CZ300496A3 - Process for preparing encapsulated cells for implantation into a host organism, cells prepared in such a manner and biologically compatible capsule containing thereof - Google Patents

Description

Způsob přípravy zapouzdřených buněk k implantaci do hostitelského organismu, buňky připravené tímto způsobem a biokompatibilní kapsule, která je obsahuje

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu přípravy zapouzdřených (enkapsulovaných) buněk za účelem jejich implantace do hostitelského organismu. Tyto buňky jsou vystaveny působení jedné nebo více restriktivních podmínek, které se blízce podobají podmínkám v místě implantace, po dobu dostatečnou k ustavení požadované buněčné vlastnosti, jakožto odpovědi na tyto restriktivní podmínky.

Dosavadní stav techniky

Zapouzdřené buňky produkující biologicky aktivní molekuly mohou být po implantaci do hostitelského organismu použity k prevenci či léčbě mnoha onemocnění nebo zdravotních poruch, popřípadě k tomu, aby zabezpečily, obnovily nebo zesílily jednu nebo více metabolických funkcí organismu.

Jedním z postupů používaných k zapouzdření buněk je takzvaná mikroenkapsulace. Při tomto postupu jsou mikroskopické kapičky roztoku obsahujícího buňky zapouzdřeny do maličkých kuliček (Sefton a další, Biotechnology and Bioengineering 29, strana 1135 až 1143 (1987), Sugamori a další, Trans. Am. Soc. Artf. Intern. Organs 35, strana 791 až 799 (1989).

Jiným postupem zapouzdřování buněk je takzvaná makroenkapsulace. Při tomto postupu se určité množství buněk uzavře do termoplastické kapsule. Typicky se buněčnou suspenzí nejprve naplní dutá vlákna, která se poté na koncích uzavřou. Z dosavadního stavu techniky jsou známy různé druhy makrokapsulí. Zejména Dionne a další (WO 92/19195) popisují makrokapsule, ve kterých jsou buňky dispergovány v matrici, a které mají polopropustnou obálku. Rovněž Aebischer (patenty

-2Spojených Států číslo 5,153,331, 5,253,137 a 5,234,731) popisuje buněčné kapsule tvořené vytlačováním roztoku polymeru spolu s buněčnou suspenzi.

V případě, že buňky určené k zapouzdření a poté k implantaci jsou isolovány přímo z tkáně (primární buňky), jsou typicky nejprve rozvcinény vazby mezi jednotlivými buňkami a poté jsou tyto zapouzdřeny, vrz například Aebischer a další, Trans. Am. Scc. .Artř. Intern. Organs 32, strana 134 až 137, (1935); .Altman a další, Diabetes 35, strana 625 až 633 (1985); Chang a další, U.S. patent číslo 5,084,350; Darguay a Reach, Diabetologia 23, strana 775 až 730 (1935) ; Sugamori a Seřton, Trans. Am. Soc. .Artř. Tntern. Organs 35, strana 791 až 799, (1939).

V případě, k implantaci pecne jsou buňky t-rzicky viz například -Aebi až 55 (1931); Expe (1931) (buňky PC 15 93/22427 (buňky MO e buňky určené k zapouzdřeni a poté = jí z imcrtaiizcvanýcň buněčných linii, □ dovány z kultur s vysokým obsahem živin der a dalši, Sicmaterials 12, strana 50 .mental Neurology 111, strana 269 až 275, sekretujicl docamin. a Ward a dalši, WG

Zapouzdřené buňky jsou typicky kultivovány v podmínkách in vitro a jsou před implantací funkčně charakterizovány. Zapouzdřené buňky jsou v této pre-implantační fázi často kultivovány v omezeném mediu. Tímto mediem je často vyvážený roztok solí, ve kterém nejsou obsaženy živiny viz například Aebischer a další, Trans. Am. Soc. Artř. Intern. Organs 32, strana 134 až 137, (1935); .Altman a další, Diabetes 35,

strana 625	až 633	(1936); Chang a dalš	i, U.S. patent	číslo
5,084,350.	V jin	ých případech jsou	zapouzdřené	buňky
inkubovány	v mediu	se živinami jako je	například RPMI	1640,

které obsahuje různé aminokyseliny, vitaminy, anorganické soli a glukosu (2 g/1, ii, 11 mM) í.Animai Cell Culture, editoři Poiiard a Walker, Humana Press lne., Ciifton New

-3Jersey, strana c9c

700 (1990 ktere je fetálníno telecího nebo koňského séra picxy a

Zaooutdřené a do hostitelskéhc organismu implantované buňky musí podstoupit nejméně dvě těžké změny nutričních podmínek ve srovnáni s podmínkami in vitro. K první změně Ve srovnání s podmínkami in vitro je dochází co zaocu orostreci lacouzurenvcn cune.t mnonem cnucsi :ivm· dvěma způsoby. Prvním je exi = gradientu živin mezi vnějším prostředím a vnitřkem kar í vytváří napříč membránou Hi fn« ·' mp? i vn S -i S í hnsH fal s’.

ochuzeni se projevuj

gradient	se přiraz*
posilován	znesnadněn·
a buňkami	v ruzr.ve?:
ilézaji bi

s e k živinám, která o produkty buněčnéh; v b^iz.cosu ocvrcnc tence sule. a je ískou různých místech uvnitř kaosule. Buňkv které kapsuie mají snadnější undují skrz metabciismt : a o s u _ e ne z obálku kapsuie, mn o'^r -- m snáze

ITavíc ?istuc ' sou

X ca_si výrazné zrněna v koncentraci zívm (napnxiaa kyslíku a glukosy'' dochází po implantaci do hostitelského organismu díky tomu, že koncentrace kyslíku a dalších živin v podmínkách in vitro jsou obecně mnohem vyšší než jejich koncentrace in vivo. Z toho vyplývá, že gradient podmiňující difusi těchto molekul do nitra kapsuie v podmínkách in vivo slábne.

Tyto změny nutričních podmínek mohou způsobit změny jedné nebo více buněčných vlastností. Například může dojít ke smrti buněk nebo ke zkrácení jejich dlouhodobé životnosti. Navíc může změna okolních podmínek po implantaci ovlivnit další vlastnosti zbývajících živých zapouzdřených buněk, jako například rychlost buněčného růstu, nebo schopnost buněk produkovat biologicky aktivní molekuly. Změny v rychlosti růstu diskrétních buněčných subpopulací mohou vést k převládnutí rychle;

jstoucí buněčné populace v kapsuii a

z toho plynoucího c	:osunu jejích výstupních charakteristik,
nebe k jiným nežádou	oim efektům.
Jedním z důle	čirých rozdílů mezi prostředím in vivo po
implantaci a proseč-	řdím in vitro je koncentrace glukosy, na
k_ereu jsou xu_zzv<	;vene bu.uxy adaptovány. Dalším rozdílem
mezi podmínkami v ok	áč.ové kultuře a podmínkami v impiantačním
místě te množszi :	:ro buňky využitelného kyslíku. Rovněž
koncentrace dalších	živin se mouhou v místech pro implantaci
	'Z V 31ΠΙZ J_ L 3 L Z .

Vyscce meiacclicky aktivní buňky nebo tkáně jsou

většinou velmi cit	livé na nedostatek živin nebe kyslíku
(hypoxii). Takové ;	snování vykazují například buňky mnoha
endokrinních zkání,	které jsou normálně obklopeny hustou sítí
kapilár a -sou prs	to aklimatizovány na vysoké koncentrace
kyslíku a živi:	Například buňky pankreatických
Langerhanscvých eso z	tivků a adrenáíní chromafinrxí buňky jsou
velmi citlivé na hyp	? x ž c k šok.
Je známo, že	změny v tenzi kyslíku nebo nedostatek
živin mohou zcůsccz:	: změny v expresi velkého množství genů,
ktsré ovlivňuji zzze ž	stv; buněčných funkcí. Tvto zmeněnv mohou
ovlivnit rovněž stab	zlitu a funkci určitých mRNA. Nedostatkem
živin může být z	viivněna například mRNA. pro tyrosin
hydroxylasu, enzym	katalysující mezikrok, který určuje

reakční rychlost produkce dopaminu.

Nízkými končen	.zracemi glukosy nebo aminokyselin mohou
být postiženy rovně:	'·. geny pro proteiny tepelného šoku (heat
shock proteine) a e:	<prese genů pro metaboiické enzymy, jako
například pro e.n:	tmy účastnící se na intermediárním
metabolismu (napříki	ad při glykolýze nebo giukoneogenezi).
Vysoce difere:	ncované buňky mohou za nedostatku kyslíku
ztratit svoje tkáň:	;vě specifické funkce po dobu, než se
vzpamatují t hypoxi:	:kéhc šoku (viz například Wolfře a Tata,
cSBS Letters 176,	strana 8 až 15, (1934)). Mezi funkce,

k jejichž -trázě	c zeslabení takto dochází, patří syntéza
a mcdizixace crczez	ni. Tin mize být dotčena i produkce a
sekrece terapeutický	cn faktorů, které mélp/ buňky vylučovat do
oko Iri hostitelská	;káně. Navíc mohou hypcxické podmínky za
určitých okolností	vyvzlcet maligní transformace (viz
například Jcldbaltt	i malé:., Biochemical Medicine 7, strana
241 ač 252, 12'3.· .

/ yS.CQr.e	vyvanout způsob implantace buněk do
hostitelského organ;	.srnu, zahrnující exposici nebo adaptaci
buněk na jednu nebe	více restriktivních podmínek ještě před
vlastní implantací	tak, aby se omezily nežádoucí změny
bunečnveh v'astncst;	i, ke kterým dochází v důsledku změny
orestředí cc impla.tz	asi a zim se minimalizovaly i nežádoucí
účinky na hostitele.	r.zvnez pe vvneane vyvinout bunecne _iuie
odvezené z takte ---	pravených buněk, uáie je výhodné zajistit
orostředkv crc sz v	ivc studium buněk, které prošly změnami

Podstata vynálezu
Yvr.ález occitÁ	pe způsob implantace zapouzdřených buněk
do hostitele kého c r o	anismu zahrnující in vívo nebo in vitro
exc o s * c i buněk i e d.t	é nebe více restriktivním podmínkám po
dobu potřebnou k us'	zavení požadovaných buněčných vlastností
ještě před implantac	:í buněk na požadované implantační místo
v hostitelském organ.	ismu. Je výhodné, je-li po implantaci do
hostitelského orga:	zismu zachovávána buněčná vlastnost
ustavená způsobem po;	ile vp,-nálezu. Zapouzdřené buňky produkují
bioicgicxy axtivni	molekuly, které mohou být využity pro
prevenci či léče	o onemocnění nebo poruchy, nebo
k zabezpečeni, ohne	vení či posílení metabolické funkce
hostitelského organ;	.srnu. Buňky podle vynálezu mohou být
rovněž použity v acl:	.kacích in vitro, pro diagnostické a jiné
ůčeiv.

Popis obrázků:

Obrázek 1:

v grafu ja znázorněna sekrece NGF (nervového růstového faktoru; buňkami 3HZ kulzivovánými in vatro při Leku kyslíku 50 mnHg v mediu, které obsahovalo 0,5 g/1 glukosy (10W C./gi) . ΞΚΚ buňky byly uzavřeny dc kapsuli typu 4 s dvcjazým potahem. Sekrece NGF jednotlivých kapsuli byla testována 3, 7, 14, 21 a 23 dne a je znázorněna výškou sloupce. Na svislé ose je udána hmotnost sekrete váného NGF v ng na jednu kapsuli v průběhu 24 hodin a na vodorovné jsou jednotlivá vlákna.

-plati pro testy pc 3 dnech, 3 pc po dvou týdnech, 3 po třech týdnech a h tvdnech.

Obrázek ;aocu :t.~U tetv/cn 21 a 2: dne a j· svtsue cse j e uc v ησ na ~ ednu ks

Z Z. 27 -m Γ.<y s z >n /1 gluko:

juntv o-a imtuccvane in r4^. mmng v mentu \;c j<t 3275

H2GH O-/gl) . Sekr;

li byla	testována 3, 7,	14,
zorněna	výškou sloupce.	Na
hmo t no s t	s e k r e t o v a n é h o	NGF
. v průběhu 24 hodin a	na
ío tlivá	vlákna. Legenda:
i dnech,	B po 1 týdnu, C	PO

řech tvdnech a po icn r· on t

ivnnecn.

Obrázek 3:

znazo:

masovou s e krece

NGE t (a > Pěli PAN/PVC.

mi buňkami BEK,	kultivováními	in vatro
ch LOW 0-/gl (	jako v	obr. i:	) . Buňky
zdřeny kapsuli	typu 4	(T4) vy	'robených
/ PVC (0(12,5¾	PAN/?V	G nebo	\ ~\ 1 c o.
Na svislé os	e je	udáno	množství

-Ίsekretovaného NGF v ng na jednu kapsuli v průběhu 24 hodin. Sekrece NGE jednotlivých kapsulí byla testována 3, 7, 14, 21 a 22 dne.

Obrázek 4:

znázorňuje epinefřinu Zapouzdřené řep lnef řinu (NE a anket tlaku kyslíku.

(E?l) jako adrenální chromazinní buňky cyiy kultivovány in vitro po dobu 14 dní při tlacích 20, 40, 50, 30 a 140 mmHgO-. Sekrece byla měřena no dvou (A) a 14 dnech (3, . Na svislé ose je za minu“ naměřená sekrece NE vyjádřená v pM, lak kyslíku vyjádřený v mm.-g. oast u:<azu;e basální hodnoty sekrezovaného NE, část 3 ukazuje draselnými ionty indukované hodnoto' NE, čáso 0 ukazuje basální ;atimco na vodorovné je ,,1--,.

nednoto s e .<r e o o vaneno odukovč ucazuo e „c.

Obrázek 5:

znazornuo e adrenálními zapouzdřeny sekreci kaoecnc-aminc rňromaf inními buňkami. io kaosuíí te_eoimi 3uňky byly Sekrece byla měřena před implantací (hcdnoOy A platí pro NE, hodnoty 3 pro ΞΡΪ) a po ní (hodnoty C platí pro NE, hodnoty D pro EPI) . Doba, po kterou byly buňky implantovány činila 6 týdnů. Na svislé ose je vynesena sekrece katecholaminů v průběhu 15 minut v pikomolech. Část 5A ukazuje basální sekreci, v části 53 je sekrece indukovaná nikotinem a v části 5C draselnými ionty.

Obrázek 5:

znázorňuj e adrenálními zaoouzdřenv sekreci katecholaminů telecími chromazinními buňkami. Buňky byly do kaosuíí tomu 4. Sekrece bvla měřena před implantací (hedne piati

-8hcdnoty B pro ΞΡ1) a po ní (hodnoty C platí pro ΝΞ, hodnoty D pro ΞΡΙ) . Doba, po kterou byly buňky implantovány činila 6 týdnů. Na svislé osa je vynesena sekrece katecholaminů v průběhu 15 minut v pikomoiech. Část 6A ukazuje basální sekreci, v části 6B je sekrece indukovaná nikotinem a v části 60 draselnými ionty.

