HUT76529A - Plant virus resistance gene and methods for use thereof - Google Patents

Description

A találmány tárgyát olyan anyagok és eljárások képezik, amelyek növénypatogének hatékonyabb leküzdésére alkalmasak. Közelebbről, a találmány tárgyát N-gén-proteint kódoló nukleinsav-szekvenciák, az ilyen nukleinsavszekvenciákat tartalmazó rekombináns polinukleotid-molekulák, valamint ezek - elsősorban Solanaceae családba tartozó növények dohány-mozaikvírussal szembeni rezisztencia kialakítása érdekében végrehajtott transzformálására történő alkalmazási eljárásai képezik. A találmány tárgyát képezik továbbá az N-gén-proteint kódoló nukleotidszekvenciákat tartalmazó nukleinsav-konstrukciókkal transzformált transzgenikus növények.

A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható a Solanaceae családba tartozó növények dohány-mozaikvírussal szembeni rezisztenciájának kialakítására.

A termés hozamának és minőségének legfőbb veszteségei a terménynövények - növénypatogének (vírusok, baktériumok és gombák) fertőzése által okozott - betegségeinek tudhatok be. A dohány-mozaikvírus (TMV) gazdasági jelentőségű növényeket fertőz meg, köztük a dohányt és a vele rokon nöAktaszámunk: 85003-8245/PÁ • · · · ·

vényeket (paradicsomot, paprikát). Bár a dohány-mozaikvirus nem okoz letális fertőzést, csökkenti a növények növekedését és termőképességét. A viruspatogén két fázisban terjed szét a növényben. Az első fázisban a fertőzés ott következik be, ahol a vírus bejut a gazdanövény sejtjeibe, majd a második fázisban (vírusreplikáció) a vírus elszaporodik a növény sejtjeiben.

A növények a patogének támadásával szemben számos természetes rezisztenciát biztosító - mechanizmust fejlesztettek ki. Ezek közé az előre kialakított - strukturális és kémiai - gátló mechanizmusok, valamint az aktív rezisztencia-mechanizmusok tartoznak. A növények számos patogénnel szembeni betegségrezisztenciáját a növényben és a patogénben meglévő komplementer gének szabályozzák. A növény ilyen génjeit rezisztenciagéneknek, míg a patogén génjeit avirulenciagéneknek nevezzük. Azok a növények, amelyek rezisztenciagént hordoznak, hatásos védelemben részesülnek a megfelelő avirulenciagént hordozó patogén okozta betegséggel szemben.

A dohány domináns N-lókusza rezisztenciát biztosít a dohány-mozaikvírussal szemben; a vírusfertőzés helyén lokalizált hiperszenzitív reakciót (HR) közvetít, a fertőzés helye körül lévő sejtekben, illetve a növény egyéb részeiben pedig szisztémás szerzett rezisztencia (systemic acquired resistance; SÁR) reakciót indukál·. Az N-lókuszra heterozigóta vagy homozigóta dohánynövények rezisztensek a dohány-mozaikvírus okozta betegséggel szemben. A hiperszenzitív reakció olyan komplex, aktív rezisztenciareakció, amely a növényben a patogén támadásának hatására indukálódik, azután, hogy az előre kialakított mechanizmusok kudarcot vallottak [ Keen és mtsai.: Biotechnology in

Plánt Disease Control, Wiley-Liss, Inc. 65-88. old.

(1993)] . A hiperszenzitív reakcióra jellemző, hogy a patogén behatolásának helyén sejtpusztulás (nekrózis) következik be. Bár a sejtpusztulás önmagában nem eredményezhet rezisztenciát egy behatoló patogénnel szemben, az antimikrobiális vegyületek és-a szisztémás szerzett rezisztencia-reakcióra jellemző - patogenezissel kapcsolatos proteinek nekrózissal együtt járó szintézise, valamint a strukturális gátak kialakulása összességében központi szerepet játszik a patogén elterjedésének megakadályozásában.

Az olyan növény-patogén kölcsönhatást, amely rezisztenciát eredményez, inkompatibilisnek, a betegséget eredményezőt pedig kompatibilisnek nevezzük.

Vizsgálatokat végeztek annak meghatározására, hogy a betegségrezisztencia-géneket hordozó növények milyen mechanizmus alapján ismerik fel a behatoló patogén jelenlétét, és hogyan indukálják a hiperszenzitív, illetve a szisztémás szerzett rezisztencia-reakciót. Sok esetben a hiperszenzitív reakciót az inkompatibilis növény és patogén közötti gén-gén kölcsönhatások irányítják. A Flór által feltételezett génmodell [Flór: Journal of Agricultural Research 7 4, 241 (1947)] azt sugallja, hogy a betegségrezisztencia és a patogén avirulenciája (kiváltójel termelődése) domináns sajátságok. Ilyenformán, a rezisztencia csak akkor következik be, ha a növény a specifikus rezisztenciatt ··· · · ·· gént (R-gént), a patogén pedig az annak megfelelő avirulenciagént (Avr-gént) hordozza. Baktériumokból, gombákból· és vírusokból számos Avr-gént klónoztak [ ld. Gábriel és Rolfe: Annual Rév. Phytopathology 2 8, 365 (1990); és

Keen: Annual Rév. Génét. 2 4, 447 (1990)] , és néhány esetben meghatározták a kiváltómolekula természetét [ ld. Keen:

Plánt Molecular Biology 19, 109 (1990)] . Leírták a kukorica

HM1 elnevezésű gombarezisztencia-génjét [ Johal és Briggs:

Science 258, 985 (1992)] és a paradicsom Pto elnevezésű baktériumrezisztencia-génjét [G. Martin és mtsai.: Science 262, 1432 (1993)] . Növényekből eddig természetes vírusrezisztencia-gént nem izoláltak, illetve nem klónoztak.

Az R-gének és a nekik megfelelő Avr-gének közötti egyszerű genetikai kapcsolat az R-géntermékek hatásmechanizmusának elemzéséhez vezetett. Az egyik modell szerint az R-gének - a patogéneket felismerni képes és rezisztenciát eredményező színgáltranszdukciós kaszkádokat beindító - jelölési (signaling) reakcióutakban játszanak szerepet [Lamb: Cell 7 6, 419 (1994)] . A második modell szerint az Rgéntermékek transzmembrán ioncsatornákat képeznek, amelyek - a sejtben lezajló egyéb eseményektől függetlenül - sejtpusztulást közvetítenek. A paradicsom - Pseudomonas syringae pathovar. tomato patogén ellen rezisztenciát biztosító - Pto-génjének klónozása [Martin és mtsai.: Science 2 62, 1432 (1993)] azt sugallja, hogy legalább az első modell működhet a növényi sejtekben. A Pto-gén szekvenciaanalízise azt mutatja, hogy szerin/treonin-kinázt kódol. Feltételezzük, hogy ez a szerin/treonin-krnáz köz-

vétlenül vagy közvetve - kölcsönhatásba lép a kiváltómolekulával, majd a rezisztenciareakció egy későbbi modulátorát foszforilálja, s így szignáltranszdukciós kaszkádot indít be.

A növények hiperszenzitív rezisztenciareakciói és az állatok veleszületett immunreakciói között hasonlóságokat fedeztek fel . E reakciók közös motívuma a reaktív oxigénvegyületek és -ionok (reactive oxygen species; ROS) gyors termelődése, ami oxidatív burst néven ismeretes. Az ilyen ROS-ok példái közé tartozik a szuperoxid-anion (0₂ ) és a hidrogén-peroxid (H₂O₂) . E molekulák közvetlen antimikrobiális hatásokat és egyéb védő hatásokat (pl. a növényi sejtfalban lévő strukturális proteinek keresztkötésképzése) fejthetnek ki. Lényeges, hogy a ROS-ok állatokban és növényekben képesek aktiválni a védelemmel kapcsolatos géneket [ Schreck és Bauerle: Trends in Cell Biology 1, 39 (1991); Chen és mtsai.: Science 262, 1883 (1993)] . Emlősökben a ROS-ok jelentős szerepet játszanak a citokinek [pl. a tumornekrózis-faktor (TNF) és interleukin-1 (IL-1)] másodlagos hírvivőiként egy olyan reakcióútban, amelyben az NF-kB transzkripciós faktor irányítja az immunglobulinok, interleukinek és más proteinek expresszióját. Az NF-kB-vel homológ Drosophila transzkripciós faktor (Dif) szintén aktiválja az antimikrobiális proteinek (pl. cerkopinek, attacinok, defenzinek és lizozimok) transzkripcióját [ Levine és Hultmark: Trends in Genetics 9, 178 (1993)] . Növényekben a párhuzamot a patogenezissel kapcsolatos proteinek (Pathogenesis Related Proteins) indukálása és a · · · · antimikrobiális vegyületek (pl. fitoalexinek) szintézise jelenti, melyek hidrogén-peroxid külsőleg történő alkalmazásával indukálhatok.

A növények rezisztenciareakciói tanulmányozására alkalmas, jelentős modell az N-rezisztenciagén-modell. A Nlókusz egyetlen domináns génből áll, amely a dohánymozaikvírus fertőzésének hatására nekrózis típusú reakció és szisztémás szerzett rezisztenciareakció indukcióját közvetíti [ Holmes: Phytopathology 28, 553 (1938)] . Ezt a lókuszt eredetileg Nicotiana glutinosa-ban azonosították, majd bevitték N. tabacum-ba. Az N-gén olyan hiperszenzitív reakciót közvetít, amelyre helyi léziók jellemzők, amelyekben dohány-mozaikvírus lokalizálható (ld. 1/A ábra). A dohány - N-gént nem tartalmazó - kultúrnövény-változataiban a dohány-mozaikvírus szisztémásán szétterjed, és az ilyen fertőzött növényekben kialakulnak a mozaikos tünetek, ami a levélen váltakozó világoszöld és sötétzöld területek képében jelenik meg (ld. 1/B ábra).

A rekombináns DNS-technika lehetőséget kínál patogénnel szembeni rezisztencia kialakítása céljából patogénrezisztencia-génnel transzformált növények előállítására. E megoldás megvalósíthatóságát eddig a növények klónozott, természetes rezisztenciagénjeinek hiánya, valamint a rezisztencia mechanisztikus alapja ismeretének hiánya akadályozta. A klónozott rezisztenciagének - egészen a legutóbbi időkig - nem álltak rendelkezésre, mivel növények esetében hiányoztak az olyan gének izolálási technikái, amely gének (illetve termékeik) természetéről nem voltak

megfelelő ismeretek. A utóbbi években két - növények esetében alkalmazható - génizolálási technikát fejlesztettek ki, melyek alkalmazhatósága nem függ a génről vagy az általa kódolt proteinről rendelkezésre álló ismeretektől. E két technika a pozicionális klónozás (positional cloning) és a transzpozonjelölés (transposon tagging) [ Baker, Schell,

Federoff: Proceedings of National Academy of Science, USA

83, 4844 (1986)] .

A találmány tárgyát izolált és tisztított DNSszekvenciák képezik, amelyek N-gén-proteint kódolnak, mely proteinnek az a funkciója, hogy - N-gén-proteint szintetizáló növényben - dohány-mozaikvirussal szemben rezisztenciát közvetítsen. Szintén a találmány tárgyát képezik a példaként említett aminosav-szekvenciát tartalmazó N-génproteint kódoló DNS-szekvenciák. Szintén a tárgyát képezik azok a DNS-szekvenciák, amelyek - standard körülmények között - specifikusan egy N-gén kódolószekvenciájához vagy annak komplementeréhez hibridizálódnak, és amelyek olyan Ngén-proteineket kódolnak, amelyeknek az a funkciójuk, hogy dohány-mozaikvirussal szemben rezisztenciát közvetítsenek.

A találmány tárgyát képezik továbbá az olyan nukleinsav-molekulák, amelyek N-gén-proteint kódoló szekvenciát tartalmaznak. Az ilyen molekulák közét tartoznak, például, a rekombináns vektorok (mint pl. klónozó, expressziós, illetve transzformáló vektorok), amelyek N-gén-proteint kódoló DNS-szekvenciát tartalmaznak.

A találmány tárgyát képezik továbbá azok a sejtek, amelyek a találmány szerinti vektorokkal vagy DNSszekvenciákkal vannak transzformálva.

A találmány tárgyát képezik továbbá az olyan növények vagy növényi sejtek, amelyek - dohány-mozaikvírussal szembeni rezisztencia kialakítása érdekében - N-gén kódolószekvenciájával vannak transzformálva.

Szintén a találmány tárgyát képezik az olyan oligonukleotid-próbák, amelyek a Solanacea családba tartozó növényekben N-gén (vagy funkcionális megfelelője) detektálására alkalmasak. A találmány tárgyát képezik továbbá az ilyen próbák - N-gént vagy funkcionális megfelelőjét tartalmazó - DNS-szekvenciák izolálására történő alkalmazása.

A találmány szerinti próbákhoz specifikusan hibridizálódó DNS-szekvenciák, melyek funkcionális N-gén-proteint kódolnak, szintén a találmány tárgyát képezik.

Az N-gén szekvenciáinak alkalmazása homológ gének egymással rokon és nem rokon - gazdanövényekből történő izolálását teszi lehetővé, miáltal olyan gének nyerhetők, amelyek a gazdanövényeket megvédik az egymással rokon és nem rokon patogénektől.

E felismerés alapján célul tűztük ki olyan génkonstrukciók előállítását, amelyek N-gén-proteint kódoló DNS-szekvenciát tartalmaznak, mely proteinnek az a funkciója, hogy - N-gén-proteint szintetizáló növényben - dohánymozaikví russal szemben rezisztenciát közvetítsen.

Célul tűztük ki továbbá, hogy - N-génkonstrukciókat tartalmazó - transzformáló vektorokat állítsunk elő, amelyek hatásosan alkalmazhatók az N-génkonstrukció növénybe történő bejuttatására.

• ··· ··· · · · • · · · ···· · • · · ·· ··· · ····

- 9 További célként azt tűztük ki, hogy olyan transzgenikus növényeket állítsunk elő, amelyek rezisztenciája az N-génkonstrukció expresszáltatásának eredménye.

A találmány egyéb céljait és előnyeit a következő leírásban ismertetjük.

A következőkben az ábrák rövid leírását mutatjuk be .

Az 1 . ábrán a dohánynövények leveleinek - dohánymozaikvírussal végzett fertőzés utáni - fenotípusát mutatjuk be. Az 1/A ábrán funkcionális N-gént hordozó növény levele látható. Az 1/B ábrán dohány-mozaikvírusra érzékeny növény levelét mutatjuk be. Az 1/C ábrán olyan növény levele látható, amely dohány-mozaikvírusra érzékeny háttéren (szektoros fenotípus) nekrózisos területeket mutat. Az 1/D ábrán - a pTG38-T-DNS-konstrukcióval transzformált - dohány-mozaikvírusra érzékeny SRl-dohánynövényről származó levél látható.

A 2/A-2/C ábrákon az Nt-l-próba (RFLP-marker), illetve az Ac-próba Dili-populációból származó DNS-hez történő hibridizációjának Southern-blot-analízésének eredményeit mutatjuk be. A 2/A ábrán az Nt-l-próba Nicotiana glutinosa-ból, N. tomentosiformis-ból és N. sylvestris-ből izolált genomi DNS-hez történő hibridizálásának eredményei láthatók. A 2/B ábrán az Nt-l-próba olyan visszakeresztezett utódokból származó genomi DNS-hez történő hibridizálásának eredményei láthatók, melyek az Nt-IG (N-kötött) RFLPmarker szegregálódását mutatják. A 2/C ábrán 5'-Ac-próba előbbivel azonos genomi DNS-hez történő - hibridizálásának • · · « · · · « · * · « <· · · · e eredményeit mutatjuk be.

A 3/A ábrán a vad típusú N-gén egy részletének, valamint az Ac-inszercióval mutagenizált N-gén egy részletének restrikciós térképét mutatjuk be. A 3/B és 3/C ábrán a szülői Nicotíana fajokból; az Ac-transzpozonnal mutagenizált növényekből; szektoros növényekből; a vad típusú N-génben Ac-inszerciót hordozó mutánsokból; illetve csírasejt szinten a vad típushoz visszatérő növényekből (germinal revertants) izolált DNS-ek Southern-blothibridizációs analízisének eredményeit mutatjuk be. A 3/B ábrán az N-5 N-gén próba kiválasztott növényi DNS-ekhez történő hibridizálásának eredményei, a 3/C ábrán pedig az Ac-próba kiválasztott növényi DNS-ekhez történő hibridizálásának eredményei láthatók.

A 4/A és 4/B ábrán az N-gén szerveződését mutatjuk be. A 4/A ábrán az N-gén szerveződését az intronok és exonok egymáshoz viszonyított helye alapján szemléltetjük, míg a 4/B ábrán három genomi klón (melyek mindegyike teljes hosszúságú N-gént tartalmaz) restrikciós térképe látható. Ezeket a térképeket a C7, C16 és C18 cDNS-klónok és a G38 genomi klón szekvenciaanalízise, valamint a három genomi klón restrikciós analízise alapján állítottuk elő. A Cl cDNS (melyet nem ábrázoltunk) azonos a Cl8-cDNS-sel, azzal a különbséggel, hogy a Cl tartalmaz intron-II-t, és úgy véljük, hogy egy részlegesen feldolgozott üzenetet képvisel. A C18-klón 5' -végén 753 bázispár hiányzik. A Cl és C18 együtt egy 3432 bázispáros nyitott leolvasási keretet határoz meg, amely 1144 aminosavas polipeptidet kódol. A C16 • * * * • ♦ · • 4 · « « · · » ·«· 4 Μ 0 · (- · · · «···» · » · 9 9 · · 4 * » »· ·

- 11 a leolvasási keretet megváltoztató 70 bp-os alternatív exon beépülésének következtében - 652 aminosavas proteint kódol. Mindhárom cDNS-klón 3'-vége azonos, de az 5'-végen csak a C7 és a C16 egyezik meg. A 4/B ábrán látható genomi kiónokat EcoRI-gyel (Ε) , BamHI-gyel (B) és Xhol-gyel (X) emésztettük. X* azt jelzi, hogy az adott Xhol-hely a λ-Gem11 klónozóvektor polilinkerében található.

Az 5. ábrán a dohány-mozaikvírus-fertőzés hatására bekövetkező, N-protein-közvetítette szignáltranszdukció modelljét mutatjuk be.

Úgy véljük, hogy növényekben a domináns betegségrezisztencia-gének olyan proteineket kódolnak, amelyek adott patogéneket vagy patogén-rasszokat ismernek fel, és szignáltranszdukciós kaszkádot indítanak be, ami a betegségrezisztencia megnyilvánulását eredményezi. A dohánymozaikvírus mechanikai sérülésen keresztül hatol be a növényi szövet sejtjeibe. Nem tudjuk, hogy a dohány-mozaikvírus a sejtbe történő behatolás után hogyan oszlik el, és hogyan lokalizálódik. Az N-proteint tartalmazó dohánynövényekben az N-protein feltehetően - közvetlenül vagy közvetve - kölcsönhatásba lép a dohány-mozaikvírus bizonyos komponensével. A dohány-mozaikvírus e komponense még nincs egyértelműen azonosítva, de úgy tartjuk, hogy a replikáz betöltheti ezt a szerepet [ Padgett és Beachy: Plánt Cell 5, 577 (1993)] . A dohány-mozaikvírus felismerésekor az N-protein beindítja a rezisztenciareakciót, ami lokális léziók kialakulását, valamint - távolabbi helyeken - szisztémás szerzett rezisztencia indukálását eredményezi.

* *·«««>· 99

9 *> · · * * · * * · ·« · • « » » «··* · • · · 9 · · ·· t 9 1 99

- 12 Találmányunk leírásában elsőként tárjuk fel a

Nicotiana nemzetség N-génjének klónozását, szekvenálását, valamint a transzgenikus dohány-mozaikvírus-rezisztens növények előállítását.

Ahogy a leírásban használjuk, az N-gén-protein kifejezés olyan proteinre vonatkozik, amely - N-génproteint szintetizáló növényben - dohány-mozaikvírussal szembeni rezisztencia közvetítésére képes. Az N-gén olyan genomszekvenciákat foglal magában, amelyek N-gén-proteint kódolnak, és a kódolószekvencia transzkripcióját és transzlációját irányítják. Az egyik - példaként említett - Ngéntermék kikövetkeztetett molekulatömege kb. 131 kD (e géntermék kikövetkeztetett aminosav-szekvenciáját a 4. azonosítószámú szekvenciában és a 7/A táblázatban mutatjuk be. A példaként említett genomi DNS-szekvenciát (amely magában foglalja az említett N-géntermék kódolószekvenciáját) a szekvencialista 1. azonosítószámú szekvenciájaként mutatjuk be. A 3. azonosítószámú szekvenciaként egy teljes hoszszúságú (C18-klónból származó) cDNS-szekvenciát, az 5.

azonosítószámú szekvenciaként pedig egy rövidített (C16klónból származó) cDNS-szekvenciát mutatunk be.

Mivel a genetikai kód degenerált, szakember számára nem okoz gondot az olyan egyenértékű kódolószekvenciák meghatározása, amelyek egy vagy több kodonszubsztitúciót tartalmaznak. Az ilyen egyenértékű kódolószekvenciák különböznek a példaként említett kódolószekvenciáktól, de ugyanolyan aminosav-szekvenciákat tartalmazó proteineket kódolnak, mint az utóbbiak.

• · · · · • · • · · · · · · • ··· ··· ·· · • · · ····· · ··· ·· β·· · · · · ·

- 13 A dohány-mozaikvírussal szemben rezisztenciát közvetítő funkciójú N-gén-proteint kódoló nukleotidszekvenciák speciális példáit a szekvencialista 1., 3. és 5.

azonosítószámú szekvenciáiként mutatjuk be.

A 3. azonosítószámú szekvenciaként a teljes hosszúságú N-gént tartalmazó cDNS-szekvenciát mutatjuk be, melynek hosszúsága 3760 bp. A 60. bázisnál kezdődő, és a 3494. bázisnál végződő nyitott leolvasási keret 1144 aminosavas proteint kódol (ezt a proteint a 7/A táblázatban és az 5. példában mutatjuk be).

A - 7/A táblázatban bemutatotthoz képest - rövidített N-gén-proteint kódoló cDNS-szekvenciát a szekvenciálistában 5. azonosítószámú szekvenciaként szemléltetjük. E cDNS 3830 bp hosszúságú, és 652 aminosavas proteint (6. azonosítószámú szekvencia) kódol.

A teljes hosszúságú N-gént tartalmazó genomi DNSszekvenciát a szekvencialista 1. azonosítószámú szekvenciájaként mutatjuk be. Ez a genomi DNS 7400 bp hosszúságú, és nukleotidszekvenciájának analízisével kimutattuk, hogy öt exont tartalmaz, melyek együtt a 3. azonosítószámú nukleotidszekvenciában feltüntetett kódolószekvenciának felelnek meg. Az e szekvencia által kódolt N-protein aminosav-szekvenciáját a 2. és 4. azonosítószámú szekvenciában adjuk meg.

Az N-protein aminosav-szekvenciáját vizsgálva (és más proteinek szekvenciájával összehasonlítva) megállapítottuk, hogy az N-protein jelentős mértékű szekvenciaazonosságot mutat bizonyos - szignáltranszdukcióban részt• · · vevő - proteinekkel (ld. 7/A táblázat és 5. példa) . Az Ngén-protein három funkcionális domént tartalmaz: egy szignál (signaling) domént, egy ATP/GTP-kötőhelyet (P-hurok) és egy leucinban gazdag régiót. Ezek a domének a szignáltranszdukcióban szerepet játszó proteinekben találhatók meg.

Az N-proteln leucinban gazdag régiója ( leucinerich region; LRR) 13 ismétlődést tartalmaz, és a legtöbb ismétlődés a következő szekvenciát tartalmazza: LXXLXXLXL (vagy ehhez hasonló szekvenciát). A leucinban gazdag régiók fő jellegzetessége (a sok leucinon kívül), hogy prolint is tartalmaznak. Az általunk meghatározott, leucinban gazdag régiók átlagosan hozzávetőleg 25 aminosavat tartalmaznak. Valamennyi ismétlődésben önkényesen a prolint választottuk ki első aminosavként. A 7/C táblázatban az N-gén-protein leucinban gazdag ismétlődéseinek (590-928. aminosavak) elsődleges szerkezetét mutatjuk be, és konszenzusszekvenciáját az élesztő adenilát-cikláz, a Drosophila

Toll, az emberi vérlemezkemembrán-glikoprotein Iba-lánca, a Htrk, a Drosophila Chaoptin, az Arabidopsis receptorszerű transzmembrán-kináza (TMK1) és a TMKL1 konszenzusszekvenciáival hasonlítjuk össze.

Úgy véljük, hogy a leucinban gazdag régiók igen különböző proteinek közötti protein-protein interakciókat közvetítenek. A leucinban gazdag régiók néhány protein működésében betöltött szerepének jelentőségét a mutagenezis, illetve a mutációk - mutáns fenotípus révén lehetséges izolálása határozza meg. Az élesztő adenilát-cikláz eseté• · · · • ··· · · · ·· • · · · · · · · · ··· ·· ··· · · ·

- 15 ben a mutációk (pl. a 26 leucinban gazdag régió egyikében megjelenő két aminosavas deléció) megakadályozza, hogy az adenilát-ciklázt Ras-sal aktiválni lehessen [ Suzuki és mtsai.: Proceedings of the National Academy of Science USA

87, 8711 (1990)] . Az emberi vérlemezke-glikoprotein-lb ctalegységének hat leucinban gazdag régiója egyikében bekövetkező A156-V aminosavszubsztitúció vérzékenységi rendellenességet okoz [ Ware és mtsai.: J. Clin. Invest. 92, 1213 (1993)] .

A lizinben gazdag régiók jelentős szerepet játszanak a protein-protein interakciókban. Anélkül, hogy bármilyen elmélethez ragaszkodnánk, az N-protein lizinben gazdag régiója interakcióba léphet a dohány-mozaikvirus egy bizonyos komponensével. Mivel a lizinben gazdag régió szerkezetének kis módosításai jelentős változásokat okoznak a protein működésében, elképzelhető, hogy ezek a régiók a dohány-mozaikvírus és az N-protein között specifikus kölcsönhatásokat közvetítenek. Ezenkívül, az aminosav-szekvenciák kis módosításai megváltoztathatják a proteinek specifitását is, ami a növények számára - evolúciós szempontból - jótékony hatású lehet az állandóan változó patogénpopulációkkal szembeni új rezisztencia kialakításában. A lizinben gazdag régiók másik lehetséges szerepe az, hogy a dohánymozaikvirus felismerésének hatására kölcsönhatásba lépnek egy specifikus effektormolekulával (pl. kinázzal vagy foszfátázzál) .

Az N-protein kikövetkeztetett aminosav-szekvenciája tartalmaz egy P-hurok motívumot (7/A táblázat). A GMGGVGKT szekvencia (a 4. azonosítószámú szekvencia 216-223. aminosavai) megfelel a különböző ATP- vagy GTP-kötőproteinekben található P-hurok konszenzus-szekvenciának [ (A/G)XXXXGK(S/T); ld. 7/A táblázat] . A P-hurkot tartalmazó proteinek családjába tartoznak az adenilát-kinázok, a rasproteincsalád, az elongációs faktorok, az ATP-szintetáz βalegysége, a timidin-kinázok és a foszfoglicerát-kinázok [ Saraste: Trends in Biochemical Sciences 15, 430 (1990)] .

Nem valószínű, hogy az N-protein P-hurokja szerepet játszik a GTP-kötésben, mivel az N-proteinben nincsenek jelen a GTP megkötéséhez (a P-hurkon kívül) szükséges - DXXG és NXKD konszenzus-szekvenciák [ Dever és mtsai.: Proceeding of the National Academy of Sciences USA 84, 1814 (1987)] .

A P-hurok mellett két másik szegmensről is kimutatták, hogy szerepet játszanak az adenilát-kináz és az FlATP-áz ATP-kötésében [ Fry és mtsai.: Proceeding of the

National Academy of Sciences USA 83, 907 (1986)] . Az Nprotein szekvenciájának vizsgálata alapján megállapítható, hogy ezek a szegmensek megfelelő elosztásban vannak jelen (ld. a 7/A táblázatban az aláhúzott aminosavakat) . A 2. szegmens az (I,A,L,V)(V,I) dipeptidet tartalmazza, és az Nprotein a 228-229. helyen az Al szekvenciát tartalmazza. A

P-huroktól 80-100 aminosav távolságra a 3. szegmens szekvenciája glicinnel (G) kezdődik, melyet öt hidrofób aminosav és egy aszparaginsav (D) követ. Az N-protein a 296-302.

helyeken VLIVLDD aminosav-szekvenciát tartalmaz. Az aminosav-szekvencia alapján nem lehet megjósolni, hogy az ATP milyen feltételek mellett kötődik vagy hibridizálódik.

• · · · · • · • ·

Az N-protein N-terminális aminosavai (8-150. aminosavak) hasonlóak a Drosophila Toll protein és az emberi interleukin-l-receptor (IL-1R) citoplazmatikus (szignál) doménjéhez. A három szekvencia egymás alá rendezését (alignment) a 7/B ábrán mutatjuk be. A bekeretezett aminosavak azokat a régiókat jelzik, amelyekben szekvenciaazonosságot vagy konzervatív szubsztitúciókat figyeltünk meg. Az N-szekvencia tartalmaz néhány olyan konzervált aminosavat, amelyek a Toll és az IL-1R szabályozó reakcióútjaiban szükségesek a szignál - citoplazmából sejtmagba történő - átviteléhez [ Schneider és mtsai.: Genes and

Development 5, 797 (1991) ; Heguy és mtsai. : J. of

Biological Chemistry 267, 2605 (1992)] .

A N-protein, illetve a Drosophila Toll protein és az emberi IL-1R citoplazmatikus doménje szekvenciájának hasonlósága felveti annak lehetőségét, hogy az N-protein dohány-mozaikvírus-fertőzés hatására - hasonló típusú intracelluláris szignáltranszdukciós kaszkádot indít be (5. ábra) . A különböző anyagok, mint pl. vírusok, citokinek (IL-1, TNF), mitogének (forbol-12-mirisztát-13-acetát;

PMA) , lektinek és kalcium-ionoförök interleukin-1receptorral (IL-1R) létrejövő interakciói, illetve a Tollprotein extracelluláris doménje ismeretlen szignáljának felfogása az NFkB, illetve a dorsal nevű - Rel-lel kapcsolatos - transzkripciós faktorok aktiválását és - citoplazmából sejtmagba történő - transzlokációját eredményezi. Az emlősök immunfolyamatainak gyulladásos és akut fázisú reakcióiban az NF-kB (aktív transzkripciós faktorkomplex) - 18 a kB-kötőmotívűm elnevezésű dekamer szekvenciamotívumhoz történő kötődés után - különböző védő és szignál (signalling) proteinek szintézisét indukálja vagy gátolja [ áttekintést ld. Baeuerle: Biochimica et Biophysica Acta 1072, 63 (1991)] . Az ilyen indukált proteinek - a patogének jelenlétének más sejtek számára történő jelzése révén - általános sejtvédő mechanizmusokat indítanak be [ Baeuerle és

Baltimore: Science 242, 540 (1988); Baeuerle: Biochimica et

Biophysica Acta 1072, 63 (1991)] . Drosophila embrióban a dorsal-protein nagyobb koncentrációja a sejtmagban olyan zigótikus gének transzkripcióját szabályozza, melyek az embrió dórzoventrális polaritásának meghatározásában játszanak szerepet [ áttekintést ld. Johnston és NussleinVolhard: Cell 68, 201 (1992)] . A Toll természetes recesszív alléljeinek szignál (citoplazmatikus) doménjében bekövetkező pontmutációk [ Schneider és mtsai.: Genes and Development

5, 797 (1991)] , illetve az IL1-R jeltovábbító (signalling) doménjében végrehajtott helyspecifikus (site-directed) mutációk [ Heguy és mtsai.: J. of

Biological Chemistry 267, 2605 (1992)] a dorsal, illetve az Nf-kB sejtmagba történő transzlokációjának elégtelenségét eredményezik.

