) DNA sekvence se 70% homologií nuklotidové sekvence se SEQ ID NO:1 od asi nukleotidu 1 až do nuklotidu 7400, a kde zmíněný kódovaný protein N genu má za funkci zprostředkování resistence na virus tabákové mozaiky v rostlinách syntetizujících zmíněný protein N genu.

2. Molekulu nukleové kyseliny nároku 1, kde zmíněná nukleotidové sekvence kóduje protein N genu s aminokyselinovou sekvencí jak je dána SEQ ID N0:4.

3. Molekulu nukleové kyseliny nároku 2, kde zmíněná nukleotidové sekvence kóduje protein N genu je dána SEQ ID NO:4 od nukleotidu 60 do nukleotidu 3494.

4. Přirozeně se nevyskytující molekulu nukleové kyseliny obsahující část nukleové kyseliny, která kóduje protein N genu , kde zmíněný N gen je odvozen od rostlin rodiny Solanaceae a zmíněná část kódující protein N genu a zmíněná část má alespoň 70% homologií nuklotidové sekvence se SEQ ID NO:3 od asi nuklotidu 60 do nuklotidu 3494 a kde zmíněný protein N genu má za funkci zprostředkování resistence na virus tabákové mozaiky v rostlinách syntetizujících zmíněný protein N genu.

5. Přirozeně se nevyskytující molekulu nukleové kyseliny nároku 4, kde je zmíněná část kódující N gen odvozena od rostlin rodu Nicotiana.

6. Přirozeně se nevyskytující molekulu nukleové kyseliny nároku 5, kde je zmíněná část kódující N gen odvozena od rostlin druhu Nicotiana glutinosa.

7. Přirozeně se nevyskytující molekulu nukleové kyseliny nároku 6, kde zmíněná část kódující protein N genu má aminokyselinovou sekvenci jak je dána SEQ ID N0:4.

8. Přirozeně se nevyskytující molekulu nukleové kyseliny nároku 4, kde zmíněná část kódující protein N genu má nukleotidovou sekvenci jak je dána SEQ ID NO:3 od nukleotidu 60 do nukleotidu 3494 a kde zmíněný protein N genu má za funkci zprostředkování resistence na virus tabákové mozaiky v rostlinách syntetizujících zmíněný protein N genu.

9. Přirozeně se nevyskytující molekulu nukleové kyseliny zahrnující část nukleové kyseliny, která kóduje protein N genu, kde zmíněný N gen je odvozen od rostlin rodiny Solanaceae a zmíněná část kóduje protein N genu a zmíněná část má alespoň 70% homologii nukleotidové sekvence se SEQ ID N0:l od asi nukleotidu 1 do nukleotidu 7400 a kde zmíněný protein

N genu má za funkci zprostředkování resistence na virus tabákové mozaiky v rostlinách syntetizujících zmíněný protein N genu.

10. Transgení rostlina rodiny Solanaceae, která byla zpracována genetickým inženýrstvým tak, aby obsahovala a exprivovala nukleokyselinový konstrukt obsahující nukleotidovou sekvenci kódující protein N genu, kde zmíněná nukleotidová sekvence kódující protein N genu je odvozena od rostlin rodiny Solanaceae, a zmíněná N gen kódující sekvence má alespoň 70% homologii nukleotidové sekvence se SEQ ID NO:3 od asi nukleotidu 60 do nukleotidu 3494 a kde je zmíněná rostlina učiněna resistentní na vius tabákové mozaiky cestou exprese zmíněné nukleotidové sekvence kódující zmíněný protein N genu.

11. Transgení rostlina nároku 10, kde je zmíněná N gen kódující část odvozena od rostlin rodu Nicotiana.

12. Transgení rostlina nároku 11, kde je zmíněná N gen kódující část odvozena od rostliny druhu Nicotiana glutinosa.

13. Transgení rostlina nároku 10, kde je zmíněná část kódující protein N genu má aminokyselinovou sekvenci jak je dána SEQ ID N0:4.

14. Transgení rostlina nároku 10, kde je zmíněná část kódující protein N genu má nukleotidovou sekvenci jak je dána SEQ ID NO:3 od nukleotidu 60 do nukleotidu 3494.

15. Transgení rostlina nároku 10, kde je zmíněná rostlina členem rodu Capsicum.

16. Transgení rostlina nároku 10, kde je zmíněná rostlina rodu Lysopersicon.

17. Transgení rostlina nároku 16, kde je zmíněná rostlina druhu Lysopersicon esculentum.

18. Transgení rostlina nároku 10, kde je zmíněná rostlina rodu Nicotiana.

19. Transgení rostlina nároku 10, kde je zmíněná rostlina druhu Nicotiana tabacum.

20. Transgení rostlina nároku 10, kde je zmíněná rostlina druhu Nicotiana glutinosa.

21. Transgení rostlina rodiny Solanaceae, která byla zpracována genetickým inženýrstvým tak, aby obsahovala a exprivovala N gen, kde zmíněný N gen má nukleotidovou sekvenci jak je dána SEQ ID NO:1.

