NO315555B1 - HIV proteaseinhibitorer, salt og anvendelse derav, samt farmasöytisk preparat - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en ny serie av kjemiske forbindelser nyttige som HIV proteaseinhibitorer. Foreliggende opprinnelse vedrører også salt og anvendelse av forbindelsen, samt farmasøytisk preparat.

Erhvervet immunsviktsyndrom (AIDS) er en relativt ny anerkjent sykdom eller

tilstand. AIDS forårsaker en gradvis nedbrytning av kroppens immunsystem samt progressiv reduksjon av sentral- og nervesystemer. Pga at dets opprinnelige anerkjennelse i tidlige 1980-årene har AIDS blitt spredt hurtig og har nå nådd epidemiske proposjoner innenfor et relativt begrenset segment av populasjonen. Intensiv forskning har ført til oppdagelsen av det ansvarlige midlet, humant T-lymfotrofisk retrovirus III (HTLV-III), nå vanligvis referert som humman immunsviktvirus eller HIV.

HIV er et medlem av klassen av vimser kjent som retrovimser. Det retrovirale genomet består av RNA som blir omdannet til DNA ved revers transkripsjon. Dette retrovirale DNA blir deretter stabilt integrert inn i vertscellens kromosom og ved anvendelse av replikerende prosesser til vertscellene produseres nye retrovirale partikler og infeksjonene spres til andre celler. HIV synes å ha en spesiell affinitet for human T-4 lymfocyttcelle som spiller en vital rolle i kroppens immunsystem. HIV-infeksjon av disse hvite blodcellene tapper denne populasjonen av hvite celler. Til slutt blir immunsystemet inoperativt og ineffektivt overfor forskjellige opportunistiske sykdommer så som pneumocystisk carini pneumoni, Kaposis sarkom og cancer i lymfesystemet.

Til tross for at den nøyaktige mekanismen for dannelse og virkning av HIV-viruset ikke er kjent har identifikasjon av vimset ført til en viss progresjon ved kontrollering av sykdommen. F.eks er medikamentet azidotymidin (AZT) funnet å være effektivt for inhibering av revers transkripsjon av det retrovirale genomet til HIV-vimset og gir deretter følgelig et mål på kontroll, men ikke en helbredelse av pasienter påvirket av AIDS. Det letes fortsatt etter medikamenter som kan lege eller i det minste tilveiebringe et forbedret mål og en kontroll av det dødelige HIV-vimset.

Retroviral replikasjon tilveiebringer mtinemessig post-translasjonell prosessering av polyproteiner. Denne prosesseringen blir oppnådd ved viralt kodet HIV proteaseenzym.

Dette tilveiebringer modne polypeptider som deretter er behjelpelige med dannelsen og funksjonen til infeksiøst vims. Dersom denne molekylære prosesseringen ødelegges vil den normale produksjon av HIV avsluttes. Inhibitorer av HIV protease kan følgelig virke som anti-HIV virale midler.

HIV protease er et av de translaterte produktene fra HIV strukturert protein pol gen. Denne retrovirale proteasen spalter spesifikt andre strukturelle polypeptider ved bestemte seter for å frigjøre disse nye aktiverte strukturelle proteinene og enzymene, for derved å gjøre viruset replikasjons-kompetent. Inhibisjon av HIV proteasen ved potente forbindelser kan forhindre proviral integrasjon av infiserte T-lymfocytter i løpet av den tidlige fasen av HIV-1 livssyklusen og også inhibere viral proteolytisk prosessering i løpet av det senere stadiet. I tillegg kan proteaseinhibitorer ha den fordelen av å være lettere tilgjengelig, leve lengre i virus og være mindre toksisk enn for tiden tilgjengelige medikamenter som muligens er forårsaket av deres spesifisitet for den retrovirale proteasen.

I henhold til foreliggende opprinnelse er det tilveiebragt en ny klasse av kjemiske forbindelser som kan inhibere og/eller blokkere aktiviteten til HIV protease og som reduserer proliferasjonen av HIV-viruset, og farmasøytiske blandinger inneholdende disse forbindelsene.

Foreliggende oppfinnelse vedrører forbindelser som faller inn under formel (9) nedenfor og farmasøytiske akseptable salter og solvater derav, som inhiberer proteasen kodet av human immunsviktvirus (HIV) type 1 (HTV-1) eller type 2 (HIV-2). Disse forbindelsene er nyttige for behandling av infeksjon med HTV og behandling av erhvervet immunsviktsyndrom (AIDS). Forbindelsene, deres farmasøytiske akseptable salter og farmasøytiske blandinger ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli anvendt alene eller i kombinasjon med andre antivirale midler, immunmodulatorer, antibiotika eller vaksiner. Forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse kan også bli anvendt som promedikamenter. Fremgangsmåte for behandling av AIDS, fremgangsmåte for behandling av HIV-infeksjon og fremgangsmåte for inhibering av HIV protease er beskrevet.

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse er kjennetegnet ved å ha

formel (9)

hvor

RerH;

R' er en (Ci-C6)alkyl-OR]-gruppe;

hvor R| er H;

eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller solvat derav.

Det er videre foretrukket en forbindelse kjennetegnet ved at den har formelen:

eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller solvat derav.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre salt ifølge krav 1, kjennetegnet ved at det har formelen

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre farmasøytiske formuleringer omfattende en effektiv mengde av en forbindelse med formel (9) og en farmasøytisk akseptabel bærer.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre farmasøytisk preparat kjennetegnet ved at det omfatter:

(a) en effektiv mengde av forbindelsen ifølge krav 2; og

(b) en farmasøytisk akseptabel bærer for denne.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre anvendelse av en effektiv mengde av en forbindelse ifølge krav 1 eller et farmasøytisk akseptabelt promedikament, salt eller solvat derav for fremstilling av et farmasøytisk preparat for inhibering av HIV protease.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre anvendelse av en effektiv mengde av en forbindelse ifølge krav 2 eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller solvat derav for fremstilling av et farmasøytisk preparat for inhibering av HIV protease.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer nye forbindelser som faller under formel (9),

som beskrevet ovenfor, som er nyttig for behandling av HIV-infeksjon og/eller AIDS.

Søkerene inkorporerer som referanse US-patent nr. 5.484.926, US-patentsøknad nr. 08/708.411 og 08/708.607 og japansk patentsøknad nr. JP 95-248183 og JP 95-248184, med den forutsetningen at definisjonene av preferanser, termer, variabler, markører og lignende anvendt i hver søknad bare kan anvendes i den tilsvarende beskrivelsen fra den søknaden.

Pga at hver av de ovennevnte søknadene inkorporert heri som referanse ble fremstilt separat kan de opprinnelige søknadene i noen tilfeller anvende samme term, markør eller variabel, men hvor det menes er noe annet. F.eks blir variablen "X" anvendt i hver søknad, men hver søknad har egne bestemte definisjoner på substituenten eller delen representert ved denne variabelen. Det er kjent for fagfolk innenfor dette området at termer, markører og variabler i hver søknad inkorporert som referanse er kun begrenset til beskrivelsen fra den søknaden, og kan bli erstattet med andre egnede termer, markører og variabler eller lignende som representerer de bestemte substituentene og delene. Fagfolk vet dessuten at et hvilket som helst egnet sett av tenner, markører og variabler kan bli anvendt for generisk eller mer

spesifikk representere gjenstanden beskrevet i foreliggende søknad, inkludert termer,

i markører, variabler og lignende generelt anvendbart i de inkorporerte beskrivelsene av ovennevnte søknader og følgende beskrivelse.

Forbindelsene med formel (9) kan være promedikamenter, som kan virke slik at de forbedrer de farmasøytiske egenskapene til forbindelsene, så som farmakokinetiske

egenskaper, f.eks forbedret biotilgjengelighet eller oppløselighet. Fremstilling av promedikamentene kan bli utført ifølge standard fremgangsmåte kjent for fagfolk innenfor dette området.

Alle temperaturer angitt heri er i grader Celsius (°C). Alle måleenheter anvendt heri er

i vektenheter med unntagelse av væsker som er i volumenheter.