Az utóbbi időben beszámoltak egy rel-t tartalmazó másik - Drosophila immunreakcióban szerepet játszó - génről, melyet Dif-nek neveztek el ( dorsal-lal kapcsolatos immunitás) [ Ip és mtsai. : Cell 75, 753 (1993)] . A Difprotein normális esetben - az Nf-kB-hez és a dorsal-hoz hasonlóan - a lárvák citoplazmájában van jelen, és sérülés • ·· · vagy fertőzés hatására a sejtmagba kerül, ahol specifikusan a különböző antimikrobiális gének promóterrégiójában lévő kB-szerű motívumokhoz kötődik [ Sun és mtsai.: European Journal of Biochemistry 196, 247 (1991); Engström és mtsai.:

Journal of Molecular Biology 232, 32 (1993); Kappler és mtsai.: EMBO J. 12, 1561 (1993)] . A fentebb említett immunreakciókhoz és fejlődési reakciókhoz hasonlóan, a dohánymozaikvírus egy terméke (kiváltómolekula) a citoplazmában az N-protein (receptor) - vagy egyéb, ismeretlen protein lizinben gazdag régiójához vagy más régiójához kötődik, miáltal - a patogénnel összefüggő (patogen related; PR) gének indukciójához szükséges - rel/kB-szerű transzkripciós faktor-komplexet aktiválja.

A találmány tárgyát képező eljárás egyik legfőbb előnye, hogy alkalmazásával a dohányban és más, rokon fajokban (mint pl. paradicsomban és paprikában) rezisztenciát alakíthatunk ki a dohány-mozaikvirussal szemben. Ez azért előnyös, mert a dohány-mozaikvirussal szembeni - N-protein közvetítette - rezisztencia igen hatásos, és a dohánymozaikvírus leggyakrabban előforduló törzsei még nem képesek e rezisztencia kikerülésére.

A klónozott természetes rezisztenciagén (N-gén) alkalmazása előnyösebb a növények dohány-mozaikvírusrezisztenciája kialakításának jelenlegi technikáinál. A dohány-mozaikvírussal szembeni rezisztencia kialakítására két gént alkalmaznak széles körűen: az egyik a dohánymozaikvírus burokproteinjének (coat-protein; CP) génje, a másik pedig a polimerázgén. A dohány-mozaikvirussal szembe- 20 ni védekezés jelenlegi módszerének hátránya, hogy a CPközvetítette rezisztencia - az idő előrehaladásával vagy magasabb szintű vírusfertőzés esetén - hatástalanná válhat, a polimeráz-közvetítette rezisztencia pedig nagyon specifikus arra a virustörzsre, amelyből a polimerázgén származik.

A vírusgén eredetű rezisztencia másik lényeges veszélye, hogy a természetes törzsek és a transzgének közötti rekombináció révén a vírusok hipertörzsei alakulhatnak ki. E hátrányok kiküszöbölhetők oly módon, hogy a gazdasági jelentőségű terménynövény-változatokba - transzformációval klónozott növényi vírusrezisztencia-gént viszünk be. A dohány N-génje - egy kivételével - valamennyi ismert dohánymozaikvírus-törzzsel szemben rezisztenciát biztosít.

A klónozott természetes növényi virusrezisztenciagén a rezisztenciagén-patogénfelismerés mechanizmusának és az indukált védőreakciók jeltovábbításának (signalling) alapvető tanulmányozását is elősegíti, miáltal azonosíthatók a gén kulcsfontosságú funkcionális doménjei, és - génsebészeti módszerek alkalmazásával - szélesebb rezisztenciaspektrumú rezisztenciagének állíthatók elő. Találmányunk leírásában elsőként tárunk fel olyan növényi rezisztenciagént, amelynek terméke feltételezett ATP/GTP-kötőhelymotívumot (P-hurok), leucinban gazdag régiót és jeltovábbító domént tartalmaz.

Az N-gén klónozását - a kukorica Ac-transzpozon alkalmazásával - N. tabacum-ban transzpozonjelöléssel (transposon tagging) végeztük. Az Ac-indukálta mutánsok [ HR mutánsok, melyek a dohány-mozaikvírusra nem képesek hiperszenzitív reakcióval (HR) reagálni] izolálása érdekében kifejlesztettünk egy pozitív szelekciós módszert. Az Ac-transzpozont hordozó 36 HR-mutáns egyike olyan instabil mutációt tartalmazott, amely összefüggésben állt egy

AclO-nek elnevezett - Ac-transzpozon jelenlétével. Az N-gén teljes hosszúságú cDNS-eit és genomi DNS-eit tartalmazó kiónok azonosítása céljából - a cDNS- és genomi DNSkönyvtárak szkrínelésére - az AclO-transzpozont szegélyező genomi DNS-szekvenciákat alkalmaztuk. N. glutinosa genomi könyvtárából N-gént tartalmazó genomi kiónt izoláltunk, amely alkalmas a növények - dohány-mozaikvírussal szembeni rezisztencia kialakítása érdekében történő - transzformálására. Az N-gént vektorba klónoztuk, melyet a dohánymozaikvírusra érzékeny növények transzormálására alkalmaztunk. A transzformált növények rezisztensek voltak a dohány-mozaikvírusra.

A találmány szerinti megoldás értelmében nukleinsav-molekulaként DNS-molekulát, RNS-molekulát vagy hibrid DNS-RNS-molekulát egyaránt alkalmazhatunk. A nem természetes nukleinsav-molekulán olyan nukleinsav-molekulát értünk, amely a természetben nem fordul elő. Az ilyen nem természetes nukleinsav-molekulák közé tartoznak, például, a következők: izolált vagy tisztított DNS-szekvenciák; a heterológ régiót (vagyis olyan azonosíthatatlan DNS-szegmenst, amely a természetben nem kapcsolódik kovalens kötéssel az N-gén kódolószekvenciájához) tartalmazó rekombináns nukleinsavmolekula; kémiai úton szintetizált részekből álló, nem természetes molekula; olyan konstrukció, amelyben a kódolószekvencia önmagában nem található meg a természetben (pl. olyan cDNS, amelyben a genomi kódolószekvencia intronokat tartalmaz); vagy olyan szintetikus szekvencia, amely az eredeti génben lévőktől eltérő kodonokat tartalmaz. A heterológ forrásokból származó részeket bármilyen ismert eljárással (pl. in vitro ligálással) hozzákapcsolhatjuk a molekulához. Más módon, az ilyen molekularészeket in vivő technikákkal, pl. rekombinációval is hozzákapcsolhatjuk a molekulához, de a rekombináció irányítását, és a kívánt eredmény azonosítását mesterségesen kell végezni.

A találmány szerinti DNS-molekulák példáiként a Nicotiana glutinosa N-génjének cDNS-eit említjük, melyeket a szekvencialista 3. és 5. azonosítószámú szekvenciájaként mutatunk be. A teljes hosszúságú N. glutinosa N-gént tartalmazó genomi nukleotidszekvenciát az 1. azonosítószámú szekvenciaként mutatjuk be.

A találmány tárgyát képezik azok a nukleinsavmolekuiák is, amelyek olyan N-gént tartalmaznak, amely az

1. azonosítószámú nukleotidszekvencia kb. 1-7400.

nukleotidjaival legalább kb. 70%-os nukleotid-homológiát mutat, és amely nukleinsav-molekulák olyan N-gén-proteint kódolnak, amelynek megvan az a funkciója, hogy az ilyen Ngén-proteint kódoló növényben dohány-mozaikvírussal szembeni rezisztenciát biztosítson. Szintén a találmány tárgyát képezik azok a nukleinsav-molekulák, amelyek N-gén-protein kódolószekvenciáját tartalmazzák, mely kódolószekvencia a

3. azonosítószámú nukleotidszekvencia 60. nukleotidtól

3494. nukleotidig terjedő szakaszával legalább 70%-os •·· ··· • · ·· • « · • « · • · · «···· · ··· ·· ··· · ····

- 23 nukleotidszekvencia-homológiát mutat, és amely nukleinsavmolekulák olyan N-gén-proteint kódolnak, amelynek megvan az a funkciója, hogy az ilyen N-gén-proteint kódoló növényben dohány-mozaikvírussal szembeni rezisztenciát biztosítson. A találmány tárgyát képező homológ szekvenciák Southernhibridizációs analízissel azonosíthatók, olyan feltételek alkalmazásával, amelyek legalább 70%-os homológra esetében teszik lehetővé a hibridizációt, szemben a nem specifikus kötődéssel [ a szigorú ( stringent és enyhe (nonstringent ) feltételek leírását ld. a 2. példában] . Homológián azt értjük, hogy két szekvencia nukleotidjai egy kiválasztott régió meghatározott hosszúságában - egymással megegyezőek. A hibridizációs feltételek leírását ld.

Sambrook és mtsai.: Molecular Cloning: A Laboratory

Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989); Ausubel és mtsai.: Current Protocols in Molecular Biology , Current

Protocols (1989); mely hivatkozásokat teljes terjedelmükben a kitanítás részének kell tekinteni.

A Solanaceae család egyéb fajaiban N-gén azonosítása céljából egy ilyen fajba tartozó növényből - a találmány leírásában ismertetett eljárással - genomi DNS-t izolálunk.

Az izolált DNS-t ezután egy vagy több restrikciós enzimmel emésztjük, lambda-vektorba vagy más alkalmas vektorba klónozzuk, elektroforézist végzünk, és a DNS-t nylonmembránra (pl. Nytran-membránra) blottoljuk. A lenyomatokat a találmány leírásában ismertetett próba alkalmazásával teszteljük. Az izolált DNS-ekből készített genomi könyvtárat - N-gén azonosítása érdekében - ugyanilyen próbákkal « 4 « « · szkríneljük. A gén aktivitását úgy határozzuk meg, hogy Solanaceae családba tartozó növényben expresszáltatjuk, és értékeljük a transzformált növény dohány-mozaikvírussal szembeni rezisztenciáját (részletesen ld. később).

Az N-gén szekvenciájából származó oligonukleotidok polimeráz-láncreakcióban (PCR) láncindítokként is alkalmazhatók. A dohány egy olyan genomrégiót tartalmaz, amely Nproteint kódol. Az N-gén konzervált régiói előnyösen alkalmazhatók olyan láncindítók tervezésére, amelyek Solanaceae családba tartozó növények funkcionális homológ génjeinek izolálására használhatók fel. Ezenfelül, az N-protein doménjei elleni antitestek egyéb - Solanaceae családba tartozó - növények expressziós könyvtárainak szkrínelésére alkalmazhatók .

Az N-gén-protein kódolószekvenciája degenerált oligonukleotidokból (melyek szekvenciája az N-gén-protein aminosav-szekvenciájának megfelelő kodonokat tartalmaz) szintetikus úton is előállítható. Az ilyen oligonukleotidokat hagyományos eljárásokkal állítjuk elő, és a kapott oligonukleotidokat - összeállítva - a kívánt N-gén izolálására alkalmazzuk.

A dohánynövény - N-gén-proteint kódoló - nukleinsav-molekuláinak hozzáférhetősége lehetővé teszi, hogy egyéb - Solanaceae családba tartozó - növényekből származó,

N-gén-proteint kódoló N-génszekvenciák (vagy azok funkcionális homológjai is rendelkezésre álljanak. A dohány genomi vagy cDNS-szekvenciáit (vagy azok részeit) az egyéb növényekből származó genomi, illetve cDNS-szekvenciákhoz •· »··· · d 9 • -.· 1-. * .

• « · 9999 • r · ·*· * standard hibridizációs feltételek mellett hibridizálódó oligonukleotid-próbákként alkalmazzuk. Az N-gén kódolószekvenciájához vagy komplementeréhez specifikusan hibridizálódó szekvenciák, amelyek Solanaceae családba tartozó növényben dohány-mozaikvirussal szembeni rezisztenciát biztosító, funkcionális homológ N-gén-proteint kódolnak, szintén a találmány tárgyát képezik. Az említett próbák közé tartoznak azok, amelyek teljes N-gént tartalmaznak, továbbá azok, amelyek a következő domének közül egyet vagy többet tartalmaznak: 5' és 3' transzlálatlan régiók; jeltovábbító dómén (8-150. aminosavak); leucinban gazdag ismétlődő régió (591-929. aminosavak). Az ilyen oligonukleotidokat jól ismert, hagyományos eljárásokkal állítjuk elő, illetve állítjuk össze. Az alkalmazott próbának olyan hosszúságúnak kell lennie, ami elégséges a DNS homológ régióihoz történő hibridizálódáshoz, ami legalább kb. 70%-os homológia esetén következik be, szemben a nem specifikus kötődéssel. Az oligonukleotid-próbaként előnyösen alkalmazható DNSszekvenciák példáit az 5. példában mutatjuk be.

Az előnyös példaként említett Nicotiana glutinosa N-gén-protein amínosav-szekvenciáját a 4. azonosítószámú szekvenciaként, kódolószekvenciáját pedig a 3. azonosítószámú szekvencia 60. nukleotidjától 3494. nukleotidjáig terjedő szakaszaként mutatjuk be.

Jól ismert, hogy a proteinek szekvenciáiban bizonyos aminosav-szubsztitúciók hajthatók végre, anélkül, hogy a protein működése megváltozna. Az ilyen szubsztitúciók közé általában a konzervatív aminosav-szubsztitúciók, illetve • · • · • · · · • · · · · · · · · · · a hasonló aminosavak szubsztitúciói tartoznak. A hasonló aminosavakon olyan aminosavakat értünk, amelyek mérete és/vagy töltési sajátsága hasonló; ilyen hasonló aminosavpárok az aszparaginsav és a glutaminsav, illetve az izoleucin és a valin. Az aminosavak hasonlósága több módon is értékelhető. Dayhoff és mtsai. [Atlas of Protein

Sequence and Structure, 5. kötet, 3. melléklet, 22. fejezet, 345-352. old.; melyet a kitanítás részének kell tekinteni] az aminosav-szubsztitúciók olyan gyakorisági táblázatait állították össze, amelyek felhasználhatók az aminosavak hasonlóságának mérésére. A Dayhoff-féle gyakorisági táblázatok az egymástól evolúciós szempontból eltérő, különféle forrásokból származó - azonos funkciójú - proteinek aminosav-szekvenciáinak összehasonlításán alapulnak.

A protein aminosav-szekvenciája a Solanaceae családba tartozó növényekben természetesen előforduló aminosav-szekvenciával azonos, vagy attól eltérő lehet. Egy Ngén-protein azonosságát azon képessége alapján állapíthatjuk meg, hogy - N-gén-proteint szintetizáló - növényben vagy növényi sejtben rezisztenciát biztosít-e a dohánymozaikvírus ellen. Az 1. példában egy ilyen vizsgálatot írunk le. Röviden; az N-gén-proteint kódoló szekvenciát - a kódolószekvencia alapján N-gént-proteint szintetizálni képes - növénybe vagy növényi sejtbe (pl. Solanaceae családba tartozó növénybe) transzformáljuk, majd a transzformált növényt vagy sejtet dohány-mozaikvírussal fertőzzük. A növényen figyelemmel kísérjük a hiperszenzitív reakció megjelenését; amennyiben rezisztenciát észlelünk, a vizsgált pro27 • · · · tein képes a dohány-mozaikvírus elleni rezisztencia közvetítésére. Ezen túlmenően, a protein szekvenciájában mesterségesen indukált mutációk is lehetnek, azzal a megkötéssel, hogy nem károsíthatják a protein aktivitását. A mutált Nprotein kifejezésen olyan proteint értünk, amelynek megvan a szóban forgó aktivitása, de amely egy N-protein kódoló

DNS mutációjának eredménye. A mutációjának eredménye kifejezésen azt értjük, hogy a protein egy - N-gén-protein kiindulási anyagot kódoló - DNS-ből, például, helyspecifikus mutagenezis alkalmazásával közvetlenül származtatható, illetve olyan DNS szintézisével származtatható, amelynek szekvenciája hasonlít az N-gén szekvenciájához, de határozottan különbözik attól. Mivel rendelkezésre állnak a kívánt hosszúságú oligonukleotidok előállítására alkalmas eszközök, az ilyen DNS-ek - teljes egészükben vagy részlegesen - előállíthatok a szekvenciájukat alkotó nukleotidőkből.

Ahogyan azt fentebb említettük, a dohán - N-génproteint kódoló - szekvenciáinak hozzáférhetősége azt eredményezi, hogy rendelkezésre állnak egyéb, Solanaceae családba tartozó növényekből származó funkcionális N-génhomológok (vagyis olyan gének, amelyek tartalmaznak egy N~ szerű proteint kódoló részt is, amely N-szerű protein egy olyan polipeptid, melynek az a szerepe, hogy növényi víruspatogénnel - pl. dohány-mozaikvírussal - szemben rezisztenciát közvetítsen). Az ilyen N-szerű gének a dohány találmány szerinti - N-kódolószekvenciájával mutatott szekvencia-homológiájuk alapján azonosíthatók és izolálhatok. A • · · · · • · · • · · · · · · • ·········· • · · ····· · •·· ·· ··· · ····

- 28 jelentős mértékű homológiát mutató szekvenciák azonosítása érdekében - hibridizálással - cDNS- és/vagy genomi könyvtárakat szkrínelhetünk. Az igy azonosított szekvenciákat - a teljes nyitott leolvasási keret meglétének ellenőrzése érdekében - szekvenáljuk, majd - növényben expresszáltatható

- növényi vektorba klónozzuk, mely vektorral növényi szövetet transzformálhatunk. A transzgenikus növények szakember számára ismert technikák alkalmazásával állíthatók elő, és a transzgenikus növényekkel teszteket végezhetünk annak igazolása érdekében, hogy a patogénnel szembeni rezisztencia - az N-szerű protein bevitt kódolószekvenciájának köszönhetően - kialakult-e. Az N-szerű gének közé tartozik a paprikából származó L-gén, a paradicsomból származó Tm2- és

Tm2a-gén, valamint a Nicotiana sylvéstris-ből származó N'gén .

Szintén a találmány tárgyát képezik a génsebészeti módszerekkel manipulált, rekombináns nukleinsav-molekulák, vagyis az olyan - természetben nem előforduló - nukleinsavmolekulák (előnyösen DNS-molekulák), amelyek N-gén-proteint vagy annak funkcionális homológját kódoló szekvenciát tartalmaznak, amely proteinnek vagy homológnak az a funkciója, hogy N-gén-proteint, illetve annak funkcionális homológját szintetizáló növényben dohány-mozaikvírussal szembeni rezisztenciát közvetítsen. A rekombináns DNS-molekula kifejezésen olyan hibrid DNS-szekvenciát értünk, amely legalább két DNS-szekvenciát tartalmaz, melyek a természetben normális esetben nem fordulnak elő együtt. Az ilyen molekulák a genetikai anyag - restrikciós enzimek vagy ligázok alkalma29 • · · « zásával végzett - génsebészeti manipulációjával és hasonló rekombináns technikákkal állíthatók elő [ ld. pl. Sambrook és mtsai.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold

Spring Harbor Laboratory (1989); Ausubel és mtsai.: Current

Protocols in Molecular Biology, Current Protocols (1989);

és DNA Cloning: A Practical Approach, I. és II. kötet, szerk.: D.N. Glover, IRL Press, Oxford (1985)] . Az ilyen DNS-molekulák példái közé tartoznak az olyan rekombináns vektorok (pl. klónozó vagy expressziós vektorok), amelyek 5'—>3' (szensz) vagy 3'—>5 ' (antiszensz) orientációban - Ngén-proteint kódoló - DNS-szekvenciát tartalmaznak. A 7. példában egy N-gént tartalmazó rekombináns DNS-molekula előállítását írjuk le. Ahogy a leírásban alkalmazzuk, a rekombináns kifejezés nem vonatkozik a természetben előforduló genetikai rekombinációkra.

A génsebészeti módszerekkel manipulált kifejezés azt jelenti, hogy a rekombinációt mesterségesen irányítottuk. Egy - adott DNS-molekula bevitele céljából - génsebészeti módszerekkel manipulált növényen olyan növényt értünk, amelybe a DNS-molekulát ismert eljárásokkal (például, többek között, Agrobacteríum-közvetítette transzformációval, elektroporációval, részecskebombázással és hasonló módszerekkel) vittük be. Egy génsebészeti módszerekkel manipulált nukleinsav-molekulán (pl. DNS-molekulán) olyan molekulát értünk, amely molekuláris biológiai eljárások eredményeként - például, többek között, DNS-ligálás, in vitro mutagenezis vagy hasonlók - állítható elő.

• ·· ····· ·· • · · · · · · a · · · ··· ·· · a · · ····· a a a· ·· ··· · ····

A találmány szerinti DNS-szekvenciák előnyösen alkalmazhatók az expressziós rekombináns DNS-molekulák előállítására, oly módon, hogy a találmány szerinti szekvenciákat megfelelő - idegen gént heterológ gazdába, például baktériumba, élesztőbe, vírusba, annak gazdaszervezetébe vagy növénybe bejuttatni képes - exressziós vektorba klónozzuk.

A rekombináns vektort úgy állítjuk elő, hogy a kódolószekvenciát a megfelelő irányítószekvenciával működőképesen kapcsolódva tartalmazza, vagyis az N-gén kódolószekvenciáját - az irányítószekvenciákhoz képest olyan helyzetben és orientációban helyezzük el, hogy a kódolószekvencia transzkripciója az irányítószekvenciák irányítása alatt (a DNS-molekulához az irányítószekvenciánál kapcsolódó RNS-polimeráz által) valósuljon meg. Az irányítószekvenciákat a kódolószekvencia vektorba történő inszertálása előtt ligálhatjuk a kódolószekvenciához. Más módon, a kódolószekvenciát közvetlenül egy olyan expressziós vektorba ligálhatjuk, amely már tartalmazza az irányítószekvenciát és - attól 3'-irányban (downstream) egy megfelelő restrikciós helyet is. Olyan vektort kell kiválasztani, amely tartalmaz egy olyan promótert, amely abban a gazdasejtben, amelybe a vektort be kívánjuk juttatni - működőképes, azaz amelyet a gazdasejt RNS-polimeráza felismer. Ezen túlmenően, a vektornak - a promóter, illetve a vektor azon helye között, amelynél a DNS-szekvenciát a vektorba inszertáljuk - tartalmaznia kell egy riboszómakötőhelyet kódoló régiót is, hogy az N-gén kódolószekvenciája - az inszerció után - működőképesen kap31 csolódhasson hozzá. A vektornak olyan riboszóma-kötőhelyet kell tartalmaznia, amelyet a gazdasejt - amelybe a vektort be kívánjuk juttatni - riboszómái felismernek.

Az N-gén-proteint kódoló szekvenciát 5'-3' orientációban tartalmazó rekombináns expressziós DNS-molekulát az N-gén-protein expresszáltatása érdekében - egy gazdasejtbe visszük be. A szakirodalomban számos - protein előállítására alkalmas - expressziós rendszer és gazdasejt ismert. Az ilyen célra alkalmazható prokarióta gazdasejtek egyik példája az Escherichia coli. Az eukarióta gazdákban (pl. élesztőkben, rovarsejtekben, emlőssejtekben és növényi sejtekben) történő expresszáltatás céljaira számos rekombináns rendszert fejlesztettek ki. Ezek a rendszerek részletesen vannak jellemezve, és alkalmazásukhoz arra van szükség, hogy a kódolószekvencia ligálása megfelelő transzkripciós iniciációs rendszer (promóter) és - kívánt esetben - terminátor- és erősítő- (enhancer) szekvenciák irányítása alatt történjen. Az N-gén-protein előállítása érdekében a rekombináns expressziós DNS-molekulával transzformált gazdasejteket szaporítjuk, majd a termelődött proteint izoláljuk a gazdasejtekből. A megfelelő szaporítási feltételek, valamint a protein kinyerési eljárásainak kiválasztása szakember feladata.

A következőkben az N-gén-protein Escherichia coliban végzett expresszáltatását írjuk le. Az N-gén-protein kódolószekvenciáját expressziós vektorba [például pRSET (Ivitrogen Corp., CA) vagy pET-vektorba (Novagen, WI)] inszertáljuk, majd T7-bakteriofág erős transzkripciós és

- 32 transzlációs szignáljai irányítása alatt expresszáltatjuk.

A találmány szerinti N-gének esetében különösen előnyösen alkalmazhatók azok az expressziós rendszerek, amelyek növényekben működőképesek. Az N-gén-protein kódolószekvenciája, valamint az a DNS, amely az - N-génproteinné transzlálódó - mRNS reverz transzkriptuma, növényekben alkalmazható expressziós rendszerekbe foglalható. A növényekben történő expresszáltatásra alkalmas rekombináns expressziós kazetta - az N-gén-protein kódolószekvenciáján felül - növényi promóterrégiót (abban az esetben, ha ez hiányzik a szekvenciából); transzkripciós kezdőhelyet (abban az esetben, ha az átírni kívánt kódolószekvenciából hiányzik) ; valamint transzkripciós terminációs szekvenciát tartalmaz. A terminációs régió ugyanabból a génből vagy más génből származhat, mint a promóter. Az expressziós kazetta 5'- és 3'-végén lévő egyedi restrikciós helyek azt a célt szolgálják, hogy a kazetta könnyen inszertálható legyen egy - már létező - vektorba. Növényi expressziós rendszerként olyan rendszerek alkalmazhatók, amelyek szövetspecifikus promóter irányítása alatt állnak, valamint azok, amelyek valamennyi növényi szövetben működőképes promótert tartalmaznak .

A találmány szerinti megoldás értelmében alkalmazható transzkripciós iniciációs régiók közé tartoznak a különböző opin iniciációs régiók, mint pl . az oktopin, mannopin, nopalin, stb. Növénypatogén vírusok promóterei [mint pl. a karfiolmozaikvírus (CaMV) 35S-promótere] szintén alkalmazhatók. Ezenkívül, szintén alkalmazhatók az • · · · · · · • · · · · ··· ··· ·· · • · ····· · • · · ··· · ····

- 33 olyan növényi promóterek, mint pl. a ribulóz-1,3-difosztátkarboxiláz-promóter, a gyümölcs-specifikus promóterek, hősokk-promóterek, magspecifikus promóterek, stb. A konkrét esetnek megfelelően olyan promótert kell kiválasztani, amely megfelelő szintű expressziót biztosít ahhoz, hogy a növényi sejtek - és a belőlük regenerált növények - dohánymozaikvírussal szembeni rezisztenciájának kialakításához elégséges mennyiségű N-gén-protein termelődjön. A CaMV-35Spromóterről kimutatták, hogy - transzgenikus növények genomjába integrálva - számos növényi szervben és különböző fejlődési stádiumokban nagy aktivitást mutat. A szövetspecifikus promóterek szintén jól ismertek.

A dohány-mozaikvírus-rezisztencia kifejeződését

N-gén expresszióján keresztül - irányító molekulákban a transzkripciós terminációs szignál(ok)at előnyösen az Ngén-protein kódolórégiójától 3 '-irányban (és ahhoz működőképesen kapcsolva) helyezzük el. Terminációs szignálként az N-gén normális terminációs szignálját vagy egy vagy több heterológ transzkripciós terminációs szignált alkalmazhatunk. A szakirodalomban számos transzkripciós terminációs szignál ismert, mint pl. az Agrobacterium tumefaciens TDNS-génjeinek terminációs szignáljai (pl. a nos szignál).

A kapott expressziós rendszert vagy kazettát - növény transzformálására alkalmas - rekombináns vektorba ligáljuk._A vektor rendszerint szelektálható markergént is tartalmaz, amelynek segítségével a transzformált növényi sejtek azonosíthatók a tenyészetben. Markergénként általában antibiotikumrezisztenciát kódoló gént alkalmazunk. E • ·· ····· · · • · · · fe · · • · · · ··· ·· · • · · ····· · ··· ·· ··· · ···· markerek közé tartozik a G418-cal, higromicinnel, bleomicinnel, kanamicinnel és gentamicinnel szembeni rezisztenciamarkerek. A növényi sejtek transzformálása után a vektort tartalmazó sejteket annak alapján azonosítjuk, hogy képesek az adott antibiotikumot tartalmazó táptalajon szaporodni. A vektorba általában bakteriális vagy virális eredetű replikációs szekvenciákat is foglalunk, hogy a vektor baktérium- vagy fággazdában klónozható legyen. Előnyösen széles gazdaspektrumú prokarióta replikációs kezdőhelyet alkalmazunk. A vektorban baktériumok számára alkalmas szelektálható markert is alkalmazhatunk, hogy lehetővé tegyük a kívánt konstrukciót hordozó baktériumsejtek szelektálását. Az alkalmas szelektálható prokarióta markerek közé szintén antibiotikum-reszitenciamarkerek (kanamícin vagy tetraciklin) tartoznak.

N-protein által közvetített dohány-mozaikvírusrezisztenciát mutattunk ki olyan transzgenikus növényekben, amelyekbe genomi N-klónt vittünk be (és amelyek a genetikai módosítás előtt érzékenyek voltak a dohány-mozaikvírusra). Az N-proteint kódoló cDNS-klón - dohány-mozaikvírusra érzékeny - Solanaceae családba tartozó növényekben is felhasználható a dohány-mozaikvírus-rezisztencia létrehozására. A cDNS-t működőképesen - növényi sejtben funkcionális promóterhez (attól 3'-irányban) klónozzuk, majd növényi szövetbe visszük be, és transzgenikus növényeket regenerálunk; az eljárás során szakember számára ismert vektorokat és technikákat alkalmazunk. A vírussal szembeni rezisztenciát az adott vírussal (pl. dohány-mozaikvírussal) végzett • · • · · · · · • ···· · ··· · · · · · fertőzéssel igazoljuk. cDNS alkalmazása esetén hasznos, ha a növényi szövetbe teljes hosszúságú cDNS-t (3.

azonosítószámú szekvencia) és rövidített cDNS-t (5.

azonosítószámú szekvencia) egyaránt beviszünk (miután azokat működőképesen - növényi sejtekben funkcionális transzkripciós irányítószekvenciákhoz kapcsoltuk). A dohány-mozaikvírus-rezisztenciát dohány-mozaikvirussal végzett fertőzési teszt alapján igazoljuk.

A találmány szerinti megoldás értelmében alkalmazott vektorban további funkciókat betöltő DNS-szekvenciák is jelen lehetnek. Például, az Agrobacterium-közvetítette transzformációk esetében - a növényi kromoszómákba történő későbbi bevitele érdekében - T-DNS-szekvenciák is alkalmazhatók .

A megfelelő vektor előállítása után olyan transzgenikus növényeket hozunk létre, amelyek a kívánt expressziós rendszert tartalmazzák. Az N-gén-proteint kódoló szekvenciákat - a kívánt növényfaj (esetünkben Solanaceae családba tartozó növény) transzformálására alkalmas - növényi transzformációs vektorba inszertáljuk, amellyel a növényt rezisztenssé tehetjük a dohánymozaikvirussal szemben. A Solanaceae családba - a dohány (Nicotiana, például N. tabacum és N. glutinosa) mellett élelmezési szempontból kiemelkedő jelentőségű növények tartoznak. Ezek példáiként megemlíthető a paradicsom (Lycoperslcon, pl. L. lycopersicum és L. esculentum); a paprika (Capsícum); burgonya (Solanum tuberosum) és a padlizsán (Solanum melongena) .

• · · • · ·

A növények vagy növényi sejtek transzformálására számos eljárás ismeretes. A baktérium-közvetítette transzformáció esetében egy növényi sejtet - a növénybe bejuttatni kívánt DNS-sel előzetesen transzformált - Agrobacteríum tumefaciens-szel vagy A. rhizogenes-szel fertőzünk. Az

Agrobactérium a Gram-negatív Rhizobiaceae család egyik jellegzetes képviselője. Alkalmas növényi sejtekbe - az Agrbacterium tumefaciens Ti-plazmidja vagy az A. rhizogenes Ri-plazmidja segítségével - heterológ genetikai anyagot juttathatunk be. A Ti- vagy Ri-plazmidot Agrobacteriumfertőzéssel kerül a növényi sejtekbe, ahol stabilan a növény genomjába integrálódik [ J. Schell: Science 237, 1176 (1987)] . A Ti- és Ri-plazmid két olyan régiót tartalmaz, amely a transzformált sejtek előállításában kulcsfontosságú.

A rekombináns Ti- és Ri-plazmidok előállítása rendszerint a gyakoribb bakteriális vektorok (pl. pUC19) előállítására általánosan alkalmazott eljárásokkal történik. Jelenleg a rekombináns Ti- és Ri-plazmidvektor-rendszerek két változatát alkalmazzák. Az elsőben (melyet ko-integrált rendszernek neveznek) a kérdéses gént tartalmazó ingázó (shuttle) vektort genetikai rekombinációval olyan - nem onkogén - Ti-plazmidba inszertálják, amely (a növények transzformálásához szükséges) cisz- és transz-működésű elemeket egyaránt tartalmaz. Ide tartozik pl. a DeBlock és mtsai. által leírt pMLJl ingázó vektor [ EMBO J. 3_, 1681 (1984)] és a nem onkogén pGV3850 Ti-plazmid [ Zambryski és mtsai.: EMBO J. 2, 2143 (1983)] . A másik változatban, az • « · · · • ··· ·«· ·« · • · · «··· · ··· «· · · · f, ···

- 37 ún. biner rendszerben a kérdéses gént - növények transzformálásához szükséges - cisz-működésű elemeket tartalmazó ingázóvektorba inszertálják. A többi szükséges funkciót in trans nem onkogén Ti-plazmiddal biztosítják; e rendszer példája a pBIN19 ingázóvektor [Bevan és mtsai.: Nucleic Acids Research 12, 8711 (1984)] és a nem onkogén PAL4404

Ti-plazmid [ Hoekema és mtsai.: Natúré 303, 179 (1983)] . alkalmazása. E vektorok némelyike kereskedelmi forgalomban beszerezhető.