22. Transgení rostlina rodiny Solanaceae, která byla zpracována genetickým inženýrstvým tak, aby obsahovala a exprivovala N protein kódující sekvenci jak je dána SEQ ID NO:3, kde zmíněná transgení rostlina byla dále zpracována genetickým inženýrstvím tak, aby obsahovala a exprivovala N odvozenou sekvenci jak je dána SEQ ID NO:5.

23. Metoda užití nukleové molekuly obsahující část nukleové kyseliny , která kóduje protein N genu , kde je zmíněná protein N genu kódující část odvozena od rostliny rodiny Solanaceae a zmíněná protein N genu kódující část má alespoň 70% homologii nukleotidové sekvence se SEQ ID NO:3 od asi nukleotidu 60 do nukleotidu 3494 a kde zmíněný protein

N genu má za funkci zprostředkování resistence na virus tabákové mozaiky v rostlinách syntetizujících zmíněný protein N genu a učinit tak transgení rostliny obsahující a exprivující zmíněný protein N genu resistentní na virus tabákové mozaiky , kde zmíněná metoda obsahuje kroky:

(a) zpracování rostlině tkáně genetickým inženýrstvím tak, aby obsahovala a exprivovala protein N genu kódující sekvenci, a (b) regeneraci rostlině tkáně zpracované genetickým inženýrstvím kroku (a) tak, aby vytvořila rostlinu, která obsahuje a exprivuje zmíněnou sekvenci a je tak učiněna resistentní na virus tabákové mozaiky.

24. Metodu nároku 23, kde zmíněná část kódující N gen je odvozena od rostlin rodu Nicotiana.

25. Metodu nároku 24, kde zmíněná část kódující N gen je odvozena od rostlin druhu Nicotiana glutinosa.

26. Metodu nároku 25, kde zmíněná část kódující protein N genu má aminokyselinovou sekvenci jak je dána SEQ ID NO:4.

27. Metodu nároku 26, kde zmíněná část kódující protein N genu má nukleotidovou sekvenci jak je dána SEQ ID NO:3 od nukleotidu 60 do nukleotidu 3494.

28. Metodu nároku 25, kde zmíněná část kódující protein N genu má aminokyselinovou sekvenci jak je dána SEQ ID NO:6.

29.Metodu nároku 28, kde zmíněná část kódující protein N genu má nukleotidovou sekvenci jak je dána SEQ ID NO:5 od nukleotidu 60 do nukleotidu 2018.

30..Metoda užití nukleové molekuly obsahující část nukleové kyseliny , která kóduje protein N genu , kde zmíněná část je dána SEQ ID NO:1 má za funkci zprostředkování resistence na virus tabákové mozaiky v rostlinách syntetizujících zmíněný protein N genu a učinit tak transgení rostliny obsahující a exprivující zmíněný protein N genu resistentní na virus tabákové mozaiky , kde zmíněná metoda obsahuje kroky:

(a) zpracování rostlině tkáně genetickým inženýrstvím tak, aby obsahovala a exprivovala protein N genu kódující sekvenci, a (b) regeneraci rostlině tkáně zpracované genetickým inženýrstvím kroku (a) tak, aby vytvořila rostlinu, která obsahuje a exprivuje zmíněnou sekvenci a je tak učiněna resistentní na virus tabákové mozaiky.

31.Metodu užití nukleové molekuly obsahující první část nukleové kyseliny, která kóduje protein N genu, kde zmíněná protein N genu kódující část má nukleotidovou sekvenci danou SEQ ID NO:3 od nukleotidu 60 do nukleotidu 3494 a druhá část nukleové kyseliny má nukleotidovou sekvenci danou SEQ ID NO:5, kde jsou zmíněné první a druhé části nukleové kyseliny exprivovány v rostlině tkáni , kde zmíněná metoda obsahuje kroky:

(a) zpracování rostlině tkáně genetickým inženýrstvím tak, aby obsahovala a exprivovala zmíněnou první a druhou část nukleové kyseliny a (b) regeneraci zmíněné rostlině tkáně tak, aby vytvořila rostlinu, která obsahuje a exprivuje zmíněnou první a druhou část nukleové kyseliny a je tak učiněna resistentní na virus tabákové mozaiky.