Betegnelsen "alkyl" som anvendt heri refererer til lineære eller forgrenete grupper, med en til seks, og mest foretrukket fra en til fire karbonatomer. Betegnelsen "Ci-Cg-alkyl"

representerer en lineær eller forgrenet alkylkjede med fra en til seks karbonatomer. Eksempelvis innbefatter Ci-C6-alkylgrupper metyl, etyl, n-propyl, isopropyl, butyl, isobutyl,

sekk.butyl, t-butyl, pentyl, noe-pentyl, heksyl, isoheksyl og lignende. Betegnelsen "C1-C6-alkyl" innbefatter innenfor definisjonen derav betegnelsen "C|-C4-alkyl".

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse har minst fem asymmetriske sentre angitt med en stjerne i formel (9) nedenfor

Som en konsekvens av disse asymmetriske sentrene kan forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse oppstå i hvilke som helst mulige stereoisomeriske former, og kan bli anvendt i blandinger av stereoisomerer, som kan være optisk aktive eller racemiske, eller kan bli anvendt alene som vesentlig rene stereoisomerer, dvs minst 95% renhet. Alle asymmetriske formene, individuelle stereoisomerer og kombinasjoner derav hører inn under rammen av foreliggende oppfinnelse.

Individuelle stereoisomerer kan bli fremstilt fra deres respektive forløpere ifølge fremgangsmåtene beskrevet ovenfor, ved oppløsning av de racemiske blandingene eller ved separering av diastereomerene. Oppløsningen kan bli utført i nærvær av et oppløsningsmiddel, ved kromatografi eller ved gjentatt krystallisering eller ved en kombinasjon av disse teknikkene som er kjent innenfor fagområdet. Ytterligere detaljer med hensyn på oppløsninger finnes i Jacques et al., Enantiomers, Racemates, and Resolutions, John Wiley & Sons 1981.

Foretrukne av forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse er vesentlig rene, dvs med 50% renhet. Det er foretrukket at forbindelsene har en renhet på minst 75%. Det er mer foretrukket at forbindelsene har en renhet på mer enn 90%. Det er ytterligere mer foretrukket at forbindelsene har en renhet på minst 95%, mer foretrukket minst 97% og ytterligere mer foretrukket minst 99% renhet.

Som nevnt ovenfor innbefatter oppfinnelsen farmasøytiske akseptable salter av forbindelser definert ved formel (9). En forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse kan inneha tilstrekkelige sure, tilstrekkelige basiske eller både funksjonelle grupper, og følgelig reagere med et hvilket som helst antall uorganiske eller organiske baser, og uorganiske og organiske syrer, for å danne et farmasøytisk akseptabelt salt.

Betegnelsen "farmasøytisk akseptabel salt", som anvendt heri, refererer til salter av forbindelser med ovenfor angitte formel som er vesentlig ikke-toksiske for levende organismer. Eksempler på farmasøytisk akseptable salter innbefatter salter fremstilt ved omsetning av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse med en mineral eller organisk syre eller en uorganisk base. Reaktantene blir generelt kombinert i et felles løsningsmiddel så som dietyleter eller benzen, for syreaddisjonssalter eller vann eller alkoholer for baseaddisjonssalter. Salter presipiteres normalt ut av løsningen i løpet av en time til omtrent ti dager og kan bli isolert ved filtrering eller andre konvensjonelle fremgangsmåter. Slike salter er kjent som syreaddisjons- og baseaddisjonssalter.

Syrene som kan bli anvendt for å danne syreaddisjonssalter er uorganiske syrer som saltsyre, hydrobromsyre, hydrojodsyre, svovelsyre, fosforsyre og lignende, og organiske syrer så som p-toluensulfonsyre, metansulfonsyre, oksalsyre, p-bromfenylsulfonsyre, karbonsyre, ravsyre, sitronsyre, benzosyre, eddiksyre og lignende.

Eksempler på farmasøytiske akseptable salter er sulfat, pyrosulfat, bisulfat, sulfit, bisulfit, fosfat, monohydrogenfosfat, dihydrogenfosfat, metafosfat, pyrofosfat, klorid, bromid, jodid, acetat, propionat, dekanoat, kaprylat, akrylat, format, isobutyrat, kaproat, heptanoat, propiolat, oksalat, malonat, suksinat, suberat, sebakat, fumarat, maleat, butyn-l,4-diat, heksyn-l,6-dioat, benzoat, klorbenzoat, metylbenzoat, dinitrobenzoat, hydroksybenzoat, metoksybenzoat, ftalat, sulfonat, xylensulfonat, fenylacetat, fenylpropionat, fenylbutyrat, sitrat, laktat, g-hydroksybutyrat, glykollat, tartrat, metansulfoant, propansulfonat, naftalen-1-sulfonat, naftalen-2-sulfonat, mandelat og lignende.

Foretrukne farmasøytiske akseptable syreaddisjonssalter er de som blir dannet med mineralsyrer så som saltsyre og hydrobromsyre, og de som blir dannet med organiske syrer så som maleinsyre og metansulfonsyre.

Base addisjonssalter innbefatter de som er avledet fra uorganiske og organiske baser, så som ammonium eller alkali eller jordalkalimetallhydroksider, karbonater, bikarbonater og lignende. Baser nyttige for fremstilling av saltene ifølge oppfinnelsen innbefatter følgelig natriumhydroksid, kaliumhydroksid, ammoniumhydroksid, kaliumkarbonat, natriumkarbonat, natriumbikarbonat, kaliumbikarbonat, kalsiumhydroksid, kalsiumkarbonat og lignende. Kalium- og natriumsaltformene er spesielt foretrukne.

Et "farmasøytisk akseptabelt solvat" er antatt å innbefatte et solvat som beholder den biologiske effektiviteten og egenskapene til biologisk aktive komponenter til forbindelsene med formel (9).

Eksempler på farmasøytiske akseptable solvater innbefatter, men er ikke begrenset til, forbindelser med formel (9) i kombinasjon med vann, isopropanol, etanol, metanol, DMSO, etylacetat, eddiksyre eller etanolamin.

Det er å bemerke at det bestemte motionet som danner en del av et hvilket som helst salt ifølge oppfinnelsen er ikke av kritisk natur dersom saltet i sin helhet er farmakologisk akseptabelt og dersom motionet ikke bidrar med uønskede kvaliteter til saltet som en helhet.

En foretrukket forbindelse er forbindelse 21

[3S-[2(2S<*>,3S<*>),3-alfa,4a beta, 8a beta]]-N-(l,l-dimetyl-2-hydroksyetyl)dekahydro-2-[2-hydroksy-3 - [(3-hydorksy-2-metylberø^

En fremgangsmåte for fremstilling av forbindelse 21 er angitt nedenfor. Forbindelse 21 er også blitt oppnådd som en metabolitt fra plasma til pasienter som blir administrert [3S-(3R,4aR*, 8aR*,2'S*,3'S*)]-2-[2,-hydroksy-3'-fenyltiometyl-4'-aza-5'-okso-5'-(2"-metyl-3"-hydroksyfenyl)pentyl]dikahydroisokinolin-3-N-t-butylkarboksamidmetansulfonsyresalt, som er beskrevet i US-patent nr. 5.484.926.

Forbindelsene med formel (9) kan bli fremstilt ifølge følgende reaksjonsskjema I.

Reaksjonsskjema I

Forbindelse la, perhydroisokinolin som er kommersielt tilgjengelig fra NSC Technologies (Chicago, IL) eller Procos SpA (Milan, Italia) blir utsatt for forlenget sur hydrolyse i trinn la for å oppnå forbindelse 2a. En mengde uorganiske syrer som ble anvendt i enten en vandig/organisk løsningsmiddelblanding eller i vann alene ved temperaturer over 50°C. Et eksempel på en slik uorganisk syre er 6N vandig HG. Substituenter for forbindelse la innbefatter følgende estere lb, tioestere lc eller andre amider ld:

hvor Z, Zi og Z2 hver uavhengig kan være alkyl, sykloalkyl, heterosyklisk gruppe eller aryl.