A növényi sejtek Agrobacterium-közvetítette transzformálásának két általános módja van: az egyik az

Agrobacterium - tenyésztett, izolált - protoplasztokkal együttes tenyésztése; a másik a sértetlen sejtek vagy szövetek Agrobacteriummal történő transzformálása. Az első eljárás gyakorlati megvalósításához olyan tenyésztőrendszerre van szükség, amely lehetővé teszi a protoplasztok tenyésztését, majd a transzformált növény - tenyésztett protoplasztokból történő - regenerálását. A második eljáráshoz arra van szükség, hogy (a) az ép növényi szövetek (pl. sziklevelek) Agrobacteri um-mal transzformálhatok legyenek; és (b) a transzformált sejtekből vagy szövetekből teljes növények legyenek regenerálhatok. A legtöbb kétszikű növényfaj transzformálható Agrobacterium-mal, mivel valamenynyi faj, amely az Agrobacterium természetes gazdája, transzformálható in vitro.

A klónozás és transzformálás egy másik eljárása során az N-gén kódolószekvenciáját a pMDl T-DNS-vektorben lévő CaMV-35S-promóter és NOS-terminátorrégió közé klónozzuk.

»· ·« » · · • * · ·» · < « ·* · • · « ····· · •·» · · ·** » ··»·

- 38 A germinális (csírasejt szintű) Ac-kivágási eseményeket ( Ac excision events) hordozó növényeket Horsch és mtsai.

leírása szerint [ Science 227, 1229 (1985)] , Hehl által leírt módosítások alkalmazásával [ Hehl; Molecular General

Genetics 217, 53 (1989)] transzformáljuk. Ezt az eljárást az 1. példában mutatjuk be részletesen.

Ismert, hogy az Agrobacteríum turné faciensközvetítette transzformáció a Solanaceae családba tartozó növényfajok esetében hatásos, és különösen előnyösen alkalmazható. Egyéb transzformációs eljárások is alkalmazhatók, mint pl. az elektroporáció, a mikrolövedékes ill. részecskeágyú technika, továbbá alkalmazhatók liposzómák, valamint a szabad DNS felvételét fokozó vegyszerek is. A transzformáit sejtek vagy növények azonosítását rendszerint úgy tesszük lehetővé, hogy a transzformálóvektorba szelektálható markert foglalunk, vagy más módon, bebizonyítjuk a sikeres baktériumfertőzést. A transzformált növényi sejtek ismert eljárások alkalmazásával regenerálhatok teljes növénynyé .

A Solanaceae családba tartozó növények regenerálását Horsch és mtsai. [ Science 227, 1229 (1985)] részletesen leírták. A növények tenyésztett protoplasztokból történő regenerálásának leírását ld. Evans és mtsai.: Handbook of

Plánt Cell Cultures, 1. kötet, MacMillan Publishing Co. ,

New York (1983) és Vasil, I.R.: (szerk.) Cell Culture and

Somatic Cell Genetics of Plants , Acad. Press, Orlando I.

kötet (1984), és II. kötet (1986) . Ismert, hogy gyakorlatilag valamennyi növény regenerálható tenyésztett sejtekből *► ··Ί· ·· « · · ' · « · * · « * · · fi « • · * ···» · ”·· ·» ··» · ···»

- 39 vagy szövetekből.

A regenerálás módjai fajonként változóak, de először általában transzformáit protoplasztok szuszpenzióját vagy petricsészében transzformált explantátumok tenyészetét kell előállítani, melyekből kalluszszövetet alakítunk ki, és a kalluszból hajtások, majd gyökerek fejleszthetők. Más lehetőség szerint, a kalluszszövetben szomatikus embrióképződést indukálhatunk. Az ilyen szomatikus embriók a természetes embriókhoz hasonlóan csíráznak, és növényekké fejlődnek. Az alkalmazott tenyésztő táptalaj általában különböző aminosavakat és növényi hormonokat, pl. auxint és citokineket tartalmaz. A hatékony regeneráció függ az alkalmazott táptalajtól, a genotípustól, illetve a tenyészet előtörténetétől függ. Ha e három tényező kontrollált, a regeneráció rendszerint reprodukálható és megismételhető. A regenerált növényeket hagyományos módon, talajon neveljük.

Miután az expressziós kazetta stabilan beépült a regenerált transzgenikus növényekbe, ivaros keresztezés útján más növényekbe is átvihető. Erre a célra - a keresztezni kívánt fajoktól függően - a hagyományos nemesítési technikák bármelyike alkalmazható. A keresztezés eredményeként kapott növényeket felneveljük, és hagyományos módszerekkel betakarítjuk.

Az alábbiakban a találmány szerinti megoldást kísérleti példákon keresztül fogjuk szemléltetni, mely példák a találmány igényelt oltalmi körét nem korlátozzák. A példákban leírt kísérletekben a rekombináns DNS növényi szövetben történő manipulálásával, valamint a transzgenikus • · · · · · • · · · · · ··· · ···· növények tenyésztésével és regenerálásával kapcsolatban számos - szakember számára ismert - eljárást alkalmazunk.

Az enzimeket kereskedelmi forrásokból szereztük be, és a forgalmazók útmutatásai szerint - vagy más, ismert módon alkalmaztuk. A kísérletekben alkalmazott reagensek, pufferek, illetve tenyésztési feltételek szintén ismertek. A standard molekuláris biológiai eljárásokat illetően ld. a következő forrásokat: Sambrook és mtsai.: Molecular

Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring

Harbor Laboratory, Plainview, NY (1983); R. Wu (szerk.): Methods in Enzymology 218 (1993); Wu és mtsai. (szerk.):

Methods in Enzymology 100, 101; Glover (szerk.): DNA

CLoning, I. és II. kötet, IRL Press, Oxford, Egyesült Királyság (1985); Hames és Higgins (szerk.): Nucleic Acid

Hybridization , IRL Press, Oxford, Egyesült Királyság (1985). A növényi szövetek manipulálását és transzformálását illetően ld. Kung és Arntzen (szerk.) : Plánt

Biotechnology, Butterworths, Stoneham, MA (1989); R.A. Dixon (szerk.): Plánt Cell Culture: A Practical Approach IRL Press, Oxford, Egyesült Királyság (1985); Schuler és Zielinski: Methods in Plánt Molecular Biology Academic

Press, San Diego, CA (1988); Weissbach és Weissbach (szerk.) Academic Press, San Diego, CA (1988); Potrykus:

Ann. Rév. Plánt Physiol. Plánt Mól. Bioi. 42, 205 (1991);

Weising és mtsai. : Annu. Rév. Génét. 22, 421 (1988) ; van

Wordragen és mtsai.: Plánt Mól. Bioi. Rep. 1 9, 12 (1992);

Davey és mtsai.: Plánt Mól. Bioi. 13, 273 (1989); Walden és

Schell: Eur. J. Biochem. 192, 563 (1990); Joersbo és

Brunstedt: Physiol. Plánt. 81, 256 (1991); valamint a fenti forrásokban említett hivatkozások. A találmány leírásában említett hivatkozásokat teljes terjedelmükben a kitanítás részének kell tekinteni.

1. példa

Ebben a példában egy nem stabil HR mutáns izolálását írjuk le. Röviden; az N-lókusz mutációit - a kukorica Ac-transzpozon alkalmazásával - transzpozonjelöléssel (transposon tagging) izoláltuk. Ezután a dohánymozaikví rus-függő hiperszenzitív reakcióra képtelen mutánsokat pozitív szelekcióval izoláltuk, melynek során azokat az N-gént hordozó, dohány-mozaikvírussal fertőzött növényeket választottuk ki, amelyek nem voltak képesek dohánymozaikví rus-függő hiperszenzitív reakcióra (HR mutánsok). Azonosítottuk a HR mutációikra homozigóta növényeket, miáltal nem stabil HR mutációt tartalmazó mutáns vonalat azonosítottunk.

A dohány-mozaikvírus Ul-törzsét (melyet M. Zaitlintól kaptunk) dohány-mozaikvírusra érzékeny (nn genotípusú) dohánynövény kultúrnövény-változatban (cv. Petit Havana SRI; a továbbiakban SRl-dohány) szaporítottuk. A dohánymozaikví rus-fertőzéseket - a mutáns szkrínelése céljából végzett fertőzés kivételével (ld. később) - a következők szerint végeztük: a puhított - dohány-mozaikvírussal fertőzött SRl-dohányleveleket nedvét steril vízben tízszeres térfogatúra hígítottuk, és ezzel az oldattal telített szivaccsal bekentük a hatleveles fejlődési stádiumban lévő nö• · · · • · • · ....

• · · · ··· ··· ·· « • · ····· · ·· ··· · ···

- 42 vények leveleinek felső felületét. Az igy kezelt növényeken 48 óra elteltével értékeltük a helyi léziók megjelenését, majd a fertőzés után egy hetes időközönként a szisztémás fertőzés jeleit (mozaikosság) és/vagy a nekrózisos szektorok jelenlétét.

Aktív Ac-transzpozont hordozó transzgenikus dohánynövények izolálása céljából dohány-mozaikvírus-rezisztens dohánynövényt (cv. Samsun NN) - a Horsch és mtsai. szerinti eljárás [ Science 227, 1229 (1985)] módosításának [ Hehl és

Baker: Mól. Gén. Génét. 217, 53 (1989)] alkalmazásával pGV3850-HPT::pKU3-konstrukcióval transzformáltunk. A pGV3850-HPT::pKU3 transzformáló vektor neomicin-foszfotranszferáz-II-gént (NPTII) hordoz, melyet az Actranszpozon szakít meg. A pGV3850-HPT::pKU3-vektor dohánynövénybe történő bevitele után az Ac-transzpozont kivágjuk a hibás NPTII-génből, ami NPTII-expressziót eredményez, és a transzformánsok kanamicint tartalmazó táptalajon képessé válnak a növekedésre.,

Röviden; MS-táptalajon nevelt, steril, 6-8 hetes dohány-mozaikvírus-rezisztens dohánynövényekből (cv. Samsun NN) levélkorongokat készítettünk. Ezeket a korongokat pGV3850-HPT::pKU3-vektort vagy kontroll Ti-plazmidvektorokat tartalmazó - Agrobacterium tumefaciens jelenlétében 2-4 napig inkubáltuk. Ezután a levélkorongokat - 3% szacharózt és 500 mg/1 Cefotaxime-ot (Calbiochem, La Jolla, CA) tartalmazó - MS-tápközegben öblítettük, majd 3% szacharózt, 0,5 mg/1 BAP-ot (6-benzil-amino-purin) , 0,1 mg/1 NAA-t (naftalin-ecetsav) , 500 mg/1 Cefotaxime-ot és • · · · · • · • ··· · · · · · · • · · ··«·· · ··· ·· ··· · ···

- 43 200 mg/1 kanamicint vagy 20 mg/1 higromicint tartalmazó MS-táptalajra helyeztük. 2-3 hét elteltével a hajtásokat az előzővel azonos összetételű, de 2 mg/1 koncentrációjú BAPot tartalmazó táptalajra helyeztük át. 1-2 hét múlva a hajtásokat ismét a fentivel azonos - de a gyökérképződés elősegítése érdekében hormonokat nem tartalmazó - táptalajra helyeztük át. Újabb 10-15 nap elteltével a növényeket talajba ültettük. A transzgenikus kalluszokat 100 mg/1 kanamicint tartalmazó táptalajon regeneráltuk, hogy kiszelektáljuk azokat a transzgenikus szöveteket, amelyek Actranszpozonokat tartalmaznak [Baker és mtsai., (1987), ld. fentebb] . A KnR primer transzgenikus növényekből (T0 generáció) genomi DNS-t izoláltunk.

Megállapítottuk, hogy az Ac-transzpozon a TO-3 növényben (pGV3850-HPT::pHU3) nagyon aktív, mivel ez a növény 100 mg/1 koncentrációjú kanamicinre rezisztens, és fokozott kópiaszámú Ac-transzpozont tartalmaz (amit Southern hibridizációval határoztunk meg). A T0-3 növényt a Samsun

NN változattal kereszteztük. A keresztezésből származó TI növények közül hármat (Tl-9, Tl-10, Tl-13; melyekről megállapítottuk, hogy transzpozícióra képes Ac-elemeket tartalmaznak) dohány-mozaikvírusra érzékeny (nn), Petite Havana

SRI (SRI) változatba tartozó dohánynövényekkel kereszteztük, miáltal három FI Nn::Ac-populációt kaptunk, melyeket a dohány-mozaikvírus-függő hiperszenzitív reakció elmaradására vizsgáltunk. Az endogén N-gén instabilitásának megállapítása érdekében, a Samsun NN és az SRI növények keresztezésével - Ac-transzpozon nélküli - Nn-populációt is létre• · · hoztunk.

HR mutánsok izolálása céljából hozzávetőleg 64000

Nn::Ac magvat és 29000 Nn magvat - tálcánként kb. 2000 magvat, kb. 3 esiranövény/cm² sűrűségben - vetettünk el. A nyolc hetes csíranövényeket 30 °C-ra helyeztük, és festékszóró (Paasche, VL) segítségével dohány-mozaikvírus és

Celite (Fischer, Pittsburgh, PA) szuszpenziójával fertőztük [ R.W. Fulton: Nicotíana: Procedures fór Experimental

Use, 79-86. old. (1979)] . A dohány-mozaikvírus koncentrációja elegendő volt ahhoz, hogy a - kb. 3 csíranövény/crh sűrűséggel palántáit és 24 °C-on tartott - Samsun NN csíranövényeken helyi leziokat eredményezzen (cm -énként egyet). A fertőzött SRl-növények leveleiről a dohány-mozaikvírust Lane leírása szerint [ Methods in Enzymology 118, 687 (1986)] izoláltuk. A fertőzés utáni harmadik napon a csíranövényeket 30 °C-ról 21 °C-ra helyeztük, és az ötödik napon értékeltük a csíranövények túlélését. A dohánymozaikví russal végzett fertőzés és hőmérsékletváltoztatás három ciklusa közül a másodikban már kezdett megmutatkozni a 100%-os fertőzöttségi arány.

1. táblázat

HR mutánsok izolálása

Keresztezés	Vizsgált növények száma	HR mutánsok	Gyakoriság1
Samsun NN x nn	29000	11	3,8 x 10 4
Tl-9b, Tl-10b	64000	36	5, 6 x 10~4
és Tl-13b x nn
Összesen:	93000	47	5,0 x 10~4

• · · · · • · · · · · • · · ····· ·

- 45 ^a A gyakoriságot úgy számítottuk ki, hogy a HR növények számát elosztottuk az egyes keresztezésekből kapott FI növények számával;

^bAktív Ac-transzpozonokat hordozó Samsun NN növények.

Két növénypatogén baktériumtörzset [ a Pseudomonas syringae pv. tomato (P.s.t.) DC3000-törzset és a P.s. pv.

phaseolica (P.s.p.) NP53121-törzset] , valamint a nem patogén P.s.t. DC3000 hrpS::Tn5-törzset kétszer desztillált vízben, lxlO⁸ sejt/ml mennyiségben szuszpendáltuk (mindegyik törzset B. Staskawicz-tcl kaptuk). 10 ml-es fecskendő és 20-as tű alkalmazásával a három baktériumszuszpenziót, valamint egy desztillált víz kontrollt a növények egy levele fonákjának négy különböző helyére injektáltuk [ Z. Klement in: Methods in Phytobacteriology (szerk.: Klement és mtsai.), 101-102. old., Akadémia Kiadó, Budapest, Magyarország (1990)] . A kísérletekhez a következő genotípusok mindegyikéből három növényt alkalmaztunk: 9 HR mutáns önmegtermékenyítéssel kapott, Nt-lG/g genotípusú utódai, két dohány-mozaikvírusra érzékeny dohányváltozat (SRI és Xanthi) és két dohánymozaikvírus-rezisztens dohányváltozat (NN és Xanthi ne) .

A leveleken - a fertőzés után 48 órával - a négy különböző kezelésre adott reakciót értékeltük.

A pozitív szelekciós módszer lehetővé teszi, hogy az Nn-csíranövények nagy populációjából olyan mutánsokat izoláljunk, amelyek nem képesek dohány-mozaikvírus-függő hiperszenzitív reakcióra. A mutánsszelekciós módszer azt használja ki, hogy az N-gént hordozó dohány• · · · « · · · · · • ··· ··· ·· · • · · ····· · • · · ·· ··· · ···

- 46 mozaikvírussal fertőzött és 28 °C feletti hőmérsékleten tartott - növényekben a hiperszenzitív reakció kifejeződése gátolt. A funkcionális N-gént hordozó növényekben 28 °C feletti hőmérsékleten nem alakulnak ki helyi léziók, és a dohány-mozaikvírus az egész növényben szétterjed. A hiperszenzitív reakció gátlása reverzibilis, és a dohánymozaikvírussal fertőzött, N-gént hordozó növények letális szisztémás nekrózist (szisztémás hiperszenzitív reakciót) mutatnak, ha a hőmérsékletet 24 °C-ra csökkentjük. Ez pozitív mutánsszelekció, mivel várhatóan csak azok a növények maradnak életben, amelyek elveszítették azon képességüket, hogy dohány-mozaikvírus-függő hiperszenzitív reakciót mutassanak (HR mutánsok).

A Samsun NN, illetve három NN::Ac növény SRldohánynövénnyel végzett négy független keresztezésének eredményeként kapott heterozigóta (Nn) FI csíranövények közül 47 HR mutánst izoláltunk. A dohány-mozaikvírussal fertőzött HR növényeket összesen 93000 FI csíranövény közül kaptuk. A Samsun NN törzzsel végzett kontroll keresztezésből származó 29000 csíranövény közül 11 mutánst, míg a három NN::Ac keresztezésből származó 64000 csíranövény közül 36 mutánst izoláltunk (1. táblázat) . A dohánymozaikvírussal szembeni rezisztencia elvesztésének gyakorisága a Samsun NN és NN::Ac Nn utódai esetében hasonló (3,8x10 , illetve 5,6x10 ) volt. Az Ac-transzpozont tartalmazó, illetve azt nem tartalmazó Nn-populációkból a HR mutánsok hasonló kinyerési gyakorisága arra utal, hogy az

N-gén endogén mutációs rátája nagyon magas.

• · · ·

Annak meghatározása érdekében, hogy a HR mutánsok hiperszenzitív reakció kifejtésére vonatkozó - általános képességük hibás-e, kilenc mutáns (köztük a C2-2) utódait két olyan patogén baktériummal fertőztük, amelyekről ismert, hogy dohányon hiperszenzitív reakciót váltanak ki. A patogén Pseudomonas syringae pv. tomato (P.s.t.) DC3000törzs és a szintén patogén P.s. pv. phaseolica (P.s.p.) NP53121-törzs valamennyi esetben hiperszenzitív reakciót váltott ki, míg a nem patogén P.s.t. DC3000 hrpS::Tn5törzs, illetve a desztillált víz kontroll nem váltott ki ilyen reakciót. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a HR mutánsokból nem hiányzik a patogén baktériumokkal szembeni hiperszenzitív reakció megnyilvánulási képessége, és a HR fenotípus valószínűleg specifikus a dohány-mozaikvírusrezisztencia-reakcióra.

A HR mutációikra homozigóta növények azonosítása céljából 15 mutáns önmegtermékenyítéssel kapott utódait molekuláris szinten vizsgáltuk. Az egyes mutánsok 27-64 - önmegtermékenyítéssel kapott - utódaiból DNS-t izoláltunk, az izolált DNS-t EcoRI-gyel emésztettük, majd az N-kötött Nt-1 RFLP-próbával hibridizáltuk [ Hehl és Baker: The Plánt Cell

27, 709 (1990)] . Az Nt-1 egy olyan RFLP-t (Nt-IG) határoz meg, amely a N. glut ínosa-bói került a dohány-mozaikvírusrezisztens Samsun NN dohánynövény-változatba. Az Nt-1G a

Samsun NN változatban Nt-IT homológját helyettesíti, és az N-lókusztól <0,25 cM távolságra helyezkedik el. Feltételeztük, hogy a 2. táblázatban felsorolt mutáns vonalak HR mutációikra homozigóták, mivel homozigóták a szorosan kap• · · · ·

- 48 csőit Nt-lG-markerre, illetve az Nt-lG-marker deléciójára.

Az Ac-indukálta mutációkra jellemző, hogy gyakran nem stabilak. A HR fenotípus stabilitását 15 homozigóta mutáns vonal önmegtermékenyítéssel kapott utódaiban vizsgáltuk. Az egyes vonalak esetében 95-150 utódot fertőztünk meg dohány-mozaikvirussal, és értékeltük a növények fenotípusát. Az egyik mutáns vonal utódaiban (Dll-1) a HR fenotípus nagy gyakorisággal instabil volt. Az értékelt 145 Dll-l-növény közül 20 dohány-mozaikvírus-rezisztens (TM^R) , 68 pedig dohány-mozaikvírusra érzékeny (TMV‘) volt. Érdekes, hogy 57 növényben dohány-mozaikvírusra érzékeny háttéren nekrózisos szektorok voltak láthatók (TMV fenotípus; ld. 2. táblázat). A léziót utánzó mutánsok nekrózisos szektorokat is mutatnak. Az ilyen mutánsok esetében a nekrózis általában - nekrózisos reakciókat kiváltó abiotikus vagy biotikus faktorok hiányában - spontán fejeződik ki [V.

Walbot és mtsai.: Genetic Engineering of Plants, 431-442.

old. (1983)] . A Dll-l-utódokon - és az itt leírt vizsgálatban alkalmazott egyéb populációkon - megfigyelt nekrózisos szektorok megkülönböztethetők a léziót utánzó fenotípustól, mivel ezek dohány-mozaikvírus-fertőzéstől függnek. E populacioban a TMV és TMV fenotípusú növények azonosítása azt mutatta, hogy a HR mutáció nem stabil. A TMV^R és TMV^R/S fenotípust a többi 14 mutáns vonal utódaiban nem észleltük (2 . táblázat) .

• · · · · • ··· ··· ·· · • · · ····· · ··· ·· ··· · ···

- 49 2. táblázat

Instabil HR mutáns vonal azonosítása

Vonal3	Mutáns szülőb	tmvr	Fenotípus' tmvr/s	TMVS	Ös szesend
D2-2	C3-2	0	0	144	144
D6-2	C3-6	0	0	126	126
D9-2	Cl-1	0	0	125	125
Dll-1	C2-2	20	57	68	145
D12-6	C2-3	0	0	134	134
D13-3	C2-5	0	0	149	149
D15-3	C2-7	0	0	133	133
D16-3	C2-9	0	0	134	134
D17-2	C2-10	0	0	143	143
D21-1	C2-16	0	0	95	95
D23-5	C2-19	0	0	148	148
D24-2	C2-20	0	0	111	111
D26-2	C2-21	0	0	144	144
D27-2	C2-22	0	0	150	150
D28-2	C2-23	0	0	150	150
Samsun NN	na	150	0	0	150
SRI	na	0	0	150	150

na: nem alkalmazható;

Az e kísérletekben tesztelt vonalak az FI nemzetségbe tartozó Nn-mutánsok - önmegtermékenyítéssel kapott - utódai voltak. Ezek a növények az N-kötött Nt-IG RFLP-re homozigóták .

• · · · · · · • · · · ··· ·· · • · · · ·♦·· · ··· · · ··· · ··»·

FI mutáns ős; A Cl-X ősök a Tl-9 x SRI keresztezésből, a

C3-X ősök a Tl-10 x SRI keresztezésből, a C2-X ősök pedig a

Tl-13 x SRI keresztezésből származnak.

^G Az egyes homozigóta mutáns vonalak - önmegtermékenyítéssel kapott - utódait egyenként 50 csíranövényt tartalmazó tálcákon csíráztattuk. A csíranövényeket kb. hat hetes korukban dohány-mozaikvírus Ul-törzzsel fertőztük, és a fertőzés után 48 órával, majd egy hetes időközönként értékeltük fenotípusukat. A Samsun NN, illetve SRI vonalat a TMV^R, illetve a TMV^S fenotípus kontrolljaként alkalmaztuk.

A fenotípusokat a következők szerint rövidítettük: TMV^R (dohány-mozaikvírussal szemben rezisztens); TMV^R (dohánymozaikví rusra érzékeny); és TMV^R/t (dohány-mozaikvírusra érzékeny háttéren dohány-mozaikvírus-függő, nekrózisos szektorok) .

^d Az egyes vonalakba tartozó - megfertőzött és fenotípusra vizsgált - csíranövények összes száma.

Az 1. ábrán a Dll-1 instabil mutáns vonalban a dohány-mozaikvírus-fertőzés után megfigyelt három különböző fenotípust mutatjuk be. Az 1/A ábrán bemutatott levél dohány-mozaikví rusra rezisztens növényről származik, és dohány-mozaikví rusra rezisztens (HR*) növényre jellemző léziók láthatók rajta. Az 1/B ábrán bemutatott levél dohány-mozaikví rusra érzékeny növényről származik, és váltakozó világos- és sötétzöld területek látható rajta (mozaikosság) . Az 1/C ábrán látható levél TMV^R'^b fenotípust mutat, amelyre nekrózisos és mozaikos területek jellemzők.

A TMV^r fenotípusú levéllel ellentétben, az TMV^R/fa levélen • · ♦ · •·· · · · • · · ····· · ··· · ♦ ··· · · · · ,

- 51 látható nekrózis nem korlátozódik elhatárolt léziókra. Az 1/C ábrán bemutatott TMV^R/b fenotípusú levélen kis nekrózisos foltok láthatók, azonban találkoztunk olyan növénnyel is, amelyen a nekrózis fél levelekre és teljes levelekre is kiterjed, és az egész száron felfut. A Dll-1 utódaiban megfigyelhető TMV es TMV' fenotípus azt jelzi, hogy ebben a mutáns vonalban a HR mutáció instabil.

2. példa

Ebben a példában olyan teszteket mutatunk be, amelyekkel meghatározható, hogy a TMV fenotípus két olyan Ac-transzpozonnak tulajdonítható-e, amelyek az N-kötött Nt1G RFLP-markerrel együtt szegregálódnak.

Ha másképp nem jelezzük, a DNS-DNS-híbridizációhoz a cél-DNS-t megtisztítjuk és egy vagy több restrikciós endonukleázzal emésztjük. Az emésztett DNS-t agarózgélelektroforézissel méret szerint frakciónáljuk, majd Nytran-membránra (Schleicher & Schuell, Keene, NH) blottoljuk. A hibridizációs próbákat random láncindító hexamerek alkalmazásával állítjuk elő, és [ ³^P] -dCTP-vel, illetve Klenow-polimerázzal jelöljük. A szigorú hibridizáció standard feltételei a következők: 50%-os formamid, 5xSSC és 5xDenhardt' s-oldat jelenlétében, 42 °C-on végzett hibridizáció, és 65 °C-on 0,lxSSC és 1 vegyes% nátriumdodecil-szulfát (SDS) elegyében végzett mosás.

A nem szigorú hibridizáció standard feltételei: 35 °C-on 50%-os formamid, 5xSSC és 5xDenhardt' s-oldat alkalmazásával végzett hibridizáció, és 50 °C-on 0,lxSSC és 1% SDS alkalmazásával végzett mosás.

Az N-kötött Nt-IG RFLP izolálása érdekében, az

RFLP-analízishez SRI növényekből - áthelyezett Ac-elemek hibridizációs helyeiként - izolált DNS-fragmenseket alkalmaztunk [ Hehl és Baker: Mól. Gén. Génét. 217, 53 (1989);

Hehl és Baker: The Plánt Cell 2, 709 (1990)] . Az egyik DNSfragmens (Nt-1) a TMV^b fenotípusú SRI-dohányváltozat és a TMV^r fenotípusú Samsun NN dohányváltozat közötti RFLP-t detektál. A 2/A ábrán egy 1,2 kb-os BglII/HindlII NT-1fragmens - három diploid dohányfajból; a N. glutinosa-ból (amely az N-gén forrása), a N. sylvestris-ből, és a N. tomentosiformis-ból (2/A ábra, 1., 4., ill. 5. oszlop); valamint a Samsun NN és SRI N. tabacum termesztett változatból (2/A ábra, 2. és 3. oszlop) származó -, EcoRI-gyel emésztett genomi DNS-hez történő hibridizációjának eredményeit mutatjuk be. Az Nt-1 az egyes diploid dohányfajokra specifikus RFLP-ket detektál. A 13,1 kb-os DNS-fragmens a

Samsun NN és SRI változatban, illetve a N. sylvestrísben található meg (2/A ábra, 2., 3. és 4. oszlop). A 15,5 kb-os DNS-fragmens a N. tomentosiformis-ban és az SRI változatban van jelen (2/A ábra, 5. és 3. oszlop), míg a

14,3 kb-os DNS-fragmens a N. glutinosa-ban és a Samsun NN változatban található (2/A ábra, 1. és 2. oszlop). A

Samsun NN változatból hiányzik a 15,5 kb-os N.

tomentosiformis RFLP-je (Nt-IT), de a N. glutinosa 14,3 kbos RFLP-jével (Nt-IG) azonos méretű RFLP-t hordoz.

Az Nt-IG és az N-gén közötti kapcsolatot - a

Samsun NN és az SRI változat keresztezéséből származó -

• ·· • · ·

420 TMV fenotípusú F2 utódban teszteltük, melyek dohánymozaikvírus-rezisztenciára és -érzékenységre 3:1 arányban, az Nt-IG és Nt-IT RFLP-kre pedig 1:2:1 arányban szegregálódtak. A dohány-mozaikvírusra érzékeny F2 növényekből származó DNS-t EcoRI-gyel emésztettük, és Nt-l-gyel hibridizáltuk. Az egyik - dohány-mozaikvírusra érzékeny növény tartalmazott Nt-IG RFLP-t, ami azt bizonyítja, hogy az Nt-IG nagyon szorosan kapcsolódik az N-génhez (a kettő közötti távolság <0,25 cM).

Az N-kötött RFLP-vel (Nt-IG)) két Ac-transzpozon zz R / ^C· z szegregalodott együtt. Ha a TMV ' fenotipus az N-gén mutálható alléljétől függ, ennek a fenotípusnak az N-lókuszhoz kapcsolódó molekuláris markerrel együtt kellene szegregálódnia. A TMV^R/“ fenotípus - N-kötött Nt-IG markerrel együttes - szegregálódását a C2-2 jelölésű instabil HR mutáns és az SRI dohánynövény tesztelő keresztezésével kapott utódokban vizsgáltuk. A tesztelő keresztezéssel kapott utódokat (melyeket Dl11-populációnak nevezünk) dohány-mozaikvírussal fertőztük, és értékeltük fenotípusukat. A 264 vizsgált Dili-növény közül 164 volt érzékeny a dohány-mozaikvírusra (TMV), míg 80 növény - dohány-mozaikvírusra érzékeny háttéren - nekrózisos szektorokat mutatott. Vad típusú, dohány-mozaikvírus-rezisztens növényeket nem találtunk. A 80 Dili-növény DNS-ét EcoRI-gyel emésztettük, és Nt-l-gyel hibridizáltuk. Ezután meghatároztuk a növények Nt-1 genotípusát, és azt találtuk, hogy 39 növény Nt-IG/T genotípusú, míg 41 növény Nt-IT/T genotípusú volt (ld. 3. táblázat) . A 26, TMV^K/' fenotípusú növény Nt··· · · · · φ

- 54 lG-markert tartalmazott, míg az Nt-IT/T genotípusú növények TMV^S fenotípusúak voltak (3. táblázat). Ezek az eredmények azt jelzik, hogy - a nekrózisos szektorok létrehozásának képessége alapján meghatározott - instabil HR mutáció az Nt-lG-markerhez kapcsolódott.

