CZ319199A3 - Inhibitory HIV proteasy - Google Patents

Description

Předkládaný vynález se týká nové serie chemických sloučenin, které jsou použitelné jako inhibitory HIV proteasy a použití takových sloučenin jako antivirových činidel.

Dosavadní stav techniky

Syndrom získané imunodeficience (AIDS) je relativně nově rozpoznaným onemocněním. AIDS způsobuje stupňující se selhání imunitního systému, stejně jako progresivní zhoršování centrálního a periferního nervového systému. Od zjištění v roce 1980 se AIDS rychle šířil a nyní dosáhl epidemických rozměrů uvnitř relativně omezené části populace. Intenzivní výzkum vedl k objevu příčinného agens, lidského T-lymfotropního retroviru III (HTLV-III), který je v současnosti častěji označován jako virus lidské imunodeficience neboli HIV.

HIV je členem třídy virů známé jako retroviry. Retrovirový genom se skládá z RNA, která je převedena na DNA reversní transkripcí. Tato retrovirová DNA je potom stabilně integrována do chromosomu hostitelské buňky a využívá replikační procesy hostitelské buňky, produkuje nové retrovirové částice a způsobuje infekci dalších buněk. Zdá se, že HIV má částečnou afinitu k lidským T-4 lymfocytům, které mají zásadní úlohu v imunitním systému. HIV infekce těchto buněk způsobuje jejich depléci. Nakonec je imunitní systém neúčinný proti různým oportgpím onemocněním, jako je například pneumonie způsobená Pnegmocystis carinii, Kaposhiho sarkom a nádory lymfatického systému.

Ačkoliv není přesný mechanismus tvorby a funkce HIV viru znám, ·· ·

Φ vedla identifikace viru k určitému pokroku v kontrole onemocnění. Například, lék azidothymidin (AZT) je účinný v inhibici reversní transkripce retrovirového genomu HIV viru, což umožňuje dosažení kontroly, nikoliv však vyléčení, onemocnění u pacientů postižených AIDS. Pokračuje výzkum léčiv umožňujících vyléčení, * nebo alespoň kontrolu, smrtelné infekce HIV virem.

v Retrovirová replikace běžně obsahuje post-translační zpracování polyproteinů. Toto zpracování je provedeno virem kódovaným enzymem HIV proteasou. Zpracování vede k zisku polypeptidu, který se potom účastní tvorby a funkcí infekčního viru. Pokud je toto molekulové zpracování utlumeno, tak je normální produkce HIV ukončena. Proto mohou inhibitory HIV proteasy působit jako anti-HIV činidla.

HIV proteasa je jeden z translatovaných produktů pol genu HIV pro strukturální protein. Tato retrovirová proteasa specificky štěpí jiné strukturální polypeptidy v přesně určených místech a uvolňuje nově aktivované strukturální proteiny a enzymy, které umožňují replikaci virionu. Tak může inhibice HIV proteasy účinnými sloučeninami bránit integraci proviru v infikovaných T lymfocytech během časné fáze životního cyklu HIV-l, stejně tak jako může inhibovat proteolytické zpracování viru během pozdního stadia. Dále mohou mít inhibitory proteas výhodu snadnější . dostupnosti, delšího poločasu ve viru a menší toxicity v porovnání se současnými léky, pravděpodobně z důvodů jejich specificity pro retrovirovou proteasu.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález obsahuje novou třídu chemických sloučenin, které mohou inhibovat a/nebo blokovat aktivitu HIV proteasy, což inhibuje proliferaci HIV viru, farmaceutické prostředky

0 0

0 0 • 0 0

0 0 ·· * ·« » • · · <* · «· • · 0 · · 9 • 0000 »00 0 * « 0 0 0 ♦··· * 00 0·· obsahující takové sloučeniny a použití sloučenin jako inhibitorů HIV proteasy.

Předkládaný vynález obsahuje sloučeniny vzorce (9) a jejich farmaceuticky přijatelné soli, proléčiva a solvaty, které inhibují proteasu kodovanou virem lidské imunodeficience (HIV) typu 1 (HIV-1) nebo typu 2 (HIV-2). Tyto sloučeniny jsou použitelné v léčbě infekce HIV a v léčbě syndromu získané imunodeficience (AIDS). Sloučeniny, jejich farmaceuticky přijatelné soli a farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu mohou být použity samostatně nebo v kombinaci s jinými antivirovými činidly, imunomodulátory, antibiotiky nebo vakcinami. Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být použity také jako proléčiva. Jsou zde popsány také způsoby pro léčbu AIDS, způsoby pro léčbu infekce HIV a způsoby pro inhibici HIV proteasy.

Vynález obsahuje sloučeniny vzorce (9):

kde

R a R' jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl-OR^, cykloalkyl substituovaný (C^-C^)alkylem nebo (C_i-C₄)alkyl-OH, heterocyklus substituovaný (C_i-C_e)alkylem nebo (C_i-C_e)alkyl-OH, alkyl-NR₂R₃, nebo alkyl-S(X)(Y)R₄, kde • · · <

·· ··

R_x je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl nebo acyl;

R₂ a R₃ jsou každý nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, cykloalkyl, heterocyklus, aryl, acyl a sulfonyl;

R₄ je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, cykloalkyl, heterocyklus nebo aryl; a

X a Y jsou každý nezávisle =0 nebo nejsou přítomny; nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli, proléčiva nebo solvaty.

Ve sloučeninách vzorce 9 je R výhodně H. Lépe je R H a R' je cykloalkyl vybraný ze skupiny skládající se z:

Ve sloučeninách vzorce 9, pokud je alespoň jeden z R a R' alkyl-0R_x, tak je R_i -výhodně H. Konkrétně, pokud je alespoň jeden z R a R’ alkyl-0R_x, tak je alkyl-0R_i vybrán ze skupiny zahrnující -CÍCH ) CH OH, -CH(CH)CH0H, -CHCHOH, -C(CH )(CH OH) ,

J2 3 2 2 2 3 2 2

-CÍCH ) -O-CH -O-CH , -C(CH ) CH -O-CH -O-CH , a

-C(CH_a)₂CH₂-0-acyl nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí, proléčiv nebo solvatů.

Pokud je alespoň jeden z R a R' cykloalkyl substituovaný (C_i-C₆)alkylem nebo (C_x-C_e)alkyl-OH, tak je cykloalkyl výhodně vybrán ze skupiny skládaj ící se z:

. CH3 CH3 - CHa CHa CHjOH _j CH, .CHjOH , CHjOH ♦· 9 ·*

9 9 9 « • · * 9 9

9999*9 9 *99 9

999

Pokud je alespoň jeden z R a R' heterocyklus substituovaný (C^-Cg)alkylem nebo (C^-Cg)alkyl-OH, tak je heterocyklus výhodně vybrán ze skupiny skládaj ící se z:

h₃c

,ch₃ h₃C

.0

N—R₃· ³¹

N— R₃ kde R₃ je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, cykloalkyl, heterocyklus nebo aryl, acyl nebo sulfonyl.

Výhodnou sloučeninou vzorce (9) je [3S-[2 (2S^W, 3S~)3a,4afi,8aB]]-N-(1,1-dimethyl-2-hydroxyethyl)dekahydrogen-2-[2-hydroxy-3-[(3-hydroxy-2-methylbenzoyl)amino]-4-(fenylthio)butyl]-3-isochinolinkarboxamid

Me

H

OH a jeho farmaceutické přijatelné soli a proléčiva. Výhodná proléčiva mohou být získána nahrazením vodíku v jedné alkoholové skupině acylem, nebo lépe aminokyselinovou acylovou skupinou.

• 9 9 9 • 9 9« • 9 • 9 9 ► 9 9 9«

Předkládaný vynález dále obsahuje farmaceutické prostředky obsahující účinné množství sloučeniny vzorce (9) nebo její farmaceuticky přijatelné soli, v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem, jako je například ředidlo nebo přísada.

Předkládaný vynález dále obsahuje způsob pro léčbu AIDS, který obsahuje podání účinného množství sloučeniny podle předkládaného vynálezu pacientovi, jako je například primát.

Předkládaný vynález dále obsahuje způsob pro inhibici replikace HIV, který obsahuje podání účinného množství sloučeniny podle předkládaného vynálezu buňkám infikovaným HIV, buňkám vnímavým k infekci HIV nebo pacientovi, jako je například primát.

Předkládaný vynález se týká nových sloučenin vzorce (9), jak jsou popsány výše, které jsou použitelné pro léčbu infekce HIV a/nebo AIDS.

Jako odkazy jsou uvedeny U.S. patent č. 5484926, U.S. patentové přihlášky č. 08/708411 a 08/708607 a Japonské patentové přihlášky č. JP 95-248183 a JP 95-248184, s upozorněním, že definice přednostních provedení, termínů, proměnných, značek a podobně, které jsou použité v každé přihlášce, jsou aplikovatelné pouze na odpovídající popis v odpovídající přihlášce.

Konkrétně, protože byla každá z výše uvedených přihlášek uvedených jako odkaz vypracována zvlášť., mohou přihlášky obsahovat v některých případech stejný termín, značku nebo proměnnou mající odlišný význam. Například, proměnná X je použita v každé přihlášce, ale každá přihláška má svou vlastní definici substituentu nebo skupiny representované touto proměnnou. Odborníkům bude jasné, že termíny, značky a proměnné v ·· · »« * * · « 4 4 • · » 4 · • 444«4« 4 • · 4 4 • · 44 * · 4 ♦ * * • * 4 ♦ « 44 každé přihlášce uvedené jako odkaz jsou omezeny pouze na popis konkrétní přihlášky a že mohou být nahrazeny jinými vhodnými termíny, značkami a proměnnými a podobně, které představují určité substituenty nebo skupiny. Samozřejmě, jak je odborníkům jasné, pro popis předmětu vynálezu v každé přihlášce může být použita jakákoliv vhodná sada termínů, značek a proměnných, včetně termínů, značek, proměnných a podobně, které jsou universálně použitelné pro objevy obsažené v uvedených přihláškách a v předkládaném vynálezu.

Sloučeniny vzorce (9) mohou být ve formě proléčiv, která mohou být vyrobena pro zlepšení farmaceutických vlastností sloučenin, jako jsou farmakokinetické vlastnosti, například lepší biologická dostupnost a nebo rozpustnost. Příprava proléčiv může být provedena standartními postupy známými v oboru. Výhodné proléčivo může být získáno acylací nebo alkylaci výchozího alkoholu, kde R nebo R' je CH{CH₃)^CH^OH.

Všechny uvedené teploty jsou ve stupních celsia (°C). Všechny použité jednotky měření jsou v hmotnostních jednotkách, s výjimkou kapalin, které jsou uvedeny v objemových jednotkách.

Termín alkyl, jak je zde použit, označuje skupiny s přímým nebo rozvětveným řetězcem, výhodně obsahující 1 až 8, lépe obsahující l až 6 a nejlépe obsahující 1 až 4 atomy uhlíku.

Termín C_i-C₆alkyl označuje alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem obsahující 1 až 6 atomů uhlíku. Příklady C_x-C_ealkylů jsou methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, t-butyl, pentyl, neo-pentyl, hexyl, isohexyl a podobně. Termín C_x-C_ealkyl zahrnuje také termín C_x-C₄alkyl.

Termín cykloalkyl představuje nasycený nebo částečně nasycený, mono- nebo poly-cyklický uhlíkový kruh, který výhodně • v ft · · · • «· ··· obsahuje 5-14 atomů uhlíku v kruhu. Příklady cykloalkylů jsou monocyklické kruhy mající 3-7, lépe 3-6 atomů uhlíku, jako je například cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl, cyklohexyl, cykloheptyl a podobně. Příkladným cykloalkylem je

C_s-C_vcykloalkyl, což je nasycený uhlovodíkový kruh obsahující od 5 do 7 atomů uhlíku.

Termín alkoxy znamená -O-alkyl. Příkladem alkoxy-skupiny je C_i-C_galkoxy, což je alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem obsahující jeden až šest atomů uhlíku navázaný na atom kyslíku. Příklady C_x-C_galkoxy skupin jsou methoxy-, ethoxy-, propoxy-, ísopropoxy-, butoxy-, sec-butoxy-, t-butoxy-, pentoxy-, hexoxy- a podobně. Termín C_i-C_galkoxy zahrnuje také termín Cý-Cýalkoxy.