Forbindelse 2A blir deretter beskyttet ved aminnitrogen for å oppnå forbindelse 2b i trinn lb. Beskyttelsesgruppen Rp er definert som en egnet konjugerende gruppe for å unngå uønsket dekomponering av aktiverte karboksylatderivater av forbindelse 2b i trinn 2. Slike beskyttelsesgrupper kan vanligvis være av karbamatopprinnelse, med en generell struktur med formel 11:

Identiteten til R" i formel 11 kan være en hvilken som helst alkyl, sykloalkyl, aryl eller heterosyklisk gruppe som lett kan bli fjernet i et avbeskyttelsestrinn etter trinn 2. Eksempler på R" innbefatter, men er ikke begrenset til metyl, etyl, propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, t-butyl eller høyere forgrenete eller lineære alkyl, 2,2,2-trikloretyl, 2-trimetylsilyletyl, allyl, fenyl, substituert fenyl, benzyl, substituert benzyl, 9-fluorenylmetyl, 9-antrylmetyl og høyere polysykliske aromatisk ringsystem. Følgende materialer, som definert nedenfor, kan bli oppnådd fra Aldrich Chemical Co. (Sigma Aldrich Fluka):

Slike beskyttelsesgrupper kan vanligvis bli innført ifølge en acyleringsreaksjon av tilsvarende halogenformatester 12a eller et dikarbonat 12b: i nærvær av en egnet base i typiske organiske løsningsmidler for disse reaksjonstypene så som halogenerte løsningsmidler, etere og hydrokarboner. Slike baser er vanligvis uorganiske, så som metallhydroksider, bikarbonater og karbonater eller organiske baser så som aminer som trietylamin, dietylamin, dietylisopropylamin, l,8-diazabisyklo[2.2.2]oktan (DABCO) eller relaterte di- eller trialkylaminer, samt amidinbaser som l,8-diazabisyklo[5.4.0]undek-7-en (DBU) og l,8-diazabisyklo[4.3.0]non-5-en (DBN). Følgende materialer, som definert nedenfor, kan bli oppnådd fra Aldrich Chemical Co. (Sigma Aldrich Fluka):

Disse reaksjonene blir vanligvis kjørt fra under romtemperatur til omtrent 100°C.

Amidkoplingstrinn 2 kan bli oppnådd på en hvilken som helst måte avhengig av hvordan karboksylgruppen er aktivert. En gruppe J blir innført i trinn 2 ved omsetning av karboksylsyre 2b for å danne aktivert derivat 2C.

Gruppen J kan være hvilken som helst av en mengde avspaltbare grupper så som alkoksy, hydroksy, halogen, pseudohalogen (inkludert azid, cyanid, isocyanat og isotiocyanat), alkyl eller arensulfonat, aromatisk heterosyklisk gruppe (bundet gjennom et heteroatom) og N-hydroksyheterosyklisk gruppe, inkludert hydroksysuksinimid eller hydroksybenzotriazolester. De følgende definisjoner gjelder for ovennevnte betegnelser:

Acylhalider (2c, J = halogen) kan bli fremstilt ved anvendelse av uorganiske halogenerende midler så som tionylklorid eller bromid, fosfortriklorid eller bromid, fosforpentaklorid eller bromid eller organisk midler så som oksalylklorid eller triklorisocyanursyre. Estere (2c, J = OR") (R" er definer ovenfor) og kan bli fremstilt på forskjellige måter begynnende fra syreklorid 2c hvor J er Cl ved kombinasjon med ønsket alkohol i nærvær av en organisk eller uorganisk base tidligere angitt for acylering av forbindelse 12a eller forbindelse 12b. Alternativt kan esteren bli fremstilt ved syre-fremmed forestring i nærvær av ønsket alkohol. Sulfonater (2c, J = OSO2W1, hvor W[ er alkyl eller aryl) blir vanligvis dannet ved omsetning av karboksylsyre 2b med alkyl eller arylsulfonylklorider i nærvær av en organisk aminbase så som trietylamin i et ikke-polart løsningsmiddel ved temperaturer under 0°C. Alkyl og arylsulfonyl er definert som følger:

Pseudohalogenderivater ifølge 2c (J = pseudohalogen) blir vanligvis fremstilt fra syrehalider 2c (J = halogen) ved onisetning med uorganisk pseudohalid i nærvær av en base. Slike baser innbefatter, men er ikke begrenset til metallhydroksider, bikarbonater og karbonater eller organiske baser så som aminer som trietylamin, dietylamin, dietylisopropylamin, l,8-diazabicyklo[2.2.2]oktan (DABCO) eller beslektede di- eller trialkylaminer, samt amidinbaser som l,8-diazabisyklo[5.4.0]undek-7-en (DBU) og 1,8-diazabisyklo[4.3.0]non-S-en (DBN). En spesielt foretrukket base er trietylamin. Heteroaromatiske derivater ifølge 2c blir også dannet fra syrehalidene 2c (J = halogen), ved anvendelse av den spesifikke heteroaromatiske forbindelsen i nærvær av en aminbase i et upolart løsningsmiddel. N-hydroksyheterosykliske derivater av 2c kan bli dannet fra syrehalider som ovenfor og kan også bli dannet ved anvendelse av alkylkarbodiimider (alkyl-n=C=N-alkyl, hvor alkylgruppene kan være like eller forskjellige) eller arylkarbodiimider (aryl-N=C=N-aryl, hvor arylgruppene kan være like eller forskjellige) og en aminbase som kondenseringsmidler.

Primært eller sekundært amin (vist over pilen i trinn 2 ifølge skjema I) anvendt i koplingsprosessen kan inkorporere egnede beskyttelsesgrupper, avhengig av funksjonaliteten tilstede i aminet og koplingsmetoden anvendt Koplingsmetoden ifølge 2c med et primært eller sekundært amin kan bli utført på forskjellige måter avhengig av identiteten til J. Når en fri syre blir anvendt (2c, J = OH) kan koplingen bli utført ved anvendelse av karbodiimidbaserte fremgangsmåter ved anvendelse av hvilke som helst av de vanlige reagensene i denne klassen, inkludert disykloheksylkarbodiimid eller beslektede dialkylkarbodiimider, EDC (salter av l-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimid) eller beslektede vann-oppløselige reagenser sammen med en organisk aminbase i polare organisk løsningsmidler så som dioksan, DMF, NMP og acetonitril i nærvær av en N-hydroksyheterosyklisk forbindelse så som N-hydroksysuksinimid eller 3-hydroksybenzotriazol. Alternativt kan halogenformatestere, så som 12d, blir anvendt for temporært å aktivere syren for å tilveiebringe blandede anhydrider med generell formel 2d.

Slike halogenformatestere er vanligvis som vist i 12d ovenfor og innbefatter metyl-, etyl-, isopropyl-, isobutyl-, n-butyl-, fenyl og beslektede alkyl- og arylklorformater definert nedenfor.

Formel 2d er et mulig mellomprodukt i trinnet fra formel 2b til formel 3. Formel 2d er et mellomprodukt, men fremgangsmåten som er beskrevet her resulterer i formel 3, uten isolering av formel 2d.

Disse reaksjonene blir vanligvis utført i en mengde upolare organiske løsningsmidler som halogenkarboner og etere så som dietyleter, metyl t-butyleter, diisopropyleter, dioksan og THF ved temperaturer under 0°C ledsaget av en organisk aminbase så som trietylamin, dietylamin, dietylisopropylamin, DABCO eller relaterte di- eller trialkylaminer, samt amidinbaser som DBU og DBN.

Når J i forbindelse 2c er en alkyl eller arensutfonat (J = OSO2R eller OSChAr), kan koplingen bli utført i forskjellige upolare organiske løsningsmidler som halogenkarboner og etere, så som dietyleter, metyl t-butyleter, diisopropyleter, doksan og THF ved temperaturer under 0°C, ledsaget av en organisk aminbase så som trietylamin, dietylamin, dietylisopropylamin, DABCO eller relaterte di- eller trialkylaminer, samt amidinbaser som DBU og DBN.