Mivel az instabil HR mutáció az Nt-lG-markerhez kapcsolódott, azt vizsgáltuk, hogy a Dl 11-populációban egy Ac-transzpozon együtt szegregálódik-e az Nt-IG RFLPmarkerrel. EcoRI-gyel emésztett Dlll-DNS-t az Actranszpozon 5'-végéről származó próbával hibrid!záltűk. Két - Ac-próbával hibridizálódó - sávról (Ac8, amely egy 8,0 kb-os EcoRI Ac-sáv; és AclO, amely egy 10,2 kb-os EcoRI Acsáv) kimutattuk, hogy együtt szegregálódnak az Nt-IGmarkerrel. Harminc Nt-1G/T növény Ac8-at és AclO-et egyaránt tartalmazott, további öt növény Ac*-ot, három növény pedig AclO-et tartalmazott, egy növényben pedig egy elemet sem találtunk (ld. 4. táblázat). A 41 Nt-IT/T növényben Ac8 és AclO nem volt jelen, ami arra utal, hogy ez a két Actranszpozon Nt-lG-hez kapcsolódott.

A 3. és 4. táblázatban összefoglalt Southern hibridizációs eredmények egy-egy példáját a 2/B, illetve 2/C ábrán mutatjuk be. A 2/B ábrán az Nt-l-marker 14 Dlllnövény - EcoRI-gyel emésztett - DNS-éhez történő hibridizálódásának eredményeit mutatjuk be. A 14 növény közül 10 heterozigóta Nn, Nt-1G/T genotípusú volt, amit a 14,3 kb-os Nt-IG RFLP és a 15,5 kb-os Nt-1T RFLP jelenléte bizonyít (2., 4-11. és 14. oszlop) . E tíz növény közül hat TMV^R/b fenotípusú volt (2., 4., 7., 9., 11. és 14. oszlop) . A 14 • ·· ····· · · • · · V · · • ··· ··· · · · • · · · · · * · · • · · ·· ··· · ··· növény közül négy növény homozigóta nn, Nt-IT/T genotípusú volt, amit a 15,5 kb-os Nt-IT RFLP jelenléte, illetve a 14,3 kb-os Nt-IG RFLP hiánya bizonyít (1-, 3., 12. és 13.

oszlop). A négy Nt-IT/T genotípusú növény nem TMV^R/S fenotípusú volt. Ezt követően, ezeket a DNS-eket az 5'-Acpróbával hibridizáltuk (ld. 2/C ábra). Mind a tíz Nt-IG/T genotípusú növény esetében kimutatható a 8,0 kb-os Ac-sáv (Ac8), miközben e tíz növény közül hétben megtalálható a

10,2 kb-os AclO is (2., 4., 7., 8., 9., 11. és 14. oszlop).

Az Nt-IT/T genotípusú növények sem a 8,0 kb-os, sem a 10,2 kb-os Ac-RFLP-t nem tartalmazzák, más Ac-transzpozonokat azonban igen.

3. táblázat

Az instabil HR fenotípus együttes szegregációja az Nkötött RFLP-vel (Nt-IG)

Nt-1 b genotípus'	TMV tmvr	fenotípusd	Összesen
tmvr/s	TMVS
Nt-IG/T	0	26	13	39
Nt-IT/T	0	0	41	41

^a Az instabil HR mutáns (C2-2) és az SRI dohánynövény keresztezéséből származó 80 növényt (a Dl11-populációt) dohány-mozaikvírussal fertőztük, és - a 2 . táblázatnál leírt módon - értékeltük fenotípusukat.

^b A Dili-növényekből származó DNS-t EcoRI-gyel emésztettük, és Nt-l-markerhez hibridizáltuk.

• t · · · • · · ··· ··

4. táblázat

Két Ac-transzpozon együttes szegregációja az Nt-IGmarkerrel

Nt-1 genotípus	Együtt szegregálódó Ac-sávokd,b AclO/8 AclO Ac8	Összesen
Nt-1G/T Nt-lT/T	30 0	3 0	5 0	1 41	39 41

Az Nt-1 hibridizáció után az - EcoRI-gyel emésztett Dlll-DNS-eket tartalmazó Southern-lenyomatokat csíkokra vágtuk, és 5'-Ac-próbával hibridizáltuk.

^b Két olyan Ac-sávot azonosítottunk, amelyek az Nt-IGmarkerrel együtt szegregálódtak, azonban a legtöbb növény további 3-8 Ac-kópiát tartalmazott.

3. példa

Ebben a példában olyan tesztet mutatunk be, amelylyel meghatározható, hogy az instabil HR mutációért az Ac8- és az AclO-transzpozon közül melyik a felelős.

A C2-2 HR mutáns - önmegtermékenyítéssel kapott utódai közül egy olyan germinális revertánst (csírasejt szinten a vad típushoz visszatérő egyed; germinal revertant) (D112-15) azonosítottunk, amely az Nt-lG-re homozigóta volt, és Ac8- és Acl0-transzpozont egyaránt tartalmazott. Mivel e növényben mind az Ac8, mind az AclO jelen volt, feltételeztük, hogy az N-gén egyik transzpozonnal kapcsolódó - allélja csírasejt szinten visszatér a vad típushoz, míg a másik alléi továbbra is ·· ·· · · • · · a · · · · » · ·· · * ·· <· tartalmaz Ac-transzpozont, és így megvan a lehetősége a visszatérésre. A D112-15 növényt SRI növénnyel kereszteztük, hogy megvizsgáljuk, vajon az Ac8 vagy AclO kivágása összefüggésben van-e a rezisztencia visszaállásával és a HR mutáció instabilitásával. Azt vártuk, hogy az e keresztezésből származó utódok (E501-populáció) a TMV^R és TMV^S + TMV^R/S fenotípusra kb. 1:1 arányban szegregálódnak, és Nt1G/T genotípusúak. Azt vártuk továbbá, hogy az N-gén instabil mutációjáért felelős Ac-transzpozon - a keresztezésből származó - valamennyi rezisztens utódból hiányozni fog. 95 E501-növényt dohány-mozaikvírussal fertőztünk, majd értékeltük a növények fenotípusát. A 95 növény közül 54 TMV^R fenotípusú volt; 21 növényen nekrózisos szektorokat észleltünk; a többi 20 növény pedig TMV^b fenotípusú volt (ld. 5. táblázat). Az e növényekből származó DNS-t EcoRI-gyel emésztettük, és próbaként Nt-l-marker, majd az 5'-Ac-próba alkalmazásával teszteltük. Megállapítottuk, hogy mind a 95 növény Nt-IG/T genotípusú volt. Lényeges, hogy az 54 dohány-mozaikví rus-rezisztens növény egyikében sem mutattuk ki a 10,2 kb-os EcoRI Ac-sávot, de a 8 kb-os sáv 52 növényben jelen volt (5. táblázat). A dohány-mozaikvírusrezisztens E501 utódokban az Ac8-transzpozon jelenléte, illetve az AclO-transzpozon hiánya arra utal, hogy az AclO az az elem, amely az instabil HR mutációt okozza, és így ez kapcsolódik ( tagging ) az N-lókuszhoz.

·· ·· « ·

- 58 5. táblázat

Az AclO-transzpozon és a HR mutáció közötti összefüggés

N-kötött Ac- transzpozon	TMV fenotípusa,b
tmvr	tmvr/s	TMVS
AclO	0	1	1
Acl0/Ac8	0	18	1
Ac8	52	1	18
-	2	1	0

^a A TMV^r fenotipusú germinális revertáns (D112-15) és az SRI dohánynövény keresztezéséből származó 95 növényt (az E501-populációt) dohány-mozaikvírussal fertőztük, és - a 2. táblázatnál leírt módon - értékeltük fenotípusukat.

^b Az E501-növényekből izolált DNS-t a Southern analízishez EcoRI-gyel emésztettük, és 5'-Ac-próbával hibridizáltuk.

A Dili- és E501-populációban az Ac-transzpozon kópiaszáma magas, ami esetleg eltakarhatja az Nt-lG-vel együtt szegregálódó egyéb Ac-elemeket. Azonosítottunk egy TMV fenotipusu növényt (E501-70), amely csak az AclO-et tartalmazta. Annak igazolása céljából, hogy az AclOtranszpozon egymagában képes az instabil HR mutáció előidézésére, e növény önmegtermékenyítéssel kapott utódait (F501-populáció) - dohány-mozaikvírus-fertőzést követően fenotípusukra, AclO-transzpozon jelenlétére, illetve Nt-1 genotípusukra vizsgáltuk. 500 vizsgált növény közül 7 TMV^R fenotípus növényt kaptunk. A molekuláris szintű vizsgálat azt mutatta, hogy három TMV^R növény heterozigóta volt az • ·· ··»· V ·» ·· · · · · · • «·μ ·»« λ « « • · · · ···· · ··► ·4 ··« « ····

Nt-lG-re, melyek egyike sem tartalmazott AclO-sávot, míg négy TMV^R növény Nt-IG/G genotrpusú volt, és ezek tartalmazták az AclO-sávot. Hasonlóan a D112-15 növény esetéhez, itt is feltételeztük, hogy az Nt-IG/G homozigótákban az Achibridizáció az N-gén egy mutáns allélja jelenlétének köszönhető (ezekben a növényekben és a revertánsokban egyaránt) .

Az E501- és F501-populációban összefüggés tapaszP / ^c falható az AclO jelenlete és a TMV' fenotípus között. 21 TMV^R/S fenotrpusú E501-növény közül 19 mutatott Achibridizációt, és a 12 - molekuláris szinten analizált TMV^r/s fenotrpusú F501-növény mindegyike tartalmazta a 10,2 kb-os Ac-sávot. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a növényeknek szükségük van az AclO jelenlétére ahhoz, hogy nekrózisos szektorokat hozzanak létre, és hogy fenntartsák a rezisztenciához való szomatikus visszatérés lehetőségét. Az

Ac-hibridizáció nélküli, szektoros növényekből származó szövet DNS-e valószínűleg több kivágást tartalmaz, így a

10,2 kb-os Ac-sáv Southern-blot-hibridizációval nem mutatható ki .

A Dili- és E501-populációban egy 2,3 kb-os EcoRIsáv (amely 3'-Ac-próbához hibridizálódott) a 10,2 kb-os 5'Ac-sávval azonos viselkedésű volt. Mivel az Ac 4,6 bp hoszszúságú, egy 7,9 kb-os [ vad típusú vagy kivágásos (excision)] EcoRI-f ragmens származtatható. Valószínűnek tartjuk, hogy a TMV¹' fenotípusú revertánsokban ez a fragmens helyreállítódik. A genomi inszerciós és kivágásos fragmensek jelenlétének tesztelése érdekében a - csak AclO60 et és Ac8-at (2/C ábra, 9. oszlop) tartalmazó - Dlll-95 növényből, fordított polimeráz-láncreakcióval (inverse polymerase chain reaction; IPCR) AclO-et szegélyező genomi szekvenciákat izoláltunk (ld. 4. példa).

A - csak AclO-et és Ac8-at tartalmazó - Dlll-95 növényből származó templát-DNS-t Hpall-vel emésztettük, ligáltuk, majd Clal-gyel linearizáltuk. A polimerázláncreakciókat 50 μΐ térfogatban, Taq-polimeráz (Promega,

Madison, WI) alkalmazásával, Perkin-Elmer Thermocycle PCR-készüléken (Emeryville, CA), a következő feltételekkel végeztük: 35 cikluson keresztül 94 °C-on 1 perc; 55 °C-on 1 perc és 72 °C-on 2 perc. Az Ac-specifikus CC28 (4' CACGGATCCATACGATAACGGTCGGTACGGGA-3' ) és CC32 (5' CACGAATTCGGAAACGGAAACGGTAGAGC-3' ) láncindító alkalmazásával

419 bp-os terméket (AclO-1) amplifikáltunk, amely az AclOtől 5' -irányban helyezkedett el. Az AclO 3' -oldali szegélyező szekvenciájának (AclO-2) amplifikálása érdekében a

Dl11-95-DNS-t EcoRI-gyel emésztettük, ligáltuk, majd Acclgyel linearizáltuk. A CC21-láncindító (5' CACCTGCAGAGATCTTTACCGACCGTTACCGACCG-3' ) és a CC30láncindító (5' -CACCTGCAGAGATCTGCAGGCTTATAATATAAGGC-3' ) alkalmazásával egy 122 bp-os terméket amplifikáltunk. Az IPCR-termékeket TA-klónozóvektorba (Invitrogen, San Diego,

CA) klónoztuk.

Az Ac-transzpozon 5' -végéről egy 400 bp-os IPCRterméket (AclO-1) izoláltunk, melyet TA-klónozóvektorba klónoztunk és szekvenáltunk. Az ál-Ac-hibridizáció lehetőségének csökkentése céljából - Ac-szekvenciákat nem tártál- 61 mazó AclO-1-próba előállítása érdekében - PCR-láncindítókat szintetizáltunk. Az Acl0-1-szekvenciát dohánynövény genomi DNS-ének próbájaként alkalmazva ismétlődő szekvenciákat detektáltunk. A Dll-1 növény DNS-ében a 10,2 kb-os inszerciós Ac-sávhoz történő hibridizációt figyeltünk meg, azonban a kikövetkeztetett 7,9 kb-os kivágásos EcoRI-sáv - a próba ismétlődő természete miatt - nem volt felismerhető. Az AclO

3' -végéről kapott IPCR-klón (AclO-2) 1118 bp hosszúságú volt, és próbaként megbízhatatlannak bizonyult.

A C7 cDNS-klón 3' -végéről (5020-5370. bázisok) egy megbízható, kis kópiaszámú próbát (N-5) kaptunk, amely az 1. azonosítószámú szekvencia 6587-6600., 6934-6948. és

6977-7270. bázisainak felel meg. Az E501- és F501-populáció molekuláris analízisét EcoRI alkalmazásával folytattuk. A két populációból származó DNS-eket EcoRI-gyel emésztettük, majd Ac- és Ν-5-próbával hibridizáltuk. Az Ac-próba egy

10,2 kb-os EcoRI-sávhoz hibridizálódott, amely az E501- és

F501-populációban az AclO-nek felel meg. Az Ac-próba - instabil HR mutációt hordozó vonal egyes generációiból kiválasztott egyedek - DNS-éhez történő hibridizálásának eredményeit a 3/C ábrán mutatjuk be. Az SRl-növények, a N. glutinosa, illetve a Samsun NN növények kontroll DNS-ével

Ac-hibridizációt nem tapasztaltunk. Az eredeti HR mutáns (C2-2) - legalább két másik Ac-transzpozonon kívül - egy

10,2 kb-os sávot mutat. A D112-15 germinális revertáns a

10,2 kb-os Ac-sáv mellett legalább 10 egyéb Ac-transzpozont tartalmaz. A D112-15 TMV fenotípusú utóda, az E501-70, csak a 10,2 kb-os AclO-sávval rendelkezik. Az E501-70 két

I • · · · ·

TMV^r fenotípusú, germinális revertáns utóda (F501-65 és F501-66) nem mutat 10,2 kb-sávot. Az F501-65 egy új Acinszerciót tartalmaz, míg az F501-66 már nem mutat Achibridizációt. Az F501-2, F501-3 és F501-4 jelzésű szektoros növények mindegyike tartalmaz még AclO-inszerciót. Az F501-48 és F501-64 a TMV^S fenotípusú növények két olyan példája, amelyek AclO-hibridizációt már nem hordoznak. Az F501-48 növény már nem tartalmaz Ac-hibridizációt, míg az F501-64 új inszerciót hordoz.

Mivel az Ac hosszúsága 4,6 kb, abban az esetben, ha próbaként Ν-5-öt alkalmazunk, 7,9 kb-os - vad típusú vagy kivágásos - fragmensre következtethetünk. Az Ν-5-próba hibridizációjának példáit a 3/B ábrán mutatjuk be. Az N-5próba a N. glutinosa és a Samsun NN változat esetében egy

7,9 kb-os sávhoz hibridizálódik. A C2-2 HR mutáns DNS-e egy 10,2 kb-os AclO inszerciós sávhoz hibridizálódik, a 7,9 kb-os sávhoz pedig gyenge hibridizációt mutat. A D112-15

DNS-e a 10,2 kb-os és 7,9 kb-os sávokkal egyaránt rendelkezik. Az F501-65 és F501-66 germinális revertánsok csak a

7,9 kb-os sávot tartalmazzák. E növények genotípusa Nt1G/T, így csak egy olyan N-allélt tartalmaznak, amely viszszaváltozott. Az egyéb revertánsok, mint pl. a D112-15, amely Nt-IG/G genotípusú, inszerciós és kivágásos fragmenseket egyaránt tartalmaz. Az F501-2, F501-3 és F5014 DNS-e a 10,2 kb-os és 7,9 kb-os RFLP-t egyaránt tartalmazza. Az F501-48 és F501-64 csak a 7,9 kb-os kivágásos fragmenst tartalmazza.

• · · · · • · • ·

- 63 Lényeges, hogy a D112-15 növény 54 - TMV^R fenotípusú - E501 utódja tartalmazta a 7,9 kb-os EcoRI kivágásos sávot, csakúgy, mint a 7 TMV^R fenotípusú F501 utód. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a rezisztencia visszaállásához szükség van a genomi DNS-szekvenciák vad típusúvá történő visszaalakulására. Ezenkívül, az eredmények azt bizonyítják, hogy az N-gén egy mutáns allélja a D112-15 növényben germinálisan visszatért a vad típushoz, és az N-gén funkciójának helyreállásáért az AclO kivágása volt felelős. Ezeket az eredményeket az E01-70 növényt - csak AclO-et hordozó - utódainak vizsgálatával is alátámasztottuk, melynek során megállapítottuk, hogy mind a hét dohány-mozaikvírusrezisztens növény tartalmazta a 7,9 kb-os kivágásos sávot. Az Nt-1G/T genotípusú növények AclO-hibridizációt nem mutattak, és a 7,9 kb-os vad típusú, genomi fragmenst tartalmazták .

A TMV fenotipusu növények - az E501-generáció két ilyen növénye kivételével - tartalmazták a 10,2 kb-os és a

7,9 kb-os sávot is. E sávok egy szövetben együttes jelenléte azt jelzi, hogy a szövetben olyan sejtek vannak, amelyek AclO kivágás helyett AclO-et tartalmaznak. Mindegyik sáv azt jelzi, hogy néhány szövet TMV^b fenotípusú vagy potenciálisan revertáns egyaránt lehet, ami magyarázatot adhat az e vizsgálatokban megfigyelt TMV^R/r fenotípusra.

. példa

Ebben a példában a genomi inszerciós és kivágási helyek szekvenciáinak vizsgálatát mutatjuk be.

• · · ·

- 64 Az Ac kivágási helyeket tartalmazó PCR-termékeket közvetlenül szekvenáltuk. Az alkalmazott növényeket a 6.

táblázatban soroljuk fel. Egy kb. 379 bp-os termék amplifikálásához a kivágási helyet szegélyező NG1-5 (447744 96. bázisok; 5' -GCCCTCGAGAAATCAAGAAAACAGAGGTC-3' ) és N752 (4838-4856. bázisok; 5' -GCACTCGAGCTTCAAGATTACTACATTG-3' ) láncindítókat alkalmaztuk. Az polimeráz-láncreakciókat az

IPCR esetében leírt módon végeztük, azzal a különbséggel, hogy a következő feltételeket alkalmaztuk: 25 cikluson keresztül 94 °C-on 1 perc; 55 °C-on 2 perc; és 72 °C-on 3 perc. A PCR-termékeket alacsony olvadáspontú agarózban (FMC) végzett elektroforézissel, majd fenolos extrakcióval tisztítottuk. Az egyes termékek hozzávetőleg 500 fmólját

DNA Sequencing System (Promega, Madison, WI) és N7-52láncindító alkalmazásával szekvenáltuk.

A 21 TMV^b fenotípusú E501-növény közül 19, valamint a négy TMV (Nt-IG/T genotípusú) F501-növény tartalmazta a kivágásos sávot, de az AclO-et nem [AclO(-)] . Az Actranszpozon egyik - dohánynövényben konzerválódott - tulajdonsága, hogy inszerció hatására egy nyolc bázispáros (az elemet szegélyező) közvetlen duplikáció jön létre. Ezt az AclO-1 és AzlO-2 szekvenciáiban kimutattuk. Az AclOtranszpozont egy 8 bp-os közvetlen ismétlődés szegélyezi (5' -ATTTGCCG-3' ) . Az Ac-kivágás gyakran nem pontos, és ún.

footprint marad vissza. Ezek a footprint-ek kereteltolódási mutációkat és/vagy aminosav-inszerciókat vagy -deléciókat okozhatnak, melyek megakadályozzák a funkcionális géntermék termelődését.

• · ·

6. táblázat

Vad típus

Fenotípus

Ac-ins zerció	-CAT TTG CCG TCT-	TMV
	-CAT TTG CCG//Ac//AT	TTG	CCG TCT-		TMVS
Ac-kivágás
N* footprint	-ek
F501-48 -CAT	TTG CCC TTT GCC GTC	-8	aminosav-	*	TMVS
F501-64 -CAT	TTG CCT GCC GTC	-9	aminosav-	*	TMVS
E501-2 -CAT	TTG CTT TGC CGT	-4	aminosav-	*	TMVS
E501-3 -CAT	TTG CCA TTT TGC CGT	-4	aminosav-	*	TMVS
E501-9 -CAT	TTG CCC CGT	-4	aminosav-	*	TMVS
E501-16 -CAT	TTG CCC TTT GCC GTC	-9	aminosav-	*	TMVS
E501-28 -CAT	TTG CCC TTT GCC GTC	-9	aminosav-	*	TMVS
N-revertánsok
D112-15	-CAT TTG CCG TCT-				tmvr
F501-34	-CAT TTG CCG TCT-				tmvr
F501-45	-CAT TTG CCG TCT-				tmvr
F501-65	-CAT TTG CCG TCT-				tmvr
F501-66	-CAT TTG CCG TCT-				tmvr
F501-67	-CAT TTG CCG TCT-				tmvr
F501-68	-CAT TTG CCG TCT-				tmvr
F501-69	-CAT TTG CCG TCT-				tmvr
A 6.	táblázatban az N-génbe	n az AclO	célhely
szekvenciaanalízisének eredményét,	illetve az adott	genotí-

pussal összefüggő dohány-mozaikvírus-rezisztens vagy dohány-mozaikví rus-érzékeny fenotípust mutatjuk be. Az AclO inszerciójának hatására a vad típusú NB-szekvencia 8 bp-os szakasza (5034-5041. nukleotidok; ATTTGCCG) megduplázódik.

A 6. táblázatban feltüntetett tripletek a cDNS-szekvencia kodonjait jelentik. Aláhúzással jelöltük azokat a további szekvenciákat, amelyek az AclO kivágása után a TMV^S növényekben megmaradtak. A korai stopkodont jelöl, amely

5'-irányban 9 vagy 4 aminosav távolságra található. Az E501-növények a D112-15 germinális revertáns növény visszakeresztezésével kapott utódok, az F501-növények pedig az

E501-70-növény önmegtermékenyítésével kapott utódok. A 6. táblázatban a dohány-mozaikvírus-érzékeny és dohánymozaikvírus-rezisztens fenotípus jelölése TMV⁸, illetve TMV^r.

Az AclO-transzpozon az N-génhez kapcsolódva megjelöli azt ( tagging ) . Hét TMV^S fenotípusú, AclO(-) növény N-génjének kivágási helyét megszekvenáltuk, és mindegyik esetben azt találtuk, hogy - a vad típusú kivágási helyhez képest - nukleotidváltozások következtek be (6. táblázat).

Ezen túlmenően, a D112-15-növény és hat, F501generációba tartozó dohány-mozaikvírus-rezisztens növény DNS-ének kivágási helyeit is megszekvenáltuk, és azt találtuk, hogy a vad típusú szekvenciát tartalmazzák (6. táblázat) . A vad típushoz - bázisváltozás nélkül - visszatérő (revertáns) növények megtalálásának lehetősége arra utal, hogy ez a régió a protein működése szempontjából nagyon lényeges, és az aminosavak szubsztitúciói, addíciói vagy deléciói nincsenek tolerálva. Ennek ellenére, még nem azonosítottunk olyan TMV° fenotípusú, footprint-tel rendel• · · • ·· · ·

- 67 kező növényt, amely lehetővé tette volna egy teljes hosszúságú, de nem működőképes protein szintézisét. Az e példában feltárt eredmények azt bizonyítják, hogy az AclOtranszpozon az N-génhez kapcsolódik, és az AclO N-génről történő pontos lehasítása szükséges a HR? fenotípus helyreállításához .

5. példa

N. glutínosa cDNS-könyvtárból N-cDNS-t izoláltunk, a következők szerint. 8-12 hetes növényeket 32 °C-on dohány-mozaikvírussal fertőztünk. A fertőzést követően 24 órával a hőmérsékletet 24 °C-ra mérsékeltük. 48 órával a fertőzés után - poliadenilált RNS [ poli (A)¹-RNS] izolálása érdekében - összegyűjtöttük a növények leveleit. A λ-Zap cDNS-szintetizáló reagenskészlet (Stratagene, La Jolla, CA) alkalmazásával, 5 pig poli (A)⁺-RNS-ből cDNS-t állítottunk elő. A cDNS-t Gigapack II Gold csomagolókivonat alkalmazásával (Stratagene) csomagoltuk, és az Escherichia coli

XL 1-Blue mrf törzsének tenyészetére szélesztettük.

A dohány-mozaikvírussal fertőzött N. glutínosa RNSéből készített cDNS-könyvtár l,0xl0^c’ kiónjának szkrínelésére az AclO-1-transzpozont alkalmaztuk. 15 olyan kiónt azonosítottunk, amely homológiát mutatott az AclO-1gyel, azonban 100%-os szekvenciaazonosságot csak egy klón (C7) esetében észleltünk. A C7-klón 3' -végén lévő 50205370. bázisokból olyan próbát (N-5) származtattunk, amely dohánynövényben egy kópiában volt jelen, és amely egy 7,9 kb-os EcoRI-fragmenshez hibridizálódott. Ezután az N-5···· próbával 1x10 plakkot hibridizáltunk. A második szkrínelés során három kiónt azonosítottunk, melyek mindegyike 100%-os szekvenciaazonosságot mutatott az AclO-1-transzpozonnal. Később meghatároztuk a C7-, C16- és Cl 8-cDNS-inszertek teljes hosszúságú szekvenciáit (ld. lentebb).

A didezoxi láncterminációs eljárással [ Sanger és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1977)]

Sequenase version 2.0 rendszer (United States Biochemical

Corporation, Cleveland, OH) alkalmazásával - kétszálú plazmid-DNS-t szekvenáltünk. A C7-DNS szekvenálása céljából az Exonuclease III eljárás (Henikoff: Methods in

Enzymology 155, 156 (1987)] alkalmazásával - egymásba illesztett deléciókat állítottunk elő. A C16- és C18-cDNS-t a

C7-szekvenciából származó láncindítók alkalmazásával szekvenáltuk.

A szekvenciaanalíziseket GCG szekvenciaanalizáló programok (Madison, Wisconsin) alkalmazásával végeztük. A genomi N-gén (ld. 1. azonosítószámú szekvencia) exonjai és intronjai térképét a C7-, C16- és Cl 8-cDNS-klónok szekvenciaanalízise, illetve a G38-Z-klón részleges szekvenálása alapján készítettük (4/B ábra) . A C7- és 08klónból együttesen arra következtethetünk, hogy öt exon van összeillesztve egy 3432 bázispáros nyitott leolvasási keretté, amely 1144 aminosavas polipeptidet (N) kódol. A 08cDNS-szekvenciát a 3. azonosítószámú szekvenciaként mutatjuk be. A 06 - egy 70 bázispáros exon alternatív beillesztése (splicing) miatt (ami egy rövidített, 1956 bázispáros nyitott leolvasási keretet eredményez) - egy 652 amino• · · • · • · · savas polipeptidet (Ntr) kódol (4/A ábra; 5. azonosítószámú szekvencia). Ez a plusz exon (EE) a fibronektin EDAexonjához [M. Caputi: Nucleic Acids Research 22, 1018 (1994)] hasonlóan illeszthető. A 70 bp-os exonon belüli szekvenciamotívumok 95%-ban hasonlóak az EDA-exon azon szekvenciáihoz, amelyek - e 81 bp-os exon splicing-ját módosító - kettős erősítőszekvenciát határoznak meg.

A cDNS-ek 3' -terminálisainak hosszúsága változó, ami azt jelzi, hogy különböző poliadenilációs szignálokat alkalmaznak. E cDNS-klónok 3' -transzlálatlan régiójában több potenciális poliadenilációs szignál található, ami magyarázatot adhat az eltérő érési (processing) eseményekre. A C7-klón tartalmazza a leghosszabb 3' -terminálist, ezenkívül tartalmazza a C16- és C18-klón rövidített 3' terminálisait is. A C7- és C16-klón 5'-terminálisa azonos.

A Cl 8-szekvencia a C16- és C7-klónban teljes egészében megtalálható, így ez nem teljes hosszúságú cDNS, és ez tartalmazza a legrövidebb 3' -terminálist. A C7-klón intron-2-t tartalmaz, és valószínűleg olyan mRNS-ből származik, amelyik nincs teljesen összeillesztve. A 06- és C18-klónból hiányzik az intron-2. Ha a C18-klónhoz hozzáadjuk a 06vagy C7-klón 750 bp-os 5' -végi szekvenciáját, 3432 bp-os nyitott leolvasási keretet kapunk, amely 1144 aminosavas polipeptidet kódol (7/A táblázat). A G38-k-klón részleges szekvenálása azt mutatja, hogy a genomi szekvenciában valamennyi olyan szekvencia megtalálható, amely a három izolált cDNS-típus létrehozásához szükséges. Ennek megfelelően, ezek a cDNS-ek egyetlen génből származnak.

A kikövetkeztetett N- és Ntr-protein kikövetkeztetett molekulatömege 131,4 kD, illetve 75,3 kD. A 7/A táblázatban az N-géntermék kikövetkeztetett aminosavszekvenciája látható (ld. még: 4. azonosítószámú szekvencia) . A táblázatban a potenciális szignál (citoplazmatikus) domént egyszeres aláhúzással, az ATP/GTP-kötőhelymotívumban (P-hurok) konzervált aminosavakat kettős aláhúzással jelöljük. A leucinban gazdag ismétlődéseket (LRR1LRR13) dőlt betűkkel jelöljük. Az N-protein aminosavszekvenciájában nyolc lehetséges N-kötött glikozilációs hely található. Ezeket a helyeket - amelyek az NX(S/T) konszenzusszekvenciát tartalmazzák - a 7/A táblázatban vastag betűkkel jelöljük. Az 7/A, 7/B és 7/C táblázatban az aminosavak rövidítését az alábbi egy betűs kódokkal adjuk meg: A

- Alá; C - Cys; D - Asp; E - Glu; F - Phe; G - Gly; H His; I - Ile; K - Lys; L - Leu; M - Met; N - Asn; P - Pro;

Q - Gin; R - Arg; S - Ser; T - Thr; V - Val; W - Trp; és Y

- Tyr.

Az N-protein aminosav-szekvenciájának ualom program alkalmazásával végzett vizsgálata azt jelzi, hegy az Nproteinben transzmembrán-régió nincs jelen. A Signalase programmal végzett vizsgálattal megállapítottuk, hogy az Nproteinben szignálszekvencia sem található. Ezek alapján, úgy tűnik, hogy az N-protein a citoplazmában helyezkedik el.

Az N-polipeptid kikövetkeztetett aminosavszekvenciá j át BLAST program [ Altschul és mtsai.: J. Mól. Biology 215, 403 (1990)] alkalmazásával összehasonlítottuk : .........· .· ··· ..* · ···· ·

..... · ·?·· a Genbank aminosav-szekvenciáival [ kibocsátási szám (release) : 82.0] . A kikövetkeztetett aminosav-szekvencia korlátozott, de lényeges hasonlóságokat mutat olyan proteinekkel, amelyekről ismert, hogy szerepet játszanak a szignáltranszdukcióban.

Az N-protein kikövetkeztetett aminosav-szekvenciája tartalmaz egy P-hurok motívumot (7/A táblázat). A GMGGVGKT szekvencia (216-223. aminosavak) megegyezik a különböző

ATP- vagy GTP-kötőproteinekben található P-hurok konszenzus-szekvenciával [ (A/G)XXXXGK(S/T)] . A P-hurok motívumot tartalmazó proteinek családjába tartoznak az adenilátkinázok, a ras-proteincsalád, az elongációs faktorok, az ATP-s zintetáz β-alegysége, a timidin-kinázok és a foszfoglicerát-kinázok [M. Saraste és mtsai.: Trends in

Biochemical Sciences 15, 430 (1990)] . Az a legvalószínűbb, hogy a kérdéses P-hurok az ATP megkötésében játszik szerepet. A szóban forgó aminosav-szekvenciában nincs jelen a

GTP megkötéséhez szükséges DXXG és NXKD konszenzusszekvencia [ Dever és mtsai.: Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84, 1814 (1987)] .