Obrá k 7:

znázorňuj e nikotinu katecholam v_ rn ~ r* basální (část 7A) a 20μΜ koncentrací stimulovanou (část 7B) sekreci inů zapouzdřenými telecími adrenáiními ími buňkami. Buňky byly na 6 týdnů implantovány do krysích subarachnoidáiních. prostorů. Sekrece byla měřena před a po impianzacní periodě. Hodnoty označené A platí pro norepznezrin a hodnoty 3 pro epinefrin. Hodnoty na svislé ose jsou vyjádřeny v pM.

Obrázek 8:

ukazuje sekreci dopaminu (hodnoty A) a L-dopa .hodnoty 3) zapouzdřenými buňkami PC12 a PC12A před a po 3 měsíční implantační periodě ve striatu krysy. Části 8A a 8B znázorňují před impianzační basáiní sekreci buněk PC12 respektive PC12A. Části 8C a 8D znázorňují po implantační basální sekreci buněk PC12 respektive PC12A. Svislá osa udává 30 minutovou sekreci kapsulí v oikomolech.

Obrázek 9: porovnává sekreci katecholaminů buněk, které byly aklimatizovány in vivo za normálních nebo snížených koncentrací dopaminu. Nízké koncentrace dopaminu byly způsobeny injekcí 6-hydroxydopaminu (c-OHDA) do krysí substantia nigra. Část 9A hodnotu basální sekrece L-dopa buněk PC12 jako

Obrázek 1( :une.<

lěsíc

Obrázek 1

-ba.<xiXiat:

a 06 •živo v ooskozene respektive naccskozené tntia nigra. Hodnoty (hodnoty B) jsou udány za 30 minut a jednu kapsuli. Část 93 směr basálních sekrečníoh rychlostí :aminu jako funkci doby aklimatizace poškozené (hodnoty A) respektive oásti (hodnoty 3) substantia nigra.

:oi katecholaminů ze zapouzdřených ;ako funkci doby aklimatizace (v vivo v mozku primátů. Prázdné •zorňují body platné pro basáiní ’/yjaarena sekrece ose je udána sekrece :ch za 15 minut na šednu :un.<7 holost NG? buněk 3HK-hNGF .antací a 14 měsíců po byly zapouzdřeny do jedncplášťových dutých vláken HF 120794-6 7- matrici tvořené Yitrogenem nebo bez matrice. Buňky z buněčné banky (03) jsou neaklimatizované buňky ΞΗΚ-hNG? klonu 23. Na svislé ose je udána sekrece NGF v nanogramech na ml za 24 hodin. Legenda (A) aklimatizované buňky v matrici tvořené Vit rogenem', (3) aklimatizované buňky bez matrice. (0) 03 buňky v matrici a (D) CB buňky

C6 3 Πλ3. 1 Σ2» 3Θ .

Podrobný ocois vvnalezi unecna fenotvcový znak, nose podle vynálezu je libovolný ý může být kvantitativně měřen, včetně

II ~. .

	— - r* _
životaschopncsni,	rychlosti růstu a buněčné produkce
biologicky akttvrt	molekuly, ěcžadcvancu buněčnou vlastností
se může rozumět t:	t.éna v úrovni produkce jedné nebo více
biologických moleku	1 v důsledku restriktivní podmínky, nebo
změna produkčního :	::měru ov;u biologicky aktivních molekul.
Dále ss múze pcžac.	zvanou buněčnou vlastností podle vynálezu
rozumět stabtlisac·	e produkce bio logicky aktivní molekuly
v důsledku působení	restriktivní podmínky.
5 Σ — 2. hZ _ — '/Γ- L ;	: záminkou podle vynálezu se rozumí případ,
kdy se jedna nebo v	toe podmínek, za kterých jsou buňky běžně
kultivovány in vítr	t, změní tak, aby se přiblížily aktuálním
nebo očekávaném, p;	: záminkám tn vtvo v místě předpokládané
implantace do hoste	:elskérc organismu.
3 LC - 3 -7 - C .</ t	•kttvní molekulou podle vynálezu je
molekula, která mi	te a; působte uvnitř buňky, vs které
vznikla ínapříklad :	molekuly bci-2 přt prevenci apoptosy), (b)
je exprimevána na p:	:vrchu buňky a ovlivňuje buněčné interakce
s ostatníma buňkar	zt nebe biologicky aktivními molekulami
(například receptor·	y neurotransmtterů nebo buněčné adhesivní
molekuly' neot u	může být uvolňována nebo sekretována z
buň<y, v e i —	t.-z_a, a uplatňovat taa svůj v^tv na jinou
cílovou burku ;nap:	základ neuroeransmtfery, hormony, růstová
faktor, cytokiny,	nebo další přenašeče intra- či
interceíuiárnich st	cnáiů). 3iologicky aktivní molekuly mohou
být využity pro pr	evenci či léčbu onemocnění nebo poruchy
hostitele , nebo	k zabezpečení, obnovení' či posílení
metabolickš funkce	'.tsttteíského organismu.
Kostttelem ne	bz recipientem podle vynálezu je vhodný
zvířecí subjekt, vó	etně savců a zvláštěpak člověka. Termínem
recipient se rozum.	zvíře jehož buňky byly vystaveny působení
jedné nebo více	restriktivních oodmvnek tak, že buňky
vykazují požadován	zu vlastnost. Termínem hostitel nebo
hostitelský organa.	smus se rozumí zvíře, do něhož jsou

zapouzdřené buňky,	vykazující požadovanou vlastnost,
implantovány.

Buňkami pódia	vyna_eou 3 sou cu.n.oy v xicovoine zořme
včetné (aie nejenom·	buněk zachovaných jako tkáň, buněčných
shluků a j ednc tlivá	isolovaných buněk. Buňky podle vynálezu
produkují biologicky	aktivní molekuly. Takovými buňkami mohou
být primárn. buňky na	co dělicí se ouňky přirozeně produkující
biologicky aktivní	molekuly, nebo buňky k tomu přímo
geneticky upravené.

Bio kemp a tib liru	. kapsuli podne vyna-ezu se rozumí zaxcva
kapsule, která po i.	mp_anzaci do savcino nostitele nevyvoia
takovou ccrannou re.	a.uci, ;ez by nepříznivá ovlivm_a její
funkci nebe která	by ickonce způsobila její inaktivaci.
K inaktivaci kapsule	může například dejít pc uzavření kapsule
do ficrozioue sz;	zuxtury, k.era omezí dizusi zívm
k zapouzdřením buňka:	0. Bále mohou nepříznivě ovlivnit funkci
kapsule její úplná	C CIZÍL ” Γ. ’J. Z L Γ. C 5 ~ 2_ Z 6 — ©ΓΖ Γ. δ OO 11'/Z _ Z 0 V 3.Ol· Z
10xických nebo pyr;0	renních látek z kapsule do jejíhc okolí
(například vedle;áz	C Z ZCtl/lZ */ CO1 SVncézS OC —20n2.

matrice .

Tmunoisoiační	kapsulí se podle vynálezu rozumí taková
kapsul, která pí imp	líantaci do savčího hostitele minimizuje
nepříznivé působenu	imunitního systému hostitele na
zapouzdřené buňky ve	svém nitru. Tím je dosaženo dlouhodobého

působení kapsule v podmínkách in vivo.

Termínem hydrogel se rozumí trojrozměrná zesítěr.á síť hydrofiiních polymerů. Tato síť má formu gelu, jehož podstatnou část tvoři voda. Je výhodné, i když to není omezující podmínkou, cvcří-ii voda více než 90 % celu.

Zesítěné hydrogeiy :	nohou být považovány za tuhé, protože
nemohou téci ani	se deformovat bez působení značného
střižného naoětí.

-12V jednom provedení vynálezu jsou buňky zapouzdřeny do

biokompatibilní k	apsuie načež jsou in vitro vystaveny
působení jedné ne	bo více restriktivních podmínek a poté
implantovány do ur	čeného impla.otačního místa v hostitelském
organismu. Buňky	jsou vystaveny působení restriktivní
podmínky nebo pod:	mínek po dobu potřebnou k tomu, aby se
vytvořila pcžadovo	•r.á buněčná vlastnost. Výhodně je tato
vlastnost z pods'	tažné části udržována i po implantaci
zapouzdřených buně«	: do hostitelského organismu.
Restriktivní	podmínkou podle vynálezu se rozumí změna
teploty, pK, barem	etrickéhc tlaku nebo efektivní koncentrace
jednoho nebo více	mezabciitů či kofakterů jako například
cukru, alkoholu,	karbcxylových kyselin, aminokyselin,
mastných kyselin,	C_ V7.ÍL ,<CCV7Cf. Ω.ΘΟΟ _L ICC ”C _ TÍSÍIC
jiného biologického	faktoru, který se pocíií na růstu, funkci
či životaschopnost	; buněk. K takovéto změně může dc~*'t u
jedné nebo u vícer	ό podmínek. uvedená restriktivní podmínka
podle vynálezu se	mění tak, aby se kultivační prostředí
přiblížilo in vo·;	Ό codrnů nkám v Dožadovaném imolantačním
místě. Bále může	být takovou restriktivní podmínkou tměna
v efektivní končen:	iraci jedné nebo více biologicky aktivních
molekul naoříkl	.ad hormonů, růstových faktorů,
neurotransmiterů, :	oytokinů nebo jiných biologicky aktivních
faktorů, které se	zúčastňují inter- či intramolekulární
signalizace.

Některé živit

lv nebo biologicky aktivní látky mohou být

v podmínkách in vivo v nižší koncentraci než v jaké se běžně používají při kulitvaci in vitro. Na druhé straně některé živiny nebo biologicky aktivní látky se mohou in vivo vyskytovat ve vyšších koncentracích než je tomu in vitro.

Dále se restriktivní podmínkou podle vynálezu rozumí společná kultivace zapouzdřených buněk v podmínkách in vivo nebo in vitro spolu s buňkami z cílové tkáně určené pro implantaci a to tak, že dojde k vytvoření požadované buněčné vlastncsci v cacouo rlSiiSZ, '.Ί Sim.; .

Charact ^nteti :n an linie: Přícreva, :r e~ýc'~ buňkách.

Hybrid Cell· Lines: Generation,

Vtility” VHybridní neuronální buněčné ekterizace a využitelnost i v Neuronal PPL Press, strana 20 (1992).

Viz naoříklad Wainer a

Ve tcůsobech podle vynálezu mohou být použita libovolná vhodná kultivační media. Odborník může modifikovat omezené minerální kultivační medium, tak aby bylo dosaženo požadované koncentrace živin, kritického plynu nebo jiné omezující oodmínkv charakteristické pro dané imolantační místo.

vatro, rn.cn nebe mcb.cn dosaženo což a;

restriktivním implantovány recioiema.

zapusccit naa.<_ima· nebo vise biolcci růstových faktorů ovlivnit růstové schopnost aklimati: exprese, nebe nůž terapeutických fa r e s t r i kt i vn í m p o dz požadované buř’'' odebrány a mehou organismu.

vystavovány restriktivním podmínkám in ivační podmínky měnit pomalu a spojitě,

- -i V v 'ecnom nebe více krocích tak, až je :es t rikt i vní ch podmínek.

jsou buňky vystaveny tkám in vivo a to tak, že jsou lidného impiantačního místa v těle é prostředí v blízkosti takového může ovlivnit buněčné vlastnosti a aci buněk. Například koncentrace jednoho • aktivních faktorů (napříkad hormonů, neuretransmiterů nebo cytokinú) může hepnesti implantovaných buněk, jejich e tím, že dojde k adaptaci jejich genové buňky přimět k produkci požadovaných rů. Poté, co jsou buňky vystaveny kám in vivo, takže dojde k ustavení vlastnosti, jsou buňky z recipienta implantovány do určeného hostitelského

Vystavení restriktivním podmínkám in vivo je výhodné proto, že přžadovane buněčné vlastnosti je dosaženo souběžnou rovnováhou vseo.u buněčných fenotypových znaků s působícími

-14restrikcivnimi podmínkami. Na druhé straně v důsledku působeni restriktivních podmínek in vitro sice může dojít k ustavení některých požadovaných buněčných vlastností, nicméně po implantaci buněk do hostitelského organismu může dojít ke změně dalších buněčných vlastností, což může mít vliv na požadovanou cílovou buněčnou vlastnost nebo

Výhodně jsou jak recipient, tak i hostitel, primáti. Ještě výhodněji je hostitelem člověk. Ve výhodném provedení vynálezu je implantační místo v hostiteli a recipientu totožné.

in vin kultivovány Ooužívánv on é buňky pdie vynálezu mohou být rovněž nebo více restriktivních podmínek a diagnostické a další účely.

V dalším proveden vynálezu -sou buňky vystaveny několika restriktivním podmínkám in vitro ještě před svým zapouzdřením. Výhodně jsou takto ošetřené buňky zapouzdřeny a poté ještě znovu vystaveny dalším restriktivním podmínkám ještě před jejich impiantazí dc hostitelského organismu. Takováto kultivace za restriktivních podmínek ještě před zapouzdřením umožňuje selekci pouze těch buněk z původní populace, které přežily. Zapouzdřeny jsou poté pouze tyto buňky. Jscu-ii použité buňky post-mitotické nebo jiné nedělící se buňky, pak mohou být z původní buněčné populace vybrány nazákiadě projevů jejich zdraví a fenotypu. Ve výhodném provedení vynálezu jsou tyto vlastnosti měřeny produkcí požadované biologicky aktivní molekuly. V případě, že jde c aktivně se dělící buňky pak v populaci rychle převládnou přeživš buňky.

Doba, potřebná k tomu, aby došlo kustavení požadované buněčné vlastnosti v důsledku kultivace za restriktivních podmínek, závisí na druhu použitých buněk jakož i na restriktivní ch podmínkách. V typickém případě buňky projdoupo

exposici restrik-	zevním z dm. Inkám přechodovým obdobím, během
staráno e cuca-	sď' řenztvc měr.· tak, až se vyvine buněčná
vlastnost cápe v	iiajízi restriktivním podmínkám. Perioda
tohoto přechodu m	rife bvt szanuvena běžném4 zcůsoby.
Ve vyhrána:	m prz vezeni vynálezu ;sou používány buňky
ledvin mláďat kř;	ezků = HE- baby hamster kidney), které jsou
geneticky úprava	•.v·· ta-:, aby sekretcvaly nervový růstový
faktor :NGP-	:erva rrzwzh factcr, . Tyto buňky jsou
s u s p e ndovany , z	zatrici na cázi kolagenu/Vitrogenu® a poté
jsou zapouzdřeny	do dutých, semipermeabilních, na koncích
uzavřených vláke:	Příprava takovýchto 3HK-hMGF buněk byla
popsána napřiklac	• z PGG 7G94/39299. Kapsule se poté in vitro
aklimatizuji na r	ziz.-mý zesan kyslíku a glukosy a pak se měří
mne ž s t v i NG Ξ u v c	'énéhz ic crosz^ezm ~ ako funkce ; n v4tro
a:<1 uma t u z a onu es;	;y. řyznlzst prcouuze NGF na jednu kapsuli
vzrůstá spolu s i	oc ;u cu_zivace m .‘izro (viz obrázek 1; .
Ve výhodnéz	’. przvecení vynalezu jsou zapouzdřené buňky
3KK-hNGP implants	vany do lazeráinuzn mozkových komor hostitel
a akiimatizzvany	in vzu. sete ;szu xapsuie explantevany,
aklimatizované z	J.Z ~ ” V Z ů C 3 LL Z d !*CLL J_ t ÍVO VdZ.V Zd
opakcváného pasáž	: z vání. Nakonec jszu in vivo aklimatizované
buňky opět zapcu	.odřeny a implantovány do recipienta. Před
opětovnou implant	ací, a poté i v různých časových úsecích po
implantaci, jsou	kapsule s in vivo aklimatizovanými buňkami i
s buňkami nes	aklimatizovanými testovány na množství
uvolňovaného NGP	iebrázek 11).
V jiném vý	nzi.ném. provedení vynálezu jsou buňky PC12
zapouzdřeny jedn<	zplašfzve semipermeabiiní membrány a poté
kultivovány in v;	.v; v mezcích primátů po dobu 6 měsíců. Po
šestiměsíční imc1	. ar.zazi buňky vykazují požadovanou buněčnou
vlastnost ja.tczt	z zďp uzéď na reszriktivní podmínky, což
znamená, že u ni.	zh cosi: ke změně produkce r.eurotransmiterú
měřeno poměrem	zvzlněného L-dcca a dopaminu. Lze rovněž
pozorovat změny	relazzvnich produkovaných množstvích

dalších katecholaminů ve srovnání se szavem před implantací (viz obrázek 7).