Termín aryl, jak je zde použit, označuje uhlovodíkový nebo heterocyklický, aromatický, 5-14 členný monocyklický nebo polycyklický kruh. Příklady arylů jsou fenyl, naftyl, anthryl, fenanthryl, thienyl, pyrrolyl, imidazolyl, pyrazolyl, furyl, isothiazolyl, furazanyl, isoxazolyl, thiazolyl, pyridyl, pyrazinyl, pyrimidinyl, pyridazinyl, triazinyl, benzo(b)thienyl, nafto(2,3-b)thianthrenyl, isobenzofuranyl, chromenyl, xanthenyl, fenoxthienyl, indolizinyl, isoindolyl, indolyl, indazolyl, purinyl, isochinolyl, chinolyl, ftalazinyl, naftyridinyl, chinoxyalinyl, chinzolinyl, benzothiazolyl, benzimidazolyl, tetrahydrochinolyl, cinnolinyl, pteridinyl, karbazolyl, β-karbolinyl, fenanthridinyl, akridinyl, perimidinyl, fenanthrolinyl, fenazinyl, isothiazolyl, fenothiazinyl a fenoxyzinyl.

Termín aryloxy označuje -O-aryl.

Termín hydrolyzovatelná skupina označuje skupinu, která při vazbě na kyslík tvoří ester, který může být hydrolyzován in vivo na hydroxylovou skupinu. Příklady hydrolyzovatelných skupin, které jsou volitelně substituované, jsou acylová skupina, sulfonatová skupina a fosfátová skupina. Takové hydrolyzovatelné skupiny mohou obsahovat například blokovaný nebo neblokovaný aminokyselinový zbytek, hemisukcinatový zbytek a nikotinat.

Termín halogen označuje chlor, fluor, brom nebo jod. Termín halogeno- označuje chlor-, fluor-, brom- nebo jod-.

Termín cyklický uhlovodík označuje aromatický nebo nasycený nebo částečně nasycený 5-14 členný monocyklický nebo polycyklický kruh, jako je například 5- až 7-členný monocyklický nebo 7- až 10-členný bycyklický kruh, kde kruh obsahuje pouze atomy uhlíku.

Termín heterocyklus označuje aromatický nebo nasycený nebo částečně nasycený 5-14 členný monocyklický nebo polycyklický kruh, jako je například 5- až 7-členný monocyklický nebo 7- až 10-členný bycyklický kruh, kde kruh obsahuje jeden až tři heteroatomy vybrané ze skupiny skládající se z dusíku, kyslíku nebo síry, kde jakýkoliv z heteroatomů dusíku nebo síry může být volitelně oxidován a kde jakýkoliv dusík může být volitelně kvarterizován. Heterocyklický kruh může být navázán na jakýkoliv vhodný heteroatom nebo na atom uhlíku. Příklady takových heterocyklů jsou dekahydroisochinolinyl, aktahydro-thieno(3,2-c)pyridinyl, piperidinyl, piperazinyl, azepinyl, pyrrolyl, pyrrolidinyl, pyrazolyl, pyrazolidinyl, imidazolyl, isobenzfuranyl, furazanyl, imidazolinyl, imidazolidinyl, pyridyl, pyrazinyl, pyrimidinyl, pyridazinyl, oxazolyl, oxazolidinyl, isoxazolyl, thianthrenyl, triazinyl, isoxazolidinyl, morfolinyl, thiazolyl, thiazolidinyl, isothiazolyl, chinuklidinyl, isothiazolidinyl, indolyl, chinolinyl, chromenyl, xanthenyl, isochinolinyl, benzimidazolyl, • 9 * thiadiazolyl, benzopyranyl, benzothiazolyl, benzoazolyl, furyl, tetrahydrofuryl, tetrahydropyranyl, thienyl, benzothienyl, benzo(b)thienyl, nafto(2,3-b)thienyl, thiamorfolinyl, thiamorfolinylsulfoxid, thiamorfolinylsulfon, oxadiazolyl, triazolyl, tetrahydrochinolinyl, tetrahydroisochinolinyl, fenoxathienyl, indolizinyl, isoindolyl, indazolyl, purinyl, isochinolyl, chinolyl, ftalazinyl, nafthyridinyl, chinoxyalinyl, chinzolinyl, tetrahydrochinolinyl, cinnolinyl, pteridinyl, karbazolyl, β-karbolinyl, fenanthridinyl, akridinyl, perimidinyl, fenanthrolinyl, fenazinyl, isothiazolyl, fenothiazinyl a fenoxazinyl.

Termín thioether znamená S-aryl, jako je fenylthio a naftylthio; S-heterocyklus, kde heterocyklus je nasycený nebo částečně nasycený; S-(C_s-C₇)-cykloalkyl; a S-alkyl, jako je C_x~C₆alkylthio. V thioetheru mohou být -aryl, -heterocyklus, -cykloalkyl a -alkyl volitelně substituované. Příkladem thioetheru je C_x-C₆alkylthio, což je alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem obsahující jeden až šest atomů uhlíku navázaný na atom síry. Příklady C_x-C_ealkylthio skupin jsou methylthio-, ethylthio-, propylthio-, isoproylthio-, butylthio-, sec-butylthio-, t-butylthio-, pentylthio-, hexylthio- a podobně.

Termín merkapto znamená -SH.

Termín amino znamená -NL_xL₂, kde L_x a L₂ jsou výhodně nezávisle vybrány ze skupiny skládající se z kyslíku, cyklickéhoo uhlovodíku, heterocyklu, alkylu, sulfonylu a vodíku; nebo NC(O)L₃, kde L₃ je výhodně alkyl, alkoxy, vodík nebo NL_xL₂. Arylová, alkylová a alkoxy skupina může být volitelně substituovaná. Příkladem amino skupiny je C_x-C₄alkylamino skupina, což je alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem obsahující jeden až čtyři atomy uhlíku navázaný na ·· · ·· • · · · · • · · · · • ······ · • · · · ···· · ·· amino-skupinu. Příklady C^-C^alkylamino skupin jsou methylamino-, ethylamino-, propylamino-, isopropylamino-, butylamino-, sec-butylamino- a podobně. Jiným příkladem amino skupiny je di(C_x-C₄)alkylamino skupina, což jsou dva alkyly s přímým nebo rozvětveným řetězcem, které každý obsahují jeden až čtyři atomy uhlíku navázaný na amino-skupinu. Příklady di(C_x-C₄)alkylamino skupin jsou dimethylamino-, ethylmethylamino-, methylpropylamino-, ethylisopropylamino-, butylmethylamino-, sec-butylethylamino- a podobně. Jiným příkladem amino skupiny je C_x-C₄alkylsulfonylamino skupina, což je alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem obsahující jeden až čtyři atomy uhlíku navázaný na sulfonylamino-skupinu. Příklady

C_x-C₄alkylsulfonylamino skupin jsou methylsulfonylamino-, ethylsulfonylamino-, propylsulfonylamino-, isopropylsulfonylamino-, butylsulfonylamino-, sec-butylsulfonylamino-, t-butylsulfonylamino- a podobně.

Termín acyl označuje L_gC(O)L₄, kde L_e je vazba, -0 nebo -N a ^L4 je výhodně alkyl, amino, hydroxy, alkoxy nebo vodík. Alkyiová a alkoxy- skupina může být volitelně substituovaná. Příkladem acylu je C_x-C₄alkoxykarbonyl, což je alkoxy-skupina s přímým nebo rozvětveným řetězcem obsahující jeden až čtyři atomy uhlíku navázaná na karbonylovou skupinu. Příklady

C_x-C₄alkoxykarbonylových skupin jsou methoxykarbony1, ethoxykarbonyl, propoxykarbonyl, isopropoxykarbonyl, butoxykarbonyl a podobně. Jiným příkladem acylu je karboxylová skupina, kde L₆ je vazba a L₄ je alkoxy-, vodík nebo hydroxylová skupina. Dalším příkladem acylu je N-(C_x-C₄)alkylkarbamoyl (L_g je vazba a L₄ je amino skupina), což je alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem obsahující jeden až čtyři atomy uhlíku navázaný na karbamoyl skupinu. Příklady

N-(C -C₄)alkylkarbamoylových skupin jsou N-methylkarbamoyl,

N-ethylkarbamoyl, N-propylkarbamoyl, N-isopropylkarbamoyl,

N-butyikarbamoyl a N-t-butyIkarbamoyl a podobně. Ještě jiným příkladem acylu je N,N-di(C_x-C₄)alkylkarbamoyl, což jsou dva alkyly s přímým nebo rozvětveným řetězcem obsahující každý jeden až čtyři atomy uhlíku navázané na dusík karbamoylové skupiny.

Příklady N,N-di(C_x-C₄)alkylkarbamoylových skupin jsou N, N-dimethylkarbamoyl, Ν,N-ethylmethyIkarbamoyl, N,

N-methylpropylkarbamoyl, Ν,Ν-ethylisopropylkarbamoyl, N,

N-butylmethylkarbamoyl a N,N-sec-butylethylkarbamoyl a podobně.

Termín sulfinyl označuje -SO-L_s, kde L_s je výhodně alkyl, amino, aryl, cykloalkyl nebo heterocyklus. Alkyl, aryl, cykloalkyl a heterocyklus mohou být volitelně substituované.

Termín sulfonyl označuje -SO₂-L_s, kde L_s je výhodně alkyl, amino, aryl, cykloalkyl, heterocyklus nebo amino. Alkyl, aryl, cykloalkyl a heterocyklus mohou být volitelně substituované. Příkladem sulfonylu je C_x-C₄alkylsulfonyl, což je alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem obsahující jeden až čtyři atomy uhlíku navázaný na sulfonylovou skupinu. Příklady

C_x-C₄alkylsulfonylových skupin jsou me thylsulfony1, ethylsulfonyl, propylsulfonyl, isopropylsulfonyl, butylsulfonyl, sec-butylsulfonyl, t-butylsulfonyl a podobně.

Jak je uvedeno výše, mnoho skupin je volitelně substituovaných. Ve skutečnosti mohou být všechny skupiny definované v předkládaném vynálezu substituovány, pokud není výslovně uvedeno jinak. Například, pokud je použit termín alkyl, tak by mělo být jasné, že tento termín zahrnuje jak substituované, tak nesubstituované alkyly, pokud není výslovně uvedeno vyloučení jednoho typu. Příklady substituentů pro alkyl a aryl zahrnují merkapto, thioether, nitro (NO₂), amino, aryloxy, halogen, hydroxy, alkoxy, a acyl, stejně jako aryl, cykloalkyl a nasycené nebo částečně nasycené heterocykly. Příklady ·· · substituentů pro heterocyklus a cykloalkyl zahrnují substituenty uvedené výše pro alkyl a aryl, stejně jako alkyl a aryl.

Příklady substituovaných arylů zahrnují fenyl nebo naftyl substituovaný jedním nebo více substituenty, výhodně jedním až třemi substituenty, nezávisle vybranými ze skupiny zahrnující halogen, hydroxy, morfolino(C_x-C₄)alkoxykarbonyl, pyridyl(C_i-C₄)alkoxykarbonyl, halogen(C^-C^)alkyl, C_x-C₄alkyl, C^-C^alkoxy, karboxy, C_x-C₄alkoxykarbonyl, karbamoyl,

N-(C -C )alkylkarbamoyl, amino, C_x-C₄alkylamino, di(C^-C^)alkylamino nebo skupinu vzorce -(CH₂)_a~R⁷, kde a je 1,

2, 3 nebo 4 a R⁷ je hydroxy, C_x-C₄alkoxy, karboxy, C_x-C₄alkoxykarbonyl, amino, karbamoyl, C_x-C₄alkylamino nebo di(C “C )alkylamino.

Jiným substituovaným alkylem je halogen(C_x-C₄)alkyl, což je alkyl s přímým nebo s rozvětveným řetězcem obsahující jeden až čtyři atomy uhlíku, na který jsou navázány 1 až 3 atomy halogenu. Příkladem halogen(C_x-C₄)alkylu je chlořmethyl, 2-bromethyl,

1-chlorisopropyl, 3-fluorpropyl, 2,3-dibrombutyl,

3-chlorisobutyl, jod-t-butyl, trifluormethyl a podobně.

Jiným substituovaným alkylem je hydroxy(C -C₄)alkyl, což je alkyl s přímým nebo s rozvětveným řetězcem obsahující jeden až čtyři atomy uhlíku, na který je navázána hydroxylová skupina. Příkladem hydroxy(C -C )alkylu je hydroxymethyl, 2-hydroxyethyl,

3-hydroxypropyl, 3-hydroxyisopropyl, 4-hydroxybutyl a podobně.