Fry és mtsai. [ Proceedings of the National Academy of Sciences USA 83, 907 (1986)] a P-hurok mellett két másik szegmenst is meghatároztak, melyek szerepet játszanak az adenilát-kináz és az Fl-ATP-áz ATP-kötésében. Az Nszekvencia vizsgálata azt mutatja, hogy ezek a szegmensek megfelelő elosztásban vannak jelen. A 2. szegmens az (I,A,L,V)(V,I) dipeptidet tartalmazza, és az N-protein a 228-229. helyen az AI szekvenciát tartalmazza (7/A tábla72 zat). A P-huroktól 80-100 aminosav távolságra a 3. szegmens szekvenciája glicinnel (G) kezdődik, melyet öt hidrofób aminosav és egy aszparaginsav (D) követ (7/A táblázat). Az N-protein a 296-302. helyeken VLIVLDD aminosav-szekvenciát tartalmaz. Az aminosav-szekvencia alapján nem lehet megjósolni, hogy az ATP milyen feltételek mellett kötődik, illetve, hogy a kötődés hatására az ATP hidrolízise spontán módon következik-e be, vagy egyéb faktorokat igényel.

A 7/B ábrán az N-terminális aminosavak (a potenciális jeltovábbító dómén; a 4. azonosítószámú szekvencia 8150. aminosavai) Drosophila Toll protein citoplazmatikus (szignál) doménjével [ 804-9996. aminosavak; Yamagata és mtsai.: Gene 139, 223 (1994)] és az emberi interleukin-1receptor-proteinnel [H IL1-R; 317-524. aminosavak; Sims és mtsai.: Proceedings of the National Academy of Science 86,

8946 (1989)] történő egymás alá rendezését mutatjuk be. A bekeretezett aminosavak a hasonló régiókat jelzik. Az alkalmazott konzervatív szubsztitúciók a következők: hidrofób aminosavak: L/I/V/M/A/F; ionos aminosavak: K/R/D/E/Q/N/H;

aromás aminosavak: F/Y.

Az N-szekvencia tartalmaz néhány olyan konzervált aminosavat, amelyek a Toll és az Ill-R regulátor reakcióutakban a szignál - citoplazmából sejtmagba történő - átviteléhez szükségesek [ Schneider és mtsai.: Genes and Development 5, 797 (1991); Heguy és mtsai.: Journal of

Biological Chemistry 267, 2605 (1992)] .

Az N-protein - 4. azonosítószámú szekvencia 590.

aminosavától 928. aminosaváig tartó - leszármaztatott ami• · · nosav-szekvenciája 13 (hozzávetőleg 25 aminosavas) ismétlődésből álló leucinban gazdag régiót tartalmaz. A 7/C táblázatban az N-gén-protein leucinban gazdag ismétlődéseinek (LRR; 590-928. aminosavak) elsődleges szerkezetét mutatjuk be, és konszenzus-szekvenciáját az élesztő adenilát-cikláz [ AdCy; Kataoka és mtsai. : Cell 43, 493 (1985)] , a

Drosophila Toli [ Hashimoto és mtsai. : Cell 52, 269 (1988)] , az emberi vérlemezkemembrán-glikoprotein Iba-lánca [ H Gplba; Titani és mtsai.: Proceedings of the National Academy of Science 84, 5610 (1987)] , a Drosophila Chaoptin [ Reinke és mtsai.: Cell 52, 291 (1988)] , és az Arabidopsis receptorszerű transzmembrán-kinázai [ TMK1; Chang és mtsai.:

Plánt Cell 4, 1263 (1992); TMKL1, Valón és mtsai.: Plánt

Molecular Biology 23, 415 (1993); és RLK5, Walker: The

Plánt Journal _3, 451 (1993)] LRR-kons zenzus-szekvenciáival hasonlítjuk össze.

A leucinban gazdag ismétlődések (LRR) számos olyan proteinben megtalálhatók, amelyek a szignáltranszdukcióban, sejtadhézióban és egyéb működésekben játszanak szerepet. Úgy véljük, hogy a leucinban gazdag régiók protein-protein interakciókat közvetítenek. Az egymás alá rendezett leucinban gazdag régiókból származó konszenzus-szekvencia hasonló az élesztő adenilát-ciklázokban [Kataoka, (1985), ld. fentebb], a Drosophila Toll-ban [ Hashimoto és mtsai.

(1988), ld. fentebb] , az emberi vérlemezkemembránglikoprotein Iba-láncában [ Titani és mtsai. (1987), ld. fentebb], a Drosophila Chaoptin-ban [Reinke és mtsai. (1988), ld. fentebb], és az Arabidopsis receptorszerű • · · · ’Σ · · · • ··· ·«· ί , ··· *··* ·*;·

- 74 transzmembrán-kinázaiban [ Chang és mtsai. (1992), ld. fentebb; Valón és mtsai. (1993), ld. fentebb; és J. Walker (1993), ld. fentebb] LRR-konszenzus-szekvenciáival (7/C táblázat). Ezekben a proteinekben az LRR-domén - az élesztő adenilát-cikláz kivételével - az extracelluláris közegben helyezkedik el.

• ·ν«

7Α táblázat

MASS S S S3RW SYDVFLSFRG EDTRKTFTSH LYEVLilDKGI KTFQDDKRLE YGATIPGELC 61 KAIEESQFAI WFSEHYATS RHCLHELVXI MECKTRFKQT VIPIFYDVOP 5HVRHQKE5F

121 AKAFEEHETK YKDDVEGIQR HRIALUEAAH LKGSCD1IRDK TDADCIRQIV DQISSKLCKI 101 SLSYLQItIVG IDTHLEKIES LLEIGIHGVR IMGIWGMGGV GKTTI ARAIF DTLLGRMDSS 241 YQFDGACFLK DIKEtIKRGl-üt SLQtlALLSEL LREKAHYllHE EDGKHQMASR LRSKKVLIVL 301 DDIDHKDHYL EYLAGDLDWF GHG3RIIITT RDKHLIEKND IIYEVTALPD HESIQLFKQH 361 AFGKEVPMEH FEKLSLEW1I YAKGLPLALK VHGSLL1IHLR LTEWKSAIEH MKHH3YSGII 421 DKLKISYDGL EPKQQEMFLD IACFLRGEEK DYILQILESC HIGAEYGLRI LIDKSLVFI3 401 EYNQVQMHDL IQDMGKYIVH FQKDPGERSR LWLAKEVEEV MSHHTGTMAM EAIWVSSYSS 541 TLRFSIIQAVK HMKRLRVFHM GRSSTHYAID YLPHHLRCFV CTHYPWESFP STFELKMLVli 601 LQLRHNSLRX LUTETFOILPS LRRIDLSHSK RLTRTPDFTG HPNLEYVNLY QCSNLEEVHH 661 SIGCCSKVIG LYLNDCKSLK RFPCVNVESL EYLGLRSCDS LEKLPEIYGR KKPEIQIKMQ 721 GSGIRELPSS IFQYKT1IVTK LLLHNHKNLV ALPSSICRLK SLVSLSVSGC SKLES LPEEI 701 GDLDNLRVFD ASDTLILRPP SSIIRLNKLI ILNFRGFKDG VHFEFPPVAE GLHSLEYLM. 841 SYCULIDGGL PEEIGSLSSL KKLDLSRiiUF EHLPSSIAQL GALQSLDLKD CQRLTQLPEL 901 PPELNELNVD CHMALKFIHY LVTKRKKLHR VKLDDAlfNDT MYNLFAYTMF QHI3SMRHDI 961 SASDSLSLTV FTGQPYPEKI PSWF1I1IQGWD SSVSVHLPEH WYIPDKFLGF AVCYSRSLID 1021 TTAMLIPVCD DKMSRMTQKL ALSECDTESS HY3EWDIHFF FVPFAGLWDT SKAHGKTPHD 1001 YGIIRLSFSG EEKMYGLRLL YKEGPEVHAL LQMREHSHEP TEHSTGIRRT QYHNRTSFYE 1141 LING ··*· • ·

- 76 7Β táblázat

Ν ' .TOLI· Β IL-1R

Η

TOLL Β IL-1R

Η

TOLL Β XL-1R

Μ

TOLL Β IL-1R

TRKT

L ti	EL	V	ΤΓΓΤΓΤ
R M	E F		R λ λ 11
3 S			Ώ L&Íh

L Η 0 Κ G LEH- G L.S-ς κ1<3

E|Q C G

FQ F Q L Y. K L.

I Ε E 3 c|fJa I VV F 3 EK Y AIt S V0 D 3 R S0IIV L 3 Q H FI E E|n|v K K 3 RRLI I I l|v R| Epf~S G F s|hJL

Ό|α| L híj E a{a7 K L R e{H]vT[h]F NVRYHMPV<

f[e] ehet	k y|k -{d[d	VÉG
Y L X0II T	yIL KH G D	- P w
F I K K h[g	a1iJr|w g d	Κ T F

FHE F W K

S R H C 3 EHA

ΪΓν[ρΠί[Γ{ Κ E 3 F DVEKLDEEI. : μιΙο(ρΓϋ!ε k mIfIe 3 i

I • « · · ·

7C táblázat

590

PSTFE LKMLVHLQLRH HSLRHLWTETKHL·

PS LRRID LSH3KRU R TPDFTGM

PN LEYVH L Y QCSHLE E VHHSLG C C S Κ VI G L Y L H D C K S L K R F

PCVNVES LEYLGIRSCDSLEKL

PE IYGRMKPEIQIH HQGSG IREL

PSSIFQYKTH VTKLL b W H Μ K H L V A L

PSSICRLKSLVSLSVSGCSKLESL

PEEIGDLDULRVFDASDTLILRP

PSSIIRLHKLIILMFRGFKDGVHFEFP

PVAEG LHSLEYLMLSYCM LIDGGL

PEEIGSLSSLKKLDLSRHHFEH L

PSS I AQLGALQSLDLKDCQRLTQLPEL

PPELMELHVDCHMALKFIHYLVTKRKKL

929

H Gene

AdCy

Toll

H Gplbt

H trk

Chiopfcin

RLSS

IMS 1 THKL1

P--O--L--L--L-L-----L - - L

P--a--L--L--L-L--H-L--L.

P--LF-H--HL--L-L--M-L--L

P-GLL--LP-LS-L-LS-H-LTTL

L--L-O - -M-L--α

P---F--L--L--LDLS-M-L--I

P--L--L--L--L-L--M-LSG-I

L--L--L--L-L--M-Ct-G-a P I-----L-SL-L--N-LSG-LP • · · · · • ·

6. példa

Ebben a példában a genomi N-gén-szekvenciák izolálását írjuk le.

Genomkönyvtár készítése érdekében az N. glutinosaból előállított DNS-t Mbol-gyel emésztettük és gélelektroforézissel frakciónáltűk. A 12 kb-nál nagyobb DNS-fragmenseket a λ-Gem-ll bakteriofág (Promega) - BamHIgyel emésztett, defoszforilált - karjaihoz ligáltuk. A ligáit termékeket Gigapack II Gold csomagolókivonat alkalmazásával csomagoltuk, és az E. coli SURE-törzs (GIBCO, BRL. , Gaithersburg, MD) tenyészetére lxlO*³ plakkképző egységet szélesztettünk.

A genomi N-gén-szekvenciák izolálása céljából Mbol-gyel részlegesen emésztett N. glutinosa DNS λbakteriofágban készített könyvtárát (a C7-klón 695-1090. nukleotidjaiból álló) N-5- és Ν-9-próbával szkríneltük. Három olyan kiónt sikerült tisztítanunk, amelyek az N-5- és Ν-9-próbához egyaránt hibridizálódtak. EcoRI, BamHI és Xhol alkalmazásával elkészítettük e kiónok (G25, G34 és G38) restrikciós térképét. A kiónokat Southern-analízissel karakterizáltuk (4/B ábra). Megállapítottuk, hogy a három klón egymással átfedő volt, és a teljes genomi N-gént tartalmazták. A G34-klón - az N-géntől 5' -irányban - 1,4 kbsal hosszabb DNS-t tartalmazott, mint a G38, a G38-klón pedig a gén 3' -végén tartalmaz 5,4 kb-sal hosszabb DNS-t. A G38-klón magában foglalta a G25-klón szekvenciáit.

7. példa • · · ·

Ί9

Ebben a példában a genomi N-gén-klónokkal transzformáit, érzékeny vagy mutáns növényeket mutatjuk be, melyek rezisztensek a dohány-mozaikvírussal szemben.

Az SRI-dohánynövényt és a - germinális Ackivágási eseményeket hordozó, dohány-mozaikvírusra érzékeny - F501-48 és F501-64 növényeket pTG34- vagy pTG38plazmiddal transzformáltuk. A pTG34- és pTG38-plazmidot úgy állítottuk elő, hogy az egymással átfedő G34- és G38klónból származó 12,0 kb-os, illetve 10,6 kb-os Xholfragmenst a - Sall-gyel linearizált és borjúbél alkalikus foszfatázzal kezelt - pOCA28 T-DNS-vektorba [Olscewski és mtsai.: Nucleic Acids Research 16, 10765 (1988)] szubklónoztuk. A transzformálást a pGV3850 HPT::pKU3 konstrukció esetében leírtak szerint végeztük (ld. 1. példa).

A G34- és G38-klónt választottuk ki a genomi komplementációra, amit annak meghatározása céljából végeztünk, hogy ez a gén elégséges-e a dohány-mozaikvírusra érzékeny dohánynövények dohány-mozaikvírus-rezisztenciájának létrehozására. E két klón - hosszabb 5' -végeik következtében - nagyobb valószínűséggel tartalmazza a transzgén pontos expressziójához szükséges cis-szekvenciákat, mint a

G25. A G38-klón 10,6 kb-os, illetve a G34-klón 12,0 kb-os

Xhol-fragmensét a pOCA28 T-DNS-vektorba szubklónoztuk, majd Agrobacterium-közvetítette transzformációval dohánynövénybe transzforrnáltűk.

A pTG34- és pTG38-klón egyaránt dohány-mozaikvírusrezisztenciát biztosított a dohány-mozaikvírusra érzékeny SRI dohánynövények, illetve F501-48 és F501-64 növények • · · · · • · • · · · számára. Az 1/D ábrán látható, hogy a dohány-mozaikvirusra érzékeny - klónozott N. glutinosa N-gén-DNS-sel (pTG38klón) transzformált - SRl-növények rezisztenssé váltak a dohány-mozaikvírussal szemben.

• » · ·· ··· · ···

SZEKVENCIALISTA

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 7400 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettős

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

EREDETI FORRÁS:

ÉLŐLÉNY: Nicotiana glutinosa

Szövettípus: levél

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: exon

ELHELYEZKEDÉS: összekapcsolva (294...772, 1003-2098,

2941-3213, 5032-6600, 6934-6951)

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: intron

ELHELYEZKEDÉS: 773-1002

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: intron ELHELYEZKEDÉS: 2099-2940

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: intron

ELHELYEZKEDÉS: 3214-5031 • · · ·· ···

SAJÁTSÁG :

NÉV/MEGJELÖLÉS: intron

ELHELYEZKEDÉS: 6601-6933

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS: összekapcsolva (294...772, 1003-2098, 2941-3213, 5032-6600, 6934-6951)

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

TCAATCAATG GAAGGAATTC

CTTTTATTGC ATTAAGAAGA

AATTCTATGG AGTAGAGCCC ctcttctaat atatataaaa

CAATTTTTTC ACATACAGn

CTACTCCCTT CTATTAAAGT

ATTTTCCTAC TAGTGTATAT

ATCTCACACA AACTTTTTCC

ATTTGTTGAA AATACATCTA

TCTTACTCTT TTCAGAGAAT

CAAAGAAAAC CCAATAATTC

CAGTTGACTA GGACACCAAT

AATAGCAATA TAACTCTTAT

TTATTCTCTT ACCACAATCA

TAACGTTGAG TCC ATG Met

GCA Alá

TCT Ser

TCT TCT TCT

TCT Ser

TCT Ser

AGA TGG AGC TAT GAT GTT TTC TTA AGT

Ser

Ser Ser 5

Arg Trp 10

Ser

Tyr

Asp

Val

Phe 15

Leu

Ser

TTT

AGA

GGC

GAA

GAT

ACT

CGA

AAA

ACG

TTT

ACA

AGT

CAC

TTA

TAC

GAA

Phe

Arg

Gly

Glu

Asp

Thr

Arg

Lys

Thr

Phe

Thr

Ser

His

Leu

Tyr

Glu

20

25

30

GTC

TTG

AAT

GAT

AAG

GGA

ATA

AAA

ACC

TTT

CAA

GAT

GAT

AAA

AGG

CTA

Val

Leu

Asn

Asp

Lys

Gly

Ile

Lys

Thr

Phe

Gin

Asp

Asp

Lys

Arg

Leu

35

40

45

GAG

TAC

GGC

GCA

ACC

ATC

CCA

GGT

GAA

CTC

TGT

AAA

GCT

ATA

GAA

GAG

Glu

Tyr

Gly

Alá

Thr

Ile

Pro

Gly

Glu

Leu

Cys

Lys

Alá

Ile

Glu

Glu

50

55

60

65

120

180

240

296

344

392

440

488

TCT CAA TTT GCC ATT Ser Gin Phe Ala Ile

GTT Val

GTT HC TCA GAG AAT TAT GCA ACA

TCA Ser 80

AGG Arg

536

Val

Phe Ser Glu 75

Asn

Tyr

Ala

Thr

70

TGG

TGT

TTG

AAT

GAA

CTA

GTG

AAG

ATC

ATG

GAA

TGC

AAA

ACT

CGA

m

584

Trp

Cys

Leu

Asn

Glu

Leu

Val

Lys

Ile

Met

Glu

Cys

Lys

Thr

Arg

Phe

85

90

95

AAG

CAA

ACT

GTT

ATA

CCG

ATA

ne

TAT

GAT

GTG

GAT

CCA

TCA

CAT

Gn

632

Lys

Gin

Thr

Val

Ile

Pro

Ile

Phe

Tyr

Asp

Val

Asp

Pro

Ser

His

Val

100

105

110

CGG

AAC

CAA

AAG

GAG

AGC

m

GCA

AAA

GCC

ITT

GAA

GAA

CAT

GAA

ACA

680

Arg

Asn

Gin

Lys

Glu

Ser

Phe

Ala

Lys

Ala

Phe

Glu

Glu

His

Glu

Thr

115

120

125

AAG

TAT

AAG

GAT

GAT

GTT

GAG

GGA

ATA

CAA

AGA

TGG

AGG

An

GCT

nA

728

Lys

Tyr

Lys

Asp

Asp

Val

Glu

Gly

Ile

Gin

Arg

Trp

Arg

Ile

Ala

Leu

130

135

140

145

AAT

GAA

GCG

GCC

AAT

CTC

AAA

GGC

TCA

TGT

GAT

AAT

CGT

GAC

AA

772

Asn

Glu

Ala

Ala

Asn

Leu

Lys

Gly

Ser

Cys

Asp

Asn

Arg Asp

Lys

150 155 160

GTGAGTTAAA AACATATAAG CTGAATACTT TGCARCAAA TGAGRAAAC ATAATCTTAA 832

ΑΤΑΑΑΓΠΤΤ CAATTTTTTG GAATAAAHG AT ÁGH GATT ATATATGTTT CTATCAGTTA 892

ATTACAAACT CAATAACATT ATTACGTAGA TAAAATTTTT ATIAGTTCTT CAAAGAGTTT 952

GATTTATGTG CACACTCTTT GTATATATCA CAATCTTTTT ACTTTTGTAG G ACT GAT 1009

Thr Asp

GCA GAC TGT An CGA

CAG Gin

An Gn GAC CAA ATC TCA TCC AAA nA TGC

1057

Ala Asp Cys

Ile

Arg

Ile

Val Asp Gin Ile Ser Ser Lys

Leu

Cys

165

170

175

AAG

An

TCT

nA

TCT

TAT

nG

CAA

AAC

An

Gn

GGA

ATA

GAT

ACT

CAT

1105

Lys

Ile

Ser

Leu

Ser

Tyr

Leu

Gin

Asn

Ile

Val

Gly

Ile

Asp

Thr

His

180

185

190

nA

GAG

AAA

ATA

GAA

TCC

nA

CTA

GAG

ATA

GGA

ATC

AAT

GGT

Gn

CGG

1153

Leu

Glu

Lys

Ile

Glu

Ser

Leu

Leu

Glu

Ile

Gly

Ile

Asn

Gly

Val

Arg

195

200

205

210

An

ATG

GGG

ATC

TGG

GGA

ATG

GGG

GGA

GTC

GGT

AAA

ACA

ACA

ATA

GCA

1201

Ile

Met

Gly

Ile

Trp

Gly

Met

Gly

Gly

Val

Gly

Lys

Thr

Thr

Ile

Ala

215

220

225

AGA

GCT

ATA

τη

GAT

ACT

cn

nA

GGA

AGA

ATG

GAT

AGT

TCC

TAT

CAA

1249

Arg

Ala

Ile

Phe

Asp

Thr

Leu

Leu

Gly Arg

Met

Asp

Ser

Ser

Tyr

Gin

230

235

240

τη

GAT

GGT

GCT

TGT

ne

cn

AAG

GAT An

AAA

GAA

AAC

AAA

CGT

GGA

1297

Phe

Asp

Gly

Ala

Cys

Phe

Leu

Lys

Asp

Ile

Lys

Glu

Asn

Lys

Arg

Gly

245

250

255

ATG CAT Met His

TCT TTG CAA

aat gcc cn CTC

TCT GAA Ser Glu

cn nA AGG

GAA Glu

AAA Lys

1345

Ser

Leu Gin

Asn

Alá 265

Leu

Leu

Leu 270

Leu

Arg

260

GCT

AAT

TAC

AAT

AAT

GAG

GAG

GAT

GGA

AAG

CAC

CAA

ATG

GCT

AGT

AGA

1393

Alá

Asn

Tyr

Asn

Asn

Glu

Glu

Asp

Gly

Lys

His

Gin

Met

Alá

Ser

Arg

275

280

285

290

cn

CGT

TCG

AAG

AAG

GTC

CTA

An

GTG

cn

GAT

GAT

ATA

GAT

AAT

AAA

1441

Leu

Arg

Ser

Lys

Lys

Val

Leu

Ile

Val

Leu

Asp Asp

Ile

Asp

Asn

Lys

295

300

305

GAT

CAT

TAT

TTG

GAG

TAT

nA

GCA

GGT

GAT

cn

GAT

TGG

τη

GGT

AAT

1489

Asp

His

Tyr

Leu

Glu

Tyr

Leu

Alá

Gly Asp

Leu

Asp

Trp

Phe

Gly

Asn

310

315

320

GGT

AGT

AGA

ATT

An

ATA

ACA

ACT

AGA

GAC

AAG

CAT

nG

ATA

GAG

AAG

1537

Gly

Ser

Arg

Ile

Ile

Ile

Thr

Thr

Arg

Asp Lys

His

Leu

Ile

Glu

Lys

325

330

335

AAT

GAT

ATA

ATA

TAT

GAG

GTG

ACT

GCA

CTA

CCC

GAT

CAT

GAA

TCC

An

1585

Asn

Asp

Ile

Ile

Tyr

Glu

Val

Thr

Alá

Leu

Pro

Asp

His

Glu

Ser

Ile

340

345

350

CAA

TTG

TTC

AAA

CAA

CAT

GCT

TTC

GGA

AAA

GAA

cn

CCA

AAT

GAG

AAT

1633

Gin

Leu

Phe

Lys

Gin

His

Alá

Phe

Gly

Lys

Glu

Val

Pro

Asn

Glu

Asn

355

360

365

370

TTT

GAG

AAG

cn

TCA

nA

GAG

GTA

GTA

AAT

TAT

GCT

AAA

GGC

cn

CCT

1681

Phe

Glu

Lys

Leu

Ser

Leu

Glu

Val

Val

Asn

Tyr

Alá

Lys

Gly

Leu

Pro

375

380

385

TTA

GCC

CTC

AAA

GTG

TGG

GGT

TCT

nG

CTG

CAT

AAC

CTA

CGA

nA

ACT

1729

Leu

Alá

Leu

Lys

Val

Trp

Gly

Ser

Leu

Leu

His

Asn

Leu

Arg

Leu

Thr

390

395

400

GAA

TGG

AAA

AGT

GCT

ATA

GAG

CAC

ATG

AAA

AAT

AAC

TCT

TAT

TCT.

GGA

1777

Glu

Trp

Lys

Ser

Alá

Ile

Glu

His

Met

Lys

Asn

Asn

Ser

Tyr

Ser

Gly

405

410

415

ATT

ATT

GAT

AAG

CTC

AAA

ATA

AGT

TAT

GAT

GGA

nA

GAG

CCC

AAA

CAA

1825

Ile

Ile

Asp

Lys

Leu

Lys

Ile

Ser

Tyr Asp

Gly

Leu

Glu

Pro

Lys

Gin

420

425

430

CAA

GAG

ATG

τη

nA

GAT

ATA

GCA

TGC

ne

nG

CGA

GGG

GAA

GAA

AAA

1873

Gin

Glu

Met

Phe

Leu

Asp

Ile

Alá

Cys

Phe

Leu

Arg

Gly

Glu

Glu

Lys

435

440

445

450

GAT

TAC

ATC

CTA

CAA

ATC

cn

GAG

AGT

TGT

CAT

An

GGA

GCT GAA

TAC

1921

Asp

Tyr

Ile

Leu

Gin

Ile

Leu

Glu

Ser

Cys

His

Ile

Gly

Alá

Glu

Tyr

455

460

465

GGG

TTA

CGT

An

nA

An

GAC

AAA

TCT

cn

GTG

ne

ATC

TCT

GAA

TAT

1969

Gly

Leu

Arg

Ile

Leu

Ile

Asp

Lys

Ser

Leu

Val

Phe

Ile

Ser

Glu

Tyr

470

475

480

• · · ····· « · • · · « · · · • · · · ··« ·· · • · · ····· · • · · ·· ··· · ····

- 85 AAT CAG GTT CAA ATG CAT GAC TTA ATA CAG GAT ATG GGT AAA TAT ATA 2017

Asn Gin Val Gin Met His Asp Leu Ile Gin Asp Met Gly Lys Tyr Ile

485 490 495

GTG AAT TTT CAA AAA GAT CCC GGA GAA CGT A£C AGA TTA TGG CTC GCC 2065

Val Asn Phe Gin Lys Asp Pro Gly Glu Arg Ser Arg Leu Trp Leu Alá

500 505 510

AAG GAA GTC GAA GAA GTG ATG AGC AAC AAC ACA GTAAGTAAGC TAAATAATGC 2118 Lys Glu Val Glu Glu Val Met Ser Asn Asn Thr 515 520 525

AATAATATTT AATTTCTAAT TTTATATTCT AAAGACACAT AGGGCAGTCA ATTCCAGTTA 2178

TTTGTTCCTC TTGCTTCATA GTCTTGACGG TACATCATTT TAGTTGTTTA CTTTAGTTAG 2238

TAGGAGATAT AAAAGTAATA TTAATTACCT CATTAGTAAA AAAAAACATT AATTGCCTAA 2298

TTTGTTTAGT AGCCGCTTTA ATTTACGTTC CCTAATTCGT TTTTTCTTAT ATTTTTTAGG 2358

GATGGATTAG TCTAGTAGCC ACTTAATCTG TTTGATCCAA TGTCTTTCTT TGGATTAACT 2418

TGAAAATTTT ATGACATTAT ATATAATAAC TCAATCATTC ATTCACTTTA CCATTATTAT 2478

TTTTTATATA AAGTTACAAT TTATTGGTAC TGTTTCAGTT ACAATTACTT TCCAACATGG 2538

AAAACTTATA AACTGGACTC CAATAAACTT ATAAGAAAAA TGTAATAATA GAAAATAAAA 2598

TTATATAATT AATTACAAAA AAGTATTTTT CTGAAGTAAC ATCAGTATTT CTTAAAAAGA 2658

ATCCAATTAA CATTGTATCT TAAACTTTGG TATTGTAAGG CGTGAGAAAG TAGTGGCCTT 2718

ATTTCAATTT GACGTGAAGA ATAGAATGCC TTTTAACGAC ATAAGGGAAG GGGGCAAGAA 2778

TAAGTTTCTA TTCAGCCGGG CTCGAAGCAG AAGGTAGAAC GTAATATCTT TTGTTGGTTC 2838

AGCTCATCAA GCTATTACAA AAGAGTCCGC TCATATTAAC AAACGGAGTT TATÁCGACAT 2898

TTGAAATTAT ACTTTGTAGA CTAATGATCT TCTTGTTACC AG GGG ACC ATG GCA 2952

Gly Thr Met Alá

ATG GAA GCA ATT TGG GTT TCT TCT TAT TCT AGT ACT CTA CGC TTT AGC 3000

Met Glu Alá Ile Trp Val Ser Ser Tyr Ser Ser Thr Leu Arg Phe Ser

530 535 540 545

AAT CAG GCC GTG AAA AAT ATG AAA AGG CTT AGG GTA TTT AAC ATG GGG 3048

Asn Gin Alá Val Lys Asn Met Lys Arg Leu Arg Val Phe Asn Met Gly

550 555 560

AGG TCG TCG ACA CAT TAT GCC ATC GAT TAT CTG CCC AAC AAC TTG CGT 3096

Arg Ser Ser Thr His Tyr Alá Ile Asp Tyr Leu Pro Asn Asn Leu Arg

565 570 575

TGT TTT GTT TGC ACT AAC TAT CCT TGG GAG TCA TTT CCA TCT ACA TTT 3144

Cys Phe Val Cys Thr Asn Tyr Pro Trp Glu Ser Phe Pro Ser Thr Phe

580 585 590 • » ···· · • · · · · ·· ··.