V jiném výhodném provedení vynálezu buňky PC12 zapouzdřeny a kultivovány i.n vivo v substantia nigra v mozku recipienta, kde je bud’ běžná končenzrece dopaminu, nebo kde byla jednostraně jeho koncenzraoe snížena předchozí administraci 6-hydroxydcpaminu (β-OKDA). Buňky, které byly kultivovány v těchto podmínkách in vivo po dobu 29 nebe 60 dní produkují větší množství L-dopa než buňky kultivované po kratší časový úsek. v buňkách, které byly kultivovány in vivo v normálních koncentracích dopaminu se opětovné implantaci vytváří větší poměr mezi množstvím l-dopa a dopaminu ve srovnání s buňkami, které byly kultivovány v mozcích se 6-OHDA poškozením v cblasti substaznia nigra a zim i v nižších konoenzracích dopaminu (obrázek 9(.

V dalším provedení vynálezu se adrenální chromažinní buňky obalené v dvoupláštové semipermeabilní membráně vystaví působení restriktivních podmínek v subarachniodálním prostoru člověka. Po implantační periodě 55 až 34 dní vykazují buňky změny v produkci neurozransmiterů.

Místa pro	impianzac	i podle vynálezu	zahrnují c	:entrální
nervový systém,	včetně	mozku, komorové	vody a	sklivce.
Výhodnými místy	v mo z ku	jsou striatum,	cerebrální	kortex,
jádra subtnalamu	a basáln	í Meynertovo jádro. Dalším	výhodným

místem je mezkomíšní mok, nejlépe v subarachniodálním prostoru a v oblastech laterálních ventrikulů. Dále vynález popisuje implantaci do subkapsulárních oblastí ledvin a dále intraperiteneálně, subkutánně nebo libovolným jiným teraputicky užitečným způsobem.

V některých př	ípade·:	sh je už	itečné,	jscu-li místa pro
implantaci nejprve	medií	ikována,	nebo	jscu-li mofikována
souběžně s in vivo	akl:	.mat i žací	buněk	Tím je dosaženo
optimální prostředí.	Načít	,k’ ad u z	námého	modelu Parkinscnovy

choroby se používá	edmistrace 6-hyroxydopaminu do substantia
nigra. Tento toxin :	selektivně působí na dopaminergní neurony.
Do takto medií i kov a:	'6 uilCč íár.í id níCflSČL TlCSOlI fc y - --T.C u_5.Ll· _C iflV
buňky určené pro	aklimatizaci. Buňky PC12, které po
implantaci tc	takto poškozeného mozku sekretují
katechoiaminy,	.'xazup i ssooscr.v narůst produxce
katecholaminů po 1	měsíci implantace in vivo. Navíc poměr
jednotlivých katech	claminú se mění spolu s poklesem poměru
basálníhc L-DOPA a	dopamlnu již přibližně po 14 dnech in
vivo.

Lokální podmínky závisí na místě vybraném. pro

implantaci a na	konkrétním živočišném druhu. Je také
pravděpodobné, že 1	cxáln' ccdmínkv v daném imcantační nrsíě
se lisí i meči jede.	ztlivjmi jedinci téheč druhu. Koncentrace
metabolitů a plyn!	. v daném implantačním místě může být
přibližně určena p	. - - — · - 5 f — — v *“’/ “i— 'TJJ. “T —
stanovit odborník z-	;t potřeby nadbytečného experimentování.
Například v	-icsxem te_e se paroialni tia.< kysnxu
pohybuje v rozmezí	5? mmHg v arteriáiní krvi až pc méně než
1 mmHg pracující st	•levé tkáni. Další typické parciální tlaky
kyslíku jsou: 40 mm?	?c v čelní krvi, 47 mmHg v břišní dutině a
59 mmHg mezkorníšním	moku.

Podobně se mě:	ní i koncentrace glukosy v rozmezí 30 až
120 mg/100 ml (4,4	až 6,7 mlh v dobře prokrvených tkáních a
v romezí 40 až 70	mg /100 ml v mozkomíšním modu (CSK-
cerebrospinal fluid	. Viz Vědecké tabulky Geigy, svazek I.,
Měrné jednotky, Tě	(lesné tekutiny, Složení těla, Výživa,
vydání S., editor	0. Ler.tner, CIBA-GZZGY, 1934. Ve těchto
vědeckých tabulkách	lze nají“ tento a další podobné příklady.
V tabulce 1 jsou p	srovnány koncentrace některých sloučenin

v krevním seru a v

Tabulka 1

Sloučenina	Mot komisní mok. Krev (	sérum)
Kyslík	2 ?		mmHg 40	mmHg
Glukosa	100 - 1		mg/100 ml 55 i 15	mg/100 ml
G3±3jCZC 53	o. C C ~~	3	μΜ Π =	μΜ
Giycercl	-Z, z -	-z z	μΜ 120 ± 65	μΜ
Laktát	1,6 = ;	z —	mM 0,7 6 ± 0,34	mM
Pyruvát	lis = 1	-	μΜ 32 - 13	μΜ
Sc S JZC 2.ŽCLCY	o,21 -	h 5	μΜ 2, 5 i 1,2	llM
Mastné k/se'·nv	Ί = z		μΜ 500	μΜ
cAM?	— - Z -		nM 11 i 2,4	nM
cGM?	2,4 - ?	O z	rM 9,5 ±2, 1	rM
Chloridy	lz.Z - d		mM 102, 5 i 4, 5	mM
Ar.org. fosfát	u, z_ z	-z ''	mM 1,05 - 0,31	mM
Sodík	liz — 2	z	mM 140 ~ 2,35
/ scnZhú	-	- , Od	mil 2, 44 x 0, 1	mM
Hcfčík		r —	mM 0,73 - 0,04	mM
Zinek	J ,-.ϊ 22	- ,	LlM 15, 7 - 3,1	uíM
Železo	> / - Z	r -*	LlM 17,2 r 0,-5	iiM
Měď	-·, 2 o -	-z -	LlM 16,25 ± 0,75	μΜ
Mangan	22 =· o		nM 10 — 2,4	nM
Choiin	z z Z Z - ,	r	llM 15, 5 ± 2, 3	μιΜ
li Z 3 Z 3TÚ_L _l·	Ž~ -		rM 3,4 - O,-	nM
\j£ oec lne z z 1 z.	1,4 =		rM 1, 63 ji 1	nM
Zcinelrin	0, -		rM 0,13 - 0, 1	rM
Serotcnin	3 9 - *		nM 50 i 20	zM
Některé	morek	uly,	jako je například glukosa,
ami no kys e1iny,	laktát	a	ribonukleosidy, jsou transportovány
přes hemat ce.oceřalic	kou	barieru do CSF. Tím	dochází k
vyživování obl	Z 23 1 /	které jsou omývány mozkomíšním mekem,
jako jsou např	íklad ‘	' Γ Uf p T*	rikuly, sub arachnoidální prostor a
míšní kanál. T	YC 1 zj	j 50	u například koncentrace	galaktosy v

mozkomíšním moku desetinásobkem jejích koncentrací v krevní plasmě. Koncentrace laktátu a pyruvátu je rovněž vyšší v CSF než v plasmě. Na druhé straně většina aminokyselin je v

krevní plasmě 5	at ol-krát koncentrovanější než v CSF (viz
výše citované Věd	eoké tabulky Geigy, svazek I., strana 169).
— _ ’ x z tl . - ...	ronitrienzy jako je například vitamin C,
íclaty .patři mez	i vitaminy skupiny 3,, deo/.yribonukleotidy,
pyridexm ; vítám.	in Ξ5: jsou aktivně transportovány přes
hernatoencežali ok:'	o barieru do mozkomíšního moku. Navíc jsou
k o n. c e ~ z r a z e z z r. z z:	, jaro jsou sodíkové, draselné, hořečnaté a
chloridové ionty	, jsou v mezkomíšním mku velmi pečlivě
regulovány íSpeot	:r a Johanscn, Scientižic American, strana
68 az ~ i, 198 9. .

Metaboiity	v kultivačním mediu jsou obvykle vybrány
tak, abv bvl cpi	imalizován růst a životaschopnost buněk v
ΐ káňc v4 k—1 z u í ·	koncentráte těchto látek v kultivačním mediu
se obwk' e ';š·	m 'ejion koncentrace v daném imclanzačrMm
místě, často jsou	buňky kultivovány ve vyšších koncentracích
glukosy a seli ne	:ž jaké můžeme shledat v daném implantačním.
místě. Napříklao	mecium 3PMD 1640 obsahuje ll,lwM giokosu,
zatímco kcncentre	ite glukosy se pohybují okolo 4,5 mM v
krevním seru a po:	ote 1,2 až 3,9 v CSF.
Podobně i	concentraoe vápníku v mediu RPMI 1645 je
0,4 mM zatímco '	eho koncentrace v CSF je 1,2 mM a 2,44 v
krevním seru .viz	tabulka 1). Zinková ionty se v krevním seru
vyskytuji v konce	ntraci 0,5 uM, v CSF v koncentraci 16,7 μΜ
zatímco v mediu 31	řMD 1640 zcela chybí.
Dalším rozo	(úlem je, že většina buněk je in vitro
kultivována za vn-	ejsme parciálního tlaku kyslíku (142 mmHg)
nebo v inkubátoru	se vlhkým vzduchem a s obsahem 5 až 7 %
CO-, (Aebischer a	další, Sio-materiais viz výše, Ward a další
viz výše . Tyto :	oarciální tlaky kyslíku jsou výrazně vyšší
než jeho paroiái:	tí tisk in vivo ve vybraném implantačním
místě hostitelské?	,o organismu.
5. - Ξ Se .<Z Z	livační media odlišují od podmínek in vivo
tím, že neoesahu	ji molekuly s krátkou dobou životnosti.

	-20-
Takovéto molekuly	se velmi rychle degradují, ale jsou v
podmínkách in vivo	neustále opět syntetizovány a doplňovány.
Některá kultivačn	1 media jsou obohacována o tepelně
deaktivované fetál:	zí telecí nebo koňské sérum, což slouží k
nahrazení některýcr	látek, nicméně krátkodobé látky se obecně
v seru nevyszytu;	jí, nebo se vyskytují pouze v malých
koncentracích. U -	akte obohacených medií je typicky méně než
20 % z celkové hne	zy media tvořeno šerem z čehož vyplývá, že
v nej lepším přípa:	iě budou tyto látky v mediu v pětinové
koncentraci coroti	samotnému seru. Navíc takto obohacená

media mchou obsahovat látky, které se v hostitelském

organismu jiného	druhu nevyskytují, a které mohou mít
nepříznivý účinek	na zapouzdřené buňky. Dalším problémem je
to, že zatímco kt:	zcentrace většiny komponent krevního sera
odpovídá jejich k	oncenzraci v tkáňovém moku, koncentrace
některých specific-	:ých látek se mohou výrazně lišit.
Použité buňk	podle vynálezu mohou být vzhledem k
hostitelskému orgaz	.ismu aliogenní (t.j. pocházejí ze stejného
biologického d niz'.	: nebo zenogenn4 (occháze^' z jiného
biologického druhu	Ve výhodném provedení vynálezu se do
hostitelského orga:	zismu implantují zenogenní buňky. Obvykle
si příprava buněk	prs implantaci do zenogenní organismu
vyžádá jiné restr	iktivní podmínky než pro implantaci do
organismu ailogen:	tího. Může při tom dojít ke vzniku
fenotvpovš odlišné	populace s jinými buněčnými vlastnostmi.
Buňky mohou	být získány buď přímo z dárcovského
organismu (t.j. prš	.mámí buňky nebo tkáně, včetně dospělých,

neonatáiních a fatálních buněk nebo tkáni), nebo z kultur

replikovaných in vi	tro jako imortalizované buňky nebo buněčné
linie, včetně genet	loky modifikovaných buněk.

Primární buňky mohou pocházet z nedělících se

(post-mi t o t i okých)	normálních tkání, z přirozeně se dělících
(mitotických buněk	, jaks jsou například jaterní buňky, nebo
z pluripo zemních	kmenových buněk, jako jsou například

-9 1slezinné buňky nebo buňky kostní dřeně. M buňkami in vivo mohou být rovněž rakovin. buňky).

oky aktivními íky (tumorové

Primární buňky, které mohou být pc jsou například zárodečné kmenové buňky : faktorům sensitivníoh buněk, odvozené z ' Weiss, Science 255, strana 1707 až 1710 další, Proč. Nati. A.cad. Sci. USA 39, (1992), Ray a další, Proč. Nati. Acad. 3502 až 3506, (1993)', dále pak p:

Schwannovy buňky, astrccyty, β-TC buňky, buňky, oiigodendrocyty a jejich pre) žité podle vynálezu, e r vo v ýc h, k rů s f o v ým N3 savců (Reynolds a i) 19 92), Richarda a trana 3591 až 3595,

Sci. USA. 90, strana imární fibroclasty, ep-G2 buňky, ATT2 sory, mycc_ascy, myotuby, adrenální chromafinní buňky nebo tkáň dřené nadledvin. Výhodné je použití nervových kmenových buněk a adrenálních chromafinních buněk.

Rovněž výhod: způsobem podle ) 92/03536).Zapouzdře do vhodných oblast: poškozením dopamio

Schwanovy buňky mohou být přpraveny nga ¹PCT publikovaná přihláška NO : Schwannovy buňky mohou být implantovány mozku jako prevence před degenerarivním ogníoh neuronů nigro-soriátové dráhy, které se projevuje při Parkinsonovš nemoci. Obecně lze říci, že vhodné místo pro implantaci bude v blízkosti striata. Zapouzdření buněk může vést ke zvýšené sekreci troíickýcn faktorů vzhledem k tomu, že buňky nejsou v přímém kontaktu s neurony. Rovněž nedochází k jejich myelinizaoi. Za stejným účelem mohou být být zapouzdřeny a implantovány i jiné typy gliových buněk včetně astrocytů a oligoadrenocytů.