Ještě jiným substituovaným alkylem je C_x-C₄alkylthio(C_x-C₄)alkyl, což je C_x-C₄alkyl s přímým nebo s rozvětveným řetězcem, na který je navázána C_x-C₄alkylthio skupina. Příkladem C_x-C₄alkylthio(C_x-C₄)alkylu je methylthiomethyl, ethylthiomethyl, propylthiopropyl, ·· ·· • · · 1

I · · <

sec-butylthiomethyl a podobně.

Ještě jiným substituovaným alkylem je heterocyklus(C -C )alkyl, což je alkyl s přímým nebo s rozvětveným řetězcem obsahující jeden až čtyři atomy uhlíku, na který je navázán heterocyklus. Příkladem heterocyklus-(C_x-C₄)alkylu je pyrrolylmethyl, chinolinylmethyl, 1-indolylethyl, 2 -furolylethyl, 3-thien-2-ylpropyl, 1-imidazolylisopropyl, 4-thiazolylbutyl a podobně.

Ještě jiným substituovaným alkylem je aryl(C_x-C₄)alkyl, což je alkyl s přímým nebo s rozvětveným řetězcem obsahující jeden až čtyři atomy uhlíku, na který je navázána arylová skupina. Příkladem aryl(C_x-C₄)alkylu je fenylmethyl, 2-fenylethyl, 3-naftyl-propyl, 1-naftylisopropyl, 4-fenylbutyl a podobně.

Heterocyklus může být například substituovaný 1, 2 nebo 3 substituenty nezávisle vybranými ze skupiny zahrnující halogen, halogen(C -C₄)alkyl, C_x-C₄alkyl, C_x-C₄alkoxy, karboxy, C_x-C₄alkoxykarbonyl, karbamoyl, N-(C_x-C₄)alkylkarbamoyl, amino, C_x-C₄alkylamino, di(C_x-C₄)alkylamino nebo skupinu vzorce - (CH-J^-R^-7, kde a je l, 2, 3 nebo 4 a R⁷ je hydroxy, C_x-C₄alkoxy, karboxy, C_x-C₄alkoxykarbonyl, amino, karbamoyl, C_x-C₄alkylamino nebo di(C_x~C₄)alkylamino.

Příklady substituovaných heterocyklů jsou 3-N-t-butylkarboxamiddekahydroisochinolinyl,

6-N-1-butylkarboxamidoktahydro-thieno(3,2 -c)pyridinyl,

3- methylimidazolyl, 3-methoxypyridyl, 4-chlorchinolinyl,

4- aminothiazolyl, 8-methylchinolinyl, 6-chlorchinoxalinyl,

3- ethylpyridyl, 6-methoxybenzimidazolyl, 4-hydroxyfuryl,

4- methylisochinolinyl, 6,8-dibromchinolinyl, 2-methyl-l,2,3,4-tetrahydroisochinolinyl, N-methyl-chinolin-2-yl, • · 4 • 444

4«

2-t-butoxykarbonyl-l,2,3,4-isochinolin-7-yl a podobně.

Příklady heterocyklických systémů představovaných A nebo B jsou (1) 5-členné monocyklické kruhové systémy jako je thienyl, pyrrolyl, imidazolyl, pyrazolyl, furyl, isothiazolyl, furazanyl, isoxazolyl, thiazolyl a podobně; (2) 6-členné monocyklické skupiny jako je pyridyl, pyrazinyl, pyrimidinyl, pyridazinyl, triazinyl a podobně; a (3) polycyklické heterocyklické kruhové systémy , jako je dekahydroisochinolinyl, oktahydrothieno(3,2-c)pyridinyl, benzo(b)thienyl, nafto(2,3-b)thianthrenyl, isobenzofuranyl, chromenyl, xanthenyl a jejich plně nebo částečně nasycené analogy.

Cykloalkyl může být volitelně substituovaný 1, 2 nebo 3 substituenty nezávisle vybranými ze skupiny zahrnující halogen, halogen(C -C₄)alkyl, C_x-C₄alkyl, C_x-C₄alkoxy, karboxy, C_x-C₄alkoxykarbonyl, karbamoyl, N-(C_x-C₄)alkylkarbamoyl, amino, C_x-C₄alkylamino, di(C_x~C₄)alkylamino nebo skupinu vzorce -(CH₂)^-R⁷, kde a je 1, 2, 3 nebo 4 a R⁷ je hydroxy, C_x-C₄alkoxy, karboxy, C_x-C₄alkoxykarbonyl, amino, karbamoyl, C_x-C₄alkylamino nebo di(C -C )alkylamino. Příklady substituovaných cykloalkylu j sou 3-methylcyklopentyl, 4-ethoxycyklohexyl,

5-karboxy-cyklohepty1, 6-chlor-cyklohexyl a podobně.

Příklady substituovaných hydrolyzovatelných skupin jsou N-benzyl-glycyl, N-Cbz-L-valyl a N-methyl-nikotinat.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mají alespoň pět center asymetrie, které jsou ve vzorci (9) uvedeném níže označeny hvězdičkou.

HO.

·· 9 • » » • 9 9

9999 • 9

9999 9

V důsledku existence těchto center asymetrie mohou sloučeniny podle předkládaného vynálezu existovat v jakékoliv možné stereoizomerické formě a mohou být použity jako směsi stereoizomerů, které mohou být opticky aktivní nebo racemické, nebo mohou být použity ve formě v podstatě čistých stereoizomerů, t.j. alespoň 95% čistoty. Všechny asymetrické formy, jednotlivé stereoizomery a jejich kombinace spadají do rozsahu předkládaného vynálezu.

Jednotlivé stereoizomery mohou být připraveny z příslušných výchozích materiálů postupy popsanými výše, rozdělením racemických směsí nebo separováním diastereomerů. Rozdělení může být provedeno za použití rozdělovacího činidla, chromatografie nebo opakovanou krystalizací nebo kombinace těchto technik, které jsou v oboru známé. Další podrobnosti týkající se rozdělování jsou uvedeny například v Jacques et al., Enantiomers, Racemates and Resolutions, John Wiley and Sons, 1981.

Výhodně jsou sloučeniny podle předkládaného vynálezu v podstatě čisté, t.j. jsou více než 50% čistoty. Lépe mají sloučeniny alespoň 75% čistotu.Ještě lépe mají sloučeniny alespoň 90% čistotu. Ještě lépe mají sloučeniny alespoň 95% čistotu. Nejlépe lépe mají sloučeniny alespoň 99% čistotu.

Jak bylo uvedeno výše, vynález obsahuje farmaceuticky přijatelné soli sloučenin vzorce (9). Sloučenina podle předkládaného vynálezu může obsahovat dostatek acidických, bazických nebo obou skupin a proto může reagovat s jakoukoliv z mnoha organických nebo anorganických baží a organických a anorganických kyselin za vzniku farmaceuticky přijatelné soli.

Termín farmaceuticky přijatelné soli, jak je zde použit, označuje soli sloučenin vzorce (9), které jsou v podstatě « 4 • Φ φ φ < Φ

Φ Φ

Φ φ

Φ φ netoxické pro živé organismy. Příklady farmaceuticky přijatelných solí jsou soli připravené reakcí sloučenin podle předkládaného vynálezu s anorganickými nebo organickými kyselinami nebo anorganickými bázemi. Reaktanty jsou obvykle smíseny ve společném rozpouštědle jako je diethylether nebo benzen pro adiční soli s kyselinami, nebo jako je voda nebo alkoholy pro adiční soli s bázemi. Soli se vysráží z roztoku během přibližně jedné hodiny až deseti dnů a mohou být izolovány filtrací nebo jinými běžnými metodami. Takové soli se označují jako adiční soli s kyselinami nebo se zásadami.

Kyselinami, které mohou být použity pro tvorbu adičních solí s kyselinami jsou anorganické kyseliny jako je kyselina chlorovodíková, bromovodíková, jodovodíková, sírová, fosforečná a podobně, a organické kyseliny jako je kyselina p-toluensulfonová, methansulfonová, šúavelová, p-bromfenylsulfonová, uhličitá, jantarová, citrónová, benzoová, octová a podobně.

Příklady farmaceuticky přijatelných solí jsou síran, pyrosíran, kyselý síran, siřičitan, kyselý siřičitan, fosforečnan, hydrogenfosforečnan, dihydrogenfosforečnan, metafosforečnan, pyrofosforečnan, chlorid, bromid, jodid, octan, propionat, dekanoat, kaprylat, akrylat, formiat, isobutyrat, kaproat, heptanoat, propiolat, šúavelan, jablečnan, jantaran, suberat, sebakat, fumarat, meleinan, butin-1,4-dioat, hexyn-1,6-dioat, benzoat, chlorbenzoat, methylbenzoat, dinitrobenzoat, hydroxybenzoat, methoxybenzoat, ftalat, sulfonát, xylensulfonat, fenylacetat, fenylpropionat, fenylbutyrat, citrát, laktat, g-hydroxybutýrat, glykolat, vinan, methansulfonat, propansulfonat, naftalen-1-sulfonát, naftalen-2-sulfonát, mandlan a podobně.

Výhodné farmaceuticky přijatelné adiční soli s kyselinami jsou «♦ 0 • Φ ·'

0 0 « «♦·· ·

• ••D 0 soli tvořené s anorganickými kyselinami jako je kyselina chlorovodíková a kyselina bromovodíková, a soli tvořené s organickými kyselinami jako je kyselina maleinová a kyselina methansulfonová.

Mezi adiční soli s bázemi patří soli tvořené s anorganickými a organickými bázemi, jako jsou hydroxidy amonné nebo hydroxidy alkalických kovů nebo hydroxidy kovů alkalických zemin, uhličitany, hydrogenuhličitany a podobně. Mezi baze použitelné při přípravě solí podle předkládaného vynálezu tak patří hydroxid sodný, hydroxid draselný, hydroxid amonný, uhličitan draselný, uhličitan sodný, hydrogenuhličitan sodný, hydrogenuhličitan draselný, hydroxid vápenatý, uhličitan vápenatý a podobně.

Zejména jsou výhodné draselné a sodné soli.

Termín farmaceuticky přijatelné proléčivo označuje sloučeninu, která může být za fyziologických podmínek nebo solvolýzou přeměněna na sloučeninu vzorce 9.

Termín farmaceuticky přijatelný solvát označuje solvát, který si uchovává biologickou účinnost a vlastnosti biologicky aktivních složek sloučenin vzorce 9.

Příklady farmaceuticky přijatelných solvatů jsou - bez omezení - sloučeniny vzorce 9 v kombinaci s vodůu, isopropanolem, ethanolem, methanolem, DMSO, ethylacetátem, kyselinou octovou nebo ethanolaminem.

Je třeba si uvědomit, že typ konkrétního protiiontu tvořícího část jakékoliv soli podle předkládaného vynálezu není zásadní, pokud je sůl jako celek farmakologicky přijatelná a pokud nezpůsobuje protiiont nežádoucí vlastnosti soli jako celku.

· '>

:: :

:: ι *ί .1

Výhodnou sloučéhinou je sloučenina 21

[3S-[2(2S~,3S*)-3a,4aE,8aS]]-N-(1,1-dimethyl-2-hydroxyethyl)dekahydrogen-2-[2-hydroxy-3-[(3-hydroxy-2-methylbenzoyl)amino]-4-(fenylthio)butyl]-3-isochinolinkarboxamid.

Způsob výroby sloučeniny vzorce 21 je uveden dále. Sloučenina vzorce 21 může být získána také jako metabolit z plasmy pacientů, kterým byl podán [3S-(3R,4aR,8aR,2'S,3'S)]-2-[2'-hydroxy-3'-fenylthiomethyl-4'-aza-5’-oxo-5'-(2'¹-methyl-3''-hydroxyfenyl)pentyl]-dekahydroisochinolin-3-N-t-butylkarboxamid ve formě soli s kyselinou methansulfonovou, který je popsán v U.S. patentu č. 5484926.

Sloučeniny vzorce 9 mohou být připraveny podle následujícího reakčního schématu:

• · · · · • t:. :: • ······ « • t * <

*>»>· « «· · * · · · ·

I » · · ·» ··

Reakční schéma 1: Obecný způsob syntézy sloučeniny 9b a jejích derivátů

CONHfBu

vodná hydrolýza Stupeň la

COOH

chránžní aminu Stupeň lb

COOH

R R· N' kopulace aminu

2b Rp= chránící skupina pro amid stupeň 2 ‘R’

H

odstr, chránících skupin aminu 'R·

Stupeň 3 í

epoxidová sekvence uzavření -Otevření

Stupeň 4 σ

OH j chloralkohol

Stupeň 5 odstranění Cbz

Me

AcO^\^COQ kopulace amidu Stupeň 6a

Me O Z^SPh °-^N-R· lil · acedtatu

Ac<U A. A..A .....- - HO

,. “Ό

Stupeň 6b

SPh N

Me O z* ** 'R' xyA-s.»