Når J i forbindelse 2c er et halogen eller pseudohalogen kan koplingen bli utført i de fleste vanlige organiske løsningsmidlene så som THF, dietyleter, dioksan, metyl t-butylester eller andre etere; aceton, sykloheksanon, metylisobutylketon og andre ketoner; etere så som etyl,metyl og isopropylacetat; halogenerte løsnings-midler så som halogenerte metaner og etaner, klorbenzen og andre halogenerte benzener; nitriler så som acetonitril og propionitril; lavere alkoholer så som etanol, isopropanol, t-butanol og relaterte alkoholer; og polare organiske løsningsmidler så som dimetylformamid, dimetylsulfoksid, N-metyl-2-pyrrolidin og relaterte amid-inneholdende løsningsmidler. En base blir ofte anvendt og kan være en hvilken som helst av et antall uorganiske baser så som metallhydroksider, bikarbonater og karbonater eller organiske baser så som aminer som trietylamin, dietylamin, dietylisopropylamin, DABCO eller relaterte di- eller trialkylaminer, samt amidinbaser som DBU og DBN.

Fagfolk innenfor dette området vil kunne utføre amidkoplings- trinn 2 med andre mulige J-grupper.

I trinn 3 kan fjerning av beskyttelsesgruppen bli oppnådd ved anvendelse av hvilken som helst standard fremgangsmåte for avbeskyttelse av en bestemt klasse av beskyttelsesgruppen. Enkle alkyl- og substituerte alkylkarbamater kan bli fjernet med vandige løsninger av basen ved temperaturer opp til 100°C ved anvendelse av hvilke som helst av de vanlige uorganiske metallhydroksidene så som natrium-, litium-, kalium- eller bariumhydroksid eller hydroksider av andre metaller i minst støkiometriske mengder. Karbamatbeskyttelsesgruppene som inneholder benzylgruppene bundet til oksygen kan bli fjernet ved hydrogenolyse med en palladium eller platina katalysator. Alternativt kan vandige basehydrolyse ble anvendt ved temperature opp til omtrent 100°C ved anvendelse av hvilke som helst av de vanlige uorganiske metallhydroksidene så som natrium-, litium-, kalium- eller barium-hydroksid eller hydroksider av andre metaller i minst støkiometriske mengder. En mengde vannfrie syrer kan også bli anvendt for avbeskyttelse av benzyl-baserte karbamater, inkludert HC1, HBr og HI. Lewis' syrer av bor og aluminium så som AICI3, BBr3, BCI3 i upolare løsningsmidler er også effektive. Visse substituerte benzyl, aryl eller alkylgrupper hvor det spesifikke substitusjonsmønsteret er valgt for dets evne til å bli fjernet under spesifikke betingelser kan også bli anvendt. F.eks er 2-trirnetylsilyletylkarbonylgruppen (Teoc) en beskyttelsesgruppe konstruert for å dra fordel av den spesifikke reaktiviteten til 2-trimetylsilyletylgruppen i avbeskyttelsesprosessen. 2-trimetylsilyletylkarbonylklorid kan bli anvendt for å beskytte aminnitrogen og kan senere bli fjernet ved anvendelse av fluoridion-kilder så som HF eller tetraalkylammoniumfluoridsalter.

I trinn 4 er perhydroisokinolindelen ifølge formel 4 koplet til kloralkohol (forbindelse 5, skjema I) via et epoksid-mellomprodukt (13) dannet via base-indusert lukning av tilstøtende klorhydrin-funksjonalitet.

Forbindelse 5 blir produsert av Kaneka industries, Japan. Flere lukke-åpne prosedyrer ved å begynne fra forbindelse 5 -» forbindelse 13 -> forbindelse 6 kan bli anvendt. Epoksid 13 kan bli isolert eller kan bli omsatt med 4 tilsatt enten etter dannelsen av 13 eller 4 kan være tilstede fra begynnelsen av sekvensen. Epoksid 13 kan bli dannet ved anvendelse av uorganiske baser så som metallhydroksider, karbonater og bikarbonater i løsningsmidler så som alkoholer som metanoletanol eller isopropylalkohol, etere så som THF og dioksan eller blandinger av de to. Epoksid kan også bli dannet i et 2-fase løsingsmiddelsystem bestående av vann og et halogenkarbonløsemiddel så som diklormetan sammen med basen. En fase-overføringskatalysator så som tetraalkylammoniumsalt kan bli anvendt for å lette prosessen. Prosessen ved å åpne epoksid 13 med forbindelse 4 blir oppnådd i alkoholløsningsmidler eller blandinger av en alkohol og et annet løsningsmiddel som kan være et eter eller dipolart aprotisk løsningsmiddel så som dimetylformamid eller dimetylsulfoksid. Åpning av epoksid 13 med forbindelse 4 for å tilveiebringe forbindelse 6 blir fortrinnsvis utført over en periode på 2-7 timer ved 50-60°C.

I trinn 5 kan karbobenzyloksygruppen bli fjernet for å tilveiebringe fritt amin 7. Det kan bli utført ved anvendelse av HBr i eddiksyre ved anvendelse av koløsningsmidler så som halogenkarboner. Det kan også bli utført ved anvendelse av halider av bor så som BBtj og BCI3 eller alkylsubstituerte borhalider så som dimetylborbromid i halogenkarbonløsningsmidler som kloroform og diklormetan ved temperaturer varierende fra 0°C opp til romtemperatur. Alternativt kan karbobenzyloksygruppen bli fjernet ved hydrolyse ved anvendelse av vandig/alkoholholdige løsninger av metallhydroksider som barium, natrium, litium eller kaliumhydroksid ved temperaturer over romtemperatur i flere timer.

Trinn 6a er kopling av benzosyrederivater med formel 8 for å tilveiebringe 9a. I formel 8 kan Q være en avspaltbar gruppe. Q kan være hvilket som helst av avspaltbare grupper diskutert ovenfor for gruppe J. Forbindelsene med formel 8 hvor Q = OH eller Cl er kommersielt tilgjengelig fra EMS Dottikon, Lenzburg, Sveits og Sugai Chemical Industries, Ltd. i Japan. Koplingen kan bli utført på forskjellige måter avhengig av identiteten til Q. Når en fri syre blir anvendt (Q = OH) kan koplingen bli utført ved anvendelse av karbodiimidbaserte metoder ved anvendelse av hvilke som helst av de vanlige reagensene fra denne klassen inkludert disykloheksylkarbodiimid eller relaterte dialkylkarbodiimider, EDC (salter av l-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimid eller relaterte vannopptøselige reagenser sammen med en organisk aminbase i polare organiske løsningsmidler så som dioksan, DMF, NMP og acetonitril i nærvær av et N-hydroksyheterosyklisk gruppe inkludert N-hydroksysuksinimid eller 3-hydroksybenzotriazol. Når Q = et halogen eller pseudohalogen kan koplingen bli utført i de mest vanlige organiske løsningsmidlene så som THF, dietyleter, dioksan, metyl t-butyleter eller andre etere; aceton, sykloheksanon, metylisobutylketon og andre ketoner; estere så som etyl, metyl og isopropylacetat, halogenerte løsningsmidler så som halogenerte metaner og etaner, klorbenzen og andre halogenerte benzer, nitriler så som acetonitril og propionitril; lavere alkoholer så som etanol, isopropanol, t-butanol og relaterte alkoholer, og polare organiske løsningsmidler så som dimetylformamid, dimetylsulfoksid, N-metyl-2-pyrrolidon og relaterte amid-inneholdende løsningsmidler. En base blir ofte anvendt og kan være hvilket som helst av et antall uorganiske baser så som metallhydroksider, bikarbonater og karbonater eller organiske baser så som aminer som trietylamin, dietylamin, dietylisopropylamin, DABCO eller relaterte di- eller trialkylaminer, samt amidinbaser som DBU og DBN.

Acetatfjerningen blir oppnådd i trinn 6b med vandige eller alkoholiske løsninger av uorganiske baser så som metallhydroksider, karbonater og bikarbonater ved romtemperaturer opp til 100°C. Dersom det er en beskyttet funksjonalitet på karboksamidgruppen bundet til perhydroisokinolinringsystemet blir den best fjernet ved dette punktet (i løpet av eller etter trinn 6b). Naturen til dette trinnet er avhengig av den nøyaktige identiteten til beskyttelsesgruppen.

En foretrukket fremgangsmåte for å oppnå hele fremgangsmåten vist i skjema I er vist i skjema II.