Z dosavadního stavu buněk nebo- tkání, které p být · tyto způsoby odvozí Langerhansovy ostrůvky velkých zvířat (například pomocí mechanického rozv Scharp a další, patent US :eohniky jsou známy způsoby isolace :dukují vybraný produkt, nebe· mohou y ze známých technik. Například :hou být isolovány ze slinivek : vepřových nebo lidských slinivek) Lnění a štěpení koiagenasou (viz

4,363, 121:·. Z malých zvířat, jako

-22například z krys, mohou být Langerhansovy ostrůvky isolováni pomocí způsobu Sharpa a dalších, Diabetes 29, dodatek i, strana 19 až 30, (1930) .

Podobně i hepatocyty mohou být isolovány z jaterní tkáně štěpením kolagenasou, po kterém následuje frakclcnace tkáně viz Sun a další, oiomat. Art. Ceils, Art. Grg. 13, strana 433 až 496, (1937). Adrenální chromafinní buňky mohct být isolovány známými způsoby podle Livetta, Physioiogi Reviews 64, strana 1103 až 1161, (1934), Sagen a další, patent USA 4,753,635).

Imortalizované buňky mohou zdrojů, nebo mohou vybrány z buněk, které byly transformovány viry, produkty virových proteinů, onkogeny nebe jinými geny či jejich produkty, které způsobují imcrtalizaci. Příkladem takovýchto veřejně dostupných buněčných linií vhodných pro použití podle vynálezu jsou mezi jinými buňky z ledvin mláďat 3EK) , buňky z cvárií čínských, křečků (CEC) , buňky buňky myších embryí NIH-Swiss afrických zelených opic (včetně 3MT-10 a Věro), krysí adrenální /3 i gliové tumorové (C6) :ocnazet o rimarno.cn křečků i myších fibroplastů (L-M , (NIE/3T3), buněčné linie z COS-a, CO5-7, 3SC-1, 3SC-40, pheochromocyfemy buňky, RÁJI (buňky plasmacytomové buňky, z lidských buňky MN9D, odvozené z transgenních myší. Ve výhodném provedení vynálezu jsou použity buňky BEK a PC12.

lymfomů) , MOPC-31C MN9E a buňky ripIAg

Způsoby umožňující imortalizaci buněk jsou uvedeny v pracích Land a další, Nátuře 304, strana 596 až 602, (1933), a Čepko, Neuron 1, strana 345 až 353, (1933) . Potenciálními buněčnými liniemi jsou mimo jiné genetickým inženýrstvím upravené β-buněčné linie sekretujícl insulin jako například buňky NIT (Eamaguchi a další, Diabetes 40, strana 342, (1991), nebo buňky RIN (Chick a další, Proč. Nati. .Acad. Sel. USA 74, strana 628 až 632, (1977), ATT buňky (Hughes a další, Proč. Nati. Acad. Sci. US?- 39, stran 633 až 692, (1992), CEO

-23buňky (Matsumoto a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87, strana 9133 až 9137, (1990) a β—TC—3 buňky (Tal a další, Mol. Cell Bicí. 12, strana 422 až 432, (1992).

Buňky podle vynálezu buď přirozeně produkují biologicky aktivní molekuly nebo k tomu mohou být genetickou manipulací upraveny. Napřílab fibroplasty mohou být trans šikovány expresivním vektorem, který zabezpečí produkci vybrané látky (například nervového růstového faktoru, erythropcetinu, insulinu, CNTF nebo faktoru VIII).

Příkladem biologicky aktivních molekul využitelných k léčbě onemocnění nebo poruch jsou mimo jiné isulin, využitelný při léčbě cukrovky, parathyriodální hormon, který může být použit při léčbě hypcparathyroidismu, erythropoietin, který může být použit při léčbě anemií a gama-amino-máselná kyselina, která může být použita pře léčbě epilepsie.

Biologicky aktivní látky jako například trofické a růstové faktory mohou být použity při léčbě a prevenci neurcdegenerativních onemocnění jako jsou například Huntingtonova a Aizheimerova choroba, demence doprovázející AIDS a Parkinsonova nemoc. Faktory biologické odpovědi jako například lymfokiny nebo cytokiny mohou posílit imunitní systém pacienta, nebo mohou působit jako protizánětlivé látky. Takovéto biologicky aktivní látky mhou být použity při léčbě některých chronických infekčních onemocnění nebo některých forem nádorového bujení. Dále mohou být zapouzdřenými buňkami uvolňovány katecholaminy, endorfiny, enkefaliny a další opioidní peptidy utišující bolest.

Zapouzdřené buňky podle vynálezu mohou být použity také k tomu, aby organismu dodávaly biologicky aktivní molekuly sloužící při korekci enzymatické deficience. Příkladem takové deficience je prudký jaterní výpadek, při kterém není jaterní tkáň nadále schopna odstraňovat toxiny nebo odpadní produkty

-24metabolismu. Dalším příkladem je fenylketonurie, při které je aminokyselina řenylalanin produkována až dosahuje v krevním oběhu postiženého dítěte nebezpečných koncentrací.

V jiném pr produkovat bioic· vylučování škodil hostitele. Napři; scavsngery, které o u o g z c ky a například hormony, faktory, trofické faktory, lymfokiny agonisté, prekurso fragmenty. Těmi ~ enkefaii.tv a dalš faktor vlil, eryt: faktor (NGF;, neur giiových buněk (G factor), růstový f piateief-derivsd z vedení vynálezu mohou zapouzdřené buňky icky aktivní molekuly, které usnadní •ých nebo nežádoucích produktů z těla lad mohu zapouzdřené buňky uvolňovat zmáhají vylučovat například cholestrol.

ktivními molekulami podle vynálezu jsou cytokiny, růstové faktory, angiogenní faktory, protilátky, krevní koaugulační , enzymy a další terapeutické látky a ry, aktivní analogy nebo jejich aktivní sou například katecholaminy, endorfiny, i cpicidní peptidy, dynorfin, insulin, '.ropoietin, substance P, nervový růstový otrofní faktor odvozený od buněčné linie :NF- glial-cell-line derived neurotrophic ktor odvozený od krevních destiček (PDGFrtwth factor, epidermální růstový faktor i faktor odvozený z mozku (BDGF-brain ;or) , neurotrofin 3 (NT-3), neurotrofin 4/5 fibroblastových růstových faktorů, ciliární (CNTF), molekuly blízké CNTF a růstové mulinu (faktory I, II a III).

rovedení vynálezu je biolgicky aktivní '.smiter. Takovým neurotransmiterem může být gama-amino-máselná kyselina (GA3A) , :hclin, norepinefrin, epinefrin, kyselina .r.é peptidové neurotransmitery. Dále mohou .vr.ími molekulami podle vynálezu agonisté, nebo fragmenty neurotransmiterů včetně tterý funguje jako prekursor dopaminu.

(EGF), neurotroín derived grcwth fac (NT-4/5), skupina : neurotrofní faktor faktory podobné inu

V j ednom p molekulou neurotra: například dopamit serotonin, acetyi; glutamová, nebo ji být biolgitky akti analogy, deriváty například L-dopa,

-25V jiném provedení vynálezu .mohou být použity aklimatizované buňky produkující látky potlačující bolest jako jsou například katechoiaminy, enkefaliny, opioidní oeptidv nebo jejich agonisty či analogy, nebo jejich směsi.Ve výhodném orovedení vynálezu jsou sekretovány katechoiaminy nebe enkefaliny, ve velmi výhodném provedení vynálezu je

Kaosuie podle vynálezu mají typicky alespoň jednu vnější membránu nebo obálku, která ohraničuje jádro s buňkami. Tato obálka umožňuje difusi živin, biolgickv aktivních molekul a jiných vybraných sloučenin. Kapsule je biokomoatibilní a výhodně i imunoisoíační. Jádro kapsule obsahuje isolované buňky ať již suspendované v kapalném mediu nebe zmobilizované v hydrofiiní geíové matrici.

Vvbšr materiálu použitého při výrobě obálky kapsule závisí na mnoha faktorech a je podrobně popsán v přihlášce Bionne WC 92/19195. K vyýrobě obálky kapsule mohou být obecně ooužitv rozličné polymery nebo polymerní směsi. Polymerní membrány tvořící obálku kapsule mohou obsahovat poiyakryláty, (včetně akrylátových kepelymerůi, poiyvinylideny, kopolymery poiyvinylchlcridu, polyuretany, polystyreny, polyamidy, acetáty ceiulosy, nitráty celulosy, polysulfony, polyfosfoaze.uy, poiyakrvionitrily, PAN/PVC jakož i jejich deriváty, kopolymery a směsi.

Kapsule podle vynálezu mohou být připraveny libovolným způsobem známým ze stavu techniky. Jedním takovým způsobem je společné vytlačování polymeračního roztoku spolu s koaguiantem jako jsou například fragmenty biologických tkání, organeiy nebe buněčná suspenze a/nebo jiné terapeutické látky. Obálka může být jednoplášťové (typ 1, 2) nebo může být dvoupíášťová (typ 4). Jednoplášťové duté vlákno může být připraveno rychlým srážením pouze jednoho povrchu polymeračního roztoku v průběhu jeho společného vytlačování s buněčnou suspenzí. Dvoupiášťové duté vlákno může být

připraveno chlazením dv	ou povrchů poiymeračního roztoku v
průběhu jeho vytiačcvání	.. Typicky je u vláken typu 1 větší
část povrchu obsazena ms	.kropóry ve srovnání s dutými vlákny
typu 4. Dutá vlákna	typu 2 obsahují střední množství
makropórů. Viz napříkiaz	i Dionne WO 92/19195 a patenty USA
5,233,137 a 5,234,~ci.

Kapsule pcdie vynál	.ecu mehou misi různé tvary například
válcový, diskový nebo kruž	. o v y.
Velikost córů v obá	•lee kapsule určuje maximální molární
hmotnost molekuly, která	ještě semipermeabilní membránou může
projít (MWCO- Molecular	weight eut ort) . Molekuly s větší
relativní molekulovou hru	itnosfí než je hodnota MWCO nemohou z
fyzikálních důvodů memř	:ráncu procházet. Velikosz pórů v
membráně ) e crzzc v,'brán	.a tak, aby dané faktory produkované
zapouzdřenými buňkami mor	:ly difundovat ven t kapsule, ale aby
zároveň nebyl možný opa:	žný pohyb faktorů imunitní odpovědi
hostitele. Typicky je	hodnota MWCO mezi 50 až 200 kDa,
výhodně pak mezi 50 až 1	.30 kDa. Ve velmi výhodném provedení
vynálezu minimalizuje	rovněž složení membrány nežádoucí
reakce mezi efektcrcvýml	molekulami imunitní reakce hostitele
a složkami vnějšího· povrž	:hu kapsule.
Jádro imunoisciační	. kapsule podle vynálezu je vytvořeno
tak, aby vytvářelo vhodné	: podmínky pro konkrétní buňky. Jádro
může obsahován kapalné	medium schopné zabezpečit buněčný
růst. Kapalná jádra	jsou vhodná pro kultivaci
transformovaných buněk	jako jsou například buňky 9012.

V jiném provedení vynálezu může jádro obsahovat gelovou matrici. Tato geicvá matrice může být tvořena hydrofilním gelem (aiginat, Vitrcgen a tak dále), nebo složkami extracelulárni matrice (viz Dionne WO 92/19195).

Sloučeniny, které t	veří hydrofilní gely můžeme rozdělit
do tří skupin. V první	. skupině jsou gely nesoucí čistý
negativní náboj (nagřílač	. aiginat) . Druhou skupinou jsou gely

Z 7 nesoucí positivní Komerčně dostupné pozitivní náboj j třetí skupinny můž: náboj (například polyvinylaikohol).

Jádra tvořen vhodná pro kultiv; formování shluků Langerhar.sových os

Mezi faktory, umístěné do jádra k a tvar kapsule, (2 požadavky na viskot: plnění kapsulí. I ořihlášce Dionr.e W2 náboj ( nacříkíad kolagen a laminin). složky extraoeíulární matrice nesoucí ;u například Matrigel^ a Vitrogen-’. Do :e zařadit takové gely, ktré nenescu žádný ;75ocs zesítěnv coivethvien oxid nebo hvdrofilnl geicvcu matricí jsou zvláště buněk nebo tkání, jež mají tendenci k oo agregáoů, jako jsou například buňky ovků nebo cnromafinní adrenální buňkv.

které ovlivňují množství buněk nebo tkáně •csule podle vynálezu, patří (íj velikost mitotická aktivrza buněk v kapsulí a (3) tu jádra a/nebo na viskozitu suspenze při /to faktory jsou podrobně popsány v 92/19195.

Implantované makrokapsule mohou být snadno odstraněny z hostitelského organismu pomocí úponu přpevněného ke kapsulí. Mikrokapsule mohou být odstraněny odsátím nebo libovolným jiným vhodným způsobem. Odstraňování mikrckapsuií je usnadněno použitím zběrnéb.o zařízení, jak je popsáno v PCT/US93/0707S.

K uzavření kapsulí může být použito libovolného vhodného způsobu, včetně využití polymerních adhesiv a/nebo obrubování, zavazování nebo teplného uzavírání. Všechny tyto způsoby jsou známy v dosavadním stavu, techniky. Dále může být použito libovolného suchého způsobu uzavírání. V takovýchto způsobech je použit neporázní instalační bod, kterým je do kapsule vpraven roztek obsahujíc! vybrané buňky. Po naplnéní je kapsule neprodleně uzavřena. Takový způsob je popsán v PCT/US94/07015.

Před implantací kapsule do hostitelského organismu je ve výhodném provedeni vynálezu nejprve provedena zkouška

-23funkčnosti v podmínkách in vitro. Pro tyto účely mohou být použity běžné zkoušky nebo diagnostické testy, známé z dosavadního stavu techniky (viz například Methods in Enzymology, editor Abelson, Academie Press, 1993). Například mohou být použity ELISA (enzyme-linked imunosorbent assay, imunosorbční enzymatická technika stanoveni), chromatografická nebo enzymatická zkouška, nebo biologická zkouška specifická pro konkrétní produkt. V případdě petřeby je možné sledovat sekreční funkci některého z implantátů v průběhu určité periody tím, že jsou odebírány vhodné vzorky (například sérum) z těla recipienta a ty jsou poté podrobeny analýze. V případě, že recipientem je primát, může být použizo mikrodialýzy.

Metabolická aktivita buněk může být monitorována sledováním takových funkcí jako je příjem kyslíku, využití glukosy, nebo mitochondriální funkce. Příjem kyslíku může být měřen způsoby známými ze stavu techniky (například pomocí systému Diamond General Oxygen Uptake (č.1271) a Clarkovy elektrody (č.731) s polyethylenovou membránou).

Genetická stabilita buněk, které byly zkonstruovány kvůli expresi xenogenních genových produktů může být stanovena tak, že se pomocí způsobů známých ze stavu techniky určí počet kopií genového insertu. Například počet kopií plasmidu může být stanoven tak, že se nejprve enzymaticky naštěpí genomová DNA, přeblotuje se, hybridizuje se sondou a nakonec se síla signálu porovná se známými standardy pomocí systému Phosphorlmager®.