9b

Sloučenina la, perhydroisochinolin, která je komerčně dostupná od NSC Technologies (Chicago, IL) nebo od Procos SpA (Milan,

Italy) se ve stupni la podrobí prodloužené kyselé hydrolýze za zisku sloučeniny 2a. Mohou být použity různé anorganické kyseliny buď ve směsi voda/organické rozpouštědlo nebo ve vodě samotné při teplotách vyšších než 50 °C. Příkladem takové anorganické kyseliny je 6N vodný roztok kyseliny chlorovodíkové. Substituenty pro sloučeninu la zahrnují odpovídající estery lb, thioestery lc nebo jiné amidy ld:

H

lb

QOSZ

lc

QONZ,Z₂

ld

• · • · · ·

kde Z, Ζ_χ a Z₌ mohou být každý nezávisle alkyl, cykloalkyl, heterocyklus nebo aryl.

Sloučenina 2a je potom ve stupni lb chráněna na aminovém dusíku za zisku sloučeniny 2b. Chránící skupina R_p je definována jako vhodně konjugující skupina bránící nežádoucímu rozkladu aktivovaných karboxylatových derivátů sloučeniny 2b ve stupni 2. Takové chránící skupiny jsou obvykle karbamatového původu a mají obecnou strukturu podle vzorce 11:

π

R'' ve vzorci 11 může být alkyl, cykloalkyl, aryl nebo heterocyklus, které mohou být snadno odstraněny ve stupni odstranění chránících skupin, který následuje po stupni 2.

Příklad R*’ jsou methyl, ethyl, propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, t-butyl nebo vyšší alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem, 2,2,2-trichlorethyl, 2-trimethylsilylethyl, allyl, fenyl, substituovaný fenyl, benzyl, substituovaný benzyl, 9-fluorenylmethyl, 9-anthrylmethyl a vyšší polycyklické aromatické kruhové systémy. Následující materiály, jak jsou definovány dále, mohou být získány od Aldrich Chemical Co. (Sigma Aldrich Fluka):

H CHj

2-tr»mthylJ»ylethyl ’ — CHj-C-»—CHj allyl^a —CBj— benzyl» — CHj· • to to · •

to to to to to

I • to ·· · • ··· « * » • toto • to I • to · ·«

9-ftaureny1meíhyÍ» /'v**'

9-anthrylfnethyl

Takové chránící skupiny jsou obvykle navázány acylační reakcí příslušného halogenformiatového esteru 12a nebo dikarbonatu 12b:

RO X

O

Y

12a 12b ·

X = halogen Y=OCOR za přítomnosti vhodné baze v obvyklých organických rozpouštědlech pro tyto typy reakcí, jako jsou halogenovaná rozpouštědla, ethery a uhlovodíky. Takové baze jsou obvykle anorganické, jako například hydroxidy kovů, hydrogenuhličitany nebo uhličitany,~nebo organické, jako jsou například aminy jako je triethylamin, diethylamin, diethylisopropylamin,

1.8- diazabicyklo[2.2.2]oktan (DABCO) nebo příbuzné di- nebo trialkylaminy, stejně jako amidinové baze jako je

1.8- diazabicyklo[5.4.0]uhdek-7-en (DBU) nebo

1.8- diazabicyklo[4.3.0]non-5-en (DBN). Následující materiály, jak jsou definovány dále, mohou být získány od Aldrich Chemical Co. (Sigma Aldrich Fluka):

CABCO= ^rau= OD

0 *

V · »

0 0 • · · · * 0 • 0 a

0 • 0 !

» v

Tyto reakce jsou obvykle provedeny při teplotách v rozmezí od teplot nižších než je teplota okolí do přibližně 100 °C.

Kopulační reakce amidu ve stupni 2 může být provedena jakýmkoliv způsobem, podle toho, jak je karboxylová skupina aktivována. Skupina J je navázána ve stupni 2 reakcí karboxylové kyseliny 2b za vzniku aktivovaného derivátu 2c.

Stupeň 2

R,

P\

COOH aktivace karboxylové skupiny b Rp ^α chránící skupina pro amin

2b R^chránící skupina pro amin 2c J=odštěpitelná skupina

Skupina J může být jakákoliv z mnoha odštěpitelných skupin, jako je alkoxy, hydroxy, halogen, pseudohalogen (včetně azidu, kyanidu, isokyanatanu a isothiokyanatanu), alkyl nebo arensulfonat, aromatický heterocyklus (navázaný přes heteroatom) a N-hydroxyheterocyklus, včetně hydroxysukcinimidu nebo esteru hydroxybenztriazolu. Následující definice patří k výrazům uvedeným výše:

azid	— N-NaN — C=N
kyanid	— N-C-0
isokyanatan	— tfc-C-S 0
isothiokyanatan alkylsulfonat	-Ο-S- alkyl 0 0 1
arensulfonat	—O-S-«ryl O

“ dusíkový heterocyklus

9 9 »· 9 9

9 9 · 9 * · 9 ··· » * » 9 9 9 · •999· 99 9 9 99 9 » 999 « · 9 · • •Μ | 9 · 999 99 4 *

N-hydroxybeterocyklus

N-hydroxysukcinimid

hyd roxybe nzotra mle

i

OH

Acylhalidy (2c, J = halogen) mohou být připraveny za použití anorganických halogenačních činidel jako je thionylchlorid nebo bromid, chlorid fosforitý nebo bromid fosforitý, chlorid fosforečný nebo bromid fosforečný nebo za použití organických činidel jako je oxalylchlorid nebo kyselina trichlorisokyanmočová. Estery (2c, J = OR¹') (R¹' je definován výše) může být připraven mnoha způsoby z chloridu kyseliny 2c, kde J je Cl, smísením s požadovaným alkoholem za přítomnosti organické nebo anorganické baze, jak byly uvedeny výše pro acylaci sloučeniny 12a nebo 12b. Alternativně může být ester připraven kyselinou navozenou esterifikací za přítomnosti požadovaného alkoholu. Sulfonaty (2c, J = OSO₂W_i, kde je alkyl nebo aryl) jsou obvykle připraveny reakcí karboxylové kyseliny 2b s alkyl- nebo arylsulfonylchloridy za přítomnosti organického aminu jako je triethylamin v nepolárním rozpouštědle při teplotě nižší než 0 °C. Alkyl- a arylsulfonylchloridy jsou definovány následujícím způsobem:

alkylsulfonylchlorid arylsulfonylchlorid o

d—S-akyl a

o o

a-S-aryí «

o

tr?;·'.·.· v·φ φ · ·« · ·» φφ • · · · φ «φ φ

Φ · * * ♦ φ 4 ·« Φ Φ Φ» Φ» Φ

Φ « Φ «ΦΦΦ «Φ ΦΦΦ Φ Φ «Φ

Pseudohalogenové deriváty 2c (J = pseudohalogen) jsou obvykle vyrobeny z halogenidů kyseliny 2c (J = halogen) reakcí s anorganickým pseudohalogenem za přítomnosti baze. Takové baze jsou obvykle hydroxidy kovů, hydrogenuhličitany nebo uhličitany, nebo organické baze, jako jsou například aminy jako je triethylamin, diethylamin, diethylisopropylamin,

1.8- diazabicyklo[2.2.2]oktan (DABCO) nebo příbuzné di- nebo trialkylaminy, stejně jako amidinové baze jako je

1.8- diazabicyklo[5.4.0]undek-7-en (DBU) nebo

1.8- diažabicyklo(4.3.0]non-5-en (DBN). Zejména výhodnou baží je triethylamin. Heteroaromatické deriváty 2c jsou také připraveny z halogenidů kyseliny 2c ( J = halogen), za použití specifických heteroaromatických sloučenin za přítomnosti aminové baze v nepolárním rozpouštědle. N-hydroxyheterocyklické deriváty 2c mohou být také připraveny z halogenidů kyseliny, jak je uvedeno výše, a mohou být také připraveny za použití alkylkarbodiimidů (alkyl-N=C=N-alkyl, kde alkylové skupiny mohou být stejné nebo různé) nebo arylkarbodiimidů (aryl-N=C=N-aryl, kde arylové skupiny mohou být stejné nebo různé) a aminové baze jako kondenzačních činidel.

Primární nebo sekundární amin (ukázaný výše šipkou ve stupni 2 schématu I) použitý v kopulační reakci může obsahovat vhodné chránící skupiny, podle funkčních skupin přítomných v aminu a použitého způsobu kopulační reakce. Způsob kopulační reakce 2c s primárním nebo sekundárním aminem je různý, podle identity J. Pokud je použita volná kyselina (2c, J = OH), tak může být kopulační reakce provedena technikou založenou na karbodiimidu za použití jakýchkoliv běžných činidel této třídy, včetně dicyklohexylkarbodiimidu nebo příbuzných dialkylkarbodiimidů, EDC (solí 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimidu) nebo podobných činidel rozpustných ve vodě spolu s organickým aminem v polárních organických rozpouštědlech jako je dioxan, DMF, NMP a • ft · • · ** »t · · ♦ · · • · · · * · · · ftft · * ft · · • · ····#· • · · ft · · · »· * · * · · ·· acetonitril za přítomnosti N-hydroxyheterocyklické sloučeniny jako je N-hydroxysukcinimíd nebo 3-hydroxybenztriazol. Alternativně mohou být halogenformiatové estery, jako je 12d, použity pro dočasnou aktivaci kyseliny, za zisku směsných anhydridů obecného vzorce 2d:

O^OR

O^° o

RO^X

12d X = halogen 2d

Takové halogenformiatové estery mají typicky vzorec I2d uvedený výše a patří mezi ně methyl-, ethyl-, isopropyl-, isobutyl-, η-butyl-, fenyl- a příbuzné alkyl- a aryl-chlorformiaty, jak jsou definovány dále:

o alkyVCť^a alkyl-chlorformiat = aryl-chlorformiat = ?

aryl-cAd

Sloučenina vzorce 2d je možným meziproduktem při syntéze sloučeniny vzorce 3 ze sloučeniny vzorce 2b. Sloučenina vzorce 2d je meziproduktem, ale způsob zde popsaný vede k zisku sloučeniny vzorce 3, bez izolace sloučeniny vzorce 2d.

Tyto reakce jsou obvykle provedeny v různých nepolárních organických rozpouštědlech, jako jsou halogenuhlíky a ethery jako je diethylether, methyl-t-butylether, diisopropylether, dioxan a THF, při teplotách nižších než 0 °C a za přítomnosti organického aminu jako je triethylamin, diethylamin, diethylisopropylamin,

0 0 0

0 0* ·

0 0 ·

0 0 ·

0 0 · 0 « 0 0 0

0 4·

DABCO nebo příbuzné di- nebo trialkylaminy, stejně jako za přítomnosti amidinových baží jako je DBU a DBN.

Pokud je J ve sloučenině 2c alkyl nebo arensulfonat (J = OSO₂R nebo OSO₂Ar), tak jsou kopulační reakce obvykle provedeny v různých nepolárních organických rozpouštědlech, jako jsou halogenuhlíky a ethery jako je diethylether, methyl-t-butylether, diisopropylether, dioxan a THF, při teplotách nižších než 0 °C a za přítomnosti organického aminu jako je triethylamin, diethylamin, diethylisopropylamin, DABCO nebo příbuzné di- nebo trialkylaminy, stejně jako za přítomnosti amidinových baží jako je DBU a DBN.

Pokud je J ve sloučenině 2c halogen nebo pseudohalogen, tak může být kopulační reakce provedena ve většině běžných organických rozpouštědel jako je THF, diethylether, dioxan, methyl-t-butylether nebo jiné ethery, aceton, cyklohexanon, methylisobutylketon a jiné ketony, estery jako je ethyl-, methyla isopropylacetat, halogenovaná rozpouštědla jako jsou halogenované methany a ethany, chlorbenzen a jiné halogenované benzeny, nitrily jako je acetonitril a propionitril, nižší alkoholy jako je ethanol, isopropanol, t-butanol a příbuzné alkoholy, a polární organická rozpouštědla, jako například dimethyformamid, dimethysulfoxid, N-methyl-2-pyrrolidon a příbuzná rozpouštědla obsahující amid. Často je použita baze, která je vybrána z mnoha anorganických baží, jako jsou hydroxidy kovů, hydrogenuhličitaný a uhličitany nebo organických baží, jako jsou aminy jako je triethylamin, diethylamin, diethylisopropylamin, DABCO nebo příbuzné di- nebo trialkylaminy, a amidinové baze jako je DBU a DBN.