Cbz-beskyttet aminosyre 15 ble koplet med amin 22 for å tilveiebringe amin 16. Cbz-gruppen ble fjernet ved hydrogenering for å tilveiebringe 17.

Dette ble koplet med kloralkohol via epoxidet ved anvendelse av in situ prosedyren for å tilveiebringe addukt 18. Konvensjonell avbeskyttelse med base og kopling av fritt primæramin med syreklorid 20 ga opphav til amid 21. Detaljer angående denne fremgangsmåten er angitt nedenfor i eksemplene 1 A til F. Bokstavene A til F i skjema II tilsvarer de i eksemplene 1 A til F nedenfor.

Følgende eksempler illustrerer aspektene ifølge oppfinnelse. Forkortelsene for betegnelsene smeltepunkt, nukleær magnetisk resonansspektre, elektron impact massespektre, felt-desorpsjons massespektre, fast atom bombardment massespektre, infrarøde spektre, ultrafiolette spektre, elementanalyse, høy ytelse væskekromatografi og tynnsjiktskromatografi er henholdsvis sm.p., NMR, EIMS, MS(FD), MS(FAB), IR, UV, analyse, HPLC og TLC. I tillegg er absorpsjonsmaksimum oppført for IR-spektrene de av interesse, og ikke alle observerte maksimum.

I sammenheng med NMR-spektrene blir følgende forkortelser anvendt: singlett (s), dublett (d), dublett av dubletter (dd), triplett (t), kvartett (q), multiplett (m), dublett av multidubletter (dm), bredsinglett (br.s), bred dublett (br.d), bred triplett (br.t) og bred multiplett (br.m). J indikerer koplingskonstanten i Hertz (Hz). Dersom ikke annet er angitt refererer NMR-data til den frie basen av gjeldende forbindelse.

NMR-spektre ble oppnådd på et General Electric QE-300 300MHz instrument. Kjemiske skift blir uttrykt i 5-verdier i ppm. Massespektre ble oppnådd på et VG ZAB-3 spektrometer ved Scripps Research Institute, La Jolla, Ca. Infra-røde spektre ble registrert på et Midac Corporation spektrometer. UV-spektrene ble oppnådd på et Varian Cary 3E instrument. Tynnsjiktskromatografi ble utført ved anvendelse av silikaskåler tilgjengelig fra E. Merck. Smeltepunkter ble målt på et Mettler FP62 instrument og ukorrigerte.

Eksempel 1

Fremgangsmåte for fremstilling av amid med formel 21

[3S-[2(2S<*>,3S<*>),3 alfa,4a beta, 8abeta]]-N-(l,l-dimetyl-2-hydroksyetyl)dekahydro-2-[2-hydroksy-3-[(3-hydroksy-2-metylbenzoyl)amino]-4-(fenyltio)butyl]-3-isokinolinkarboksaniid

A. Perhydrisokinolin (26,4 g, 111 mmol) (kommersielt tilgjengelig fra NSC Technologies (Chicago, IL) eller Procos SpA (Milan, Italia)) ble suspendert i vann (200 ml) og konsentrert vandig HC1 (200 ml). Denne blandingen ble oppvarmet til tilbakeløp og omrørt i 3 dager hvorpå den gikk i løsning. Løsningsmidlene ble fjernet under redusert trykk for tilveiebringing av et lysegult fast stoff. Det faste stoffet ble oppslemmet i 2-propanol (200 ml) og filtrert. Filtratet ble avdampet under redusert trykk til en olje. EtOAc (100 ml) og vann (100 ml) ble tilsatt og pH til løsningen ble bragt til 8,0 ved tilsetning av 2N vandig KOH. Benzylklorformat (15,8 ml, 111 mmol) ble tilsatt dråpevis i løpet av 30 min og pH ble holdt mellom 7 og 8 ved tilsetning av 2N vandig KOH. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 18 timer. EtOAc (200 ml) ble tilsatt og det organiske laget vasket med IN vandig HC1 (100 ml), og saltvann (100 ml). Det organiske laget ble tørket (MgS04), filtrert og avdampet under redusert trykk til en olje. Produktet ble renset ved silikagel-kromatografi, eluerende med 1:1 40-60 petroleumeter/EtOAc etterfulgt av 100% EtOAc. Fraksjonsinneholdende produkt ble samlet og avdampet under redusert trykk for å tilveiebringe en forbindelse 15 (11,3 g, 32%) som en farveløs olje: <!>H NMR (300 MHz, CDC13) 5 7,43-7,28 (m, 5 H), 5,17 (br s, 2 H), 4,76 (m, 1 H), 3,79 (m, 1 H), 3,33 (m, 1 H), 2,19 (m, 1 H), 1,96 (m, 1 H), 1,88-1,15 (m, 10 H).

B. 1 -hydroksybenzotriazol (4,2 g, 31,4 mmol) og EDC (6,0 g, 31,4 mmol) ble tilsatt til en løsning av syre 15 (8,3 g, 26,2 mmol) i DMF (128 ml) ved romtemperatur. Blandingen ble oppvarmet ved 80°C i 10 minutter. l,l-dimetyl-2-trimetylsilyloksyetylamin (5,1 g, 31,4 mmol, fremstilt fra l,l-dimetyl-2-hydroksyetylamin (Aldrich Chemical Co.) og heksametyldisilazan (Aldrich Chemical Co.)) ved oppvarming av blandingen under tilbakeløp i flere timer etterfulgt av avdampning av de flyktige komponentene ble tilsatt og løsningen ble oppvarmet ved 80°C i 17 timer. Den gule løsningen ble helt inn i EtOAc (250 m) og 2N vandig HC1 (250 ml). Etter røring i 10 minutter ble EtOAc (750 ml) tilsatt og blandingen vasket med H20 (3 x 500 ml) og saltvann (1 x 250 ml). Kombinerte vandige lag ble ekstrahert med EtOAc (1 x 250 ml). Kombinerte organiske lag ble tørket (Na2S04) og renset ved flamme-kromatografi (50/50 EtOAc/heksaner) for å tilveiebringe forbindelse 16 som en farveløs olje (7,9 g, 78%): <]>H NMR (300 MHz, CD3OD) 6 7,36 (m, 5 H), 5,20 (d, J = 8,1 Hz, 1 H), 5,10 (m, 1 H), 4,53 (m, 1 H), 3,78 (dd, J = 13,2,4,4 Hz, 1 H), 3,60 (m, 2 H), 3,48 (d, J = 10,7 Hz, 1 H), 2,15-1,25 (m, 12 H), 1,31 (s, 3 H), 1,29 (s, 3 H).

C. En blanding av karbamat 16 (7,9 g, 20,4 mmol) og 5% palladium-på-karbon (Pd/C)

(1,6 g) ble hydrogenert ved 50 psi H2 i absolutt EtOH (100 ml) ved romtemperaur i 18 timer. Blandingen ble filtrert gjennom celitt og avdampet i vakuum for å tilveiebringe amin 17 som et hvitt, krystallinsk fast stff: 'H NMR (300 MHz, CD3OD) 8 3,63 (q, J = 7,0 Hz, 2 H), 3,34 (m, 1 H), 3,27 (dd, J = 11,8, 3,3 Hz, 1 H), 2,91 (m, 1 H), 2,02-1,15 (m, 12 H), 1,32 (s, 3 H), 1,31 (s,3H).

D. Vandig 10,2N NaOH (2,4 ml, 24,5 mmol) ble tilsatt til en varm (27°C) suspensjon av kloralkohol (oppnådd fra Kaneka Industries i Japan)(10,4 g, 28,6 mmol) i isopropanol (IPA)

(104 ml) med mekanisk røring. Etter 1 time ble IN vandig HC1 i IPA (fremstilt ved tilsetning av 1 ml konsentrert vandig HC1 til 12 ml IPA) omtrent (ca 1 ml) ble tilsatt for å nøytralisere (pH = 7). Amin 17 (5,2 g, 20,4 mmol) ble tilsatt som en løsning i IPA (50 ml) og den tynne suspensjonen ble varmet ved 60°Ci 10 timer. IPA ble fjernet i vakuum. Resten ble fortynnet med EtOAc (150 ml) og vasket med H20 (2 x 50 ml), mettet vandig NaHC03 (1 x 50 ml), og saltvann (1 x 50 ml). Kombinerte vandige lag ble ekstrahert med EtOAc (1 x 25 ml).