GAA CTC AAA ATG CTT GTT CAC CTC CAA CTC CGA CAC AAT TCT CTG CGT Glu Leu Lys Met Leu Val His Leu Gin Leu Arg His Asn Ser Leu Arg

595 600 605

CAT UA TGG ACA GAA ACA AAG GTACAATAGC UGAAUCTA TUTGUGTC His Leu Trp Thr Glu Thr Lys 610 615

ATUATTUT CTCTCTAACT

TGTTTUTGT TATGAAACAA

GAAUCUAT TGAATUTGG

AAAAATAACT TAGCCTCAAA

UCTAUATA ACACTTUGG

AAATGAACAG AAGUGCUT

UAUGUTA TGUGTCTAA

TAAAAATUG TCAAATAATG

GAATGAAAAA GTACGAGUA

AAAGAATGAC TAATAUGGA

CGAGACATU TCAUCGUG

AATATAGUT GTCUCTACT

GCTATATCU ATGAUTTU

CCTCAAGTGT UTGTCAAU

TAGAAUGGA UCUUGCT

TAAAGGAAAT AATUAGTU

CAGTCCAATA AGAAUCAAT

TUTCCGAAG CAUGUTGT

TAATAAAAU TUTGAGTAG

GAAATATATA UACGTAAAA

GGGAAAAUT AATAACAAAA

UAAAATATA AUTCGTCTA

AUAAGAGCC TUGTAAUT

TCUAACAAG TAATUTCCA

ATCUTGTCC UTAAUTGG

TAAAAGAAGA AGAACAATAT

GGCGATUAC AATGGGGTAA

ATAAAGCTCT UAAAAGATA

CGTACUCCT TTUTGGCTA

TGTAATUAT CAGGACUAT

TACTAAATAT AAAATACAAT

CAAATGAAAA AUAAATTU

TACUCCTAA AAGUTGATA

CTAATACTU AAAACAAATA

TACTGAATGC AAGAAAGAAA

ATTUACCU AUGCUCAA

TCACGGTCAA TAUCUCU

TGATAAATAA UTUCUAT

AAUAGUAA UCAACGACT

UAUAAUC AAACTCUAG

UTCAAATAG TAAGAAAAGT

UGUTAACT CTACGGGAGT

TAGUCAGTA CAACTCTAAT

AUTAAATCA TUTAAAGU

ATUAGUGA TTUAAAATC

GTGTAAAAU TATTUTAAA

TAATATAGTA TAAATATAAA TATATAAAAA ATAAAUTCT

TGATAATGAA CAAATAUAT

TGCAGAGAAA GAGGGAGATG

GACCCCTCTA UTACAGGGG

GACAUCACT CTAAATAGAA

GAAUATGAT ACATGTCUT

GUGAAACU ATGAAAAUG

AATATTUAT CGTAATTUT

UGGTCCUT AAAAATUGA

GTGAATAATA TGTAAAAUT

ACUAATATA CAAAUATAG

GGAAAAAAAA ACTCATUAT

ATUGTAUT TATCGATUT

ACAAGAATAA ATTUATATA

ATGATGAACT TGTAAAATAA

TAAUATUA UCTCAACAT

TATUGCTCA UCTAATTU

CATATATUT GAATUTATG

TUCTAACTC ACATTUGTA

AUAATGGGC UTAAATAAG

CUTCCTACC AAGTAAATAA

CTAAATAUA GAAAAUAAC

GGGTAAAAAA GACGAACGAC

TAAUTACCT UAUCAGU

ATAUCACAC AAAAATAATG

3192

3243

3303

3363

3423

3483

3543

3603

3663

3723

3783

3843

3903

3963

4023

4083

4143

4203

4263

4323

4383

4443

4503

4563

4623

4683

TGUGGCCCT CGTAAUCAA ATACTATCAT TCAUTCUG TCGAGGGAGT AGTAAATACT 4743 • ·

ITTAGGMAG TTAGCAATAA GTAATCAAGA AATCAAGAAA ACAGAGGTCA TTIGATGCCC 4803

ACAAATACAA ATGAAAAAAC AAAACAAATG TTACGAAACA ATAAAAGAAC AAGAATAGCC 4863

TCAAAGTAAA ACTCTCTGAT AGACATTTAC TCTAAATAGA ATTCTATTTA TAACAATCAA 4923

AAAGTTTCTA CATTTATAGA TAGCTCCACT AGCCAAATAT TTTATTATTG GAATCAGCAA 4983

AATAGGTTGT TTCTTTTTTT AnCTCATTC TGTCTGTGH CTAAACAG CAT T7G CCG 5040

His Leu Pro

TCT CTA CGG

AGG ATA Arg Ile

GAT CTC AGC TGG TCT AAA AGA TTG ACG CGA ACA

5088

Ser 620

Leu

Arg

Asp 625

Leu Ser

Trp

Ser

Lys 630

Arg

Leu

Thr

Arg

Thr 635

CCA

GAT

ne

ACG

GGG

ATG

CCA

AAT

nG

GAG

TAT

GTG

AAT

nG

TAT

CAA

5136

Pro

Asp

Phe

Thr

Gly

Met

Pro

Asn

Leu

Glu

Tyr

Val

Asn

Leu

Tyr

Gin

640

645

650

TGT

AGT

AAT

CTT

GAA

GAA

GTT

CAC

CAT

TCC

CTG

GGA

TGT

TGC

AGC

AAA

5184

Cys

Ser

Asn

Leu

Glu

Glu

Val

His

His

Ser

Leu

Gly

Cys

Cys

Ser

Lys

655

660

665

GTC

ATT

GGT

TTA

TAT

TTG

AAT

GAT

TGT

AAA

AGC

cn

AAG

AGG

τη

CCA

5232

Val

Ile

Gly

Leu

Tyr

Leu

Asn

Asp

Cys

Lys

Ser

Leu

Lys

Arg

Phe

Pro

670

675

680

TGT

GTT

AAC

GTG

GAA

TCT

cn

GAA

TAT

CTG

GGT

CTA

AGA

AGT

TGC

GAT

5280

Cys

Val

Asn

Val

Glu

Ser

Leu

Glu

Tyr

Leu

Gly

Leu

Arg

Ser

Cys

Asp

685

690

695

AGT

TTA

GAG

AAA

TTG

CCA

GAA

ATC

TAC

GGG

AGA

ATG

AAG

CCG

GAG

ATA

5328

Ser

Leu

Glu

Lys

Leu

Pro

Glu

Ile

Tyr Gly Arg

Met

Lys

Pro

Glu

Ile

700

705

710

715

CAG

ATT

CAC

ATG

CAA

GGC

TCT

GGG

ATA

AGG

GAA

CTA

CCA

TCA

TCT

An

5376

Gin

Ile

His

Met

Gin

Gly

Ser

Gly

Ile

Arg

Glu

Leu

Pro

Ser

Ser

Ile

720

725

730

TTT

CAG

TAC

AAA

ACT

CAT

Gn

ACC

AAG

CTA

nG

nG

TGG

AAT

ATG

AAA

5424

Phe

Gin

Tyr

Lys

Thr

His

Val

Thr

Lys

Leu

Leu

Leu

Trp

Asn

Met

Lys

735

740

745

AAC

CTT

GTA

GCT

cn

CCA

AGC

AGC

ATA

TGT

AGG

nG

AAA

AGT

nG

Gn

5472

Asn

Leu

Val

Ala

Leu

Pro

Ser

Ser

Ile

Cys

Arg

Leu

Lys

Ser

Leu

Val

750

755

760

AGT

CTG

AGT

GTG

TCG

GGT

TGC

TCA

AAA

cn

GAA

AGC

nG

CCA

GAA

GAG

5520

Ser

Leu

Ser

Val

Ser

Gly Cys

Ser

Lys

Leu

Glu

Ser

Leu

Pro

Glu

Glu

765

770

775

ATA

GGG

GAT

TTA

GAC

AAC

nA

CGG

GTG

τη

GAT

GCC

AGT

GAT

ACT

CTA

5568

Ile

Gly Asp

Leu

Asp

Asn

Leu

Arg

Val

Phe

Asp

Ala

Ser

Asp

Thr

Leu

780

785

790

795

AU UA Ile Leu

CGA CCT Arg Pro

CCG TCT TCC ATC ATA CGC UG AAC AAA CTT

ATA Ile 810

ATC Ile

5616

Pro 800

Ser

Ser

Ile

Ile

Arg 805

Leu

Asn

Lys

Leu

UG

ATG

TTT

CGA

GGC

ne

AAA

GAT

GGA

GTG

CAC

UT

GAG

ne

CCT

CCT

5664

Leu

Met

Phe

Arg

Gly

Phe

Lys

Asp

Gly

Val

His

Phe

Glu

Phe

Pro

Pro

815

820

825

GTG

GCT

GAA

GGA

TTA

CAC

TCA

UG

GAA

TAT

CTG

AAT

CTC

AGT

TAC

TGC

5712

Val

Alá

Glu

Gly

Leu

His

Ser

Leu

Glu

Tyr

Leu

Asn

Leu

Ser

Tyr

Cys

830

835

840

AAT

CTA

ATA

GAT

GGA

GGA

cn

CCG

GAA

GAG

AU

GGA

TCC

UA

TCC

TCT

5760

Asn

Leu

Ile

Asp

Gly

Gly

Leu

Pro

Glu

Glu

Ile

Gly

Ser

Leu

Ser

Ser

845

850

855

TTG

AAA

AAG

TTG

GAT

CTC

AGT

AGA

AAT

AAT

UT

GAG

CAT

UG

CCT

TCA

5808

Leu

Lys

Lys

Leu

Asp

Leu

Ser

Arg

Asn

Asn

Phe

Glu

His

Leu

Pro

Ser

860

865

870

875

AGT

ATA

GCC

CAA

cn

GGT

GCT

cn

CAA

TCC

UA

GAC

UA

AAA

GAT

TGC

5856

Ser

Ile

Alá

Gin

Leu

Gly Alá

Leu

Gin

Ser

Leu

Asp

Leu

Lys

Asp

Cys

880

885

890

CAG

AGG

CTT

ACA

CAG

CTA

CCA

GAA

cn

CCC

CCA

GAA

UA

AAT

GAA

UG

5904

Gin

Arg

Leu

Thr

Gin

Leu

Pro

Glu

Leu

Pro

Pro

Glu

Leu

Asn

Glu

Leu

895

900

905

CAT

GTA

GAT

TGT

CAT

ATG

GCT

CTG

AAA

nr

ATC

CAT

TAT

UA

GTA

ACA

5952

His

Val

Asp

Cys

His

Met

Alá

Leu

Lys

Phe

Ile

His

Tyr

Leu

Val

Thr

910

915

920

AAG

AGA

AAG

AAA

CTA

CAT

AGA

GTG

AAA

cn

GAT

GAT

GCA

CAC

AAT

GAT

6000

Lys

Arg

Lys

Lys

Leu

His

Arg

Val

Lys

Leu

Asp Asp

Alá

His

Asn

Asp

925

930

935

ACT

ATG

TAC

AAT

TTG

TTT

GCA

TAT

ACC

ATG

UT

CAG

AAT

ATC

TCT

TCC

6048

Thr

Met

Tyr

Asn

Leu

Phe

Alá

Tyr

Thr

Met

Phe

Gin

Asn

Ile

Ser

Ser

940

945

950

955

ATG

AGG

CAT

GAC

ATC

TCT

GCT

TCA

GAT

TCC

UG

TCA

CTA

ACA

GTA

nr

6096

Met

Arg

His

Asp

Ile

Ser

Alá

Ser

Asp

Ser

Leu

Ser

Leu

Thr

Val

Phe

960

965

970

ACC

GGT

CAA

CCG

TAT

CCT

GAA

AAG

ATC

CCG

AGT

TGG

ne

CAC

CAT

CAG

6144

Thr

Gly

Gin

Pro

Tyr

Pro

Glu

Lys

Ile

Pro

Ser

Trp

Phe

His

His

Gin

975

980

985

GGT

TGG

GAT

AGT

AGT

GTA

TCA

GTC

AAT

UG

CCT

GAA

AAT

TGG

TAT

ATA

6192

Gly Trp

Asp

Ser

Ser

Val

Ser

Val

Asn

Leu

Pro

Glu

Asn

Trp

Tyr

Ile

990

995

1000

CCT

GAT

AAA

ne

TTG

GGA

τη

GCT

GTA

TGT

TAC

TCT

CGT AGC

UA

AU

6240

Pro Asp

Lys

Phe

Leu

Gly

Phe

Alá

Val

Cys

Tyr

Ser

Arg Ser

Leu

Ile

1005

1010

1015

• · · · ·

GAC ACA ACA GCT CAC TTG ATT CCC GTA	TGT GAT GAC AAG ATG TCG CGC	6288
Asp Thr 1020	Thr	Alá His	Leu Ile Pro 1025	Val	Cys	Asp Asp Lys Met Ser Arg
1030	1035
ATG ACC	CAG	AAA CTT	GCC TTA TCA	GAA	TGT	GAT ACA GAA TCA TCC	AAC	6336
Met Thr	Gin	Lys Leu Alá Leu Ser 1040	Glu	Cys Asp Thr Glu Ser Ser Asn 1045 1050
TAT TCA	GAA	TGG GAT	ATA CAT TTT	ne	TTT	GTA CCT TTT GCT GGC	TTA	6384
Tyr Ser	Glu	Trp Asp 1055	Ile His Phe	Phe Phe 1060	Val Pro Phe Alá Gly 1065	Leu
TGG GAT	ACA	TCT AAG	GCA AAT GGA	AAA	ACA	CCA AAT GAT TAT GGG	ATT	6432
Trp Asp	Thr Ser Lys 1070	Alá Asn Gly Lys 1075	Thr	Pro Asn Asp Tyr Gly 1080	Ile
ATT AGG	CTA	TCT TTT	TCT GGA GAA	GAG	AAG	ATG TAT GGA CH CGT	TTG	6480
Ile Arg Leu 1085	Ser Phe	Ser Gly Glu 1090	Glu	Lys	Met Tyr Gly Leu Arg 1095	Leu
TTG TAT	AAA	GAA GGA	CCA GAG GTT	AAT	GCC	TTG TTA CAA ATG AGG	GAA	6528
Leu Tyr 1100	Lys	Glu Gly	Pro Glu Val 1105	Asn	Alá	Leu Leu Gin Met Arg 1110	Glu 1115
AAT AGC	AAT	GAA CCA	ACA GAA CAT	TCC	ACT	GGG ATA AGG AGG ACT	CAA	6576
Asn Ser	Asn	Glu Pro Thr Glu His 1120	Ser	Thr Gly Ile Arg Arg Thr 1125 113C	Gin 1
TAT AAC Tyr Asn	AAC Asn	AGA ACT TCC TTT TAT Arg Thr Ser Phe Tyr	GTAAGTCTCT ACHCTAHA GCTACAAAGT	6630

1135

CTTCTTCCAA AATCAATACT CCATCCGTTC CAGTTTATGT GAACCTATTT TTTGTTCGTC 6690

CATTCTAAAA AGAATGACCC CTTTCTAAAT TTGGAAATAA TTTTGGnAA ACTTATAATT 6750

CTACCATTAA CGAGAAGCTT TTATAACCAC ACAAATATTC TGGGGCCCTT TTTGAATTGT 6810

TTAGGACCAT AAAHCCAAA AGTCCTCAH TTTTCTTAAA CTCCGTGCCC AATCAAACAA 6870

GTTCACGTAA ATTGGAACGG AGGGAATATA i IHI ICTTC TCATTCTTTT CCCCTATTTA 6930

CAG GAG CTC ATC AAT GGG TGATGTACAT ATCAACAACG AGTTTTAAAG 6978

Glu Leu Ile Asn Gly 1140 114

GATTCCAACA AGTATAACH TTTATGCTCA AATCAGCTCC TTGTATTGTG GAGAAAGCTG 7038

AGTACGAGAT GAAGTTGACG TCCGTTATCC THATGATCT CTCTGHCH TGTGTTAACT 7098

TGCCTACTTC ATCAGATGAA TAACAGAAGC CCGTTCCTCT CATTCTCAAC ACTGTTTGCA 7158

CGTCTGTTGT TACT7GTTAA AATGGATCTT GATAAAGTAA TAACATCTCT ATATTACTTA 7218

TAAGTGGTTT TAACAAGTTC ACTCTTTTGC TTTTGCAGTT CAAATGGGAA CACAATGTAT 7278

ATTGAGAACT AGAACAATGA CACTGCATAT ATATATATAT ATGTATGTAT GTAATTCTCG 7338

TCTTTTGGAC TAGAATACCT TGTTTCATTA TGAAATGAAT TAACATCTTC GCCTTTGCTG 7398

AC

7400 • · ·

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 1144 aminosav TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met

Alá

Ser

Ser

Ser

Ser

Ser

Ser

Arg

Trp

Ser

Tyr

Asp

Val

Phe

Leu

1

5

10

15

Ser

Phe

Arg

Gly

Glu

Asp

Thr

Arg

Lys

Thr

Phe

Thr

Ser

His

Leu

Tyr

20

25

30

Glu

Val

Leu

Asn

Asp

Lys

Gly

Ile

Lys

Thr

Phe

Gin

Asp

Asp

Lys

Arg

35

40

45

Leu

Glu

Tyr

Gly

Alá

Thr

Ile

Pro

Gly

Glu

Leu

Cys

Lys

Alá

Ile

Glu

50

55

60

Glu

Ser

Gin

Phe

Alá

Ile

Val

Val

Phe

Ser

Glu

Asn

Tyr

Alá

Thr

Ser

65

70

75

80

Arg

Trp

Cys

Leu

Asn

Glu

Leu

Val

Lys

Ile

Met

Glu

Cys

Lys

Thr

Arg

85

90

95

Phe

Lys

Gin

Thr

Val

Ile

Pro

Ile

Phe

Tyr

Asp

Val

Asp

Pro

Ser

His

100

105

110

Val

Arg

Asn

Gin

Lys

Glu

Ser

Phe

Alá

Lys

Alá

Phe

Glu

Glu

His

Glu

115

120

125

Thr

Lys

Tyr

Lys

Asp

Asp

Val

Glu

Gly

Ile

Gin

Arg

Trp

Arg

Ile

Alá

130

135

140

Leu

Asn

Glu

Alá

Alá

Asn

Leu

Lys

Gly

Ser

Cys

Asp

Asn

Arg

Asp

Lys

145

150

155

160

Thr

Asp

Alá

Asp

Cys

Ile

Arg

Gin

Ile

Val

Asp

Gin

Ile

Ser

Ser

Lys

165

170

175

Leu

Cys

Lys

Ile

Ser

Leu

Ser

Tyr

Leu

Gin

Asn

Ile

Val

Gly

Ile

Asp

180

185

190

Thr

His

Leu

Glu

Lys

Ile

Glu

Ser

Leu

Leu

Glu

Ile

Gly

Ile

Asn

Gly

195

200

205

Val

Arg

Ile

Met

Gly

Ile

Trp

Gly

Met

Gly

Gly

Val

Gly

Lys

Thr

Thr

210

215

220

Ile

Alá

Arg

Alá

Ile

Phe

Asp

Thr

Leu

Leu

Gly

Arg

Met

Asp

Ser

Ser

225 230 235 240

Tyr Gin Phe Asp Gly Alá Cys Phe Leu Lys Asp Ile Lys Glu Asn Lys 245 250 255

Arg Gly Met

His 260

Ser Leu Gin Asn

Alá 265

Leu Leu Ser Glu

Leu 270

Leu

Arg

Glu

Lys

Alá

Asn

Tyr

Asn

Asn

Glu

Glu

Asp

Gly

Lys

His

Gin

Met

Alá

275

280

285

Ser

Arg

Leu

Arg

Ser

Lys

Lys

Val

Leu

Ile

Val

Leu

Asp Asp

Ile

Asp

290

295

300

Asn

Lys

Asp

His

Tyr

Leu

Glu

Tyr

Leu

Alá

Gly Asp

Leu

Asp

Trp

Phe

305

310

315

320

Gly

Asn

Gly

Ser

Arg

Ile

Ile

Ile

Thr

Thr

Arg Asp

Lys

His

Leu

Ile

325

330

335

Glu

Lys

Asn

Asp

Ile

Ile

Tyr

Glu

Val

Thr

Alá

Leu

Pro

Asp

His

Glu

340

345

350

Ser

Ile

Gin

Leu

Phe

Lys

Gin

His

Alá

Phe

Gly

Lys

Glu

Val

Pro

Asn

355

360

365

Glu

Asn

Phe

Glu

Lys

Leu

Ser

Leu

Glu

Val

Val

Asn

Tyr

Alá

Lys

Gly

370

375

380

Leu

Pro

Leu

Alá

Leu

Lys

Val

Trp

Gly

Ser

Leu

Leu

His

Asn

Leu

Arg

385

390

395

400

Leu

Thr

Glu

Trp

Lys

Ser

Alá

Ile

Glu

His

Met

Lys

Asn

Asn

Ser

Tyr

405

410

415

Ser

Gly

Ile

Ile

Asp

Lys

Leu

Lys

Ile

Ser

Tyr Asp

Gly

Leu

Glu

Pro

420

425

430

Lys

Gin

Gin

Glu

Met

Phe

Leu

Asp

Ile

Alá

Cys

Phe

Leu

Arg

Gly

Glu

435

440

445

Glu

Lys

Asp

Tyr

Ile

Leu

Gin

Ile

Leu

Glu

Ser

Cys

His

Ile

Gly Alá

450

455

460

Glu

Tyr Gly

Leu

Arg

Ile

Leu

Ile

Asp Lys

Ser

Leu

Val

Phe

Ile

Ser

465

470

475

480

Glu

Tyr

Asn

Gin

Val

Gin

Met

His

Asp

Leu

Ile

Gin

Asp

Met

Gly

Lys

485

490

495

Tyr

Ile

Val

Asn

Phe

Gin

Lys

Asp

Pro

Gly

Glu

Arg

Ser

Arg

Leu

Trp

500

505

510

Leu

Alá

Lys

Glu

Val

Glu

Glu

Val

Met

Ser

Asn

Asn

Thr

Gly

Thr

Met

515

520

525

Alá

Met

Glu

Alá

Ile

Trp

Val

Ser

Ser

Tyr

Ser

Ser

Thr

Leu

Arg

Phe

530

535

540

Ser

Asn

Gin

Alá

Val

Lys

Asn

Met

Lys

Arg

Leu

Arg

Val

Phe

Asn

Met

545

550

555

560

Gly

Arg

Ser

Ser

Thr

His

Tyr

Alá

Ile

Asp

Tyr

Leu

Pro

Asn

Asn

Leu

565

570

575

Arg

Cys

Phe

Val

Cys

Thr

Asn

Tyr

Pro

Trp

Glu

Ser

Phe

Pro

Ser

Thr

580

585

590

Phe

Glu

Leu

Lys

Met

Leu

Val

His

Leu

Gin

Leu

Arg

His

Asn

Ser

Leu

595

600

605

Ai*g

His

Leu

Trp

Thr

Glu

Thr

Lys

His

Leu

Pro

Ser

Leu

Arg

Arg

Ile

610

615

620

Asp

Leu

Ser

Trp

Ser

Lys

Arg

Leu

Thr

Arg

Thr

Pro

Asp

Phe

Thr

Gly

625

630

635

640

Met

Pro

Asn

Leu

Glu

Tyr

Val

Asn

Leu

Tyr

Gin

Cys

Ser

Asn

Leu

Glu

645

650

655

Glu

Val

His

His

Ser

Leu

Gly

Cys

Cys

Ser

Lys

Val

Ile

Gly

Leu

Tyr

660

665

670

Leu

Asn

Asp

Cys

Lys

Ser

Leu

Lys

Arg

Phe

Pro

Cys

Val

Asn

Val

Glu

675

680

685

Ser

Leu

Glu

Tyr

Leu

Gly

Leu

Arg

Ser

Cys

Asp

Ser

Leu

Glu

Lys

Leu

690

695

700

Pro

Glu

Ile

Tyr

Gly

Arg

Met

Lys

Pro

Glu

Ile

Gin

Ile

His

Met

Gin

705

710

715

720

Gly

Ser

Gly

Ile

Arg

Glu

Leu

Pro

Ser

Ser

Ile

Phe

Gin

Tyr

Lys

Thr

725

730

735

His

Val

Thr

Lys

Leu

Leu

Leu

Trp

Asn

Met

Lys

Asn

Leu

Val

Alá

Leu

740

745

750

Pro

Ser

Ser

Ile

Cys

Arg

Leu

Lys

Ser

Leu

Val

Ser

Leu

Ser

Val*

Ser

755

760

765

Gly

Cys

Ser

Lys

Leu

Glu

Ser

Leu

Pro

Glu

Glu

Ile

Gly

Asp

Leu

Asp

770

775

780

Asn

Leu

Arg

Val

Phe

Asp

Alá

Ser

Asp

Thr

Leu

Ile

Leu

Arg

Pro

Pro

785

790

795

800

Ser

Ser

Ile

Ile

Arg

Leu

Asn

Lys

Leu

Ile

Ile

Leu

Met

Phe

Arg

Gly

805

810

815

Phe

Lys

Asp

Gly

Val

His

Phe

Glu

Phe

Pro

Pro

Val

Alá

Glu

Gly

Leu

820

825

830

His

Ser

Leu

Glu

Tyr

Leu

Asn

Leu

Ser

Tyr

Cys

Asn

Leu

Ile

Asp

Gly

835

840

845

Gly

Leu

Pro

Glu

Glu

Ile

Gly

Ser

Leu

Ser

Ser

Leu

Lys

Lys

Leu

Asp

850

855

860

·♦ · · ·

Leu Ser Arg Asn 865	Asn Phe Glu His 870	Leu	Pro	Ser Ser Ile Alá Gin Leu
875	880
Gly Alá Leu Gin	Ser Leu Asp Leu 885	Lys	Asp 890	Cys	Gin Arg Leu Thr Gin 895
Leu Pro Glu Leu 900	Pro Pro Glu Leu	Asn 905	Glu	Leu	His Val Asp Cys His 910
Met Alá Leu Lys 915	Phe Ile His Tyr 920	Leu	Val	Thr	Lys Arg Lys Lys Leu 925
His Arg Val Lys 930	Leu Asp Asp Alá 935	His	Asn	Asp	Thr Met Tyr Asn Leu 940
Phe Alá Tyr Thr 945	Met Phe Gin Asn 950	Ile	Ser	Ser 955	Met Arg His Asp Ile 960
Ser Alá Ser Asp	Ser Leu Ser Leu 965	Thr	Val 970	Phe	Thr Gly Gin Pro Tyr 975
Pro Glu Lys Ile 980	Pro Ser Trp Phe	His 985	His	Gin	Gly Trp Asp Ser Ser 990
Val Ser Val Asn 995	Leu Pro Glu Asn Trp 1000	Tyr	Ile	Pro Asp Lys Phe Leu 1005
Gly Phe Alá Val 1010	Cys Tyr Ser Arg 1015	Ser	Leu	Ile	Asp Thr Thr Alá His 1020
Leu Ile Pro Val 1025	Cys Asp Asp Lys 1030	Met	Ser	Arg Met Thr Gin Lys Leu 1035 1040
Alá Leu Ser Glu	Cys Asp Thr Glu 1045	Ser	Ser Asn 1050	Tyr Ser Glu Trp Asp 1055
Ile His Phe Phe Phe Val Pro Phe 1060	Alá 1065	Gly	Leu	Trp Asp Thr Ser Lys 1070
Alá Asn Gly Lys 1075	Thr Pro Asn Asp Tyr Gly 1080	Ile	Ile Arg Leu Ser Phe 1085
Ser Gly Glu Glu 1090	Lys Met Tyr Gly Leu 1095	Arg	Leu	Leu Tyr Lys Glu Gly 1100
Pro Glu Val Asn 1105	Alá Leu Leu Gin 1110	Met	Arg	Glu 1115	Asn Ser Asn Glu Pro i 1120
Thr Glu His Ser	Thr Gly Ile Arg Arg 1125	Thr 113C	Gin Tyr Asn Asn Arg Thr 1 1135

Ser Phe Tyr Glu Leu Ile Asn Gly 1140 • ·· · ·

- 94 A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 3760 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: mRNS-ről készített cDNS EREDETI FORRÁS:

ÉLŐLÉNY: Nicotiana glutinosa Szövettípus: levél SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS: 60-3494

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GGCACGAGAT TTTTTCACAT ACAGTTTCTT ACTCTTTTCA GAGAAUAAC GÍTGAGTCC 59

ATG Met 1

GCA TCT

TCT Ser

TCT TCT

TCT TCT AGA TGG AGC TAT GAT GH TTC TTA

107

Alá

Ser

Ser 5

Ser

Ser Ser Arg Trp 10

Ser

Tyr

Asp

Val

Phe 15

Leu

AGT

TTT

AGA

GGC

GAA

GAT

ACT

CGA

AAA

ACG

TTT

ACA

AGT

CAC

nA

TAC

155

Ser

Phe

Arg

Gly

Glu

Asp

Thr

Arg

Lys

Thr

Phe

Thr

Ser

His

Leu

Tyr

20

25

30

GAA

GTC

TTG

AAT

GAT

AAG

GGA

ATA

AAA

ACC

τη

CAA

GAT

GAT

AAA

AGG

203

Glu

Val

Leu

Asn

Asp

Lys Gly

Ile

Lys

Thr

Phe

Gin

Asp

Asp

Lys

Arg

35

40

45

CTA

GAG

TAC

GGC

GCA

ACC

ATC

CCA

GGT

GAA

CTC

TGT

AAA

GCT

ATA

GAA

251

Leu

Glu

Tyr

Gly Alá

Thr

Ile

Pro

Gly

Glu

Leu

Cys

Lys

Alá

Ile

Glu

50

55

60

GAG

TCT

CAA

TTT

GCC

ATT

GTT

GTT

ne

TCA

GAG

AAT

TAT

GCA

ACA

TCA

299

Glu

Ser

Gin

Phe

Alá

Ile

Val

Val

Phe

Ser

Glu

Asn

Tyr

Alá

Thr

Ser

65

70

75

80

AGG

TGG

TGT

TTG

AAT

GAA

CTA

GTG

AAG

ATC

ATG

GAA

TGC

AAA

ACT

CGA

347

Arg

Trp

Cys

Leu

Asn

Glu

Leu

Val

Lys

Ile

Met

Glu

Cys

Lys

Thr

Arg

85

90

95

TTT

AAG

CAA

ACT

GTT

ATA

CCG

ATA

ne

TAT

GAT

GTG

GAT

CCA

TCA

CAT

395

Phe

Lys

Gin

Thr

Val

Ile

Pro

Ile

Phe

Tyr Asp

Val

Asp

Pro

Ser

His

100

105

110

GTT

CGG

AAC

CAA

AAG

GAG

AGC

TTT

GCA

AAA

GCC

nr

GAA

GAA

CAT

GAA

443

Val

Arg

Asn

Gin

Lys

Glu

Ser

Phe

Alá

Lys

Alá

Phe

Glu

Glu

His

Glu

115

120

125

ACA

AAG

TAT

AAG

GAT

GAT

GTT

GAG

GGA

ATA

CAA

AGA

TGG

AGG

An

GCT

491

Thr

Lys

Tyr

Lys Asp Asp

Val

Glu

Gly

Ile

Gin

Arg Trp Arg

Ile

Alá

130

135

140

···· • ··

TTA AAT Leu Asn 145

GAA Glu

GCG GCC

AAT CTC AAA GGC TCC TGT GAT AAT CGT GAC AAG

539

Alá

Alá

Asn 150

Leu Lys

Gly

Ser Cys 155

Asp

Asn

Arg

Asp

Lys 160

ACT

GAT

GCA

GAC

TGT

ATT

CGA

CAG

ATT

Gn

GAC

CAA

ATC

TCA

TCC

AAA

587

Thr

Asp

Alá

Asp

Cys

Ile

Arg

Gin

Ile

Val

Asp

Gin

He

Ser

Ser

Lys

165

170

175

ΠΑ

TGC

AAG

ΑΠ

TCT

TTA

TCT

TAT

TTG

CAA

AAC

An

Gn

GGA

ATA

GAT

635

Leu

Cys

Lys

Ile

Ser

Leu

Ser

Tyr

Leu

Gin

Asn

Ile

Val

Gly

Ile

Asp

180

185

190

ACT

CAT

TTA

GAG

AAA

ATA

GAA

TCC

TTA

CTA

GAG

ATA

GGA

ATC

AAT

GGT

683

Thr

His

Leu

Glu

Lys

Ile

Glu

Ser

Leu

Leu

Glu

Ile

Gly

Ile

Asn

Gly

195

200

205

GU

CGG

ATT

ATG

GGG

ATC

TGG

GGA

ATG

GGG

GGA

GTC

GGT

AAA

ACA

ACA

731

Val

Arg

Ile

Met

Gly

Ile

Trp Gly

Met

Gly Gly

Val

Gly

Lys

Thr

Thr

210

215

220

ATA

GCA

AGA

GCT

ATA

TTT

GAT

ACT

CTT

nA

GGA

AGA

ATG

GAT

AGT

TCC

779

Ile

Alá

Arg

Alá

Ile

Phe

Asp

Thr

Leu

Leu

Gly Arg

Met

Asp

Ser

Ser

225

230

235

240

TAT

CAA

TIT

GAT

GGT

GCT

TGT

TTC

cn

AAG

GAT

An

AAA

GAA

AAC

AAA

827

Tyr

Gin

Phe

Asp

Gly

Alá

Cys

Phe

Leu

Lys Asp

Ile

Lys

Glu

Asn

Lys

245

250

255

CGT

GGA

ATG

CAT

TCT

HG

CAA

AAT

GCC

cn

CTC

TCT

GAA

cn

nA

AGG

875

Arg

Gly

Met

His

Ser

Leu

Gin

Asn

Alá

Leu

Leu

Ser

Glu

Leu

Leu

Arg

260

265

270

GAA

AAA

GCT

AAT

TAC

AAT

AAT

GAG

GAG

GAT

GGA

AAG

CAC

CAA

ATG

GCT

923

Glu

Lys

Alá

Asn

Tyr

Asn

Asn

Glu

Glu

Asp

Gly Lys

His

Gin

Met

Alá

275

280

285

AGT

AGA

CTT

CGT

TCG

AAG

AAG

GTC

CTA

An

GTG

cn

GAT

GAT

ATA.