Odborník v oboru bude schopen provést kopulační reakci amidu ve stupni 2 s jinými možnými J skupinami.

• 4 • · · » · · 4 4 4 4 4

4·4* » 4 4

4 · « •44< · 44 «

4 4 4 · 4 4 • 4 4 * * · · • 4 4 4 • 4 «4

Ve stupni 3 může být odstranění chránících skupin provedeno za použití jakýchkoliv standardních metod pro odstranění určité třídy chránících skupin. Jednoduché alkyl- a substituované alkylkarbamaty mohou být odstraněny pomocí vodných roztoků baží při teplotách až 100 °C, za použití jakýchkoliv běžných hydroxidů kovů jako je hydroxid sodný, lithný, draselný nebo hydroxid barya, nebo za použití hydroxidů jiných kovů v alespoň stochiometrickém množství. Karbamatové chránící skupiny, které obsahují benzylové skupiny navázané na kyslík, mohou být odstraněny hydrolýzou s palladiovým nebo platinovým katalyzátorem. Alternativně může být použita hydrolýza vodnou baží při teplotách až do 100 °C, za použití jakýchkoliv běžných hydroxidů kovů jako je hydroxid sodný, lithný, draselný nebo hydroxid barya, nebo za použití hydroxidů jiných kovů v alespoň stochiometrickém množství. Různé bezvodé kyseliny, včetně HC1,

HBr a HI, mohou být také použity pro odstranění chránících skupin z benzyl-karbamatů. Lewisovi kyseliny boru a hliníku, jako je A1C1₃, BBr₃, BC1₃ v nepolárních rozpouštědlech jsou také účinné. Mohou být také použity některé substituované benzylové, arylové nebo alkylové skupiny, ve kterých jsou specifické substituenty vybrané pro svou schopnost být odstraněny za určitých podmínek. Například, 2-trimethylsilylethylkarbonylová skupina (Teoc) je chránící skupina navržená tak, že má výhodu specifické reaktivity 2-trimethylsilylethylové skupiny při odstraňování chránících skupin. 2-trimethylsilylethylkarbonylchlorid může být použit pro chránění aminového dusíku a může být později odstraněn za použití zdroje fluoridového iontu jako je HF nebo tetraalkylammoniumfluorid.

Ve stupni 4 je perhydrogenisochinolinová část sloučeniny vzorce 4 navázána na chloralkohol (sloučenina 5, schéma I) pomocí epoxidového meziproduktu (13) vytvořeného baží-indukovaným uzavřením spojovací chlorhydrinové funkce.

SPh

CbžHN • · · · * • · 9 9 « 9 • 9 9 9 » • ·«··«· 9 * 9 9

9999 · 9· 9

9 9 ·

9 9 ·

9 9 9

9 99

Sloučenina 5 je vyráběna Kaneka Industries, Japan. Při zpracování sloučeniny 5 - sloučeniny 13 - sloučeniny 6 může být použito několik postupů uzavření-otevření. Epoxid 13 může být izolován nebo může reagovat se sloučeninou 4, která se přidá buď po vytvoření 13, nebo je přítomna na počátku postupu. Epoxid 13 může být vyroben za použití anorganických baží jako jsou hydroxidy kovů, uhličitany nebo hýdrogenuhličitany v rozpouštědlech jako jsou alkoholy, například methanol, ethanol nebo isopropylalkohol, ethery, například THF a dioxan, nebo ve směsi těchto rozpouštědel. Epoxid může být také vyroben ve 2-fázovém systému rozpouštědel, který se skládá z vody a halogenuhlovodíkového rozpouštědla, jako je dichlormethan spolu s baží. Pro usnadnění procesu může být použit katalyzátor pro fázový přenos, jako je například tetraalkylammoniová sůl.

Otevření epoxidu 13 sloučeninou 4 je provedeno v alkoholových rozpouštědlech nebo ve směsi alkoholu a jiného rozpouštědla, jako je ether nebo dipolární aprotické rozpouštědlo jako je dimethylformamid nebo dimethylsulfoxid. Otevření epoxidu 13 sloučeninou 4 za zisku sloučeniny 6 je optimálně provedeno během 2-7 hodin při 50 - 60 °C.

Ve stupni 5 může být karbobenzyloxy skupina odstraněna za zisku volného aminu 7. Toto může být provedeno za použití HBr v kyselině octové, za současného použití rozpouštědel jako jsou halogenuhlíky. Tento krok se také může provést za použití halogenidů boru jako je BBr_s a BC1₃ a alkylem substituovaných halogenidů boru jako je bromid dimethylboru v halogenuhlíkových φ φ • · · φ φ φφφ • φ β * φ φ φ φ φ φ φ · φ φ φ φ φ φ φ rozpouštědlech jako je chloroform a dichlormethan při teplotách v rozmezí od 0 °C do teploty okolí. Alternativně může být karbobenzyloxy skupina odstraněna hydrolýzou za použití vodných/alkoholových roztoků hydroxidů kovů jako je hydroxid sodný, lithný, draselný nebo hydroxid barya při teplotách vyšších než je teplota okolí při reakční době v řádu hodin.

Stupeň 6a je kopulační reakce derivátů kyseliny benzoové vzorce 8 za vzniku sloučeniny vzorce 9a. Ve vzorci 8 může být Q odštěpitelná skupina. Q může být jakákoliv z odštěpitelných skupin popsaných výše pro skupinu J. Sloučeniny vzorce 8, kde Q = OH nebo Cl jsou komerčně dostupné od EMS Dottikon, Lenzburg, Switzerland a od Sugai Chemical Iňdustries, Ltd., Japan.

Kopulační reakce může být provedena různými způsoby, podle identity Q. Pokud je použita volná kyselina (Q = OH), tak může být kopulační reakce provedena technikou založenou na karbodiimidu za použití jakýchkoliv běžných činidel této třídy, včetně di cyklohexyl karbodiimidu nebo příbuzných dialkylkarbodiimidů, EDC (solí 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylkarbodiimidu) nebo podobných činidel rozpustných ve vodě spolu s organickým aminem v polárních organických rozpouštědlech jako je dioxan, DMF, NMP a acetonitril za přítomnosti N-hydroxyheterocyklické sloučeniny jako je N-hydroxy suke inimid nebo 3-hydroxybenztriazol. Pokud je Q halogen nebo pseudohalogen, tak může být kopulační reakce provedena ve většině běžných organických rozpouštědel jako je THF, diethylether, dioxan, methyl-t-butylether nebo jiné ethery, aceton, cyklohexanon, methylisobutylketon a jiné ketony, estery jako je ethyl-, methyl- a isopropylacetat, halogenovaná rozpouštědla jako jsou halogenované methany a ethany, chlorbenzen a jiné halogenované benzeny, nitrily jako je acetonitril a propionitril, nižší alkoholy jako je ethanol, isopropanol, t-butanol a příbuzné alkoholy, a polární organická rozpouštědla, jako je například dimethyformamid, dimethysulfoxid, • · tt ·« · * · · · ♦ ·« tt · · ♦ · · • ······ · · tt · » · · ···· · tt· ··· ·· ·· • · « • · · • ♦ · • · · tt· ··

N-methyl-2-pyrrolidon a příbuzná rozpouštědla obsahující amid. Často je použita baze, která je vybrána z mnoha anorganických baží, jako jsou hydroxidy kovů, hydrogenuhličitany a uhličitany nebo organických baží, jako jsou aminy jako je triethylamin, diethylamin, diethylisopropylamin, DABCO nebo příbuzné di- nebo trialkylaminy, a amidinové baze jako je DBU a DBN.

Odstranění acetatu je provedeno ve stupni 6b za použití vodných nebo alkoholových roztoků anorganických baží, jako jsou hydroxidy kovů, uhličitany a hydrogenuhličitany, při teplotách okolí až teplotách do 100 °C. Pokud je chráněná skupina na karboxamidové skupině navázané na perhydrogenisochinolinový kruh, pak je nejlépe odstraněna v tomto okamžiku (během nebo po stupni 6b). Charakter tohoto stupně závisí na přesné identitě chránící skupiny.

Výhodný způsob provedení celého procesu uvedeného ve schématu I je zobrazen ve schématu II.

Schéma II: Syntéza amidu 21

CONH-t-Bu

I. 6 N iq. HCI

2. CtaCI peňiydroisodiinolin Stupeň A

SPh

CbHN·

COOH

IS

OTMS 22

EDO, HOBcHjO Stupeň B

Cbx

Me

OH »2

J%PdZC

EtOH

Stupeň C

SPh

OH chtoralkohol NOH. IP A

H

SPh C^Á^s • iwMe

OH

JO%eq.N»OH

1PA

Stupeň D I

OH ¹ L

I

H

T_UX OH H Me

I

Me

AoO. 1 COC1

Et₃N, THF, EtOH potom 50% vodný NaOH

Stupeň F

Stupeň E

• 00 · * »

0 · 0 · 0 0 0 0 0 « 0 0

000000 0 0 « 0 0 0 0 •000 0 00 000 • 0 »

0 ·

0 0 0 00 00

Cbz chráněná aminokyselina 15 se naváže na amin 22 za vzniku amidu 16. Cbz skupina se odstraní hydrogenací za zisku aminu 17. Tento amin se naváže na chloralkohol pomocí epoxidu za použití postupu in šitu za zisku adduktu 18. Po běžném odstranění chránících skupin za použití baze a po navázání volného primárního aminu na chlorid kyseliny 20 se získá amid 21. Podrobnosti týkající se tohoto postupu jsou uvedeny dále v příkladech IA až 1F. Označení A až F ve schématu II odpovídá příkladům IA až 1F uvedeným dále.

Následující příklady dokreslují jednotlivé aspekty vynálezu. Tyto příklady jsou ilustrativní a nijak neomezují rozsah předkládaného vynálezu.

Příklady provedeni vynálezu

Zkratky pro teplotu tání, spektrum nukleární magnetické resonance, hmotnostní spektrum při ostřelování elektrony, hmotnostní spektrum za desorpce polem, hmotnostní spektrum při ostřelování rychlými atomy, infračervené spektrum, ultrafialové spektrum, elementární analýzu, vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii a chromatografii na tenké vrstvě jsou, v příslušném pořadí, t.t., NMR, EIMS, MS(FD), MS(FAB), IR, UV, Analýza, HPLC a TLC. Dále, absorpční maxima uvedená pro IR spektra jsou významná maxima, nikoliv všechna pozorovaná maxima.

Při popisu NMR spektra jsou použity následující zkratky: singlet (s), dublet (d), dublet dubletů (dd), triplet (t) kvartet (q), multiplet (m) , dublet multipletů (dm), široký singlet (br.s), široký dublet (br.d), široký triplet (br.t), a široký multiplet (br.m). J označuje kapling konstantu v Hertzech (Hz). Pokud není uvedeno jinak, týkají se NMR data sloučeniny ve formě volné baze.

• 9

9« 9 99

9*9 99

9 9 9 9 • 9 9 9· 9 9 9

9 9 «

9999 9 99

99

9 9

9 9

9 9 ·9 9

99

NMR spektrum bylo získáno na přístroji General Electric QE-300 300 MHz. Chemické posuny jsou vyjádřeny v δ hodnotách v ppm. Hmotnostní spektrum bylo získáno na VG ZAB-3 Spectrometer ve Scripps Research Institute, La Jolla, CA. Infračervené spektrum bylo získáno na spektrometru od Midac Corporation. UV spektrum bylo získáno na přístroji varian Cary 3E. Chromatografie na tenké vrstvě byla provedena na deskách z oxidu křemičitého získaných od E. Merck. Teploty tání byly měřeny na přístroji Mettler FP62 a jsou nekorigované.

Příklad 1: Syntéza amidu vzorce 21 [3S-[2(2S*, 3S~),3a,4aS,8aE]]-N-(1,1-dimethyl-2-hydroxyethyl)dekahydrogen-2- [2-hydroxy-3- [ (3-hydroxy-2-methylbenzoyl) amino] -4-(fenylthio)-butyl]-3-isochinolinkarboxamid

A. Perhydrogenisochinolin (26,4 g, 111 mmol) (komerčně dostupný od NSC Technologies (Chicago, IL) nebo od Procos SpA (Milan, Italy)) se suspenduje ve vodě (200 ml) a koncentrovaném vodném roztoku HC1 (200 ml). Směs se zahřívá při teplotě zpětného toku po dobu 3 dnů, během kterých se zapracuje do roztoku.