Počet kapsulí a jejich velikost by měla být dostatečná k tomu, aby po implantaci došlo k léčebnému učinku. Tyto údaje jsou stanoveny podle množství biologické aktivity nutné pro konkrétní aplikaci. V případě sekrečních buněk produkujících terapeutické substance jsou pro určení množství požadované terapeutické substance použity standardní úvahy a kriteria pro dávkování známé z dosavadního stavu techniky.

-29Faktory, které je nuto přitom brát v úvahu viz Dionne, WO92/19195.

Implantace zapouzdřených buněk je provedena za sterilních podmínek. Kapsule je obecně implantována na místo, které umožní vhodnou distribuci sekretovaného produktu a transport živin k implantovaným buňkám či tkáni a dále rovněž umožní snadný přístup ke kapsuli pro případ jejího vyjmutí nebo náhrady. Vynález bude podrobněji popsán v následujících oříkladech, které vsak nelze v žádném případě považovat za omezující pro provedení vynálezu.

Příklady

Příklad 1:

O Θ ] SOU a gl·

NGF zapouzdřeními BKK buňkami, které taveny prostředí s nízkým obsahem kyslíku

Produkce buněčné linie BHX-hNGF

EKK linie buněk, které sekrefují NGF, byla produkována a dále ponechávána v prostředí s nízkým obsahem kyslíku a glukosy.

2,51 kb fragment obsahující přibližně 37 párů bází z 3' konce prvního intronu, zdvojenou ATG sekvenci považovanou za začátek translace proteinu pre-pro-NGF a kompletní kódující sekvenci a celou 3'nepřekládanou oblast lidského genu (Koyle a další, Neuron, 10, strana 1019 až 34, 1993) byla subklonována do expresivniho vektoru pNUT založeného na DKFR těsně vedle promotoru pro myší metallothionein-1 proti směru transkripce (-650 až +7) a první intron genu krysího insulinu II (Baetge a další, Proč. Nati. Acad. Sci., 83, strana 5454 až 58 (1935) ) .

-30Euňky z ledvin mláďat křečků (BHK buňky) byly transfikovány konstruktem pNU?-b-NGF za použití kalcium-fcsfátové metody. BHK buňky rostly v DMEM obsahujícím 10% řetáiní hovězí sériím, ix pen/ střep/ amř B (0.3 g/1) , a L-gíutamin (GTBCO;, v 5% oxidu uhličitém a 37°c. Transřikované BHK buňky byly selektovány v mediu obsahujícím 200uM methctrexár (Sigma' po dobu 3 až 4 týdnů a rezistentní buňky byly dále udržovány jako polykionální populace v mediu bud” s nebo bez 2 3 3uM methctrexátu.

Příorava PAN/PVC vláken:

Semipermeabilní dutá vlákna zvlákňování proudem vlhkého vzduch?. (Cabassc, Hoilow Eibers Membranes byla připravena pomocí (dry jet-wet spinning) Membrány dutých vláken, svazek 12, KirkWiley, New Ebrk, W'O 92/19195; . .A roztoku kopoiym ( PAN/ PVC) v dim· přímo v koagulač sbírána do vodr.

trnerov . vzdán:

ncykíopedie chemické technologie, strana 492 až 517, 1930, Dionne, dutá vlákna byla odlévána z 10% pclyakrylonitrilu a polyvinylchlcridu yl sulfoxidu (w/w) a prudce schlazována lázni. Výsledná dvcuplášťová vlákna byla lázně bez rozpouštědel, givcerinována a susena.

Příprava matrice ml kolagenu z ocasu krysy (Typ IV, Collaborative, lot 91 až 1083) bylo přidáno k 1 ml PBS s fenolovou červení (Phosphate Buffered Salině- fosfátem pufrovaný fysiologický roztok) a pří tonete roztoku bylo upraveno na 7,0. Ke 2 ml P3S s fenolovou červeni bylo přidáno 3 mi Vitrogenu“ (Celtrix, Palo Alto, CA, Let 923173). Matriční roztok byl vytvořen smíšením roztoku kolagenu a Vitrogenu⁹ v poměru 1:1.

-31Postup plnění a uzavírání vláken

Jednotlivé buněčné suspenze 3KK buněk produkujících NGF, které rostly s 90% synchronizací, byly vypláchnuty P3S (bez vápníku a hořčíku), štěpeny trypsinem po dobu přibližně 1 minuty a peietovány centrifugací při 1000 otáčkách za minutu po dobu 3 minut. Buňky byly resuspendovány v mediu na konečnou koncentraci 2xl0⁷ buněk/mi. Tato buněčná suspenze oak bvia smíšena v ccměru í:l s .agen/Vitrogen’ matričním roztokem, výsledná koncenrace buněk tedy byla IxlO⁷ buněk/ml.

Buňky byly jemně vmíchány do matrice tak, aby byla zajištěna rovnoměrná distribuce koagulační hmoty před zapouzdřením. Vlákna pak byla plněna 2.5 ml koagulační matriční hmoty obsahujízí buňky (10,000 buněk/ml) za použití zešikmené šoičkv katezru a Hamiltonc-vy stříkačkv.

Kapsuie úseku suchého ; proximáiním ko buněk do nitra yiy uzavírány upevněním i až i. I cm dlouhého otého vlákna na dutý hřídel s příčně uzavřeným cem. Z hřídele bylo přístup možné injikování zařízení. Poté, co byla vlákna naplněna 2.5 ul buněčné suspenze, septum bylo odlomeno cnstucovv otvor uzavřen pomocí světlem polymerujícího akrylátu (Luxt.rak-⁴ LCM

24, ICI Besins US, Wiimington, MA; . Následně byly kapsuie opatřeny manipulačním očkem. Na každou kapsuli byla připevněna i. 5 cm dlouhá silikonové trubice (hadička) o průměru 0.020 na akrylázové hrdlo.

Kapsuie byly aklimatizovány po dobu tří dnů za atmosférického tlaku kyslíku, a testovány na basální sekreci NGF. Tři dny staré medium bylo vyměněno 1 ml čerstvého média.

Poté byly kapsuie umístěny do jamek 24-jamkových destiček, ve kterých byla buď nízká hladina glukosy (0,8 mg/1) a kyslíku (50 mmHg) nebo vysoká hladina glukosy (5,5 mg/1) a atmosférický tlak kyslíku (142 mmHg). Média byla vyměňována a měření NGF prováděna každých 7 dní. 1 den před výměnou byly v čerstvých médiích nastaveny příslušné koncentrace Zapouzdřené čtyř týdnů.

kysliku pro jednotlivé buňky byly kultivovány

3.CG odminky akiimatiz mto způsobem po dobu

Hladiny NGF tyly určovány pomocí FZLI3A testu (enzyme-linked immuncsorbent assay - imur.o-enzymatické stanovení na pevné fázi) ve dnech 0, 3, 7, 14, 21, a 23. Reprezentativní kapsule byly pro histologická určení životaschopnosti buněk fixovány 4% paraformaidehydem.

Po fixaci ve 4% paraformaldehydu byly vybrané kapsule promývány ve fosfátem dehydratovány v abso glykol-methakryiátovéj Mounting Medium, Re i pudrovaném fyziologickém roztoku (PBS),

alkoholu do	95 %	a vloženy do
'ilt račního	roztoku	(Z-Zist cresine
ung) . Pomocí	mikrot	cmu (Superout

uce*

2065, Leica) na sklíčka a

NGF EL ISA.

Kvantifikace hNGF uvolněného te zapouzdřených 3Z-ZK/NGF buněk byla prováděna následovně. Mikrotitrační ΞΖΖ.Ι3Α desky (Nunc-immuno Maxisorc) byly potaženy protilátkou proti myšímu b-NGF (2,53), rozpuštěnou v potahovacím pufru (lxPBS bez CaCl₂ a bez MgCi₂/G,l% azid sodný, pH 9,6). Použitá koncentrace protilátky byla 1 ng/ml, pro potažení každé jamky destičky bylo použito 150 μΐ tohoto roztoku protilátky. Takto připravené destičky byly inkubovány ve 37°C po dobu nejméně 2 hodin nebo ve 4³C přes noc.

Potahovací roztok byl odstraněn, jamky byly 3x propláchnuty 300 μΐ promývacího pufru (50 Tris-HCi/200 mm NaCÍ/1% Triton X-iCC/0,1% azid sodný, pH 7,0) a blokovány 300 μΐ potahovacíhc roztoku, který obsahoval BSA. (10 mg/ml), v pokojové teplotě po dobu 30 minut. Pak byly buňky opět 3x propláchnuty 300 μΐ promývacího pufru. Vzorky kondiciovaného média byly zředěny 1:1 v dvakrát koncentrovaném vzorkovém

-33pufru (vzorkový pufr je stejný jako promývecí pufr, obsahuje navíc pouze 2 % BSA) . Do každé jamky bylo přidáno 10 ul připravených vzorků. Destičky byly inkubovány po dobu nejméně dvou hodin při teplotě 37°C nebo ve 4°C přes noc.

Všechny jamky byly 3x propláchnuty 300 μΐ promývaciho pufru a poté bylo do každé jamky přidáno 100 ul konjugátu (4 U/ml) protilátky proti myšímu b-NGF(2,5S)-b-gal. Destičky byly inkubovány ve 37°C nejméně 1 hodinu. Všechny jamky byly vyprázdněny, 3x propláchnuty 300 μΐ promývaciho pufru a poté bylo přidáno 200 μΐ b-D-galaktopyranosidového substrátového roztoku s chlorfenolovou červení (40 mg CPRG ve 100 mM HEPES/150 mM NaCl/2 mM MgCl/0,1% azid scdr.ý/1% BSA, pH 7,0). Destičky byly inkubovány při teplotě 37°c půl hodiny až hodinu nebo do té doby než proběhla dostačující barevná změna pro fotometrické stanovení při 570 mn.

Výsledky

Na obrázku i a 2 je vyneseno uvolňováni NGF, vztažené na jednu kapsuli, jako funkce času ve dvou různých prostředích pro 10% vlákna typu 4 s uzavřenými hrdly (hub sealed). Údaje jsou vyjádřeny v ng NGF uvolněného jednou kapsuli během 24 hodin. Produkce NGF vztažená na jednu kapsuli během sledované periody rostla.

Příklad 2: Sekrece NGF buňkami BHK aklimatizovanými po jejich zapouzdření do kapsuli s rozdílnými hydraulickými permeabilitami

V tomto Příklade byly používány BHK-hNGF buňky popsané v Příkladě 1. Dutá vlákna byla připravována stejně jako v Příkladě 1, při výrobě makrokapsulí však bylo kromě 10% PAN/PVC v potahovacím roztoku použito též 12,5% a 15% PAN/PVC. PAN/PVC dvouplášťová vlákna (T4) byla 1 cm dlouhá a měla následující charakteristiky:

-34% sušiny Vnitřní průměr (pm; Hydraulická propustnost

721 60

12,5 733 20

746 13 (hydraulická propustnost je udána v ml/min/m*/mmH

BHK-hNGF buňky byly plněny do tří typů makrokapsulí a kapsule byly uzavírány stejně jako v Příkladě 1. Kapsule byly vystaveny prostředí s nízkým obsahem glukosy a kyslíku po dobu čtyř týdnů a testovány na uvolňování NGF tak, jak je to popsáno v Příkladě 1.

Produkce NG tří různých typů kapsuli vyjádřená jako funkce času je ukázána na obrázku 3. Průměru vcmovant z kapsule s 10% PAN/PVC bylo po čtyřech týdnech kolem 30ng na kapsuli za 24 hodin, ve srovnání s 30ng na kapsuli za 24 hodin u kapsule s 12,5% PAN/PVC. Kapsule s 15% PAN/PVC neprodukovala po 1, 2, 3 ani 4 týdnech detegova NGF. Histologická zkoušky potvrdily, ze zdravá :ur.s.<

byly přítomny pouze v kapsulích s 10% a 12,5% PAN/PVC. V kapsulích s 15% PAN/PVC byly po čtyřech týdnech přítomny pouze mrtvé buňky.

Příklad 3:

Zapouzdřené hostitelského

BHK-hNGF organismu buňky implantované dc

Zapouzdřené buňky z Příkladu 1 byly vystaveny prostředí s nízkým obsahem kyslíku a glukosy jako v Příkladě 1 tak dlouho, dokud sekrece NGF z BHK buněk za těchto restriktivních podmínek nebyla stabilní. Zapouzdřené buňky byly implantované do lidského hostitelského organismu. Implantační místa zahrnovala laterální komory a striatum mozku. Postup implantace kapsuli do mozku viz Aebischer a další, WO 93/00127.

-35Příklad 4: Zapouzdřené chromafinní buňky nadledvin vystavené restriktivním podmínkám in vitro

Hovězí chromafinní buňky nadledvin byly z nadledvin odebrány pomocí částečné digesce kolagenázou, tak jak je popsáno v práci Livett, Physiol. Rev., 64, strana 1103 až 62 (1934). Shluky buněk nadledvin byly imobilizovány v 1,5% alginátové matrici zasíťované pomocí CaCl. a zapouzdřeny do dvouplášťových dutých vláken typu 4 z imunoisolační PAN/PVC membrány (s vnitřním, průměrem 750 um, tloušťkou stěny 35 um, MWCO 60 kD), jak je popsáno ve WO92/19195.

Zapouzdřené buňky byly kultivovány po dobu 2 týdnů při parciálním tlaku kyslíku 20, 40, 60, 30 a 142 mmHg. Buňky byly testovány na basální sekreci katecholaminů, evokovanou inty 7, ve dnech 2 a 14. Po 14 dnech byly capsuie fixovány ve 4% parafcrmaidehydu, zpracovány pro histologii, rozřezány a morfologicky testovány.

Katechoiaminy byly analyzovány pomocí HPLC za použití elektrochemické detekce. Chromatografický systém používal couiometrický mult ielektrodový detektor (model 5100A., ESA., Tne.), čerpadlo Hitachi (Hitachi, lne.) a chromatografickou kolonu Hypersil 150 mm x 4,6 mm., 3 mikron ODS (Keyszone Scientific, lne.) napojenou na MPLC kolonu NewGuard (A.ppiied Biosystems, lne.). Celý postup byl prováděn při 26°C.

Mobilní fáze se skládala z 75 mM NaH,PO₄, 1,4 mM oktansulfonové kyseliny, 0, 274 mM EDTA a 100 ml/1 CH₃CN. pH bylo upraveno na 3,0 použitím koncentrované kyseliny fosforečné. Průtoková rychlost byla udržována 1 ml/min.

Detektor byl vybaven preinjektorovým bezpečnostním článkem (model 5020), pracujícím při +450mV a vysoce citlivým duálním analytickým článkem (model 5011) operujícím na oxidativním principu s napětími -40 mV a +400 mV na první

-36rescektive druhé elektrodě. Analyzované vzorky se měřily na druhém detektoru.