GAT

971

Ser

Arg

Leu

Arg

Ser

Lys

Lys

Val

Leu

Ile

Val

Leu

Asp Asp

Ile

Asp

290

295

300

AAT

AAA

GAT

CAT

TAT

TTG

GAG

TAT

nA

GCA

GGT

GAT

cn

GAT

TGG

τη

1019

Asn

Lys

Asp

His

Tyr

Leu

Glu

Tyr

Leu

Alá

Gly Asp

Leu

Asp

Trp

Phe

305

310

315

320

GGT

AAT

GGT

AGT

AGA

ATT

ATT

ATA

ACA

ACT

AGA GAC

AAG

CAT

nG

ATA

1067

Gly

Asn

Gly

Ser

Arg

Ile

Ile

Ile

Thr

Thr

Arg Asp

Lys

His

Leu

Ile

325

330

335

GAG

AAG

AAT

GAT

ATA

ATA

TAT

GAG

GTG

ACT

GCA

CTA

CCC

GAT

CAT

GAA

1115

Glu

Lys

Asn

Asp

Ile

Ile

Tyr

Glu

Val

Thr

Alá

Leu

Pro

Asp

His

Glu

340

345

350

TCC

ATT

CAA

TTG

ne

AAA

CAA

CAT

GCT

ne

GGA

AAA

GAA

Gn

CCA

AAT

1163

Ser

Ile

Gin

Leu

Phe

Lys

Gin

His

Alá

Phe

Gly

Lys

Glu

Val

Pro

Asn

355

360

365

···»

GAG AAT TTT GAG

AAG CTT

TCA TTA GAG GTA GTA AAT TAT GCT

AAA Lys

GGC Gly

1211

Glu Asn Phe 370

Glu

Lys

Leu

Ser Leu 375

Glu

Val

Val

Asn Tyr 380

Alá

CTT

CCT

TTA

GCC

CTC

AAA

GTG

TGG

GGT

TCT

TTG

CTG

CAT

AAC

CTA

CGA

1259

Leu

Pro

Leu

Alá

Leu

Lys

Val

Trp

Gly

Ser

Leu

Leu

His

Asn

Leu

Arg

385

390

395

400

TTA

ACT

GAA

TGG

AAA

AGT

GCT

ATA

GAG

CAC

ATG

AAA

AAT

AAC

TCT

TAT

1307

Leu

Thr

Glu

Trp

Lys

Ser

Alá

Ile

Glu

His

Met

Lys

Asn

Asn

Ser

Tyr

405

410

415

TCT

GGA

ATT

ATT

GAT

AAG

CTC

AAA

ATA

AGT

TAT

GAT

GGA

TTA

GAG

CCC

1355

Ser

Gly

Ile

Ile

Asp

Lys

Leu

Lys

Ile

Ser

Tyr Asp

Gly

Leu

Glu

Pro

420

425

430

AAA

CAA

CAA

GAG

ATG

TTT

TTA

GAT

ATA

GCA

TGC

ne

TTG

CGA

GGG

GAA

1403

Lys

Gin

Gin

Glu

Met

Phe

Leu

Asp

Ile

Alá

Cys

Phe

Leu

Arg

Gly

Glu

435

440

445

GAA

AAA

GAT

TAC

ATC

CTA

CAA

ATC

CTT

GAG

AGT

TGT

CAT

ATT

GGA

GCT

1451

Glu

Lys

Asp

Tyr

Ile

Leu

Gin

Ile

Leu

Glu

Ser

Cys

His

Ile

Gly

Alá

450

455

460

GAA

TAC

GGG

TTA

CGT

ATT

TTA

ATT

GAC

AAA

TCT

cn

GTG

ne

ATC

TCT

1499

Glu

Tyr

Gly

Leu

Arg

Ile

Leu

Ile

Asp

Lys

Ser

Leu

Val

Phe

Ile

Ser

465

470

475

480

GAA

TAT

AAT

CAG

GTT

CAA

ATG

CAT

GAC

TTA

ATA

CAG

GAT

ATG

GGT

AAA

1547

Glu

Tyr

Asn

Gin

Val

Gin

Met

His

Asp

Leu

Ile

Gin

Asp

Met

Gly

Lys

485

490

495

TAT

ATA

GTG

AAT

TTT

CAA

AAA

GAT

CCC

GGA

GAA

CGT

AGC

AGA

UA

TGG

1595

Tyr

Ile

Val

Asn

Phe

Gin

Lys Asp

Pro

Gly

Glu

Arg

Ser

Arg

Leu

Trp

500

505

510

CTC

GCC

AAG

GAA

GTC

GAA

GAA

GTG

ATG

AGC

AAC

AAC

ACA

GGG

ACC

*ATG

1643

Leu

Alá

Lys

Glu

Val

Glu

Glu

Val

Met

Ser

Asn

Asn

Thr

Gly

Thr

Met

515

520

525

GCA

ATG

GAA

GCA

ATT

TGG

GTT

TCT

TCT

TAT

TCT

AGT

ACT

CTA

CGC

πτ

1691

Alá

Met

Glu

Alá

Ile

Trp

Val

Ser

Ser

Tyr

Ser

Ser

Thr

Leu

Arg

Phe

530

535

540

AGC

AAT

CAG

GCC

GTG

AAA

AAT

ATG

AAA

AGG

cn

AGG

GTA

τπ

AAC

ATG

1739

Ser

Asn

Gin

Alá

Val

Lys

Asn

Met

Lys

Arg

Leu

Arg

Val

Phe

Asn

Met

545

550

555

560

GGG

AGG

TCG

TCG

ACA

CAT

TAT

GCC

ATC

GAT

TAT

CTG

CCC

AAC

AAC

UG

1787

Gly Arg

Ser

Ser

Thr

His

Tyr

Alá

Ile

Asp

Tyr

Leu

Pro

Asn

Asn

Leu

565

570

575

CGT

TGT

TTT

GTT

TGC

ACT

AAC

TAT

CCT

TGG

GAG

TCA

τη

CCA

TCT

ACA

1835

Arg Cys

Phe

Val

Cys

Thr

Asn

Tyr

Pro

Trp

Glu

Ser

Phe

Pro

Ser

Thr

580

585

590

• ·

τπ GAA CTC

AAA ATG CTT GTT CAC CTC CAA CTC CGA CAC AAT

TCT Ser

CTG Leu

1883

Phe Glu

Leu 595

Lys

Met

Leu Val

His 600

Leu

Gin Leu

Arg

His 605

Asn

CGT

CAT

TTA

TGG

ACA

GAA

ACA

AAG

CAT

nG

CCG

TCT

CTA

CGG

AGG

ATA

1931

Arg

His

Leu

Trp

Thr

Glu

Thr

Lys

His

Leu

Pro

Ser

Leu

Arg Arg

Ile

610

615

620

GAT

CTC

AGC

TGG

TCT

AAA

AGA

nG

ACG

CGA

ACA

CCA

GAT

ne

ACG

GGG

1979

Asp

Leu

Ser

Trp

Ser

Lys

Arg

Leu

Thr

Arg

Thr

Pro

Asp

Phe

Thr

Gly

625

630

635

640

ATG

CCA

AAT

TTG

GAG

TAT

GTG

AAT

nG

TAT

CAA TGT

AGT

AAT

cn

GAA

2027

Met

Pro

Asn

Leu

Glu

Tyr

Val

Asn

Leu

Tyr

Gin

Cys

Ser

Asn

Leu

Glu

645

650

655

GAA

GTT

CAC

CAT

TCC

CTG

GGA

TGT

TGC

AGC

AAA

GTC

An

GGT

nA

TAT

2075

Glu

Val

His

His

Ser

Leu

Gly

Cys

Cys

Ser

Lys

Val

Ile

Gly

Leu

Tyr

660

665

670

TTG

AAT

GAT

TGT

AAA

AGC

cn

AAG

AGG

τη

CCA

TGT

Gn

AAC

GTG

GAA

2123

Leu

Asn

Asp

Cys

Lys

Ser

Leu

Lys

Arg

Phe

Pro

Cys

Val

Asn

Val

Glu

675

680

685

TCT

cn

GAA

TAT

CTG

GGT

CTA

AGA

AGT

TGC

GAT

AGT

nA

GAG

AAA

nG

2171

Ser

Leu

Glu

Tyr

Leu

Gly

Leu

Arg

Ser

Cys

Asp

Ser

Leu

Glu

Lys

Leu

690

695

700

CCA

GAA

ATC

TAC

GGG

AGA

ATG

AAG

CCG

GAG

ATA

CAG

An

CAC

ATG

CAA

2219

Pro

Glu

Ile

Tyr

Gly Arg

Met

Lys

Pro

Glu

Ile

Gin

Ile

His

Met

Gin

705

710

715

720

GGC

TCT

GGG

ATA

AGG

GAA

CTA

CCA

TCA

TCT

An

τη

CAG

TAC

AAA

ACT

2267

Gly

Ser

Gly

Ile

Arg

Glu

Leu

Pro

Ser

Ser

Ile

Phe

Gin

Tyr Lys

Thr

725

730

735

CAT

GTT

ACC

AAG

CTA

TTG

nG

TGG

AAT

ATG

AAA

AAC

cn

GTA

GCT·

cn

2315

His

Val

Thr

Lys

Leu

Leu

Leu

Trp

Asn

Met

Lys

Asn

Leu

Val

Alá

Leu

740

745

750

CCA

AGC

AGC

ATA

TGT

AGG

nG

AAA

AGT

nG

Gn

AGT

CTG

AGT

GTG

TCG

2363

Pro

Ser

Ser

Ile

Cys

Arg

Leu

Lys

Ser

Leu

Val

Ser

Leu

Ser

Val

Ser

755

760

765

GGT

TGC

TCA

AAA

CTT

GAA

AGC

nG

CCA

GAA

GAG

ATA

GGG

GAT

nA

GAC

2411

Gly

Cys

Ser

Lys

Leu

Glu

Ser

Leu

Pro

Glu

Glu

Ile

Gly Asp

Leu

Asp

770

775

780

AAC

TTA

CGG

GTG

TTT

GAT

GCC

AGT

GAT

ACT

CTA

An

nA

CGA

CCT

CCG

2459

Asn

Leu

Arg

Val

Phe

Asp

Alá

Ser

Asp

Thr

Leu

Ile

Leu

Arg

Pro

Pro

785

790

795

800

TCT

TCC

ATC

ATA

CGC

TTG

AAC

AAA

cn

ATA

ATC

nG

ATG

ΠΤΓ

CGA

GGC

2507

Ser

Ser

Ile

Ile

Arg

Leu

Asn

Lys

Leu

Ile

Ile

Leu

Met

Phe

Arg

Gly

805 810 815 • · · • · «

TTC AAA

GAT GGA GTG CAC Asp Gly Val His 820

TTT GAG RC CCT CCT GTG GCT GAA GGA TTA

2555

Phe

Lys

Phe Glu

Phe 825

Pro

Pro

Val

Alá

Glu 830

Gly

Leu

CAC

TCA

TTG

GAA

TAT

CTG

AAT

CTC

AGT

TAC

TGC

AAT

CTA

ATA

GAT

GGA

2603

His

Ser

Leu

Glu

Tyr

Leu

Asn

Leu

Ser

Tyr

Cys

Asn

Leu

Ile

Asp

Gly

835

840

845

GGA

CTT

CCG

GAA

GAG

ATT

GGA

TCC

TTA

TCC

TCT

TTG

AAA

AAG

nG

GAT

2651

Gly

Leu

Pro

Glu

Glu

Ile

Gly

Ser

Leu

Ser

Ser

Leu

Lys

Lys

Leu

Asp

850

855

860

CTC

AGT

AGA

AAT

AAT

TTT

GAG

CAT

TTG

CCT

TCA

AGT

ATA

GCC

CAA

cn

2699

Leu

Ser

Arg

Asn

Asn

Phe

Glu

His

Leu

Pro

Ser

Ser

Ile

Alá

Gin

Leu

865

870

875

880

GGT

GCT

cn

CAA

TCC

TTA

GAC

TTA

AAA

GAT

TGC

CAG

AGG

cn

ACA

CAG

2747

Gly

Alá

Leu

Gin

Ser

Leu

Asp

Leu

Lys

Asp

Cys

Gin

Arg

Leu

Thr

Gin

885

890

895

CTA

CCA

GAA

CTT

CCC

CCA

GAA

TTA

AAT

GAA

TTG

CAT

GTA

GAT

TGT

CAT

2795

Leu

Pro

Glu

Leu

Pro

Pro

Glu

Leu

Asn

Glu

Leu

His

Val

Asp Cys

His

900

905

910

ATG

GCT

CTG

AAA

TTT

ATC

CAT

TAT

TTA

GTA

ACA

AAG

AGA

AAG

AAA

CTA

2843

Met

Alá

Leu

Lys

Phe

Ile

His

Tyr

Leu

Val

Thr

Lys

Arg

Lys

Lys

Leu

915

920

925

CAT

AGA

GTG

AAA

CTT

GAT

GAT

GCA

CAC

AAT

GAT

ACT

ATG

TAC

AAT

nG

2891

His

Arg

Val

Lys

Leu

Asp Asp

Alá

His

Asn

Asp

Thr

Met

Tyr

Asn

Leu

930

935

940

TTT

GCA

TAT

ACC

ATG

TTT

CAG

AAT

ATC

TCT

TCC

ATG

AGG

CAT

GAC

ATC

2939

Phe

Alá

Tyr

Thr

Met

Phe

Gin

Asn

Ile

Ser

Ser

Met

Arg

His

Asp

Ile

945

950

955

960

TCT

GCT

TCA

GAT

TCC

RG

TCA

CTA

ACA

GTA

TTT

ACC

GGT

CAA

CCG

TAT

2987

Ser

Alá

Ser

Asp

Ser

Leu

Ser

Leu

Thr

Val

Phe

Thr

Gly

Gin

Pro

Tyr

965

970

975

CCT

GAA

AAG

ATC

CCG

AGT

TGG

TTC

CAC

CAT

CAG

GGT

TGG

GAT

AGT

AGT

3035

Pro

Glu

Lys

Ile

Pro

Ser

Trp

Phe

His

His

Gin

Gly Trp Asp

Ser

Ser

980

985

990

GTA

TCA

GTC

AAT

TTG

CCT

GAA

AAT

TGG

TAT

ATA

CCT

GAT AAA

ne

nG

3083

Val

Ser

Val

Asn

Leu

Pro

Glu

Asn

Trp

Tyr

Ile

Pro

Asp Lys

Phe

Leu

995

1000

1005

GGA

TTT

GCT

GTA

TGT

TAC

TCT

CGT

AGC

TTA

ATT

GAC

ACA

ACA

GCT

CAC

3131

Gly

Phe

Alá

Val

Cys

Tyr

Ser

Arg

Ser

Leu

Ile

Asp

Thr

Thr

Alá

His

1010

1015

1020

TTG

ATT

CCC

GTA

TGT

GAT

GAC AAG

ATG

TCG

CGC

ATG

ACC

CAG

AAA

cn

3179

Leu

Ile

Pro

Val

Cys Asp Asp Lys

Met

Ser

Arg

Met

Thr

Gin

Lys

Leu

1025

1030

1035

1040

• ·· ····· e · • · · · · 9 • · · · ··· «· « • · · ····· ·

GCC TTA Alá Leu	TCA GAA Ser Glu	TGT GAT Cys Asp 1045	ACA GAA TCA TCC AAC TAT	TCA GAA Ser Glu	TGG GAT Trp Asp 1055	3227
Thr	Glu	Ser	Ser Asn 1050	Tyr
ATA CAT	TTT TTC	TTT GTA	CCT	TTT	GCT	GGC TTA	TGG	GAT ACA	TCT AAG	3275
Ile His	Phe Phe	Phe Val	Pro	Phe	Alá	Gly Leu	Trp Asp Thr	Ser Lys
	1060			1065		1070
GCA AAT	GGA AAA	ACA CCA	AAT	GAT	TAT	GGG ATC	ATT	AGG CTA	TCT TTT	3323
Alá Asn	Gly Lys	Thr Pro	Asn	Asp Tyr	Gly Ile	Ile	Arg Leu	Ser Phe
	1075			1080			1085
TCT GGA	GAA GAG	AAG ATG	TAT	GGA	cn	CGT HG	HG	TAT AAA	GAA GGA	3371
Ser Gly	Glu Glu	Lys Met	Tyr	Gly	Leu	Arg Leu	Leu	Tyr Lys	Glu Gly
1090		1095			1100
CCA GAG	GTT AAT	GCC TTG	TTA	CAA	ATG	AGG GAA	AAT	AGC AAT	GAA CCA	3419
Pro Glu	Val Asn	Alá Leu	Leu	Gin	Met	Arg Glu	Asn	Ser Asn	Glu Pro
1105		1110			1115		1120
ACA GAA	CAT TCC	ACT GGG	ATA	AGG	AGG	ACT CAA TAT	AAC AAC	AGA ACT	3467
Thr Glu	His Ser	Thr Gly	Ile	Arg	Arg	Thr Gin Tyr	Asn Asn	Arg Thr
		1125				1130			1135
TCC TTT	TAT GAG	CTC ATC	AAT	GGG	TGATGTACAT ATCAACAACG AG	ITTTTAAAG	3521
Ser Phe	Tyr Glu	Leu Ile	Asn	Gly

1140

GATTCCAACA AGTATAACTT TTTATGCTCA AATCAGCTCC TTGTATTGTG GAGAAAGCTG 3581

AGTACGAGAT GAAGTTGACG TCCGTTATCC TTTATGATCT CTCTGTTCTT TGTGTTAACT 3641

TGCCTACTTC ATCAGATGAA TAACAGAAGC CCGTTCCTCT CATTCTCAAC ACTGTTTGCA 3701

CGTCTGTTGT TACTTGTTAA AATGGATCTT GATAAAGTAA TAACATCTCT ATATTACTT 3760

- 100 -

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 1144 aminosav TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met Alá Ser Ser Ser

Ser Ser

Ser

Arg Trp Ser Tyr Asp Val Phe Leu

1

5

10

15

Ser

Phe

Arg

Gly

Glu

Asp

Thr

Arg

Lys

Thr

Phe

Thr

Ser

His

Leu

Tyr

20

25

30

Glu

Val

Leu

Asn

Asp

Lys

Gly

Ile

Lys

Thr

Phe

Gin

Asp

Asp

Lys

Arg

35

40

45

Leu

Glu

Tyr Gly

Alá

Thr

Ile

Pro

Gly

Glu

Leu

cys

Lys

Alá

Ile

Glu

50

55

60

Glu

Ser

Gin

Phe

Alá

Ile

Val

Val

Phe

Ser

Glu

Asn

Tyr

Alá

Thr

Ser

65

70

75

80

Arg

Trp

Cys

Leu

Asn

Glu

Leu

Val

Lys

Ile

Met

Glu

Cys

Lys

Thr

Arg

85

90

95

Phe

Lys

Gin

Thr

Val

Ile

Pro

Ile

Phe

Tyr Asp

Val

Asp

Pro

Ser

His

100

105

110

Val

Arg

Asn

Gin

Lys

Glu

Ser

Phe

Alá

Lys

Alá

Phe

Glu

Glu

His

Glu

115

120

125

Thr

Lys

Tyr

Lys Asp Asp

Val

Glu

Gly

Ile

Gin

Arg

Trp Arg

Ile.

Alá

130

135

140

Leu

Asn

Glu

Alá Alá

Asn

Leu

Lys

Gly

Ser

cys

Asp

Asn

Arg Asp

Lys

145

150

155

160

Thr

Asp

Alá

Asp Cys

Ile

Arg

Gin

Ile

Val

Asp

Gin

Ile

Ser

Ser

Lys

165

170

175

Leu

Cys

Lys

Ile

Ser

Leu

Ser

Tyr

Leu

Gin

Asn

Ile

Val

Gly

Ile

Asp

180

185

190

Thr

His

Leu

Glu

Lys

Ile

Glu

Ser

Leu

Leu

Glu

Ile

Gly

Ile

Asn

Gly

195

200

205

Val

Arg

Ile

Met

Gly

Ile

Trp

Gly

Met

Gly Gly

Val

Gly

Lys

Thr

Thr

210

215

220

Ile

Alá

Arg

Alá

Ile

Phe

Asp

Thr

Leu

Leu Gly Arg

Met

Asp

Ser

Ser

225

230

235

240

Tyr Gin Phe Asp Gly Alá Cys Phe Leu Lys Asp Ile Lys Glu Asn Lys 245 250 255 • ·

- 101 • · · · · · · • ··· ·«· ·· · * · · ····· · •·· ·· «·· · ····

Arg Gly Met

His 260

Ser Leu Gin Asn

Alá 265

Leu Leu Ser Glu

Leu 270

Leu

Arg

Glu

Lys

Alá

Asn

Tyr

Asn

Asn

Glu

Glu

Asp

Gly

Lys

His

Gin

Met

Alá

275

280

285

Ser

Arg

Leu

Arg

Ser

Lys

Lys

Val

Leu

Ile

Val

Leu

Asp Asp

Ile

Asp

290

295

300

Asn

Lys

Asp

His

Tyr

Leu

Glu

Tyr

Leu

Alá

Gly Asp

Leu

Asp Trp

Phe

305

310

315

320

Gly

Asn

Gly

Ser

Arg

Ile

Ile

Ile

Thr

Thr

Arg Asp

Lys

His

Leu

Ile

325

330

335

Glu

Lys

Asn

Asp

Ile

Ile

Tyr

Glu

Val

Tiír

Alá

Leu

Pro

Asp

His

Glu

340

345

350

Ser

Ile

Gin

Leu

Phe

Lys

Gin

His

Alá

Phe

Gly Lys

Glu

Val

Pro

Asn

355

360

365

Glu

Asn

Phe

Glu

Lys

Leu

Ser

Leu

Glu

Val

Val

Asn

Tyr

Alá

Lys

Gly

370

375

380

Leu

Pro

Leu

Alá

Leu

Lys

Val

Trp

Gly

Ser

Leu

Leu

His

Asn

Leu

Arg

385

390

395

400

Leu

Thr

Glu

Trp

Lys

Ser

Alá

Ile

Glu

His

Met

Lys

Asn

Asn

Ser

Tyr

405

410

415

Ser

Gly

Ile

Ile

Asp

Lys

Leu

Lys

Ile

Ser

Tyr Asp

Gly

Leu

Glu

Pro

420

425

430

Lys

Gin

Gin

Glu

Met

Phe

Leu

Asp

Ile

Alá

Cys

Phe

Leu

Arg Gly

Glu

435

440

445

Glu

Lys

Asp

Tyr

Ile

Leu

Gin

Ile

Leu

Glu

Ser

Cys

His

Ile

Gly·

Alá

450

455

460

Glu

Tyr

Gly

Leu

Arg

Ile

Leu

Ile

Asp

Lys

Ser

Leu

Val

Phe

Ile

Ser

465

470

475

480

Glu

Tyr

Asn

Gin

Val

Gin

Met

His

Asp

Leu

Ile

Gin

Asp

Met

Gly

Lys

485

490

495

Tyr

Ile

Val

Asn

Phe

Gin

Lys

Asp

Pro

Gly

Glu

Arg

Ser

Arg

Leu

Trp

500

505

510

Leu

Alá

Lys

Glu

Val

Glu

Glu

Val

Met

Ser

Asn

Asn

Thr

Gly

Thr

Met

515

520

525

Alá

Met

Glu

Alá

Ile

Trp

Val

Ser

Ser

Tyr

Ser

Ser

Thr

Leu

Arg

Phe

530

535

540

Ser

Asn

Gin

Alá

Val

Lys

Asn

Met

Lys Arg

Leu

Arg

Val

Phe

Asn

Met

545

550

555

560

·· • · · ·

- 102 -

Gly Arg Ser Ser Thr

His

Tyr

Alá Ile Asp Tyr Leu Pro Asn Asn

Leu

565

570

575

Arg

Cys

Phe

Val

Cys

Thr

Asn

Tyr

Pro

Trp

Glu

Ser

Phe

Pro

Ser

Thr

580

585

590

Phe

Glu

Leu

Lys

Met

Leu

Val

His

Leu

Gin

Leu

Arg

His

Asn

Ser

Leu

595

600

605

Arg

His

Leu

Trp

Thr

Glu

Thr

Lys

His

Leu

Pro

Ser

Leu

Arg Arg

Ile

610

615

620

Asp

Leu

Ser

Trp

Ser

Lys

Arg

Leu

Thr

Arg

Thr

Pro

Asp

Phe

Thr

Gly

625

630

635

640

Met

Pro

Asn

Leu

Glu

Tyr

Val

Asn

Leu

Tyr

Gin

Cys

Ser

Asn

Leu

Glu

645

650

655

Glu

Val

His

His

Ser

Leu

Gly Cys

Cys

Ser

Lys

Val

Ile

Gly

Leu

Tyr

660

665

670

Leu

Asn

Asp

Cys

Lys

Ser

Leu

Lys

Arg

Phe

Pro

Cys

Val

Asn

Val

Glu

675

680

685

Ser

Leu

Glu

Tyr

Leu

Gly

Leu

Arg

Ser

Cys

Asp

Ser

Leu

Glu

Lys

Leu

690

695

700

Pro

Glu

Ile

Tyr Gly Arg

Met

Lys

Pro

Glu

Ile

Gin

Ile

His

Met

Gin

705

710

715

720

Gly

Ser

Gly

Ile

Arg

Glu

Leu

Pro

Ser

Ser

Ile

Phe

Gin

Tyr

Lys

Thr

725

730

735

His

Val

Thr

Lys

Leu

Leu

Leu

Trp

Asn

Met

Lys

Asn

Leu

Val

Alá

Leu

740

745

750

Pro

Ser

Ser

Ile

Cys

Arg

Leu

Lys

Ser

Leu

Val

Ser

Leu

Ser

Val*

Ser

755

760

765

Gly Cys

Ser

Lys

Leu

Glu

Ser

Leu

Pro

Glu

Glu

Ile

Gly Asp

Leu

Asp

770

775

780

Asn

Leu

Arg

Val

Phe

Asp

Alá

Ser

Asp

Thr

Leu

Ile

Leu

Arg

Pro

Pro

785

790

795

800

Ser

Ser

Ile

Ile

Arg

Leu

Asn

Lys

Leu

Ile

Ile

Leu

Met

Phe

Arg

Gly

805

810

815

Phe

Lys

Asp

Gly

Val

His

Phe

Glu

Phe

Pro

Pro

Val

Alá

Glu

Gly

Leu

820

825

830

His

Ser

Leu

Glu

Tyr

Leu

Asn

Leu

Ser

Tyr Cys

Asn

Leu

Ile

Asp Gly

835

840

845

Gly

Leu

Pro

Glu

Glu

Ile

Gly

Ser

Leu

Ser

Ser

Leu

Lys

Lys

Leu Asp

850

855

860

- 103

Leu Ser 865	Arg Asn Asn Phe 870	Glu His	Leu Pro Ser Ser Ile Alá Gin Leu
875	880
Gly Alá	Leu Gin Ser Leu	Asp Leu	Lys Asp Cys Gin	Arg Leu Thr Gin
	885		890	895
Leu Pro	Glu Leu Pro Pro	Glu Leu	Asn Glu Leu His	Val Asp Cys His
	900		905	910
Met Alá	Leu Lys Phe Ile	His Tyr	Leu Val Thr Lys	Arg Lys .Lys Leu
	915	920		925
His Arg	Val Lys Leu Asp Asp Alá	His Asn Asp Thr	Met Tyr Asn Leu
930		935	940
Phe Alá	Tyr Thr Met Phe	Gin Asn	Ile Ser Ser Met	Arg His Asp Ile
945	950		955	960
Ser Alá	Ser Asp Ser Leu	Ser Leu	Thr Val Phe Thr	Gly Gin Pro Tyr
	965		970	975
Pro Glu	Lys Ile Pro Ser	Trp Phe	His His Gin Gly Trp Asp Ser Ser
	980		985	990
Val Ser	Val Asn Leu Pro	Glu Asn	Trp Tyr Ile Pro Asp Lys Phe Leu
	995	1000	1005
Gly Phe	Alá Val Cys Tyr	Ser Arg	Ser Leu Ile Asp Thr Thr Alá His
1010	1015	1020
Leu Ile	Pro Val Cys Asp Asp Lys	Met Ser Arg Met	Thr Gin Lys Leu
1025	1030	1035	1040
Alá Leu	Ser Glu Cys Asp	Thr Glu	Ser Ser Asn Tyr Ser Glu Trp Asp
	1045		1050	1055
Ile His	Phe Phe Phe Val	Pro Phe	Alá Gly Leu Trp Asp Thr Ser-Lys
	1060		1065	1070
Alá Asn	Gly Lys Thr Pro	Asn Asp	Tyr Gly Ile Ile Arg Leu Ser Phe
	1075	1080	1085
Ser Gly	Glu Glu Lys Met	Tyr Gly Leu Arg Leu Leu Tyr Lys Glu Gly
1090	1095	1100
Pro Glu	Val Asn Alá Leu	Leu Gin	Met Arg Glu Asn	Ser Asn Glu Pro
1105	1110	1115	1120
Thr Glu	His Ser Thr Gly Ile Arg Arg Thr Gin Tyr Asn Asn Arg Thr
	1125		1130	1135

Ser Phe Tyr Glu Leu Ile Asn Gly 1140

- 104 • ·

AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 3830 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: mRNS-ről készített cDNS EREDETI FORRÁS:

ÉLŐLÉNY: Nicotiana glutinosa Szövettípus: levél SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS: 60...2018

AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GGCACGAGAT TTTTTCACAT ACAGTTTCTT ACTCTTTTCA GAGAATTAAC GnGAGTCC 59

ATG Met 1

GCA TCT

TCT Ser

TCT TCT

TCT TCT AGA TGG AGC TAT GAT GTT TTC TTA

107

Alá

Ser

Ser 5

Ser

Ser Ser Arg Trp 10

Ser

Tyr

Asp

Val

Phe 15

Leu

AGT

TTT

AGA

GGC

GAA

GAT

ACT

CGA

AAA

ACG

TTT

ACA

AGT

CAC

TTA

TAC

155

Ser

Phe

Arg

Gly

Glu

Asp

Thr

Arg

Lys

Thr

Phe

Thr

Ser

His

Leu

Tyr

20

25

30

GAA

GTC

TTG

AAT

GAT

AAG

GGA

ATA

AAA

ACC

ITT

CAA

GAT

GAT

AAA

AGG

203

Glu

Val

Leu

Asn

Asp

Lys

Gly

Ile

Lys

Thr

Phe

Gin

Asp Asp

Lys

Arg

35

40

45

CTA

GAG

TAC

GGC

GCA

ACC

ATC

CCA

GGT

GAA

CTC

TGT

AAA

GCT

ATA .GAA

251

Leu

Glu

Tyr

Gly

Alá

Thr

Ile

Pro

Gly

Glu

Leu

Cys

Lys

Alá

Ile

Glu

50

55

60

GAG

TCT

CAA

TTT

GCC

AU

GTT

GTT

ne

TCA

GAG

AAT

TAT

GCA

ACA

TCA

299

Glu

Ser

Gin

Phe

Alá

Ile

Val

Val

Phe

Ser

Glu

Asn

Tyr

Alá

Thr

Ser

65

70

75

80

AGG

TGG

TGT

TTG

AAT

GAA

CTA

GTG

AAG

ATC

ATG

GAA

TGC

AAA

ACT

CGA

347

Arg

Trp

Cys

Leu

Asn

Glu

Leu

Val

Lys

Ile

Met

Glu

Cys

Lys

Thr

Arg

85

90

95

UT

AAG

CAA

ACT

GTT

ATA

CCG

ATA

ne

TAT

GAT

GTG

GAT

CCA

TCA

CAT

395

Phe

Lys

Gin

Thr

Val

Ile

Pro

Ile

Phe

Tyr Asp

Val

Asp

Pro

Ser

His

100

105

110

GU

CGG

AAC

CAA

AAG

GAG

AGC

TTT

GCA

AAA

GCC

TTT

GAA

GAA

CAT

GAA

443

Val

Arg

Asn

Gin

Lys

Glu

Ser

Phe

Alá

Lys

Alá

Phe

Glu

Glu

His

Glu

115

120

125

ACA

AAG

TAT

AAG

GAT

GAT

GTT

GAG

GGA

ATA

CAA

AGA

TGG

AGG

ATT

GCT

491

Thr

Lys

Tyr

Lys

Asp Asp

Val

Glu

Gly

Ile

Gin

Arg

Trp Arg

Ile

Alá

130

135

140

• ·· • · ·

- 105 -

• · ··

• · • · ·

·· · · · • ··· ·

TTA

AAT

GAA

GCG

GCC

AAT

CTC

AAA

GGC

TCA

TGT

GAT

AAT

CGT

GAC

AAG

539

Leu

Asn

Glu

Alá

Alá

Asn

Leu

Lys

Gly

Ser

Cys

Asp

Asn

Arg Asp

Lys

145

150

155

160

ACT

GAT

GCA

GAC

TGT

An

CGA

CAG

An

Gn

GAC

CAA

ATC

TCA

TCC

AAA

587

Thr

Asp

Alá

Asp

Cys

Ile

Arg

Gin

Ile

Val

Asp

Gin

Ile

Ser

Ser

Lys

165

170

175

TTA

TGC

AAG

An

TCT

nA

TCT

TAT

nG

CAA

AAC

An

Gn

GGA

ATA

GAT

635

Leu

Cys

Lys

Ile

Ser

Leu

Ser

Tyr

Leu

Gin

Asn

Ile

Val

Gly

Ile

Asp

180

185

190

ACT

CAT

nA

GAG

AAA

ATA

GAA

TCC

nA

CTA

GAG

ATA

GGA

ATC

AAT

GGT

683

Thr

His

Leu

Glu

Lys

Ile

Glu

Ser

Leu

Leu

Glu

Ile

Gly

Ile

Asn

Gly

195

200

205

GR

CGG

An

ATG

GGG

ATC

TGG

GGA

ATG

GGG

GGA

GTC

GGT

AAA

ACA

ACA

731

Val

Arg

Ile

Met

Gly

Ile

Trp

Gly

Met

Gly Gly

Val

Gly

Lys

Thr

Thr

210

215

220

ATA

GCA

AGA

GCT

ATA

τη

GAT

ACT

cn

nA

GGA

AGA

ATG

GAT

AGT

TCC

779

Ile

Alá

Arg

Alá

Ile

Phe

Asp

Thr

Leu

Leu

Gly Arg

Met

Asp

Ser

Ser

225

230

235

240

TAT

CAA

τη

GAT

GGT

GCT

TGT

ne

cn

AAG

GAT

An

AAA

GAA

AAC

AAA

827

Tyr

Gin

Phe

Asp

Gly

Alá

Cys

Phe

Leu

Lys

Asp

Ile

Lys

Glu

Asn

Lys

245

250

255

CGT

GGA

ATG

CAT

TCT

nG

CAA

AAT

GCC

cn

CTC

TCT

GAA

cn

nA

AGG

875

Arg

Gly

Met

His

Ser

Leu

Gin

Asn

Alá

Leu

Leu

Ser

Glu

Leu

Leu

Arg

260

265

270

GAA

AAA

GCT

AAT

TAC

AAT

AAT

GAG

GAG

GAT

GGA

AAG

CAC

CAA

ATG

GCT

923

Glu

Lys

Alá

Asn

Tyr

Asn

Asn

Glu

Glu

Asp

Gly

Lys

His

Gin

Met

Alá

275

280

285

AGT

AGA

cn

CGT

TCG

AAG

AAG

GTC

CTA

An

GTG

cn

GAT

GAT

ATA

GAT

971

Ser

Arg

Leu

Arg

Ser

Lys

Lys

Val

Leu

Ile

Val

Leu

Asp Asp

Ile

Asp

290

295

300

AAT

AAA

GAT

CAT

TAT

nG

GAG

TAT

nA

GCA

GGT

GAT

cn

GAT

TGG

τη

1019

Asn

Lys

Asp

His

Tyr

Leu

Glu

Tyr

Leu

Alá

Gly Asp

Leu

Asp Trp

Phe

305

310

315

320

GGT

AAT

GGT

AGT

AGA

An

An

ATA

ACA

ACT

AGA GAC

AAG

CAT nG

ATA

1067

Gly

Asn

Gly

Ser

Arg

Ile

Ile

Ile

Thr

Thr

Arg Asp

Lys

His

Leu

Ile

325

330

335

GAG

AAG

AAT

GAT

ATA

ATA

TAT

GAG

GTG

ACT

GCA

CTA

CCC

GAT

CAT

GAA

1115

Glu

Lys

Asn

Asp

Ile

Ile

Tyr

Glu

Val

Thr

Alá

Leu

Pro

Asp

His

Glu

340

345

350

TCC

An

CAA

nG

ne

AAA

CAA

CAT

GCT

ne

GGA

AAA

GAA

Gn

CCA

AAT

1163

Ser

Ile

Gin

Leu

Phe

Lys

Gin

His

Alá

Phe

Gly

Lys

Glu

Val

Pro

Asn

355

360

365

··· · • · · · · · «

—

106

• · • · »