Rozpouštědla se odstraní za redukovaného tlaku za zisku světle žlutého solidního materiálu. Vyrobí se kaše z pevného materiálu a 2-propanolu (200 ml) a táto kaše se filtruje. Filtrát se odpaří za redukovaného tlaku za ziskti óleje. Přidá se EtOAc (100 ml) a voda (100 ml) a pH roztoku se upraví na 8,0 přidáním 2N vodného roztoku KOH. Po kapkách během 30 minut se přidá

9 ·· 9 99 ·· • •9 9999 9999

999 99 9 9999

9999 99 9 9 99 99 9

9 999 9999

9999 9 99 999 99 99 benzylchlorformiat (15,8 ml, 111 mmol) a pH se udržuje mezi 7 a 8 pomocí přidání 2 N vodného roztoku KOH. Směs se mísí při teplotě okolí po dobu 18 hodin. Přidá se EtOAc (200 ml) a organická vrstva se promyje IN vodným roztokem HCI (100 ml) a solankou (100 ml). Organická vrstva se suší (MgSO₄), filtruje se a odpaří se za redukovaného tlaku za zisku oleje. Výsledný materiál se přečistí chromatografii na silikagelu za eluce 1:1 40-60 petrolether/EtOAc a potom 100% EtOAc. Frakce obsahující výslednou sloučeninu se odeberou a odpaří se za redukovaného tlaku za zisku sloučeniny 15 (11,3 g,' 32%) jako bezbarvého oleje.

¹H NMR (300 MHz, CDC1₃) δ 7,43 - 7,28 (m, 5H), 5,17 (br s, 2H), 4,76 (m, 1H), 3,79 (m, 1H), 3,33 (m, 1H), 2,19 (m, 1H), 1,96 (m, 1H), 1,88 - 1,15 (m, 10H).

B. 1-hydroxybenzotriazol (4,2 g, 31,4 mmol) a EDC (6,0 g, 31,4 mmol) se přidají do roztoku kyseliny 15 (8,3 g, 26,2 mmol) v DMF (128 ml) při teplotě okolí. Směs se zahřívá při 80 °C po dobu 10 minut. Přidá se 1, l-dimethyl-2-trimethylsilyloxyethylamin (5,1 g, 31,4 mmol, připravený z 1,l-dimethyl-2-hydroxyethylaminu (Aldrich Chemical Co.) a hexamethyldisilazan (Aldrich Chemical Co.) zahříváním směsi při teplotě zpětného toku po dobu několika hodin, po čemž následuje odpaření těkavých složek) a roztok se zahřívá při 80 °C po dobu 17 hodin. Žlutý roztok se nalije do EtOAc (250 ml) a 2N vodného roztoku HCI (250 ml). Po míšení po dobu 10 minut se přidá EtOAc (750 ml) a směs se promyje H₂O (3 x 500 ml) a solankou (1 x 250 ml). Kombinované vodné vrstvy se extrahují EtOAc (1 x 250 ml). Kombinované organické vrstvy se suší (Na^SO^) a přečistí se rychlou chromatografii (50/50 EtOAc/hexany) za zisku sloučeniny 16 jako bezbarvého oleje (7,9 g, 78%).

^XH NMR (300 MHz, CD₃OD) δ 7,36 (m, 5H), 5,20 (d, J = 8,1 Hz, • φ

Φ · · · * φ φ φ φ φ • φ φ φ φ · φ · • φ φ φ φ Φ· · φ · φ ·· · ·· · • · φ φ φ • » · φ φ · • φ φ · · φ φφ φ φ φφ

1H) ,	5,10	(m,	1H) ,	4,53 (m, 1H),	, 3,78 (dd,	J = 13,2,	4,4 Hz, 1H),
3,60	(m,	2H) ,	3,48	(d, J = 10,7	Hz, 1H), 2,	,15 - 1,25	(m, 12H),
1,31	(s,	3H) ,	1,29	(S, 3H).

C. Směs karbamatu 16 (7,9 g, 20,4 mmol) a 5% palladia na uhlíku (Pd/C) (1,6 g) se hydrogenuje při 50 psi H₂, v absolutním EtOH (110 ml) při teplotě okolí po dobu 18 hodin. Směs se filtruje přes celit a odpaří se ve vakuu za zisku aminu 17 jako bílé, krystalické pevné látky.

¹H NMR (300 MHz, CD₃OD) δ 3,63 (q, J = 7,0 Hz, 2H), 3,34 (m, 1H), 3,27 (dd, J = 11,8, 3,3 Hz, 1H), 2,91 (m, 1H), 2,02 - 1,15 (m, 12H), 1,32 (s, 3H), 1,31 (s, 3H).

D. Vodný roztok 10,2 N NaOH (2,4 ml, 24,5 mmol) se přidá do teplé (27 °C) suspenze chloralkoholu (získaného od Kaneka Industries, Japan) (10,4 g, 28,6 mmol) v isopropanolu (IPA) (104 ml) a provede se míšení. Po 1 hodině se přidá 1 N vodný roztok HCI v IPA (připravený adicí 1 ml koncentrované vodné HCI do 12 ml IPA) (přibližně 1 ml) pro neutralizaci (pH = 7). Amin 17 (5,2 g, 20,4 mmol) se přidá jako roztok v IPA (50 ml) a hustá suspenze se zahřívá při 60 °C po dobu 10 hodin. IPA se odstraní ve vakuu. Zbytek se ředí EtOAc (150 ml) a promyje se H₂O (2 x 50 ml), nasyceným vodným roztokem NaHCO₃ (1 x 50 ml) a solankou (1 x 50 ml). Kombinované vodné vrstvy se extrahují EtOAc (1 x 25 ml). Kombinované organické vrstvy se suší (Na₂SO₄) a přečistí se rychlou chromatografií (75/25 EtOAc/hexany) za zisku sloučeniny 18 jako bílé pevné substance (8,98 g, 76%).

¹H NMR (300 MHz, CD₃OD) δ 7,33 (m, 10H) , 5,08 (AB, = 12,2 Hz, δϋ = 12,1 Hz, 2H), 3,96 (m, 2H), 3,56 (q, J = 7,3 Hz, 2H),

3,50 (m, 1H), 3,20 (dd, J = 13,6, 9,2 Hz, 1H), 3,03 (m, 1H),

2,64 (m, 2H), 2,20 - 1,20 (m, 14H), 1,28 (s, 6H).

··· ·· · 4 4 4 4 • · · 4 · · · 4 4 4 4

4 4 · · 4 4 4 4 4 ······· · 4 44 44 4

Ε. 50% vodný roztok NaOH (2,7 g, 1,8 ml, 33,6 mmol) se přidá do suspenze karbamatů 18 (6,75 g, 11,6 mmol) v IPA (34 ml) při teplotě okolí. Směs se zahřívá při teplotě zpětného toku po dobu 12 hodin. Po ochlazení na teplotu okolí se směs ředí methyl-t-butyletherem (MTBE) (600 ml) a promyje se H₂O (2 x 250 ml), a solankou (1 x 125 ml). Kombinované vodné vrstvy se extrahují MTBE (1 x 150 ml). Kombinované organické vrstvy se suší (Na₂S0₄) a odpaří se ve vakuu za zisku směsi sloučeniny 19 a benzylalkoholu jako mastné bílé pevné substance.

¹H NMR (300 MHz, CD₃OD) δ 7,34 (m, 10H), 4,63 (s, 2H), 3,81 (m,

1H), 3,58 (m, 3H), 3,03 - 2,60 (m, 5H), 2,17 (m, 1H), 2,05 (m,

1H) , 1,87 - 1,05 (m, 12H) , 1,30 (s', 3H) , 1,28 (s, 3H) .

F. Triethylamin (3,2 g, 4,3 ml, 31,2 mmol) se přidá do roztoku směsi aminu 19 (4,7 g, 10,4 mmol, získaný z aminu 18) a benzylalkoholu v EtOH (23 ml) při teplotě okolí. Přidá se roztok 3-acetoxy-2-methylbenzoylchloridu (20) (získaný postupem uvedeným v U.S. patentové přihlášce č. 08/708411, podané 5.9.1996, která je zde uvedena jako odkaz) (2,4 g, 11,5 mmol) v THF (4 ml). Po 2 hodinách se přidá 50% vodný roztok NaOH (4,1 g, 2,8 ml, 52,2 mmol) a směs se zahřívá při teplotě zpětného toku po dobu 1 hodiny. Po ochlazení na teplotu okolí se směs neutralizuje na pH = 7 pomocí 2 N vodného roztoku HC1 (26 ml). Tato směs se ředí EtOAc (500 ml) a promyje se H₂0 (1 x 250 ml) , nasyceným vodným roztokem NaHCO₃ (2 x 250 ml), Η₌Ο (1 x 250 ml) a solankou (1 x 125 ml). Organické vrstvy se suší (Na₂SO₄) a přečistí se rychlou chromatografií (75/25 EtOAc/hexany) za zisku amidu 21 18 jako bílé pěny (1173-57A, 1,39 g, 23%). T NMR analýza ukazuje na přítomnost 11% hmotnostních EtOAc, které nemohou být odstraněny ve vakuu.

Analýza:

• · · 4

I ···· • 4 · ··

4 4 · 4 4 4 • · · · 4 4 • · · · 4 4 4

4 4 4 4 4 • 4 444 44 44

XH NMR	(300 MHz, CDaOD) δ	7,53	(d, J = 7,3 Hz,	2H)	, 7,32 (t,	J =
7,0 :	Hz,	2H), 7,20 (t, J =	7,3	Hz, ÍH) , 7,06 (t	, J	= 8,1 Hz,	ÍH) ,
6,92	(d	, J = 8,1 Hz, ÍH),	6,83	(d, J = 8,1 Hz,	ÍH)	, 4,42 (m,	1H) ,
4,08	(m	, ÍH), 3,61 (dd, J	= 13	,6, 4,0 Hz, ÍH),	3,4	5 (AB, J 9 AJ&
11,0	Hz	, Ó.U = 18,0 Hz,	2H) ,	3,29 (dd, J = 1	3,6,	10,3 HZ,	ÍH) ,
3,10	(m	, ÍH), 2,66 (m, 2H)	, 2,	28 (S, 3H), 2,22	(m,	2H), 2,04	(m,
ÍH) ,	1,	86 - 1,20 (m, 11H) ,	1,1	9 (S, 3H), 1,18	(s,	3H) .

^X3C NMR (75,5 MHz, CD₃OD) δ 175,7, 172,5, 155,9, 138,8, 136,7, 129,8, 128,9, 126,3, 126,0, 122,4, 118,4, 115,9, 70,3, 69,9,

68,2, 59,3, 58,8, 54,9, 53,0, 36,5, 34,2, 34,1, 31,1, 30,7, 26,4, 26,0, 23,1, 23,0, 20,8, 12,1.

Příklad 2: Inhibiční aktivita sloučeniny 21 pro HIV proteasu a anti-HIV aktivita v buněčné kultuře

Kinetická analýza těsné vazby byla použita pro určení hodnot K_± pro sloučeninu 21. K_± = 5,6 ± 0,91 nM.

Metody

Exprese HIV-1 proteasy

Gen pro HIV-1 proteasu byl izolován z virového kmene IIIB (Ratner, L. et al., Nátuře, 316: 227 - 284 (1985)). Pro zvýšení stability přečištěné proteasy (Rose, J.R. et al., J. Biol. Chem. 268: 11939 - 11945 (1993) byl glutaminový zbytek v pozici 7 (Q7) mutován na serin (S) nahrazením segmentu o 33 párech baží mezi Ndel a BstEII místy genu pro proteasu syntetickým oligonukleotidem kódujícím Q7S mutaci. Modifikovaná genová sekvence byla insertována do plasmidového vektoru pGZ (Menge,

K.L. et al., Biochemistry 34: 15934 - j.5942 (1995)) pod kontrolou promotoru fágu T7. Výsledný konstrukt, pGZ/HP-19Q7S#9, byl ·· 00 • · · • · 0

0 0 » 0 0 0

00 • · 0000 transformován do kmene E. coli BL21 (DE3), který byl získán od Novagen, lne.

Exprese HIV-1 PR: Kultury byly kultivovány ve 2YT mediu (1,6% Trypticase peptod, 1% kvasinkový extrakt, 0,5% NaCl při počátečním pH 7,5) obsahujícím 200 gg/l ampicilinu ve 100 1 fermentační nádobě (Biolafitte SA) při 37 °C po dobu 5 hodin, a potom byly indukovány přidáním 1 mM IPTG (isopropyl-β-D-thiogalaktopyranosidu). Teplota kultury během indukce byla zvýšena na 42 °C pro zvýšení akumulace rekombinantní HIV-1 proteasy ve formě nerozpustných inklusních tělísek. Po 2 hodinách při 42 °C byly buňky odebrány filtrací s křížovým prouděním za použití Pellicon 0,1 gm WPP000C5 kazety #10 (Millipore) a buněčná suspenze byla uskladněna ve zmrzlém stavu při -70 °C.