Kombinerte organiske lag ble tørket (Na2S04) og renset ved flamme-kromatografi (75/25 EtOAc/heksaner, deretter EtOAc) for å tilveiebringe forbindelse 18 som et hvitt, fast stoff (8,98 g, 76%): 'H NMR (300 MHz, CD3OD) 8 7,33 (m, 10 H), 5,08 (AB, Jab = 12,2 Hz, Auab = 12,1 Hz, 2 H), 3,96 (m, 2 H), 3,56 (q, J = 7,3 Hz, 2 H), 3,50 (m, 1 H), 3,20 (dd, J = 13,6,9,2 Hz, 1 H), 3,03 (m, 1 H), 2,64 (m, 2 H), 2,20-1,20 (m, 14 H), 1,28 (s, 6 H).

E. 50% vandig NaOH (2,7 g, 1,8 ml, 33,6 mmol) ble tilsatt til en suspensjon av karbamat 18 (6,75 g, 11,6 mmol) i IPA (34 ml) ved romtemperatur. Blandingen ble oppvarmet under tilbakeløp i 12 timer. Etter avkjøling ved romtemperatur ble blandingen fortynnet med metyl t-butyleter (MTBE) (600 ml) og vasket med H20 (2 x 250 ml) og saltvann (1 x 125 ml). Kombinerte vandige lag ble ekstrahert med MTBE (1 x 150 ml). Kombinerte organiske lag ble tørket (Na2S04) og avdampet i vakuum for å tilveiebringe en blanding av forbindelse 19 og benzylalkohol som et oljeholdig, hvitt fast stoff: <*>H NMR (300 MHz, CD3OD) 8 7,34 (m, 10 H), 4,63 (s, 2 H), 3,81 (m, 1 H), 3,58 (m, 3 H), 3,03-2,60 (m, 5 H), 2,17 (m, 1 H), 2,05 (m, 1 H), 1,87-1,05 (m, 12 H), 1,30 (s, 3 H), 1,28 (s, 3 H).

F. Trietylamin (3,2 g, 4,3 ml, 31,2 mmol) ble tilsatt en løsning av blandingen av amin 19 (4,7 g, 10,4 mmol teoretisk fra 18) og benzylalkohol i EtOH (23 ml) ved romtemperatur. En løsning av 3-acetoksy-2-metylbenzoylklorid (20) (oppnådd ifølge fremgangsmåten angitt i US patentsøknad nr. 08/708.411, inngitt 5. september 1996, som er spesifikt inkorporert heri ved referanse) (2,4 g, 11,5 mmol) i THF (4 ml) ble tilsatt. Etter 2 timer ble 50% vandig NaOH (4,1 g, 2,8 ml, 52,2 mmol) tilsatt og blandingen ble oppvarmet under tilbakeløp i 1 time. Etter avkjøling til romtemperatur ble blandingen nøytralisert til pH = 7 med 2N vandig HC1 (26 ml). Denne blandingen ble fortynnet med EtOAc (500 ml) og vasket med H2O (1 x 250 ml), mettet vandig NaHC03 (2 x 250 ml), H20 (1 x 250 ml) og saltvann 81 x 125 ml). Det organiske laget ble tørket (Na2S04) og renset ved flammekromatografi (75/25 EtOAc/heksaner) for å tilveiebringe amid 21 som et hvitt skum (1173-57A, 1,39 g, 23%). <]>H NMR indikerte tilstedeværelse av 11 vekt% EtOAc som ikke kunne bli fjernet i vakuum.

Analyser:

'H NMR (300 MHz, CD3OD) 8 7,53 (d, J = 7,3 Hz, 2H), 7,32 (t, J = 7,0 Hz, 2 H), 7,20 (t, J 7,3 Hz, 1 H), 7,06 (t, J = 8,1 Hz, 1 H), 6,92 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,83 (d, J = 8,1 Hz, 1 H), 4,42

(m, 1 H), 4,08 (m, 1 H), 3,61 (dd, J = 13,6,4,0 Hz, 1 H), 3,45 (AB Jab = 11,0 Hz, Au ab = 18,0 Hz, 2 H), 3,29 (dd, J = 13,6,10,3 Hz, 1 H), 3,10 (m, 1 H), 2,66 (m, 2 H), 2,28 (s, 3 H), 2,22 (m, 2 H), 2,04 (m, 1 H), 1,86-1,20 (m, 11 H), 1,19 (s, 3 H), 1,18 (s, 3 H).

<13>C NMR (75,5 MHz, CD3OD) S 175,7, 172,5,155,9, 138,8,136,7,129,8,128,9, 126,3, 126,0,122,4, 118,4,115,9, 70,3,69,9,68,2,59,3,58,8,54,9, 53,0,36,5,34,2,34,1,31,1 30,7, 26,4, 26,0, 23,1, 23,0, 20,8, 12,1,.

Eksempel 2

HIV proteaseinhibisjonsaktivitet og anti-HIV aktivitet i cellekulturen til forbindelse 21.

Tett bindingskinetikkanalyse ble anvendt for å bestemme størrelsen på Ki-verdien til forbindelse 21. Kj = 5,6 ± 0,91 nM.

Metoder

Ekpresjon av HIV-1 protease

HIV-1 proteasegenet ble isolert fra den virale stammen UIB (Råtner, L. et al., Nature, 316, 227-284 (1985)). For å øke stabiliteten av renset protease (Rose, J. R. et al., J. Biol. Chem., 268,11939-11945 (1993)), var glutaminresten i posisjon 7 (Q7) mutert til serin (S) ved erstatning av 33 basepar-segmentet mellom Ndel og BstEII setene til proteasegensekvensen med syntetiske oligonukleotider kodende for Q7S mutasjon. Den modifiserte gensekvensen ble skutt inn i plasmidvektor pGZ (Menge, K. L. et al., Biochemistry, 34:15934-15942 (1995) under kontrollfag T7 promoteren. Den resulterende konstruksjonen pGZ/HJM9Q7S#9, ble overført inn i E. coii stamme BL21(DE3) oppnådd fra Novagen, Inc.

Ekspresjon av HIV-1 PR: Kutterer ble dyrket i 2YT medium (1,6% trypticase pepton, 1% gjærekstrakt, 0,5% NaCl ved opprinnelig pH 7,5) inneholdende 200 u.g/1 ampicillin i 1001 fermentor (Biolafitte SA) ved 37°C i 5 timer og deretter indusert ved tilsetning av 1 mM IPTG (isopropyl-(3-D-tiogalactopyranosid). Temperaturen til kulturen i løpet av induksjonen ble øket til 42°C for å øke akkumuleringene av rekombinant HIV-1 protease som uoppløselige inklusjonslegemer. Etter 2 timer ved 42°C ble cellene høstet ved krysstrømfiltrering ved anvendelse av Pellicon 0,1 um WPP000C5 kassett #10 (Millipore) og cellepastaen ble lagret i frossen tilstand ved -70°C.

Rensning av rekombinant HIV-1 protease: Alle trinn ble dersom ikke annet er angitt utført ved 4°C. Proteinkonsentrasjonene ble besemt ved anvendelse av BioRad proteinanalyseløsning med bovint serumalbumin (BioRad, Richmond, CA) som en standard. Kromatografitrinnene og renhet til HIV PR ble analysert ved natrium todecylsulfarpolyakrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE). Endelig renhet av HTV-PR var

>98%. Typisk sluttutbytte fra hver 1001 kultur av ~120 mg.