• · ·· • · · ·

> · · • · · · ·

GAG

AAT

TTT

GAG

AAG

CTT

TCA

TTA

GAG

GTA

GTA

AAT

TAT

GCT

AAA

GGC

1211

Glu

Asn

Phe

Glu

Lys

Leu

Ser

Leu

Glu

Val

Val

Asn

Tyr

Alá

Lys

Gly

370

375

380

cn

CCT

TTA

GCC

CTC

AAA

GTG

TGG

GGT

TCT

nG

CTG

CAT

AAC

CTA

CGA

1259

Leu

Pro

Leu

Alá

Leu

Lys

Val

Trp

Gly

Ser

Leu

Leu

His

Asn

Leu

Arg

385

390

395

400

TTA

ACT

GAA

TGG

AAA

AGT

GCT

ATA

GAG

CAC

ATG

AAA

AAT

AAC

TCT

TAT

1307

Leu

Thr

Glu

Trp

Lys

Ser

Alá

Ile

Glu

His

Met

Lys

Asn

Asn

Ser

Tyr

405

410

415

TCT

GGA

ATT

ATT

GAT

AAG

CTC

AAA

ATA

AGT

TAT

GAT

GGA

ΠΑ

GAG

CCC

1355

Ser

Gly

Ile

Ile

Asp

Lys

Leu

Lys

Ile

Ser

Tyr

Asp

Gly

Leu

Glu

Pro

420

425

430

AAA

CAA

CAA

GAG

ATG

ITT

TTA

GAT

ATA

GCA

TGC

ne

nG

CGA

GGG

GAA

1403

Lys

Gin

Gin

Glu

Met

Phe

Leu

Asp

Ile

Alá

Cys

Phe

Leu

Arg

Gly

Glu

435

440

445

GAA

AAA

GAT

TAC

ATC

CTA

CAA

ATC

cn

GAG

AGT

TGT

CAT

ΑΠ

GGA

GCT

1451

Glu

Lys

Asp

Tyr

Ile

Leu

Gin

Ile

Leu

Glu

Ser

Cys

His

Ile

Gly

Alá

450

455

460

GAA

TAC

GGG

TTA

CGT

ATT

TTA

ATT

GAC

AAA

TCT

cn

GTG

ne

ATC

TCT

1499

Glu

Tyr

Gly

Leu

Arg

Ile

Leu

Ile

Asp

Lys

Ser

Leu

Val

Phe

Ile

Ser

465

470

475

480

GAA

TAT

AAT

CAG

GTT

CAA

ATG

CAT

GAC

nA

ATA

CAG

GAT

ATG

GGT

AAA

1547

Glu

Tyr

Asn

Gin

Val

Gin

Met

His

Asp

Leu

Ile

Gin

Asp

Met

Gly

Lys

485

490

495

TAT

ATA

GTG

AAT

ITT

CAA

AAA

GAT

CCC

GGA

GAA

CGT

AGC

AGA

nA

TGG

1595

Tyr

Ile

Val

Asn

Phe

Gin

Lys

Asp

Pro

Gly

Glu

Arg

Ser

Arg

Leu

Trp

500

505

510

CTC

GCC

AAG

GAA

GTC

GAA

GAA

GTG

ATG

AGC

AAC

AAC

ACA

GGG

ACC

‘ATG

1643

Leu

Alá

Lys

Glu

Val

Glu

Glu

Val

Met

Ser

Asn

Asn

Thr

Gly

Thr

Met

515

520

525

GCA

ATG

GAA

GCA

ATT

TGG

GTT

TCT

TCT

TAT

TCT

AGT

ACT

CTA

CGC

τη

1691

Alá

Met

Glu

Alá

Ile

Trp

Val

Ser

Ser

Tyr

Ser

Ser

Thr

Leu

Arg

Phe

530

535

540

AGC

AAT

CAG

GCC

GTG

AAA

AAT

ATG

AAA

AGG

cn

AGG

GTA

ΤΠ

AAC

ATG

1739

Ser

Asn

Gin

Alá

Val

Lys

Asn

Met

Lys

Arg

Leu

Arg

Val

Phe

Asn

Met

545

550

555

560

GGG

AGG

TCG

TCG

ACA

CAT

TAT

GCC

ATC

GAT

TAT

CTG

CCC

AAC

AAC

nG

1787

Gly

Arg

Ser

Ser

Thr

His

Tyr

Alá

Ile

Asp

Tyr

Leu

Pro

Asn

Asn

Leu

565

570

575

CGT

TGT

TTT

GTT

TGC

ACT

AAC

TAT

CCT

TGG

GAG

TCA

τη

CCA

TCT

ACA

1835

Arg

Cys

Phe

Val

Cys

Thr

Asn

Tyr

Pro

Trp

Glu

Ser

Phe

Pro

Ser

Thr

580

585

590

• ·

- 107 -

TTT GAA CTC AAA

ATG CTT GH CAC CTC CAA CTC CGA

CAC His 605

AAT Asn

TCT Ser

CTG Leu

1883

Phe Glu Leu

Lys

Met

Leu

Val His 600

Leu

Gin

Leu Arg

595

CGT

CAT

TTA

TGG

ACA

GAA

ACA

AAG

AAG

AAG

AAC

AAT

An

GCA

GAG

AAA

1931

Arg

His

Leu

Trp

Thr

Glu

Thr

Lys

Lys

Lys

Asn

Asn

Ile

Ala

Glu

Lys

610

615

620

GAG

GGA

GAT

GGA

An

cn

An

GAA

m

TGG

GGC

GAT

nA

CAA

TGG

GCA

1979

Glu

Gly

Asp

Gly

Ile

Leu

Ile

Glu

Phe

Trp

Gly Asp

Leu

Gin

Trp

Ala

625

630

635

640

TTT

GCC

GTC

TCT

ACG

GAG

GAT

AGA

TCT

CAG

CTG

GTC

TAAAAGAnG

2025

Phe

Ala

Val

Ser

Thr

Glu

Asp Arg

Ser

Gin

Leu

Val

645

650

ACGCGAACAC	CAGATnCAC	GGGGATGCCA	AATTTGGAGT	ATGTGAATTT	GTATCAATGT	2085
AGTAATCnG	AAGAAGnCA	CCAnCCCTG	GGATGnGCA	GCAAAGTCAT	TGGnTATAT	2145
nGAATGAn	GTAAAAGCCT	TAAGAGGTn	CCATGTGnA	ACGTGGAATC	TCnGAATAT	2205
CTGGGTCTAA	GAAGnGCGA	TAGTnAGAG	AAAnGCCAG	AAATCTACGG	GAGAATGAAG	2265
CCüüAGATAC	AGAnCACAT	ÜCAAÜGCTCT	GGGATAAGGG	AAC1ACCATC	AICIAIi111	2325
CAGTACAAAA	CTCATGnAC	CAAGCTAnG	nGTGGAATA	TGAAAAACCT	TGTAGCTCn	2385
CCAAGCAGCA	TATGTAGGn	GAAAAGnTG	GnAGTCTGA	GTGTGTCGGG	nGCTCAAAA	2445
CnGAAAGCT	TGCCAGAAGA	GATAGGGGAT	nAGACAACT	TACGGGTGn	TGATGCCAGT	2505
GATACTCTAA	TnTACGACC	TCCGTCnCC	ATCATACGCT	TGAACAAACT	TATAATCnG	2565
ATGTnCGAG	GCnCAAAGA	TGGAGTGCAC	nrGAGncc	CTCCTGTGGC	TGAAGGAnA	2625
CACTCAnGG	AATATCTGAA	TCTCAGnAC	TGCAATCTAA	TAGATGGAGG	ACn.CCGGAA	2685
GAGAnGGAT	CCnATCCTC	TTTGAAAAAG	nGGATCTCA	GTAGAAATAA	TnTGAGCAT	2745
nGccncAA	GTATAGCCCA	ACnGGTGCT	CnCAATCCT	TAGACnAAA	AGAnGCCAG	2805
AGGCnACAC	AGCTACCAGA	AcncccccA	GAAnAAATG	AAnGCATGT	AGAnGTCAT	2865
ATGGCTCTGA	AATnATCCA	nATTTAGTA	ACAAAGAGAA	AGAAACTACA	TAGAGTGAAA	2925
CnGATGATG	CACACAATGA	TACTATGTAC	AAnTGTnG	CATATACCAT	GnTCAGAAT	2985
ATCTCnCCA	TGAGGCATGA	CATCTCTGCT	TCAGAnCCT	TGTCACTAAC	AGTATnACC	3045
GGTCAACCGT	ATCCTGAAAA	GATCCCGAGT	TGGnCCACC	ATCAGGGnG	GGATAGTAGT	3105
GTATCAGTCA	AnTGCCTGA	AAAnGGTAT	ATACCTGATA	AAncnGGG	AnTGCTGTA	3165
TGnACTCTC	GTAGCnAAT	TGACACAACA	GCTCACnGA	nCCCGTATG	TGATGACAAG	3225

ATGTCGCGCA TGACCCAGAA ACTTGCCnA TCAGAATGTG ATACAGAATC ATCCAACTAT 3285 • · * · · • ·

- 108 TCAGAATGGG ATATACATTT TTTCTTTGTA CCTTTTGCTG GCTTATGGGA TACATCTAAG 3345 GCAAATGGAA AAACACCAAA TGATTATGGG ATTATTAGGC TATCTTTTTC TGGAGAAGAG 3405 AAGATGTATG GACTTCGTTT G TTGTATAAA GAAGGACCAG AGGTTAATGC CTTGTTACAA 3465 ATGAGGGAAA ATAGCAATGA ACCAACAGAA CATTCCACTG GGATAAGGAG GACTCAATAT 3525

AACAACAGAA CTTCCTTTTA TGAGCTCATC AATGGGTGAT GTACATATCA ACAACGAGTT 3585 TTAAAGGATT CCAACAAGTA TAACTTTTTA TGCTCAAATC AGCTCCTTGT ATTGTGGAGA 3645 AAGCTGAGTA CGAGATGAAG TTGACGTCCG TTATCCTTTA TGATCTCTCT GTTCTTTGTG 3705 TTAACTTGCC TACTTCATCA GATGAATAAC AGAAGCCCGT TCCTCTCATT CTCAACACTG 3765 TTTGCACGTC TGTTGTTACT TGTTAAAATG GATCTTGATA AAGTAATAAC ATCTCTATAT 3825

TACTT

3830 • ·· • · ·· · ·

- 109 • · · ·· · · » « ···

A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 652 aminosav TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 6

. AZ

ΌΝΟ

SÍTÓ sz

;ámú

SZERVE

;nci

A LEÍRÁ

„SA:

Met

Alá

Ser

Ser

Ser

Ser

Ser

Ser

Arg

Trp

Ser

Tyr

Asp

Val

Phe

Leu

1

5

10

15

Ser

Phe

Arg

Gly

Glu

Asp

Thr

Arg

Lys

Thr

Phe

Thr

Ser

His

Leu

Tyr

20

25

30

Glu

Val

Leu

Asn

Asp

Lys

Gly

Ile

Lys

Thr

Phe

Gin

Asp

Asp

Lys

Arg

35

40

45

Leu

Glu

Tyr

Gly

Alá

Thr

Ile

Pro

Gly

Glu

Leu

Cys

Lys

Alá

Ile

Glu

50

55

60

Glu

Ser

Gin

Phe

Alá

Ile

Val

Val

Phe

Ser

Glu

Asn

Tyr

Alá

Thr

Ser

65

70

75

80

Arg

Trp

Cys

Leu

Asn

Glu

Leu

Val

Lys

Ile

Met

Glu

Cys

Lys

Thr

Arg

85

90

95

Phe

Lys

Gin

Thr

Val

Ile

Pro

Ile

Phe

Tyr

Asp

Val

Asp

Pro

Ser

His

100

105

110

Val

Arg

Asn

Gin

Lys

Glu

Ser

Phe

Alá

Lys

Alá

Phe

Glu

Glu

His

Glu

115

120

125

Thr

Lys

Tyr

Lys

Asp

Asp

Val

Glu

Gly

Ile

Gin

Arg

Trp

Arg

Ile

Alá

130

135

140

«

Leu

Asn

Glu

Alá

Alá

Asn

Leu

Lys

Gly

Ser

Cys

Asp

Asn

Arg

Asp

Lys

145

150

155

160

Thr

Asp

Alá

Asp

Cys

Ile

Arg

Gin

Ile

Val

Asp

Gin

Ile

Ser

Ser

Lys

165

170

175

Leu

Cys

Lys

Ile

Ser

Leu

Ser

Tyr

Leu

Gin

Asn

Ile

Val

Gly

Ile

Asp

180

185

190

Thr

His

Leu

Glu

Lys

Ile

Glu

Ser

Leu

Leu

Glu

Ile

Gly

Ile

Asn

Gly

195

200

205

Val

Arg

Ile

Met

Gly

Ile

Trp

Gly

Met

Gly

Gly

Val

Gly

Lys

Thr

Thr

210

215

220

Ile

Alá

Arg

Alá

Ile

Phe

Asp

Thr

Leu

Leu

Gly

Arg

Met

Asp

Ser

Ser

225

230

235

240

Tyr

Gin

Phe

Asp

Gly

Alá

Cys

Phe

Leu

Lys

Asp

Ile

Lys

Glu

Asn

Lys

245

250

255

• ·· · ·

- 110 -

Arg Gly Met

His 260

Ser Leu

Gin

Asn Ala 265

Leu Leu Ser

Glu

Leu 270

Leu

Arg

Glu

Lys

Ala

Asn

Tyr

Asn

Asn

Glu

Glu

Asp

Gly Lys

His

Gin

Met

Ala

275

280

285

Ser

Arg

Leu

Arg

Ser

Lys

Lys

Val

Leu

Ile

Val

Leu

Asp

Asp

Ile

Asp

290

295

300

Asn

Lys

Asp

His

Tyr

Leu

Glu

Tyr

Leu

Ala

Gly Asp

Leu

Asp Trp

Phe

305

310

315

320

Gly

Asn

Gly

Ser

Arg

Ile

Ile

Ile

Thr

Thr

Arg Asp

Lys

His

Leu

Ile

325

330

335

Glu

Lys

Asn

Asp

Ile

Ile

Tyr

Glu

Val

Thr

Ala

Leu

Pro

Asp

His

Glu

340

345

350

Ser

Ile

Gin

Leu

Phe

Lys

Gin

His

Ala

Phe

Gly Lys

Glu

Val

Pro

Asn

355

360

365

Glu

Asn

Phe

Glu

Lys

Leu

Ser

Leu

Glu

Val

Val

Asn

Tyr

Ala

Lys

Gly

370

375

380

Leu

Pro

Leu

Ala

Leu

Lys

Val

Trp

Gly

Ser

Leu

Leu

His

Asn

Leu

Arg

385

390

395

400

Leu

Thr

Glu

Trp Lys

Ser

Ala

Ile

Glu

His

Met

Lys

Asn

Asn

Ser

Tyr

405

410

415

Ser

Gly

Ile

Ile

Asp

Lys

Leu

Lys

Ile

Ser

Tyr Asp

Gly

Leu

Glu

Pro

420

425

430

Lys

Gin

Gin

Glu

Met

Phe

Leu

Asp

Ile

Ala

Cys

Phe

Leu

Arg Gly

Glu

435

440

445

•

Glu

Lys

Asp Tyr

Ile

Leu

Gin

Ile

Leu

Glu

Ser

Cys

His

Ile

Gly Ala

450

455

460

Glu

Tyr Gly

Leu

Arg

Ile

Leu

Ile

Asp Lys

Ser

Leu

Val

Phe

Ile Ser

465

470

475

480

Glu

Tyr

Asn

Gin

Val

Gin

Met

His

Asp

Leu

Ile

Gin

Asp

Met

Gly Lys

485

490

495

Tyr

Ile

Val

Asn

Phe

Gin

Lys

Asp

Pro

Gly

Glu

Arg

Ser

Arg

Leu

Trp

500

505

510

Leu

Ala

Lys

Glu

Val

Glu

Glu

Val

Met

Ser

Asn

Asn

Thr

Gly

Thr

Met

515

520

525

Ala

Met

Glu

Ala

Ile

Trp

Val

Ser

Ser

Tyr

Ser

Ser

Thr

Leu

Arg

Phe

530

535

540

Ser Asn Gin Ala Val Lys Asn Met Lys Arg Leu Arg Val Phe Asn Met 545 550 555 560

• ·

111

Gly Arg

Ser Ser Thr 565

His

Tyr

Alá

Ile Asp Tyr Leu Pro Asn Asn Leu

570

575

Arg

Cys

Phe

Val

Cys

Thr

Asn

Tyr

Pro

Trp

Glu

Ser

Phe

Pro

Ser

Thr

580

585

590

Phe

Glu

Leu

Lys

Met

Leu

Val

His

Leu

Gin

Leu

Arg

His

Asn

Ser

Leu

595

600

605

Arg

His

Leu

Trp

Thr

Glu

Thr

Lys

Lys

Lys

Asn

Asn

Ile

Alá

Glu

Lys

610

615

620

Glu

Gly Asp Gly

Ile

Leu

Ile

Glu

Phe

Trp

Gly Asp

Leu

Gin

Trp

Alá

625

630

635

640

Phe

Alá

Val

Ser

Thr

Glu

Asp Arg

Ser

Gin

Leu

Val

645

650

- 112 -

Claims (3)

1. Izolált és tisztított nukleinsav-molekula, amely a következő - N-gén-proteint kódoló - nukleotid-szekvenciák bármelyikét tartalmazza:

(a) a 3. azonosítószámú szekvencia 60-3494.

nukleotidjait tartalmazó, N-gént kódoló nukleotidszekvencia;

(b) a 4. azonosítószámú szekvenciaként bemutatott aminosav-szekvenciát tartalmazó N-gén-proteint kódoló nukleot idszekvencia;

(c) a 3. azonosítószámú szekvencia körülbelül 60.

nukleotidjától 3494. nukleotidjáig terjedő szakaszával 70%os nukleotidszekvencia-homológiát mutató, az N-gén-proteint szintetizáló növényben dohány-mozaikvírussal szembeni rezisztenciát kiváltó DNS-szekvencia;

(d) az 1. azonosítószámú szekvencia 1-7400.

nukleotidjait tartalmazó, N-gén-proteint kódoló nukleotidszekvencia;

(e) az 1. azonosítószámú szekvencia körülbelül 1.

nukleotidjától 7400. nukleotidjáig terjedő szakaszával 70%os nukleotidszekvencia-homológiát mutató, az N-gén-proteint szintetizáló növényben dohány-mozaikvírussal szembeni rezisztenciát kiváltó DNS-szekvencia.

2. Az 1. igénypont szerinti nukleinsav-molekula, amely a 4. azonosítószámú szekvenciaként bemutatott aminosav-szekvenciát tartalmazó N-gén-proteint kódoló nukleotidszekvenciát tartalmaz.

• ·· ···· · ·· · · · · • ··♦ ··· · · • · · ···«· • · · ·· ··» · ·

- 113 3. A 2. igénypont szerinti nukleinsav-molekula, amely az N-gén-proteint kódoló nukleotidszekvenciaként a 3. azonosítószámú szekvencia 60-3494. nukleotidjaiból álló nukleotidszekvenciát tartalmazza.

4 . Természetben elő nem forduló nukleinsavmolekula, amely egy Solanaceae családba tartozó növényből származó N-gén-proteint kódoló nukleinsav-szakaszt tartalmaz, és az N-gén-proteint kódoló nukleinsav-szakasz a 3. azonosítószámú szekvencia - körülbelül 60. nukleotidjától 3494. nukleotidjáig terjedő - szakaszával legalább körülbelül 70%-os nukleotidszekvencia-homológiát mutat, és a kódolt N-gén-protein az azt szintetizáló növényben dohánymozaikvírussal szembeni rezisztenciát idéz elő.

5. A 4. igénypont szerinti, természetben elő nem forduló nukleinsav-molekula, amely N-gén-proteint kódoló szakaszként Nicotiana nemzetségbe tartozó növényből származó gént tartalmaz.

6. Az 5. igénypont szerinti, természetben elő nem forduló nukleinsav-molekula, amely N-gén-proteint kódoló szakaszként Nicotiana glutínosa-hól származó gént tartalmaz .

7. A 6. igénypont szerinti, természetben elő nem forduló nukleinsav-molekula, amely N-gén-proteint kódoló szakaszként a 4. azonosítószámú szekvenciaként bemutatott aminosav-szekvenciát tartalmazó N-gén-proteint kódoló szakaszt tartalmaz.

8. A 4. igénypont szerinti, természetben elő nem forduló nukleinsav-molekula, amely N-gén-proteint kódoló

- 114 szakaszként a 3. azonosítószámú szekvencia 60-3494.

nukleotidjaiból álló, az N-gén-proteint szintetizáló növényben dohány-mozaikvírussal szembeni rezisztenciát kiváltó nukleotidszekvenciát tartalmaz.

9. Természetben elő nem forduló nukleinsavmolekula, amely egy Solanaceae családba tartozó növényből származó N-gén-proteint kódoló nukleinsav-szakaszt tartalmaz, amely nukleinsav-szakasz az 1. azonosítószámú szekvencia körülbelül 1. nukleotidjától 7400. nukleotidjáig terjedő szakaszával legalább körülbelül 70%-os nukleotidszekvencia-homológiát mutat, és amely N-gén-proteinaz azt szintetizáló növényben dohány-mozaikvírussal szembeni rezisztenciát vált ki.

10. A Solanaceae családba tartozó ranszgenikus növény, amely génsebészeti módszerekkel úgy van manipulálva, hogy egy Solanaceae családba tartozó növényből származó, a

3. azonosítószámú szekvencia körülbelül 60. nukleotidjától 3494. nukleotidjáig terjedő szakaszával legalább körülbelül 70%-os nukleotidszekvencia-homológiát mutató N-gén-proteint kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazó nukleinsavkonstrukciót tartalmaz és expresszál oly módon, hogy a növény - az N-gén-proteint kódoló nukleotidszekvenciá expresszálása révén - rezisztenssé válik a dohánymozaikvírussal szemben.

11. A 10. igénypont szerinti transzgenikus növény, amely N-gén-proteint kódoló nukleotidszekvenciaként Nicotiana nemzetségbe tartozó növényből származó nukleotidszekvenciát tartalmaz.

·» ··· ·

12. A 11. igénypont szerinti transzgenikus növény, amely N-gén-proteint kódoló nukleotidszekvenciaként Nicotiana glutinosa-ból származó nukleotidszekvenciát tartalmaz .

13. A 10. igénypont szerinti transzgenikus növény, amely N-gén-proteint kódoló nukleotidszekvenciaként a 4.

azonosítószámú szekvenciaként bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazó N-gén-proteint kódoló nukleotidszekvenciát tartalmaz.

14. A 10. igénypont szerinti transzgenikus növény, amely N-gén-proteint kódoló nukleotidszekvenciaként szakaszként a 3. azonosítószámú szekvencia 60-3494.

nukleotidjaiból álló nukleotidszekvenciát tartalmaz.

15. A 10. igénypont szerinti transzgenikus növény, amely a Capsicum nemzetségbe tartozik.

16. A 10. igénypont szerinti transzgenikus növény, amely a Lycopersicon nemzetségbe tartozik.

17. A 16. igénypont szerinti transzgenikus növény, amely a Lycopersicon esculentum fajba tartozik.

18. A 10. igénypont szerinti transzgenikus növény, amely a Nicotiana nemzetségbe tartozik.

19. A 10. igénypont szerinti transzgenikus növény, amely a Nicotiana tabacum fajba tartozik.

20. A 10. igénypont szerinti transzgenikus növény, amely a Nicotiana glutinosa fajba tartozik.

21. A Solanaceae családba tartozó transzgenikus növény, amely génsebészeti módszerekkel úgy van manipulálva, hogy 1. azonosítószámú nukleotidszekvenciát tartalmazó N·» ·«·· « • · · · •·· · · · « ·· fe ♦ · ··· · * ·9 ·

- 116 gént tartalmaz és expresszál.

22. A Solanaceae családba tartozó transzgenikus növény, amely génsebészeti módszerekkel úgy van manipulálva, hogy egy N-gén-proteint kódoló, 3. azonosítószámú szekvenciaként bemutatott nukleotidszekvenciát tartalmaz és expresszál, és további génsebészeti manipulációk eredményeként úgy van módosítva, hogy egy N-gén-eredetű, 5.

azonosítószámú szekvenciaként bemutatott szekvenciát is tartalmaz és expresszál.

23. Eljárás egy Solanaceae családba tartozó növényből származó - az N-gén-proteint szintetizáló növényben dohány-mozaikvírussal szembeni rezisztenciát kiváltó - 3.

azonosítószámú szekvencia körülbelül 60. nukleotidjától

3494. nukleotidjáig terjedő szakaszával legalább körülbelül 70%-os nukleotidszekvencia-homológiát mutató N-gén-proteint kódoló nukleinsav-szakaszt tartalmazó nukleinsav-molekula alkalmazására N-gén-proteint tartalmazó és expresszáló transzgenikus növény dohány-mozaikvírussal szembeni rezisztenciájának létrehozására, azzal jellemezve, hogy (i) ncivényi szövetet génsebészeti módszerekkel úgy manipulálunk, hogy N-gén-proteint kódoló szekvenciát tartalmazzon és expresszáljon; és (ii) a génsebészeti módszerekkel manipulált növényi szövet regenerálásával növényeket állítunk elő;

miáltal az N-gén-proteint kódoló szekvenciát tartalmazó és expresszáló, dohány-mozaikvírusra rezisztens növényeket állítunk elő.

24. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jelle• · · « »·* · · • ·· · ·

- 117 mezve, hogy olyan nukleinsav-molekulát alkalmazunk, amely N-gén-proteint kódoló nukleinsav-szakaszként Nicotiana nemzetségbe tartozó növényből származó nukleinsav-szakaszt tartalmaz.

25. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan nukleinsav-molekulát alkalmazunk, amely N-gén-proteint kódoló nukleinsav-szakaszként Nicotiana glutinosa fajba tartozó növényből származó nukleinsavszakaszt tartalmaz.

26. A 25. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan nukleinsav-molekulát alkalmazunk, amely N-gén-proteint kódoló nukleinsav-szakaszként a 4.

azonosítószámú szekvenciaként bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazó, N-gén-proteint kódoló nukleinsavszakaszt tartalmaz.

27. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan nukleinsav-molekulát alkalmazunk, amely N-gén-proteint kódoló nukleinsav-szakaszként a 3. azonosítószámú szekvencia 60-3494. nukleotidjaiból álló nukleotidszekvenciát tartalmazó nukleinsav-szakaszt tartalmaz .

28. A 25. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan nukleinsav-molekulát alkalmazunk, amely

N-gén-proteint kódoló nukleinsav-szakaszként a 6.

azonosítószámú szekvenciaként bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazó, N-gén-proteint kódoló nukleinsavszakaszt tartalmaz.

29. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jelleamely

- 118 • 4· • · « mezve, hogy olyan nukleinsav-molekulát alkalmazunk, N-gén-proteint kódoló nukleinsav-szakaszként az 5. azonosítószámú szekvencia 60-2018. nukleotidjaiból álló nukleotidszekvenciát tartalmazó nukleinsav-szakaszt tartalmaz .

30. N-gén-proteint szintetizáló növényben dohánymozaikvírussal szembeni rezisztenciát kiváltó az 1.

azonosítószámú szekvenciával azonos szekvenciájú N-génproteint kódoló nukleinsav-szakaszt tartalmazó nukleinsavmolekula alkalmazására N-gén-proteint tartalmazó és expresszáló transzgenikus növény dohány-mozaikvírussal szembeni rezisztenciájának létrehozására, azzal jellemezve, hogy (i) növényi szövetet génsebészeti módszerekkel úgy manipulálunk, hogy N-gén-proteint kódoló szekvenciát tartalmazzon és expresszáljon; és (ii) a génsebészeti módszerekkel manipulált növényi szövet regenerálásával növényeket állítunk elő; miáltal az N-gén-proteint kódoló szekvenciát tartalmazó és expresszáló, dohány-mozaikvírusra rezisztens növényeket állítunk elő .

31. Eljárás egy növényi szövetben expresszálódó, Ngén-proteint kódoló, a 3. azonosítószámú szekvencia 603494. nukleotidjaiból álló nukleotidszekvenciát tartalmazó első nukleinsav-szakaszt, és egy növényi szövetben expresszálódó, 5. azonosítószámú nukleotidszekvenciát tartalmazó második nukleinsav-szakaszt tartalmazó nukleinsavmolekula alkalmazására azzal jellemezve, hogy ····

- 119 (i) növényi szövetet génsebészeti módszerekkel úgy manipulálunk, hogy az első és második nukleinsav-szakaszt tartalmazza és expresszálja; és (ii) a génsebészeti módszerekkel manipulált növényi szövet regenerálásával növényeket állítunk elő;

miáltal első és második nukleinsav-szakaszt tartalmazó és expresszáló, dohány-mozaikvírusra rezisztens növényeket ál1ítunk elő.