Přečištění rekombinantní HIV-1 proteasy: Všechny kroky, pokud není uvedeno jinak, byly provedeny při 4 °C. Koncentrace proteinu byly stanoveny pomocí BioRad proteinového testovacího roztoku s hovězím sérovým albuminem (BioRad, Richmond, CA) jako standardu. Chromatografické stupně a čistota HIV PR byla stanovena elektroforesou na pólyakry1amidovém gelu obsahujícíh dodecylsíran sodný (SDS-PAGE). Konečná čistota HIV-PR byla vyšší než 98%. Typický konečný výtěžek z každých 100 1 kultury byl přibližně 120 mg.

Buněčná kaše ze 100 1 kultury byla resuspendována ve 300 ml lyzačního pufru (50 mM Tris-Cl, pH 8,0, 25 mM NaCl, 20 mM 2-merkaptoethanolu) a byla mikrofluidizována v Microfluidics Corporation fluidizačním zařízení při 22000 psi. Surový buněčný lyzát byl projasněn centrifugací při 14000 rpm po dobu 20 minut. HIV PR se nacházela především v peletách ve formě inklusních tělísek. Inklusní tělíska byla potom opakovaně promyta lyzačním

.i W’,’¹

9*

9

9

9 9

9 9 • »9 • 99 99

9 9 9 9 9

9 9 9 9

9 9 9 9 9

9 9 9 9

999 99 9«

9 • 9

99 9 pufrem obsahujícím navíc 0,1% Triton-X100 a 1 M močovinu a po každém výplachu byla inklusní tělíska peletována centrifugací při 5000 rpm po dobu 20 minut. Přečištěná inklusní tělíska byla solubilizována v pufru obsahujícím 50 mM Tris-Cl, pH 8,0, 25 mM NaCl, 20 mM merkaptoethanol a 8 M močoviny. Roztok se pro jasnil centrifugací při 14000 rpm a vnesl se při teplotě okolí do 300 ml Fast Flow Q-Sepharosové kolony (Pharmacia, Piscataway, NJ) uvedené do rovnováhy stejným pufrem. Za těchto podmínek se HIV-PR nevázala na kolonu a v podstatě čistý enzym se nacházel ve vytékajících frakcích. Pro renaturaci proteinu byly frakce z Fast Flow Q-Sepharosové kolony dialyzovány proti třem výměnám pufru obsahujícího 25 mM NaH^PO^, pH 7,0, 25 mM NaCl, 10 mM DTT a 10% glycerolu. Po složení byla malá množství vysráženého materiálu odstraněna centrifugací a vzniklý enzymový přípravek byl koncentrován, dialyzován proti 0,5 M NaCl, 50 mM MES, pH 5,6, 10 mM DTT, byl zmrazen v malých alikvotách při přibližně 2 mg/ml a byl uskladněn při -70 °C.

Test kinetiky těsné vazby a analýza

Proteolytická aktivita přečištěné HIV-1 proteasy byla stanovena za použití modifikovaného chromogenního testu, který popsal Richards et al., (Richards, A.D. et al., J. Biol. Chem. 256: 779 - 776 (1990)). Jako substrát byl použit syntetický peptid His-Lys-Ala-Arg-Val-Leu-Phe (paraN0₂) -Glu-Ala-Nle-Ser-NH₂ (American Peptide Company) (Nle je norleucin). Test byl proveden v 0,5 M NaCl, 50 mM MES pH 5,6, 5 mM DDT a 2% DMSO při 37 °C. Štěpení lehce štěpitelné vazby mezi leucinem a paranitrofenylalaninem (Phe para-N0₂) bylo stanoveno spektrofotometrickým sledováním snížení absorbance při 305 nm. Počáteční rychlost je stanovena jako rychlost snížení absorbance během prvních 100 sekund enzymové reakce. Za těchto podmínek a za použití Q7S HIV-1 proteasy, byla Michaelisova konstanta (Km) pro tento • · · φ · substrát 59 ± 17 μΜ.

Pro určení inhibice sloučeniny 21 byla použita saturační koncentrace substrátu 200 μΜ. Bylo hodnoceno mezi 13 a 20 koncentracemi inhibitorů a pro každou koncentraci byla stanovena rychlost reakce způsobem popsaným výše. Zdánlivá Ki (Ki app) , uvedení výše, byla stanovena počítačovým nelineárním vložením dat do Morrisonovi rovnice pro těsnou vazbu (Morrison, J.F., Biochem. Biophys. Acta 185: 269 - 286 (1963)).

Příklad 3: Antivirová aktivita sloučeniny 21 proti HIV-1 v buněčné kultuře

Buňky a virové kmeny:

CEM-SS a MT-2 lidské buněčné linie T buněk a HIV-l kmeny RF a IIIB byly získány od AIDS Research and Reference Program,

Division Of AIDS, NIAID, a NIH.

Test ochrany buněk:

Inhibiční účinek každého činidla na replikaci HIV-1 byl měřen metodou redukce MTT barviva (Alley, M.C. et al., Cancer Res. 48: 589 - 601 (1988)) . Sloučeniny byly rozpuštěny v DMSO v koncentraci 40 mg/ml a potom byly ředěny 1:200 v kultivačním mediu (RPMI doplněné 10% fetálním hovězím sérem). Z každého naředěného zásobního roztoku bylo 100 μΐ do 96-jamkové plotny a byla připravená sériová poloviční logaritmická ředění. Ve zvláštních zkumavkách byly MT-2 buňky a CEM-SS buňky infikovány HIV-1 IIIB nebo HIV-1 RF 0,01 a 0,03 m.o.i. (velikost infekce), v příslušném pořadí. Po 4 hodinovém absorpčním období bylo 100 μΐ infikovaných nebo neinfikovaných buněk přidáno do jamek plotny obsahující lék v konečné koncentraci 1 χ 10* buněk/jamku. O 6 dní

IMIWIIWWHWJCIWWIW • ft ft · · 9 ·· ·· • ftft ···· · · · · (CEM-SS buňky) nebo o 7 dní (MT-2 buňky) později byl do testovacích ploten přidán MTT (5 mg/ml) a množství produkovaného formazanu bylo stanoveno spektrofotometricky při 570 nm. Data byla vyjádřena jako procento formazanu produkovaného v buňkách ošetřených lékem vzhledem k formazanu produkovaném v jamkách obsahujících neinfikované buňky, které neobsahovaly lék. ED_so byla vypočítána jako koncentrace léku, která zvyšuje produkci formazanu v infikovaných, lékem ošetřených buňkách o 50% vzhledem k množství formazanu produkovaného v neifikováných buňkách neošetřehých lékem. Cytotoxicita (TC_so) byla vypočítána jako koncentrace léku, která snižuje produkci formazanu v neinfikovaných, lékem ošetřených buňkách na 50% vzhledem k množství formazanu produkovaného v neifikováných buňkách neošetřených lékem. Terapeutický index byl stanoven po vydělení cytotoxicity (TC_so) antivirovou účinností (ED_so).

Tabulka 1: Hodnocení antivirové účinnosti a cytotoxicity sloučeniny 21 v akutní infekci CEM-SS buněk HIV-1 RF

Sloučenina	ED so (nM)	ED 95 (nM)	TC so (μΜ)	Terapeutický index*
21	34,2	154,1	96,6	2825
azidothymidin	52,3	543,1	>374,5	>7161
(AZT)
dideoxycyt idin	94,70	142,0	37,69	398
(ddC)
Terapeutický	index =	cytotoxicita	(TC=O) /	antivirová aktivita

(ED ) *

·· · • · · toto· • · · · to a to · • · • · • · • ·

I to*·· · « to • · • to • ·

Tabulka 2: Hodnocení antivirové účinnosti a cytotoxicity

sloučeniny 21 v	akutní infekci MT-2	buněk HIV	-1 IIIB
Sloučenina	ED 50	ED 95	TC«=n 50	Terapeutický
	(nM)	(nM)	(μΜ)	index*
21	85,6	ND	92,6	1082
AZT	430,7	ND	109,4	254
ddC	5924	ND	176,3	30
* Terapeutický	index = cytotoxicita	(TCSO) /	antivirová aktivita

(ED )

Jak bylo uvedeno výše, sloučeniny podle předkládaného vynálezu jsou užitečné pro inhibici HIV proteasy, což je enzym spojený s produkcí složek viru a jejich sestavením. Jedním provedením předkládaného vynálezu je způsob pro léčbu HIV infekce, při kterém je hostiteli nebo pacientovi, jako je například primát, podáno účinné množství sloučeniny vzorce (9) nebo její farmaceuticky přijatelné soli. Jiným provedením předkládaného vynálezu je způsob pro léčbu AIDS, při kterém je hostiteli nebo pacientovi podáno účinné množství sloučeniny vzorce (9) nebo její farmaceuticky přijatelné soli. Jiným provedením předkládaného vynálezu je způsob pro inhibici HIV proteasy, při kterém je buňkám infikovaným HIV nebo hostiteli nebo pacientovi, jako je například primát, podáno účinné množství sloučeniny vzorce (1) nebo její farmaceuticky přijatelné soli.

Termín účinné množství znamená množství sloučeniny vzorce (9) nebo její farmaceuticky přijatelné soli, které je účinné pro inhibici produkce a sestavení složek viru, které jsou

Φ φ φ φ · ·

ΦΦ ΦΦ ·

zprostředkovány HIV proteasou. Přesná dávka sloučeniny podaná ve způsobech podle předkládaného vynálezu pro dosažení terapeutických nebo inhibičních účinků je samozřejmě určena podle konkrétních okolností, včetně typu podané sloučeniny, způsobu podání, léčeného stavu a konkrétního léčeného hostitele nebo pacienta. Příklady denní dávky (podané v jedné dávce nebo ve více dávkách) jsou dávky sloučeniny podle předkládaného vynálezu od přibližně 0,01 mg/kg až přibližně 50 mg/kg tělesné hmotnosti. Výhodné .denní dávky jsou obyčejně od přibližně 0,05 mg/kg do přibližně 40 mg/kg, lépe od přibližně 1,0 mg/kg do přibližně 30 mg/kg.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být podány různými způsoby, včetně orálního, rektálního, transdermálního, subkutáního, intravenosního, intramuskulárního a intranasálního podání. Sloučeniny podle předkládaného vynálezu jsou výhodně připraveny ve farmaceutickém prostředku před podáním. Proto jiné provedení předkládaného vynálezu obsahuje farmaceutický prostředek nebo přípravek obsahující účinné množství sloučeniny vzorce (9) nebo její farmaceuticky přijatelné soli a farmaceuticky přijatelný nosiš, jako je například ředidlo nebo pomocné činidlo.

Aktivní složka výhodně tvoří od 0,1% do 99,9% hmotnostích prostředku. Termín farmaceuticky přijatelný znamená, že nosič, jako je ředidlo nebo přísada, je kompatibilní s dalšími složkami a není škodlivý pro hostitele nebo pro pacienta.

Farmaceutické prostředky mohou být připraveny ze sloučenin podle předkládaného vynálezu za použití známých postupů a snadno dostupných přísad. Při výrobě prostředků podle předkládaného vynálezu je obvykle aktivní složka smísena s nosičem, nebo je ředěna nosičem, nebo je uzavřena v nosiči, který může být ve o · · 4 4 • · · · • · · 4 • 4 4 4 4 4 4 • · 4

4 4 4 9 4 4

4 4 4

4 4 4

4 4 · • 4 4 4 4

4 4 4 formě kapsle, pytlíku, sáčku nebo jiného vhodného zásobníku.

Pokud slouží nosič jako ředidlo, tak může být ve formě solidního, semi-solidního nebo kapalného materiálu, který působí jako vehikulum, přísada nebo medium pro aktivní složku. Tak může být prostředek ve formě tablet, pilulek, prášků, pastilek, sáčků, oplatek, elixírů, suspenzí, emulzí, roztoků, sirupů, aerosolů (jako pevné nebo kapalné medium), mastí (obsahujících například až 10% hmotnostních aktivní sloučeniny), kapslí s tuhé nebo měkké želatiny, čípků, sterilních injekčních roztoků, sterilně balených prášků a' podobně.