Cellepasta fra 1001 kultur ble resuspendert i 300 ml lyseringsbuffer (50 mM Tris-Cl pH 8,0,25 mM NaCl, 20 mM 2-merkaptoetanol) og mikrofluidisert i Microfluidics Corporation fluidiseringsinnretning av 22.000 psi. Rå cellelysat ble klargjort ved sentrifugering ved 14.000 rpm i 20 minutter. HIV PR ble hovedsakelig funnet i pellet i form av inklusjonslegemer. Inklusjonslegemene ble deretter vasket flere ganger i lyseringsbuffer inneholdende i tillegg 0,1% trition-XlOO og 1 M urea, og etter hver vaskeprosedyre ble inklusjonslegemene pelletert ved sentriguering ved 5.000 rpm i 20 minutter. Rensede inklusjonslegemer ble oppløst i buffer inneholdende 50 mM Tris-Cl, pH 8,0,25 mM NaCl, 20 mM 2-merkaptoetanol og 8 M urea. Løsningen ble klargjort ved sentrifugering ved 14.000 rpm og applisert ved romtemperatur til en 300 ml Fast Flow Q-Sepharose kolonne (Pharmacia, Piscataway, NJ) ekvilibrert med samme buffer. Under disse betingelsene ble HIV PR ikke bundet til kolonnen og vesentlig rent enzym ble funnet i gjennomstrømnings-fraksjonene. For å renaturere proteinet ble fraksjoner fra Fast Flow Q-Sepharose kolonnen dialysert mot tre bufferskift inneholdende 25 mM NaH2P04 pH 7,0,25 mM NaCl, 10 mM DTT og 10% glyserol. Etter refolding ble små mengder av presipitert materiale fjernet ved sentrifugering og resulterende enzympreparat ble konsentrert, dialysert mot 0,5 M NaCl, 50 mM MES pH 5,6,10 mM DTT, frosset i små alikvoter med ~2 mg/ml og lagret ved -70°C.

Tett-bindingskinetikkanalyse og analyser

Den proteolytiske aktiviteten til renset HIV-1 protease ble målt ved anvendelse av en modifisert kromogen analyse utviklet av Richards et al. (Richards, A.D. et al. J. Biol. Chem., 256,773-7736 (1990)). Det syntetiske peptidet His-Lys-Ala-Arg-Val-Uu-Phe(paraN02>-Glu-Ala-Nle-Ser-NH2 (American Peptide Company) (Nie er norleucin) ble anvendt som et substrat. Analysen ble utført i 0,5 M NaCl, 50 mM MES pH 5,6, 5 mM DDT og 2% DMSO ved 37°C. Spaltning av den spaltbare bindingen mellom leucin og paranitro-fenylalanin (Phe para-N02) ble analysert ved spektrofotometrisk registrering av reduksjonen på absorbansen ved 305 nm. Opprinnelig hastighet ble bestemt som reduksjonsraten av absorbansen i løpet av de første 100 sekundene av den enzymatiske reaksjonen. Under disse betingelsene og ved anvendelse av Q7S HIV-1 protease, er Michaelis-konstanten (Km) for dette substratet 59 ± 17 uM.

For bestemmelse av inhibisjonen til forbindelse 21 ble en mettende konsentrasjon av substrat 200 \ xM anvendt. Mellom 13 og 20 konsentrasjoner av inhibitorer ble vurdert og reaksjonshastigheten ble målt ved hver konsentrasjon som beskrevet ovenfor. Tilsynelatende Ki (Ki app), angitt ovenfor, ble bestemt ved data-assistert ulineær minste kvadrattilpasning av dataene til "tight binding" ligningen til Morrison (Morrison, J. F., Biochem. Biophys. Acta, 185, 269-286(1963)).

Eksempel 3

Antiviral aktivitet til forbindelse 21 mot HIV-1 i cellekultur

Celler og virusstammer:

CEM-SS og MT-2 humane T-cellelinjer og HIV-1 stammene RF og UIB ble oppnådd fra AIDS Research and Reference Program, Division of AIDS, NIAJD og NEH.

Cellebeskyttelsesanalyser:

Inibitoriske effekter til hvert middel på HIV-1 replikasjonen ble målt ifølge MMTT farvereduksjonsmetoden (Alley, M.C. et al., Cancer Res. 48: 589-601 (1988)). Forbindelsene ble løst opp i DMSO ved en konsentrasjon på 40 mg/ml og deretter fortynnet 1:200 i kulturmedium (RPMI, supplementert med 10% føtalt bovint serum). Fra hvert fortynnet stammedium ble 100 pi tilsatt til en 96-brønns skål og seriehalvlogfortynninger ble dannet. I separate rør ble MT-2 celler og CEM-SS celler infisert med HIV-1 UIB eller HIV-1 RF ved en infeksjonsmultiplisitet (m.o.i.) på henholdsvis 0,01 og 0,03. Etter en 4-timer lang adsorpsjonsperiode ble 100 ul av infiserte eller uinfiserte celler tilsatt til brønnene av medikamentinnholdende skål for å tilveiebringe en sluttkonsentrasjon på 1 x IO<4> celler/brønn. Seks dager (CEM-SS celler ) eller 7 dager (MT-2 celler) senere, ble MTT (5 mg/ml) tilsatt til forsøksskålene og mengde av formazan produsert ble kvantifisert spektrofotometrisk ved 570 nm. Data ble uttrykt som prosentandel formazan produsert i medikament-behandlede celler sammenlignet med formazan produsert i brønnene til ikke-infiserte, medikament-frie celler. ED50 ble beregnet som konsentrasjon av medikament som økt prosentandel av farmazon-produksjonen i infiserte, medikament-behandlede celler til 50% av det som blir produsert av uinfiserte, medikament-frie celler. Cytotoksisiteten (TC50) ble beregnet som konsentrasjon av medikament som økte prosentandelen av formazan produsert i ikke-infiserte, medikament-behandlede celler til 50% av det som blir produsert i ikke-infiserte, medikament-frie celler. Terapeutisk indeks (TI) ble beregnet ved deling av cytotoksisiteten (TC30) med anti-viral effektivitet (ED50).

Som angitt ovenfor er forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse nyttige for inhibering av HIV protease, som er et enzym assosiert med viral komponentproduksjon og oppstilling. En utførelse ifølge foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte for behandling av HIV-infeksjon omfattende administrering til en vert eller pasient, så som en primat, en effektiv mengde av en forbindelse med formel (9) eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav. En annen utførelse ifølge foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte for behandling av AIDS omfattende administrering til en vert eller pasient en effektiv mengde av en forbindelse med formel (9) eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav. En ytterligere utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte for inhibering av HIV protease omfattende administrering til en HIV-infisert celle eller en vert eller pasient, så som en primat, infisert med HIV, en effektiv mengde av en forbindelse med formel (1) eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

Betegnelsen "effektiv mengde" betyr en mengde av en forbindelse med formel (9) eller dets farmasøytiske akseptable salt som effektivt inhiberer HIV protease mediert viral komponentproduksjon og oppstilling. Den spesifikke dosen til forbindelsen som blir administrert ifølge denne oppfinnelsen for å oppnå terapeutiske eller inhibitoriske effekter vil selvfølgelig bli bestemt ut i fra de bestemte omstendighetene som omgir tilfellet, inkludert f.eks forbindelsen som blir administrert, administreringsvei, betingelse som blir behandlet og den individuelle verten eller pasienten som blir behandlet. Et eksempel på en daglig dose (administrert i enkelt eller oppdelte doser) inneholder et doseringsnivå fra omtrent 0,01 mg/kg til omtrent 50 mg/kg kroppsvekt av en forbindelse ifølge oppfinnelsen. Foretrukne daglige doser utgjør generelt fra omtrent 0,05 mg/kg til omtrent 40 mg/kg og mer foretrukket er fra omtrent 1,0 mg/kg til omtrent 30 mg/kg.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan bli administrert ifølge forskjellige veier, inkludert oralt, rektalt, transdermalt, subkutant, intravenøs, intramuskulært og ved intranasal vei. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen blir fortrinnsvis formulert før administreringen. En annen utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse er følgelig en farmasøytisk blanding eller formulering omfattende en effektiv mengde av en forbindelse med formel (9) eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav og en farmasøytisk akseptabel bærer, så som et fortynningsmiddel eller en eksipient.

Det aktive ingredienset omfatter fortrinnsvis fra 0,1% til 99,9 vekt% av formuleringen. Med "farmasøytisk akseptabel" menes det at bæreren, så som fortynningsmiddelet eller eksipienten, er kompatibel med de andre ingrediensene av formuleringen og ikke skadelig for verten eller pasienten.