Na ověření detekčních prahů byla použita trojitá měření standardů. Detekční práh činil 52 fmol pro L-Dopa (L-3,4dihydrcxy-fenyl-alanin), Dopac (3,4- dihydroxy-fenyl octovou kvseiinu , norepinefrin (ΝΞ), dopamin (DA) a 104 fmol pro HVA (homcvánicovou kyselinu). Velikosti standardních odchylek pro detekční prahy byl 2 až 5 %, 9 až 12 %, 15 až 24 % respektive 6 až 17 %. Kalibrační křivky tvořené sedmi body (každý pocházel z jednoho měření) byly lineární v celém měřeném rozsahu anaivtu od 52 do 3300 fmol pro L-Dopa, Dopac, ΝΞ a DA. a v rozsahu od 104 do 6600 fmol pro HVA. Hodnoty r‘ byly pro jednotlivé látky 0,999; 0,993; 0,999 respektive 0,999.

a piky integrovaný za použiti přístroje Waters 345 VAX Chromatography Workstation.

75-sc.<7 z aer pikomo.ee a obrázek 4. Údaje (základní produkce) jsou vyjádřeny v tebo v píkomol·ech za 15 minut (produkce vyvolaná ionty K*i . Při vyšších koncentracích kyslíku základní a zejména ionty K* evokované uvolňování jak ncrepinephrinu (ΝΞ), tak epírephrínu (ΞΡΐ), bylo vyšší ve dni 14 než ve dni 2. Vystavení zapouzdřených buněk restriktivním podmínkám tedy vedlo k ovlivnění jedné nebo více buněčných vlastností.

Příklad 5: Zapouzdřené chromafinní buňky nadledvin vystavené in vivo restriktivním podmínkám

Hovězí chromafinní buňky nadledvin byly připraveny stejným způsobem jako v Příkladě 4. Agregáty buněk nadledvin byly zmobilizovány v 1,5% alginátové matrice zesíťované pomocí CaCl. a zapouzdřené buď do jednoplášťové (typ 2) imunoisaíační PAN/PVC membrány dutých vláken (vnitřní průměr 500 pm, šířka stěny 70 až 90 pm, MVCO 60 kD) - nebo dvoupiášťové (typ 4) imunoisoíační PAN/PVC membrány (vnitřní

-37průměr 500 um, tloušťka stěny 70 až 90 pm, MWCO 60 kD) , tak jak je popsáno v WO92/19Í95.

Zapouzdřené buňky byly vystaveny restriktivním podmínkám in vivo implantaci do striata krysích recipientů. Každé kryse byly implantovány bilaterálně dvě kapsuie. Po řezu vedeném v mediální ose byla do lebky vyvrtána díra v souřadnicích +0,5 mm od bregmatu, 3 mm lateráině, přičemž upevnění celého stsrectaktického zařízení bylo 0,3 mm pod intra-auráiní linií. Kapsuie byly vnořeny 7 mm pod tvrdou plenu mozkovou.

Produkce katecholaminů kapsulemi byla testována před implantací a po 6 týdenní periodě in vivo. Katecholaminy byly delegovány stejným způsobem jako v Příkladě 4.

Obrázek 5 ukazuje výsledky obdržené při použití membrán týmu 2. Óda je jsou vyjádřeny v pikomciech na kapsuii za 15 minut. Úroveň basálního (panel A.) a ionty K* navozeného (panel C) uvolňování NE a EPZ byly podobné před implantací a 5 týdnů pc implantaci. Nicméně úroveň nikotinem vyvolané sekrece NE a EPZ (panel B) po 5 týdnů trvajícím vystavení buněk podmínkám in vivo byla vyšší než úroveň sekrece před implantací.

Obrázek 6 ukazuje výsledky obdržené použitím membrán typu 4. Úroveň ionty K* navozené sekrece NE a EPZ (panel C) byla podobná před imlantací a 6 týdnů po implantaci. Nicméně úroveň nikotinem navozeného uvolňování NE a EPI (panel B) po 6 týdnech v podmínkách in vivo byla vyšší než před implantací. Navíc byl rozdíl mezi basální úrovní uvolňování katecholaminů před implantací a 6 týdnů po implantaci (panel A) .

Příklad 6: Zapouzdřené chromafinní vystavených in vivo restriktivním podmínkám buňky nadledvin

-3 3 Hovězí cnromafinní buňky nadledvin byly připravené stejným způsobem jako v Příkladě 4. Shluky buněk nadledvin byly imobilizovány v 1,5% aicinátové matrici zasíťované pomocí CaCi. a zapouzdřené v vláknech typu 4 z dvouplášťové imunoisolační Pěli/PVC membrány (s vnitřním průměrem 500 um, tloušťkou sněny ~až 90 um, MWCO 60 kO , jak je popsáno ve WO922/19195.

Zapouzdřené buňky byly vystavené in vivo restriktivním podmínkám implantací do spinálního subarachnoidálního orostoru krysích recipientů. Chirurgický postup viz Aebischer a další., WO 93/00127.

Produkce katecholaminů kapsulemi byla testována před implantací a pc 6 týdenní periodě in vivo. Katechclaminy byly detegcvánv stejným, způsobem jako v Příkladě 4. “daje jsou vyjádřené v pikomoleoh na kapsulí za 30 minut.

Obrázek 7 ukazuje rozdíl v úrovni produkce ΝΞ a ΞΡΙ ořed a oo imolantaci. Zaocuzdřené buňkv oviv imclantovánv na doou o mesrcu. z mesrcrcn rn vivo cy_a jak oasami, tax nikotinem stimulovaná produkce ΞΡΙ signifikantně snížená, ircdukce id bvla signifikantně z^- ;ena.

’říkiad 7: Zapouzdřené PC12 buňky vystavené in restriktivním codmínkám v mozku orimátů vivo

PC12 buňky byly kultivovány v kultivačním mediu RPMI doplněném o 10% teplem inaktivované koňské sérum, 5% fetáiní- telecí sérum a o 100 jednotek penicillinu/streptomycinu, byly odebrány z kultivačního media, centrifugovány a supernatant byl odstraněn.

Vvsokomoled ve 150 ml sterilr za současného int na 6,2 použitím .mí chitosan Fluka (4,4 g) byl rozpuštěn o 0,35% fyziologického roztoku při 70°C, zivního míchání, pH roztoku bylo upraveno : ml 100 mM pufrovaného fyziologického

-39roztoku HSRES (pH filtr s póry o velí

Roztok chitos použit k resuspenc·: buněk/ml. Roztok bs vytlačován spolu jednoplášťové XR11 vláken (s vnitřním až 65 um, MWCO 65 53 ml/min/m~/mmHg, 3xi0'⁴ cm/s, koefici velikosti, jimiž vyrobena použitím patentech Spojený· 5,234,751. Vlákna

3,0). Roztok byl sterilně filtrován přes kosti 0,22 um (Miilipore).

snu cyl smíšen se stejnými množstvím RRMI a svání buněčné pelety na koncentraci 5x10’ sněk v ohitosanu (přibližně 1,000 uD byl

RAN/R72, ak aby byly utvořeny RAN/RV2 memb r ány dut ých průměrem 450 až 500 um, tloušťkou stěny 50 až 100 kD, s hydraulickou propustností s koeficientem transportu glukosy .ent propustnosti odpovídal pórům o takové o imur.o iso laneprojde 33 % 3SA) . lau obecného postupu, kter;

vlákna byla ř popsaný v (ořibii;

sm o,zoo,lo / a byla nastříhána na požadované rozměry a uzavřena tecelnvm obroubením konců.

3,331,

Zapouzdřené bučky byly implantovány do tří opic druhu cynomoiugus. Chirurgické zákroky byly provedeny podle práce Aebischer a další, 772 93/10127. Dvě kapsuie byly implantovány do kaudální oblasta a tři další byly implantovány na různá místa v putamen. Jmenovité sterectakťické souřadnice pro implantaci do putamen a do kaudální oblasti byly odvozeny následovně: místo v putamen 1 = 23.0 mm anteriorně od intra-aurálního počátku, 9,0 mm laterálně od šípového švu a

16,5 mm ventrálně od povrchu mozku, místo v putamen 2 = 19,0 mm anteriorně od intra-aurálního počátku, 10 mm laterálně od šípového švu a 19,5 mm ventrálně od povrchu mozku a místo v putamen 3 = 15,5 mm anteriorně od intra-aurálního počátku, 11,5 mm laterálně cd šípového švu a 21,0 mm ventrálně cd povrchu mozku. Místo v kaudální oblasti 1 bylo 13 mm anteriorně cd intra-aurálního počátku, 4,0 mm laterálně od šípového švu a 15,0 mm ventrálně od povrchu mozku, místo v kaudální oblasti 2 bylo 22,0 mm, 4,5 18,0.

- j ς Zapouzdřené buňky byly Implantovány na cobu přibližně 6

měsíců a poté byly opět vy-perc	;vár.y. V kapsuií byly stanoveny
před i po-implantační kznce.m	trase basái.mího a draselnými
ionty evokovaném! L-dcpa	(L-d;, ncrepinefrinu (NE),
epineřrinu (E?I), dopac . ic : ,	ácpaminu (LA), a hcmcvanilové
kyseliny (EVA), viz Příkiai 4.	V tabulce 2 uvedená data jsou
vyjádřena v pikomolecb na kap.	suli za 32 minut (pro basáiní
koncentrace) nebo v pikomoiec:	o na kapsuií za 15 minut (pr
koncentrace po indukci E'-ion:	:y.! . Jak dokládají výsledky v
tabulce 2, vlastnosti zapouzd	řených buněk se po c-měsíční
exoosici v restriktivních oodmí	nkách výrazné změnil·/.

Vysvětlivky k tabulce 2:

L-d L-dcpa dpc čcpao	CL,C2 kaudální místo
ΝΞ norapinefrin LA icpamo

-40Zapouzdřené buňky byly implantovány na měsíců a poté byly opět vyoperovány. u kapsu) před i po-implantační koncer.t race ionty evokovaného L-dopa (L-d;, n epineřrinu (EPI) , dopac (dpc;, dopaminu (LA kyselinv (HVA), viz Příklad 4. V tabulce 2 ; vyjádřena v pikomolech na kapsuli za 30 mi koncentrace) nebo v pikomolech na kapsuli koncentrace po indukci K‘-icnty).

tabulce 2, vlastnosti zaoouzdřenvch burA '2.< ac.<_acam exposici v restrixtivnicn podmínkách vyi

Vysvětlivky k tabulce 2:

'.o vény jinými mu icmovan;

o ro ba; i minut výsled o o-mě;

.<·/ v

L-d	L-dcpa	dpc	dccac	Cl, CZ	kamčáímí mí 33 2
NE	nc 27 sc i. Ώ.5 ž x? n	EA	dccamm		cccamen
EPI	epir.eírir.	?t/A.	hcmcvaniicvá	necj .	3,3 3 ~ 25C33.C

k.

Tabulka

r-

Tl

07

y

X

y

i y

X

C7

s

'43

y

•Γ-1 N

X

o

Tl

o

X

X

rn

1 'T.

Tl

y

Cl

y

27

y

o

y

»—4

y

«“4

m

Tl

1 —4 1

y

O

οι

C7 X

o

cí

X

0

i O

O

0

Cl

y

y

—4

y T

^4

e-

X

O

X

07

07

2

*

X

m

X

b

r-

«2

•i

'Jl

Tl

O

Cl

r*·

'2

<-2

Tl

-4

! —4

TJ

Tl

i

υ

07

2

o

07

m

r*

r*

Cl

' X

y

O

CL

07

b

? i

M

—>

Tl

C)

y

07

Γ*

—4

1 X

•—I

TJ

•fl

,,

w

«.

•w

w

—

id

-*7

•X

»-2

T

*-4

07

—4

X

m

C|

r~

Tl

13

>

22

!—·

•

C7

;

3fc

3b

_u

* 1

•Γ2

_

•f\

l£

r?

r*

·Γ1

X

1

4C

3b

Cd

N

N

M

l

%

—4

•y

—22

01

0)

o

01

o

01

—4

; 0

3b

3b

—·

“·

“*

ϋ

24

<«·

Tri

•27

Cl

X

27

Γ*

O

27

0

C-l

t

0

X

U

Z

J\

x

N

27

m

07

y

l>

y

; “*

X

X

-

Tl

*3*

r-

Φ

O

'43

b

X

i—4

0 r-4

Cl

i Cl 1

Γ-

Tl

Ό

O

o

X

y

X

X

o

C7

X

X

j 0

O

rc

X

X

y

m

y

X

X

X

X

i —4

«—4

07

»

O

X

--'

Ti

O

y

O

C7

O

y

a

! 0

y

Tl

í r 1 !

$

•33 x

o o

Ξ

;h

'n

o o

X y

O TI

2 c-

0

C7 X

r* X

0

ί

•v?

y

3

_7

oj

'2

-?

c

Tl

x'

y

c-

27

i

X

1

d*

27

07

->

2

'0

X

27

X 07

i 1 1

S

X

07

~

s

N

2

X

X

TJ

”·

0

X

i i

O

T?

y

Φ ”

—4

o

b

X

Cl

θ'*

ti

b

ί 4

1

í z

u_

y

07

TJ

r-

23

07

o

Cl

C7

c*

Tl

0

X

í

1 ”

Ό*

'2

—

y

o

O

y

C7

—f

Cl

07

0

y

j_2

X

Cl

-

a

o~

'43

»—4

y Ή

T?

Γ-

C7

C 1

X

x

1 I

04

O

o

TI

X

X

Cl

X

.

r*

X

X

!

Cl

C7

c

T7

r-

—4

07

M

X

M

0

Tl

O

“U 71

co

b

o'

o”

b

o'

01 c

b

-D

»—4

0*

0

?!

Tl

27

•27

y

y

TJ

•—4

'X

X

0

Z

Tl

X

N

N

X

N

27

X

!>

X

C7

X

•“2

0)

01 c

ca

·—4

O

,·*!

O

O

O

O

1—4

»—4

0

O

Ό 1 _3

Tl

o TI

'27 Tl

TJ Tl

o X

O «2

07 y

O X

Γ* o

O X

X X

y m

0 X

0 •—4

ca

»“4

y TJ

Tl

y

i—4

Tl <—4

•—I

i—4 C7

f2

0 1-2

•—4

O

X Ή

·—4 •-2

‘«2

Ή

«2

C

c

01 u 04

Post

y C

jí fl 0

01 u 04

Post

01 u 04

Post

01 u 04

Post

ntčn

r· Ό ;_j

»O ní JJ C

12

flj 21 c

OJ

<!

<n

m

»0,

•-2

^4

□

1-2

C

Ξ*

cn

í

Ti

2*

M

3

•H

ά

••2

•H

a.