Následující příklady prostředků jsou pouze ilustrativní a neomězují rozsah předkládaného vynálezu. Termín aktivní složka označuje sloučeninu vzorce (9) nebo její farmaceuticky přijatelné soli.

Prostředek 1

Kapsle z tuhé želatiny se připraví z následujících přísad:

Množství (mg/kapsli)

Aktivní složka	250
Škrob, sušený	200
Stearan hořečnatý	10
Celková hmotnost	460
Prostředek 2

Tableta se připraví z následujících přísad:

ft · ft ft • ftft ftftftft · • · · ftft ftft v · · * ftft · • ft ftftftft • · ftft ftft · • · ftftftft • ft ftftft ftft ftft

	Množství (mg/tabletu)
Aktivní složka	250
Celulosa, mikrokrystalická	400
Oxid křemičitý, koloidní	10
Kyselina stearová	5

Celková hmotnost 665 mg

Složky se smísí a stlačí se za vzniku tablet o hmotnosti 665 mg.

Prostředek 3

Roztok pro aerosol se připraví z následujících složek:

Množství

Aktivní složka 0,25 Methanol 25,75 Hnací plyn 22 (chlordifluormethan) 74,00

Celková hmotnost 100,00

Aktivní složka se smísí s ethanolem a směs se přidá k části hnacího plynu 22, ochladí se na -30 °C a přenese se do plnícího zařízení. Požadované množství se potom naplní do zásobníku z nerez-ocely a ředí se zbytkem hnacího plynu, zásobník se potom opatří chlopní.

Prostředek 4

Tableta obsahující 60 mg aktivní složky se připraví

99« 99 9 99 99 «99 9 9 · 9 999 «

999 99 9 9999

9999*9 9 9 99 94 4

4 944 4494

4944 4 94 994 94 9* z následujících přísad:

Množství (mg/tabletu)

Aktivní složka 60

Škrob 45

Celulosa, mikrokrystalická 35

Polyvinylpyrrolidon (jako 10% roztok ve vodě) 4

Karboxymethyl škrob sodný 4,5

Stearan hořečnatý 0,5

Talek 1

Celková hmotnost 150 mg

Aktivní složka, škrob a celulosa se prosejí přes U.S. síto č. 45 mesh a důkladně se promísí. Vodný roztok obsahující polyvinylpyrrolidon se smísí s vzniklým práškem a směs se potom proseje přes U.S. síto č. 14 mesh. Takto vyrobené granule se suší při 50 °C a prosejí se přes č. 18 mesh U.S. síto. Karboxymethyl škrob sodný, stearan horečnatý a talek, předem proseté přes U.S. síto č. 60 mesh, se potom přidají ke granulím, které se po promísení stlačí na tabletovacím přístroji za vzniku tablet o hmotnosti 150 mg.

Prostředek 5

Kapsle obsahující 80 mg aktivní složky se připraví z následujících přísad:

0 0 0 · 0 4 0 0

0 0 0

0000 · ·

0 0 *000 0 00 • 0 0 0 0 • 00 0 0 0 0 • 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

000 0 0 00

	Množství (mg/kapsli)
Aktivní složka	80
Škrob	59
Celulosa, mikrokrystalická	59
Stearan hořečnatý	2

Celková hmotnost 200 mg

Aktivní složka, škrob, celulosa a stearan hořečnatý se smísí, prosejí se přes U.S. síto č. 45 mesh a plní se do kapslí z tuhé želatiny v množství 200 mg/kapsli.

Prostředek 6

Čípky obsahující 225 mg aktivní složky se připraví z následujících přísad:

Množství

Aktivní složka 225

Glyceridy nasycených mastných kyselin 2000

Celková hmotnost 2225 mg

Aktivní složka se proseje přes U.S. síto č. 60 mesh a suspenduje se v glyceridech nasycených mastných kyselin, které byly předem roztaveny za použití minimálního nutného tepla. Směs se potom nalije do čípkové formy nominální kapacity 2 g a nechá se vychladnout.

Prostředek 7

Suspenze obsahující 50 mg aktivní složky na 5 ml se připraví • 9

9 9 9 9

9 9 9 9 9 · 9 9 9

999999 9

9 9 9

9999 9 99 9 * 9 9 9

9 9 9

9 9 9

9 9 9 *« z následujících přísad:

Množství

Aktivní složka	50 mg
Karboxymethylcelulosa sodná	50 mg
Sirup	1,25 ml
Roztok kyseliny benzoové	0,10 ml
Chuťové korigens	q.v.·
Barvivo	q.v.

Přečištěná voda do celkového objemu 5 ml

Aktivní složka se proseje přes U.S. síto č. 45 mesh a smísí se s karboxymethylcelulosou sodnou a sirupem za vzniku hladné pasty. Roztok kyseliny benzoové, chuťové korigens a barvivo se ředí částí vody a za míšení se přidají k pastě. Potom se přidá voda do požadovaného objemu.

Prostředek 8

Prostředek pro intravenosní podání se připraví následujícím způsobem:

Aktivní složka 100 mg

Izotonický salinický roztok 1000 ml

Roztok výše uvedeného složení se obvykle podá intravenosně subjektu rychlostí 1 ml za minutu.

Prostředek 9

Tableta se připraví z následujících přísad:

« · · •ft · ·· ·· • ftftft · ftft · • ftft · · · · · · · ft ······ · ft ftft ftft ft • · ftftft ftftftft • ·· · · ·· ftftft ftft ftft

Množství (mg/tabletu)

Aktivní složka	292
Křemičitan vápenatý	146
Krospovidon	146
Stearan hořečnatý	5

Celková hmotnost

Claims (37)

1. Sloučenina vzorce (9):

kde

R a R' jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl-0R_x, cykloalkyl substituovaný (C_x-C_g)alkylem nebo (C_x-C₄)alkyl-OH, heterocyklus substituovaný (C_x-C_g)alkylem nebo (C_x-C_g)alkyl-OH, alkyl-NR₂R₃, nebo alkyl-S(X)(Y)R₄, kde

R_x je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl nebo acyl;

R₂ a R_a jsou každý nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, cykloalkyl, heterocyklus, aryl, acyl a sulfonyl;

R₄ je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, cykloalkyl, heterocyklus nebo aryl; a

X a Y jsou každý nezávisle =0 nebo nejsou přítomny; nebo její farmaceuticky přijatelné soli, proléčiva nebo solváty.

2. Sloučenina podle nároku 1, kde R je H, nebo její farmaceuticky přijatelné soli, proléčiva nebo solváty.

3. Sloučenina podle nároku 1, kde alespoň jeden z R a R’ je alkyl-0R_x, kde R_x je H, nebo její farmaceuticky přijatelné soli, φφ φ φ φ

Φ φ φ φ φ φ proléčiva nebo solvaty.

4. Sloučenina podle nároku 1, kde alespoň jeden z R a R' je alkyl-0R_i, kde uvedený alkyl-0R_x je vybrán ze skupiny zahrnující -C(CH) CHOH, -CH(CH )CH OH, -CHCHOH, -C(CH )(CH OH) ,

-C(CH₃)₂-O-CH_a-O-CH₃, -C(CH₃)₂CH_a-O-CH₂-O-CH₃,

-C(CH₃)₂ CH₂-O-acy1, -C(CH₃)₂-S-CH₂-O-CH₃,

-C(CH )CH -S-CH -O-CH , -C(CH ) -O-CH -S-CH ,

3 2 2 2 3 32 2 3

-C(CH ) CH -O-CH -S-CH a -C(CH ) CH -S-acyl, nebo její

322 2 3 322 farmaceuticky přijatelné soli, proléčiva nebo solvaty.

5. Sloučenina podle nároku 1, kde alespoň jeden z R a R’ je cykloalkyl substituovaný (C_x-C_e)alkylem nebo (C₁-C_e)alkyl-OH, kde uvedený cykloalkyl je vybrán ze skupiny skládající se z:

CHzOH

CHa CHa CHa CHa CHjOH _t CHa .CHjOH » nebo její farmaceuticky přijatelné soli, proléčiva nebo solvaty.

6. Sloučenina podle nároku 1, kde alespoň jeden z R a R' je heterocyklus substituovaný (C_l-C_e)alkylem nebo (C_l-C₆)alkyl-OH, kde uvedený heterocyklus je vybrán ze skupiny skládající se z:

H₃C h₃c h₃c

CH₃ k .O· ,CH₃ h₃C

CH₃ HaC o

(

N—R₃· t

N—R₃ ·· ·

99 9 99 99 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9999 99 9 9 99 99 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 999 9 9 99 kde R₃ je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, cykloalkyl, heterocyklus nebo aryl, acyl nebo sulfonyl, nebo její farmaceuticky přijatelné soli, proléčiva nebo solvaty.

7. Sloučenina podle nároku 1, kde uvedená sloučenina má vzorec 21:

nebo její farmaceuticky přijatelné soli, proléčiva nebo solvaty.

8. Sloučenina podle nároku 2, kde R' je cykloalkyl substituovaný (C -C )alkylem nebo (C_i-C_e)alkyl-OH, kde uvedený cykloalkyl je vybrán ze skupiny skládající se z:

nebo její farmaceuticky přijatelné soli, proléčiva nebo solvaty.

9. Sůl podle nároku 1 mající vzorec (9b):

• CH3SO3H

9b

10. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje:

(a) účinné množství sloučeniny podle nároku 1; a (b) farmaceuticky přijatelný nosič.

11. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje:

(a) účinné množství sloučeniny podle nároku 7; a (b) farmaceuticky přijatelný nosič.

12. Způsob pro inhibici HIV proteasy vyznačující se tím, že obsahuje podání účinného množství sloučeniny podle nároku 1 nebo její farmaceuticky přijatelného proléčiva, soli nebo solvatu hostiteli.

13. Způsob pro inhibici HIV proteasy vyznačující se tím, že obsahuje podání účinného množství sloučeniny podle nároku 7 nebo její farmaceuticky přijatelného proléčiva, soli nebo solvatu hostiteli.

14. Sloučenina podle nároku 1,

15. Sloučenina podle nároku 1,

16. Sloučenina podle nároku 1,

17. Sloučenina podle nároku 1,

18. Sloučenina podle nároku 7,

19. Sloučenina podle nároku 7,

20. Sloučenina podle nároku 7, která má čistotu vyšší než 90%.

která má čistotu alespoň 95%.

která má čistotu alespoň 97%.

která má čistotu alespoň 99%.

která má čistotu vyšší než 90%.

která má čistotu alespoň 95%.

která má čistotu alespoň 97%.

21. Sloučenina podle nároku 7, která má čistotu alespoň 99%.

22. Farmaceutický prostředek podle nároku 10 vyznačující se tím, že sloučenina má čistotu vyšší než 90%.

i*

23. Farmaceutický prostředek podle nároku 10 vyznačující se t í ta, že sloučenina má čistotu ’ alespoň 95%.

24. Farmaceutický prostředek podle nároku 10 vyznačující se tím, že sloučenina má čistotu alespoň 97%. ^:

25. Farmaceutický prostředek podle nároku 10 vyznačující se tím, že sloučenina má čistotu alespoň 99%.

26. Farmaceutický prostředek podle nároku 11 vyznačuj ír c í se tím, že sloučenina má čistotu vyšší než 90%.

27. Farmaceutický prostředek podle nároku 11 vyznačující se tím, že sloučenina má Čistotu alespoň 95%.

*

28. Farmaceutický prostředek podle nároku 11 ^J vyznačující se tím, že sloučenina má čistotu alespoň 97%.

29. Farmaceutický prostředek podle nároku 11 vyznačující se tím, že sloučenina má čistotu alespóft 99%.

*· · ř · · • · · • ···<

• · » · · * · ·· • · • · • 4 4 · • · · · • 4 4 ·

9 9 9 0 9

9 9 9 9

99 09

30. Způsob podle nároku 12 vyznačující se tím, že sloučenina má čistotu vyšší než 90%.

31. Způsob podle nároku 12 vyznačující se tím, že sloučenina má čistotu alespoň 95%.

32. Způsob podle nároku 12 vyznačující se tím, že sloučenina má čistotu alespoň 97%.

33. Způsób podle nároku 12 vyznačující se tím, že sloučenina má čistotu alespoň 99%.

34. Způsob podle nároku 13 vyznačující se tím, že sloučenina má čistotu vyšší než 90%.

35. Způsob podle nároku 13 vyznačující se tím, že sloučenina má čistotu alespoň 95%.

36. Způsob podle nároku 13 vyznačující se tím, že sloučenina má čistotu alespoň 97%.

37. Způsob podle nároku 13 vyznačující se tím, že sloučenina má čistotu alespoň 99%.