Farmasøytiske formuleringer kan bli fremstilt fra forbindelsene ifølge oppfinnelsen ved hjelp av kjente fremgangsmåter ved anvendelse av kjente og lett tilgjengelige ingredienser. Ved dannelse av blandingene ifølge foreliggende oppfinnelse vil det aktive ingredienset vanligvis bli blandet sammen med en bærer, eller fortynnet med en bærer, eller innesluttet i en bærer, som kan være i form av en kapsel, pute, papir eller annen egnet beholder. Når bæreren virker som et fortynningsmiddel, kan den være et fast, halv-fast eller flytende materiale som virker som en bærer, eksipient eller et medium for det aktive ingredienset. Blandingene kan følgelig være i form av tabletter, piller, pulvere, pastiller, puter, eliksirer, suspensjoner, emulsjoner, løsninger, siruper, aerosoler (så som et fast eller flytende medium), salver (inneholdende f.eks opp til 10 vekt% av den aktive forbindelsen), bløte og harde gelatinkapsler, suppositorer, sterile injiserbare løsninger, sterilt pakkede pulvere og lignende.

Følgende formuleringseksempler illustrerer rammen av oppfinnelsen. Betegnelsen "aktivt ingrediens" representerer en forbindelse med formel (9) eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

Formulering 1

Harde gelatinkapsler blir fremstilt ved anvendelse av følgende ingredienser:

Formulering 2

En tablett blir fremstilt ved anvendelse av følgende ingredienser:

Forbindelsene blir blandet og komprimert for å danne tabletter som hver veier 665 mg.

Formulering 3

En aerosolløsning blir dannet inneholdende følgende komponenter:

Den aktive forbindelsen blir blandet sammen med etanol og blandingen tilsatt til en porsjon drivmiddel 22, avkjølt til -30°C og overført til en fyllinnretning. Nødvendig mengde blir deretter tilført en rustfri stålbeholder og fortynnet med gjenværende drivmiddel. Ventilenhetene blir deretter plassert på beholderen.

Formulering 4

Tabletter, hver inneholdende 60 mg aktiv ingrediens blir dannet som følger:

Det aktive ingredienset, stivelse og cellulose blir sendt gjennom en nr. 45 mesh US-sikt og grundig blandet. Vandig løsning inneholdende polyvinylpyrrolidon blir blandet med resulterende pulver og blandingen blir deretter sendt gjennom nr. 14 mesh US-sikt Granuler produsert på denne måten blir tørket ved 50°C og sendt igjennom en nr. 18 mesh US-sikt. Natriumkarboksymetylstivlse, magnesiumstearat og talk, på forhånd sendt gjennom en nr. 60 mesh US-sikt blir deretter tilsatt til granulene som etter blanding blir komprimert på en

tablettmaskin for å tilveiebringe tabletter som hver veier 150 mg.

Formulering 5

Kapsler som hver inneholder 80 mg aktiv ingrediens blir dannet som følger:

Aktiv ingrediens, cellulose, stivelse og magnesiumstearat blir blandet, sendt igjennom en nr. 45 mesh US-sikt og fylt inn i harde gelatinkapsler i mengder på 200 mg.

Formulering 6

Suppositorer, hvor inneholdende 225 mg aktiv ingrediens blir dannet som følger:

Det aktive ingredienset blir sendt gjennom en nr. 60 mesh US-sikt og suspendert i mettede fettsyreglyserider på forhånd smeltet ved anvendelse av minimal nødvendig varme. Blandingen blir deretter helt inn i en suppositorieform med nominell 2 g kapasitet og avkjølt.

Formulering 7

Suspensjoner, hver inneholdende 50 mg aktiv ingrediens pr 5 ml dose blir dannet som følger:

Aktiv ingrediens blir sendt gjennom en nr. 45 mesh US-sikt og blandet med natriumkarboksymetylcellulose og sirup for å danne en glatt pasta. Benzosyreløsning, smak og farve blir fortynnet med en porsjon vann og tilsatt med omrøring. Tilstrekkelig vann blir deretter tilsatt for å danne nødvendig volum.

Formulering 8

En intravenøs formulering blir dannet som følger:

Løsning av ovennevnte ingredienser blir generelt administrert intravenøst til et individ i en rate på 1 ml pr minutt.

Formulering 9

En tablett blir dannet ved anvendelse av ingrediensene nedenfor:

Claims (31)

1. Forbindelse, kjennetegnet ved at den har formel (9): hvor R er H; R' er en (Ci-C6)alkyl-ORi-gruppe; hvor Ki er H; eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller solvat derav.

2. Forbindelse, kjennetegnet ved at den har formelen: eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller solvat derav.

3. Salt ifølge krav 1, kjennetegnet ved at det har formelen

4. Farmasøytisk preparat, kjennetegnet ved at det omfatter: (a) en effektiv mengde av forbindelse ifølge krav 1; og (b) en farmasøytisk akseptabel bærer for denne.

5. Farmasøytisk preparat, kjennetegnet ved at det omfatter: (a) en effektiv mengde av forbindelsen ifølge krav 2; og (b) en farmasøytisk akseptabel bærer for denne.

6. Anvendelse av en effektiv mengde av en forbindelse ifølge krav 1 eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller solvat derav for fremstilling av et farmasøytisk preparat for inhibering av HIV protease.

7. Anvendelse av en effektiv mengde av en forbindelse ifølge krav 2 eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller solvat derav for fremstilling av et farmasøytisk preparat for inhibering av HIV protease.

8. Forbindelse ifølge krav 1, kjennetegnet ved at den har en renhet på mer enn 90%.

9. Forbindelse ifølge krav 1, kjennetegnet ved at den har en renhet på mer enn 95%.

10. Forbindelse ifølge krav 1, kjennetegnet ved at den har en renhet på minst 97%.

11. Forbindelse ifølge krav 1, kjennetegnet ved at den har en renhet på minst 99%.

12. Forbindelse ifølge krav 2, kjennetegnet ved at den har en renhet på mer enn 90%.

13. Forbindelse ifølge krav 2, kjennetegnet ved at den har en renhet på minst 95%.

14. Forbindelse ifølge krav 2, kjennetegnet ved at den har en renhet på minst 97%.

15. Forbindelse ifølge krav 2, kjennetegnet ved at den har en renhet på minst 99%.

16. Farmasøytisk blanding ifølge krav 4, kjennetegnet ved at forbindelsen har en renhet på mer enn 90%.

17. Farmasøytisk blanding ifølge krav 4, kjennetegnet ved at forbindelsen har en renhet på minst 95%.

18. Farmasøytisk blanding ifølge krav 4, kjennetegnet ved at forbindelsen har en renhet på minst 97%.

19. Farmasøytisk blanding ifølge krav 4, kjennetegnet ved at forbindelsen har en renhet på minst 99%.

20. Farmasøytisk blanding ifølge krav 5, kjennetegnet ved at forbindelsen har en renhet på mer enn 90%.

21. Farmasøytisk blanding ifølge krav 5, kjennetegnet ved at forbindelsen har en renhet på minst 95%.

22. Farmasøytisk blanding ifølge krav 5, kjennetegnet ved at forbindelsen har en renhet på minst 97%.

23. Farmasøytisk blanding ifølge krav 5, kjennetegnet ved at forbindelsen har en renhet på minst 99%.

24. Anvendelse ifølge krav 6, idet forbindelsen har en renhet på mer enn 90%.

25. Anvendelse ifølge krav 6, idet forbindelsen har en renhet på minst 95%.

26. Anvendelse ifølge krav 6, idet forbindelsen har en renhet på minst 97%.

27. Anvendelse ifølge krav 6, idet forbindelsen har en renhet på minst 99%.

28. Anvendelse ifølge krav 7, idet forbindelsen har en renhet på mer enn 90%.

29. Anvendelse ifølge krav 7, idet forbindelsen har en renhet på minst 95%.

30. Anvendelse ifølge krav 7, idet forbindelsen har en renhet på minst 97%.

31. Anvendelse ifølge krav 7, idet forbindelsen har en renhet på minst 99%.