γ

n

u

b

04

Tl 04

Cl 04

i M

01 2

4J <n

42

y

O4

0«

0

0

O4

LU

oi

0

-

<u

5

U C 'U <-2

x

11

X

i

Tabulka 2 (pokračování)

Tabulka 2 (pokračování)

-44Příklad 3: Zapouzdřené buňky PC12 se implantují člověku

Buňky PC12 se zapouzdří a implantují do recipientníňo organismu tak jak je popsáno v Příkladu 7. Po 6 měsících se kapsule vyoperují a stanoví se poměr L-dopa a dopaminu. Pak se buňky umístí na kultivační desky s více jamkami a kultivují se v různých parciálních tlacích kyslíku in vitrc. Biňky se v pravidelných intervalech testjí na sekreci l-dopa a dopamlnu. Buňky, které uvolňují L-dopa a dopamin v požadovaném poměru se poté implantují do lidského mezku tak jak bylo popsáno ve WO 92/00127.

frixiac

Zapouzdřené buňky PC12, exponované restriktivním podmínkám in vivo ve striatu krysy

Kapsule

Kapsule byly připraveny z dutých vláken na bázi PAN/PVC pomoci techniky rázové inverze (vnitřní průměr 451. až 500 um) , stěna 51 až 65 um, MWCO 110 kDa, hydraulická permeabiiita 53 mi/.min/m^:/mmKg) .

Kultivace buněk a jejich zapouzdření

PC12 a PC12A buňky byly kultivovány v 500 ml nádobách umístěných v rotoru při 80 otáčkách za minutu v bezsérovém mediu KL-1 (Ventrex lne., Portland, Maine) při teplotě 37’c. Atmosféra obsahovala 7 % CO. a nasycenou vodní páru. Buňky byly zakoncentrovány z kultivačního supernatantu centrifugací při 300 g. Životaschopnost buněk byla stanovena pomocí trypanové modři a odpovídala 90+/-5 % před zapouzdřením.

Buňky byly resuspendovány v mediu KL-1, pK 7,3 tak, aby jejich koncentrace byla 4 x 10⁷ buněk/ml. Pak byl k buňkám PC12 a PC12A přidán stejný objem roztoku 2% (w/v) chitcsanu oH 6,7 o nízké viskositě (PROTOSAN\ chlorid chitcsanu,

-45Protan Biccolymer, Drammen, Norsko). Výsledná koncentrace buněk tak byla 2,0 x IQ⁷ buněk/ml.

Jednotlivé kapsule byly dlouhé 7+/-5 mm. Kapsule oiněnné buňkami PC12 a PC12A byly vyrobeny ve dvou jednotlivých dávkách a poté byly umístěny do 24-jamkových desek pro kultivaci tkáňových kultur. Každá jamka obsahovala 1 mi media HL-1.

až 7 dní po zapouzdření byly volně plovoucí ka: dvakrát promyty 1 ml HBSS (HEPES buffered sal fysiciogický roztok pufrovaný N-(2-hydroxye:

sule lne, hyl) oval piperazin-N'-(2-ethansulfonovou) kyselinou), který cbsa 10 uM kyselinu askorbovou. Tím bylo odstraněno zbyl kultivační medium. Jednotlivé vzorku byly inkubovány 30 minu (baséir.í uvolňováni) ve 250 μΐ HBSS. Před oxidaci všechny vzorky ochráněny rychlými přídavkem citrát redukujícího aciditikovaného oufru (C?A3). Tím vt stabilní vzorky v 10 mM citrátu, 20 μΜ metabisulfitu sed v 0,1 N kyselině chioristé. Dlouhodobější skladováni v v±v vano rnern a xu irobíhaio oři teplotě -30°C. Standardy byly připraven:

tak, • s zasocnr rozt CRAB a 0,

L c. / ·< S iky neředily HBSS a poté se stabiliscvaly 1 N kvseliny chioristé.

Spotřeba dopaminu ve striatu.

Krysy byly anestetizovány intramuskuiární injekcí směsi ketaminu (33 mg/ml), xylazinu (1,7 mg/mi) a acepromazinu (10 mg/ml). Celková vydadnost dávky byla 1,0 ml/kg. Poté byly krysy umístěny do Kopfova stereoaxického přístroje. Krysám bylo infusí podáno celkem 12 pg/ml 6-OKDA (6 μΐ roztoku o koncentrací 2 pg/ml 6-OKDA v 0,9 % roztoku soli s přídavkem 0,2 ug/μΐ kyseliny askorbové). Infuse byla podávána rychlstí i μΐ/min po dobu 5 minut a poté byla infusní kanila pomalu vytažena. Infusní souřadnice byly následující 4,2 mm posteriorně vzhledem k bregmatu, 1,0 mm lateráině od středové

čáry a y4 mm

ventrálně vzhledem k tvrdě oleně mozkové.

_mp_antaoc .<=;	psu_z
Kapsu.e	byly implantovány 4 měsíce po jejich lézi (2,75
měsíce po-	poslední injekci apomorfinu;. Krysy byly
anesteí izovárc	y tak, jak bylo výše popsáno a na hlavě jim byl
proveden sací	tální řez. Poté jim byl do lebky navrtán otvor,
do kterého i	:yia umístěna polymerní kapsuie. Krysám byly
kaosuíe ímc i a:	zzovánv oomocí 13-ti dílného teflonového katetru

zpevněného ke stereotaktickému rámu. Kanyla byla poté

uzavřena těs	nícím kroužkem z nerezavějící oceli, celá
soustava byla	•umístěna do mozku. Těsnící kroužek byl uvolněn
ve chvíli, kz	iy byla vytažena vnější kanyla a tak se kasule
samovolně dz	stala do sírrata hostitele. 5íereotaktické
souracncce pr:	z implantaci byly následující: 0,5 zrn anteriorně
vzhledem k br	egmě, 5,3 mm lateráině cd šípového švu a 7,5 mm
pod povrchem	kortexu. Kontrolní krysy, kzerým nebyly
implantovány	kapsuie byiy pro kontrolu operovány stejným
způsobem (ten	. tyly anestetizovány, byl jim proveden řez na
hlavě, převře;	ina lebka, a propíchnuta tvrdá plena mozková) .
Biochemická a:	zalýza
Poté co	byly dokončeny testy chování, byly krysy, jimž

byly implantovány kapsuie PC12, PC12A (nebo žádné kasule) a rovněž polovina krys s prázdnými kapsulemi, anestetizovány v komoře s kysličníkem uhličitým a poté rychle dekapitovány. Jejich mozky byly vyjmuty z lebek, kapsuie odstraněny, obě

ssriata rotře	zána na malé kousky, umístěna do plastikových
mi kro z kumave k	a zmrazená v kapalném dusíku. Poté co byly
kapsuie vyjmu	ty z mozků krys, byly na přibližně 30 minut
umístěny dc i	ml HBSS-fosfátového pufru. Po inkubaci v tomto
roztoku byly	kapsuie přeneseny do 1 ml HEPES-ríBSS. Podle

-I-!Příkladu 4 byla provedena analýza přítomných katecholaminů. Po stanovení katecholaminu byly kapsule převedeny do 4% paraformaldehvdu a postoupeny dále k mcríoicgické analýze.

Obrázek 3 popisuje uvoiň-: průběhu 30 minut. Na grafu jednotlivé kapsule z nichž kažte číslo. Jak je vidět z obrázku 3, 90 dní po implantaci se velmi iiwlantací.

ní dopaminu a l-dopa v u vyneseny hodnoty pro á přiděleno identifikační rodukoe L-dopa a dopaminu lišily cd produkce před

Příklad

Po dl chromáfinn imobilizcv CaCi. a imuno siscl 770 gm, st

Za suoaraonr rakoviny, nichž se

Zapouzdřené adrenální cnromafinní buňky vystavené restriktivním podmínkám in vivo v lidském subaraobncidálním prostoru

Příkladu 4 byly připraveny hovězí adrenální buňky. Agregáty chromafirrícr buněk byly y v 1,5% aiginátové matrici zesíťcvané pomocí rotě bviy zapouzdřeny do dvcuplášťcvých níoh PAN/PVC dutých, vláken typu 4 (vnitřní průměr a 70 gm, MWCQ 60 az iOO kla viz WC 92/19195.

do .amine prostoru cvou pacientu v cerminami razí ijichž bolesti byiy částečně tišeny narkotiky a u projevovala žádná aktivní infekce nebo nádor v meningeální cblasti. Pacienti byly informováni a souhlasili s pokusem, který byl povolen Etickým výborem Lékařské fakulty Univsrsitv v Lausanne ve Švýcarsku.

K anestezi pokožky, okostice a dalších uložených tkání až k ligamentu flavu, bylo použit infiltrace 1,0% lidekainu. Byl proveden 3 až 5 cm c na pokožce v parasagitáiní rovině i až 2 cm na napravo cd středově čáry, který pokračoval lumbodorsalnímu povážce. Pomocí tradičních referenčních bodů, jako jsou například krysta il hloubej i .o lokální iiouhý řez levo nebo směrem k kostních iaca nebo

-43bederní trnové výběžky, jakož i za pomoci fiouroskcpickéhc zavádění byla do subarachnoidálního prostoru mezi L-4 a L-3 šikmo paramediálně zavedena L3 dílná Touhyho jehla. Jehla byla směrována tak, že do subarach.no idálníhc prostoru vstoupila pod mělkým, nahoru směrováním úhlem, který nebyl větší než 30 až 35° vzhledem k míše jak v sagitáinl, tak 1 transverzální rovině.

Pak byl do středu Touhyho jehly vložen zaváděcí drát, který byl poté ponořen tak, aby přesahoval 4 až 5 cm do subarachniodálního prostoru (měřeno předem). Nakonec byla Touhyho jehla vytažena a drát uvolě.n v subarachniodálním prostoru.

Francouzský dilatátor 7 byl nasazen na zaváděcí který byl použit k nasměrování diiatátoru při jeho j ale rozhodném protlačování skrz fascium, paraspinální iigamentum řlavum až do subarachniodáiníhc dráž nasazen s kanvicu.

rrancouzsxy Francouzský

Poté co byl zaváděcí drát předilatován

Francouzským dilatázorem 7, byl na zaváděcí dilatázor 6 sestavený spolu dilatátor 6 byl spolu s kanylou pomalu protlačován do subarachniodálního prostoru dokud nedosáhl počátek kanyly 7 cm do subarachniodálního prostoru.

Když bylo překontrolováno správná umístění kanyly, byl odstraněn nejprve vodící drát a pak i Francouzský dilatátor

6.

Zapouzdřené adrenální chromafinní buňky byly dodány ve sterilním kontejneru s dvojitou obálkou, naložené v transportním mediu a zcela sestavené včetně tubulárních silikonových oček. Do kanyly byla opatrně zavedena membránová část. Kapsule byly tlačeny kupředu, dokud konec membrány nedosáhl bodu 2 až 10 mm od kraniálního konce kanyly v subarachniodálním prostoru. Poté co byly kapsule umístěny pomocí výtlačného mechanismu, byla ka.nyla i tento výtlačný

-49mechanismus zcela vyjmuty. Výsledné umístěni kapsuie bylo takové, že 5 cm dlouhá membranósní část byla ponořena dc mozkomíšního moku v subarachniodálním prostoru ventráině vzhledem ke cauda ecuina.

Po 54-denní inplantační periodě u pacienta 1 a 55-denni implantaci u pacienta 2 byly kapsuie exoiantovány. Poté byla porovnána úroveň sekrece katecholaminů (nerepmer rmu ΝΞ a epinetrinu EPI) po exposici restriktivním podmínkám in vivo a před ní (viz tabulka 3). Koncentrace katecholaminů byly měřeny tak, jak bylo popsáno v Příkladu 4. Údaje v tabulce jsou vyjádřeny v pikomolech na jednu kapsuii v průběhu 30 minut pro basální koncentrace a v pikomciech na kapsuii v průběhu 15 minut pro stimulaci nikotinem (N-S . Produkce katecholaminů byla po exposici restriktivním ccdmínkám výrazně odlišná od stavu před implantací.

Tabulka 3: Sekrece katecholaminů v kaosuiích

	implantcváné ΝΞ Pacient	kapsuie 1: Implantace	vyjmuté kaps· NB na 34 dní
Basální	0	3 z	37
N-S	2932	2573	6366
	Pacient	2: implantace	na 55 dní
Basální	43	120	4,1	59, 3
N-S	5027	5063	10, 6	65

Příklad li: Aklimatizované a opakovaně zapouzdřené buňkv BHK-hNGF vystavené restriktivním podmínkám in vitro

Zapouzdřené BHK-hNGF buňky byly připraveny ccdie

Příkladu 1, implantovány do laterálních ventrikul v mozku krysy a aklimatizovány na restriktivní podmínky in vivo 14 měsíční exposicí. Po 14 měsících byly kapsuie vyjmuty, aklimatizované buňky ze dvou kapsuii odebrány a namnoženy

-50pasáčováním v 10% KB5-DMEM mediu. Pro experiment byla vybrána buněčná linie, označená jako BHK-hNGE klon 23. Tyto buňky byly rozděleny na alikvoty a jednotlivé zkumavky byly zmrazený v kapalném dusíku. Kontrolní buňky BHK-hNGE klon 23, které nebyly aklimarizovány při kultivaci in vivo, byly pěstovány in vitro v 10% FBS-DMEM mediu (buněčná banka BHK-hNGE klon 23 i .

následujícím pokusu bylo testováno těchto šest skupin buněk a kapsulí:

Skupina i: Buňky 3HK-’nNGF 23, (buňky aklimatizované, vyjmuté z in vivo kultivovaných kapsulí), opětovně zapouzdřené dc matrice Vitrogen”, kapsule poté implantovány do laterálních ventrikul do mozku pokusných krys.

Skupina 2: Buňky BHK-hNGE 23, (aklimatizované buňky) které byly před zapouzdřením resuspendovány v 10% BBS 3ΜΞΜ bez použiti matrice, kapsule byly poté implantovány do laterálních ventrikul do mezku pokusných krys.

sxupzna xunéčné banky, raoouzdčené do : Kontrolní buňky BHK-hNGc 23, (buňky z které nebyly nikdy předtím Implantovány i, natrlce Vitrogen”, kapsule poté implantovány do laterálních ventrikul mozků pokusných krys.

Skupina 4: Kontrolní buňky BHK-hNGE 23, (buňky z buněčné banky, které nebyly nikdy předtím implantovány) , před zapouzdřením byly resuspendovány v 10% EBS DMEM bez použití matrice, kapsule byly poté implantovány do laterálních ventrikul do mozku pokusných krys.

Skupina 5: Kontrolní buňky BHK, (buňky z buněčné banky, které nebyly předtím implantovány), zapouzdřené do matrice Vitrogen*, kapsule poté implantovány do laterálních ventrikul mozků pokusných krys.

Skupina 6: Kontrolní buňky BHK, (buňky z buněčné banky, které nebyly předtím implantovány), před zapouzdřením byly

-51resuspendcvány v 10% P33 DMBM bez použití matrice, kapsule byly poté implanocvány do laterálních ventrikul do mozku co'rušných krys .

Kapsule

Aklimatizova:

podle Příkladu 1 KF120794-6 a měla kapsule byly z vláken 101-97-9, vlákny XP11 použitými v Příkladech buňky SKK-hNGF klonu 23 byly zapouzdřeny

Většina kapsuli byla tvořena vlákny konečnou délku 7 mm. Některé kontrolní která jsou 7 až 9.

srovnatelná

Jedncplásťová dutá vlákna Hc120794-6 mají v průměru stěny 36,4 Lim., vnitřní průměr 453,2 Lim, vnější průměr

625,1 um, hydraulickou permeabilitu (HP) 43 mm/min/mVmmHg a podle dextrancvého difusníhc festu propouštějí molekuly menší (MWCO) než je 137 kGa.

Jednoplášťov stěny 5 9 μη, vnitř pevnost v t: 62 mm/min/m/mmHg propouštějí moleku vlákna 101-97-9 mají v průměru tloušťku i průměr 541 um, vnější průměr 525,1 um, .u 31g, hydraulickou permeabilitu a podle dextrancvého difus.oího testu y menší než je 33 kDa.

Zapouzdření

Buňky zapouzdřované v matrici (skupina 1,3 a 5), byly resuspendovány vs Vitrogenu’, který byl naředěn 1:1 mediem PC-1. Hustota buněk byla upravena na IxlO⁷ buněk/ml. kapsule byly kultivovány v mediu PC-1 5 až 7 dní před implantací.

Buňky ze skupin 2,4 a 6 zapouzdřované bez matrice, byly resuspendovány v 10% mediu F33-DMBM a kultivovány ve zkumavkách na třepačce po dobu předcházející implantaci.

Implantace kapsuli

Náhodně vyhrané kapsule s buňkami BKX-hNGF aklimatizovanými již předchozí implantací na podmínky in vivo a kontrolní kapsule byly bilaterálně implantovány do laterálních ventriklů krys. Paralelní vzorky neaklimatizovaných buněk BHK-hNGF posloužily jako kontrola.

Biochemická analýza

Kapsule ze skupin 1 až 6 byly testovány na úroveň uvolňovaného NGF podle Příkladu 1. Produkce NGF v kapsulích obsahujících aklimatizované a neaklimatizované buňky byla měřena před implantací i po ní po dobu jednoho měsíce. Úroveň ze skupin i až 4 je znázorněna na produkce NGF u kapsuli obrázku 11. Údaje pro nejsou uvedeny. Po an 4% paraformaldehydu

NGF necrcduku’ící /ze produkce NGF byle a coszoucenv k kontrolní ounxv ni s <_ o j. o g i c ,<e morroiogicxe ks a-a

Příklad 12: Zapouzdřené buňky PC12 vyslavené podmínkám in vivo krysách s jednostranou lézí v substantia nigra

Buněčné kultury a způsob zapouzdření

Buňky PC12 byly kultivovány a poté zapouzdřeny tak, jak to bylo popsáno v Příkladu 9.

Nedostatek dopaminu v substatnia nigra

6-hydroxydopamin (o-OKDA) je selektivně toxický pro dopaminergní neurony v substantia nigra. U krys, jimž byla podáním β-OHDA poškozena substantia nigra, dochází k vývoji příznaků podobných Parkinsonově nemoci, spojené s nízkými koncentracemi dopaminu. Krysy byly anestetizovány podle

-53Příkladu 9 a umístěny do Kopfova stereotaktického přístroje. Celkem 10 μς 6-OHDA (40 μΐ roztoku, ve kterém byl 6-CKDA rozpuštěn v koncentraci 2,5 gg/mi v 0,9% solném roztoku s obsahem 0,2 gg/μΐ kyseliny askorbové) bylo uniiaterálně zavedeno infusí. Roztok bylo umožněno volně difundovat po dobu 5 minut a poté byla infusnl kanyia pomalu vytažena. Infusní souřadnice byly následující: 3,2 mm posterlorně od bregmatu, 2,7 mm iaterálně od středové čáry a 3,0 mm ventrálně od tvrdé pleny mozkové, s incisnl značkou nastavenou na +5,0 mm.

Implantace kapsuli

Kapsule byly implantovány bilaterálně dva až čtyřy týdny poté co byla krysám jednostraně poškozena substantia nigra. Krysy byly anastetizovány a kapsule implantovány za použití týchž procedur a sterectaktických souřadnic jako v Příkladu 9.

Biochemická analýza

Kapsule byly vyjmuty 3, 10, 23 a 50 dne po implantaci. Krysy byly anestetizovány v CO. komoře a rychle dekapltovány. Mozky byly vyjmuty z lebek a poté byly z poškozených a nepoškozených (kontrolních) stran mozku vyjmuty kapsule. Jak striatum tak i nuclei accumbens byly odebrány pro analýzu katecholaminů, umístěny do plastikových mikrozkumavek (Eppendorf) a rychle zamrazeny v tekutém dusíku. Kapsule byly inkubovány přibližně 30 minut v 1 ml HBSS-fosfátového pufru. Pak byl tento pufr odstraněn a kapsule byly převedeny do 1 ml HEPES-HBSS pufru. Analýza katecholaminů byla provedena tak, jak bylo popsáno v Příkladu 4. Po stanovení katecholaminů byly kapsule fixovány ve 4% paraformaldehydu a použity k morfologickým studiím.

-54Obrázek 9 (část A) ukazuje průměrné množství uvolněného L-dopa v průběhu 30 minut. Na obrázku jsou údaje pro 8 kapsulí před implantací (Pre-) a pro kapsule vyjmuté 5, 14, 28 nebo 60 dní po implantaci a to jak z poškozených (nízká koncentrace dopaminu) tak i z nepoškozených (kontrolních) striat. Část A ukazuje, že relativní množství katecholaminů produkované buňkami PC12 se mění v závislosti na čase. Kapsule odbrané jak z poškozené tak i z nepoškozené strany vykazují vyšší rychlost produkce L-dopa po aklimatizaci in vivo mezi druhým až třetím týdnem.

Obrázek 9 (část B) ukazuje poměr uvolněného L-dopa a dopaminu pro kapsule popsané v části A. Část B ukazuje, že po aklimatizaci in vivo za nízké koncentrace dopaminu produkují zapouzdřené buňky L-dopa v nižším poměru k dopaminu než buňky aklimatizované v kontrolních podmínkách. Poměr L-dopa k dopaminu se poměrně stabilizoval po přibližně 14 dnech kultivace in vivo. Kapsule po aklimatizaci in vivo vyjmuté jak z poškozených tak i ze zdravých stran vykazovaly vyšší poměry koncentrací uvolněného L-dopa k dpaminu ve srovnání s koncentracemi před implantací.

Příklad 13: Srovnání před- a poimplantačních koncentrací uvolněných katecholaminů u zapouzdřených buněk PC12 aklimatizovaných v mozku primátů

Údaje o koncentracích ovolnených katecholaminů pocházející ze studií, ve kterých byly použity buňky PC12 zapouzdřené do vláken ekvivalentních vláknům XP11 a aklimatizovány v mozku primátů (viz Příklad 7), byly porovnány s koncentracemi katecholaminů uvolněných z identických kapsulí před implantací. Zapouzdřené buňky PCI2 byly před implantací testovány a byl stanoven poměr mezi basální koncentrací uvolněného L-dopa a dopaminu. Údaje v tabulce 4 reprezentují produkci katecholaminů před implantací. Kapsule byly poté implantovány do mozků primátů,

-55kde se aklimatizovaly na podmínky in vivo po dobu 1; 2,5; 3; 4; 5 a 6 měsíců. ?o této době byly kapsule vyjmuty a byly stanoveny koncentrace basálně uvolněného L-dopa a dopaminu (obrázek IQ í .

Srovnání scuhrných údajů z obrázku 10 a tabulky 4 ukazuje, že produkce před implantací a produkce po implantaci se lisí významným způsobem. Předimplantační data v prvním řádku tabulky 4 korespondují s údaji pro explantované kapsule v 'obrázku il, které byly měřeny během jednoměsíčního intervalu. Podobně i data v dalších řádcích tabulky 4 korespondují s dalšími měsíčními údaji vynesenými v grafu na obrázku li.

-56Tabulka 4:

Eodnoty udávajíc! sekreci kapsuií s buňkami P012 před jejich implantací' do mozků primátů, kapsule jsou z materiálu katecholamminů ekviva :o v 1 á knům X ? -11

S.D.-standardní odchvlka)

Doba před impianzací 3asáinl L-dcpa 3asáiní dcpamin odpovídajíc! času in vivo pM/15min/ml pM/15mln/ml průměr (S.D.) primář (S.D.)

1	2,02	(0,08)	2, 95	(4,1)
(n=S)
2,5 (r.=6)	0, 73	(0,16)		nezj	ištěmo
3 (n=6)		(0,25)		mez j	ištěno
4 (n=6)	-'Λ -	(2,33)		2,39	(0,82
5 (n=6)	1, 06	(0,01)		4, 26	(1,62
6 (n=6)	3, 09	(1,34)		22,3	(21,7

Příklad 14: Produkce buněčných líni (3EK-CNTF)

EK p rodu ku j í c í ch hCNT F

Lidský gen pro CNTF (hCNTF) byl vložen do expresivního vektoru pNUT založeného na dihydrofolát-reduktase (DEFR) . Tento vektor obsahuje celou sekvenci pUC18 včetně polylinkeru. Transkripce cDNA kódující zmutovanou formu DEFR je řízena promotorem SV40. 3' konec je fúzován s 3' koncem genu viru hepatitidy 3 (E3V 3'), čímž je zajištěn dostatečný polyadenylační a maturační signál.

Gen hCNTF byl získán polymerasovou řetězovou reakcí (PCR) ampíifikací z lidské DNA.. Použité primery obsahovaly cílové místo pro restrikcní endonukieasu EcoRI na místě iniciačního kcdcnu přirozeného hCNTF. Gen hCNTF byl na svém

-575' konci fušován se 150 bp dlouhou sekvencí pocházející z genu myšího imunoglobulinu (Tg). Místo pro EcoRI bylo pužito tak, aby N-koncová část proteinu h.CMTE korespondovala s prvními 18 aminokyselinami genu Ig. Ma 3' konec genu hCNTE byl klonován 325 bp dlouhý Avar fragment z genu pro lidský růstový hormon (hGH) obsahující poiyadenylační sekvenci a další sekvence důležité pro maturaci 3' konce mRNA. Tento fragment byl vložen do místa Spěl v pclylinkeru oiuescript, čímž na 5' respektive 3' koncích vznikla restrikční místa BamHI respektive Netl. Na 3'konci hCNTE cyío připraveno místo BglII, které bylo použito pro ligaci do místa 3amHI v polylinkeru.

Tento konstrukt byl vložen dc posice +6 vzhledem k myšímu promotoru MT-I a celý 3050 bp dlouhý fragment MT/Ig/hCNTE/hGH KpnT-Notl byl vložen do KpnI-NctT místa vektoru pNUT. Nakonec byl· do místa Not vektoru nakloňován gen HSV-TK, čímž byl oddělen gen DHEP. od plasmidu pUC-i3. Tento konečný konstrukt byl pojmenován RP3224E2.

DNA vektoru RP3224E2 byla ampiifikována ve standardním kmenu E. coíi HB101 a purifikována pomocí soupravy Qiagen-Piamid-Kit ,'Kontron} . DNA byla transfikována pomocí běžné kalcium-fosfarové transfekční procedury. Transfikované buňky byly selektovány pomocí rostoucích koncentrací metotrexátu. Selekce byla prováděna kontinuálním přídavkem metotrexátu k buňkám kultivovaným na mediu PC-1. Medium PC-1 je omezené medium obsahující lidské rekombinantní proteiny.

CNTF, což bylo testováním nebo

Po selekci metotrexátem (25 až 200 μΜ) byly buňky BHK (BHK-CNTE) kultivovány in vitro bez selekčních látek po dobu několika měsíců. Během této doby nedošlo k poklesu exprese prokázáno v Northern blotu, biologickým E135OU. Úroveň sekrece CNTE byla podle výsledků v ELISE nebo biologických testů okolo 1,0 ng/10³ buněk/hodina.

-53Příklad 15: BHK-CNTF buňky aklimatizované v lidském lumbálním subarachnoidálním prostoru a poté reimplantované do lidských pacientů a použité k léčbě amyotrofní laterální skierosy

Zapouzdření buněk

BHK buňky sekretující CNTF (BKK-CNTF, podle Příklad i 4 byly zapouzdřeny tak, jak bylo popsáno v Příkladu i, s výjimkou toho, že bylo použito delší očko, vhodné pro implantaci do lidského lumbálního subarachnoidálního prostoru. Kapsule byly naplněny tak, aby výsledná koncentrace činila 2xl0³ transřikováných buněk na μΐ kolagenového roztoku (Zyderm). Sekrece CNTF byla měřena tak, že byla každá jednotlivá kapsule ponořena do 2 ml čerstvého media PSi na dobu 30 minut. Množství uvolněného CNTF bylo poté stanoveno R&D ELISA systémem z odebraného media. Byly vybrány takové kapsule, která intratekálně dodávaly dávku 1 μ denně. Každému z pacientů byla implantována jedna kapsule.

In vivo aklimatizace zapouzdřených BKK-CNTF buněk v lidském lumbálním subarachnoidálním prostoru.

Zapouzdřené buňky 3HK-CNTF byly implantovány na jeden měsíc do lumbálního subarachnoidálního prostoru lidskými pacientům. Další kapsule byly aklimatizovány in vivo po dobu dosahující šesti měsíců. Po jednom měsíci vyjmuté kapsule byly testovány na sekreci CNTF podle Příkladu 12. Po stanovení CNTF byly kapsule fixovány ve 4% paraformaldehydu pro morfologickou analýzu.

BHK-CNTF buňky aklimatizované in vivo byly vyjmuty z kapsulí, shromážděny a bezprodleně umístěny na kultivační medium PCI v restriktivních podmínkách nízkého tlaku kyslíku a nízké koncentrace glukosy. Tyto podmínky byly vybrány tak, aby se co nejvíce blížily podmínkám v subarachnoidálním

-59prostoru pacientů. Paralelně byly kultivovány buňky BHK-CNTF za vnějších podmínek jakožto kontrola. Aklimatizované buňky mohou být charakterizovány a mohou být adaptovány na další restriktivní podmínky.

V jedné sadě experimentů jsou in vivo aklimatizované buňky 5HK-CNTF kultivovány za vnějších nebo restriktivních podmínek, poté jsou opětovně zapouzdřeny (v podstatě stejným způsobem jako při prvním zapouzdření) a implantovány do hostitelského organismu.

V jiné sadě experimentů jsou aklimatizované buňky implantované do lidského hostitele nejprve aklimatizovány na in vitro restriktivní podmínky v organismu některého primáta (vyjma člověka).

Vhodnými subjekty pro implantaci jsou pacienti s ALS, ;e projevuje kombinace deíiciencí jak u herních motorických neuronů tak i u dolních motorických neuronů v mnoha úrovních. Tyto nedostatky jsou potvrzeny elektrcíysiologickými studiemi, které ukazují aktivní a chronickou denervaci dvou nebo tří končetin nebo bulbární muskuiazury, avšak neukazují na žádné neurolgické poškození mimo vciní motorický systém, žádný důkaz rovněž nedokazuje primární onemocnění, které by mohlo způsobit neurologické potíže, zejména například cervikální spondylolýzu nebo dvskrasii plasmatických buněk.' Pacient je relativně silný, může chodit bez cizí pomoci a je v počátečním stadiu nemoci. V době spuštění léčby má pacient vynucenou dechovou kapacitu (forced vítal capacity) vyšší než 75 % normálu.

Pacienti jsou během prvního týdne každodenně sledováni, od druhého to čtvrtého týdne jsou sledováni jednou za týden a poté jednou měsíčně. Mezi jinými jsou sledovány nežádoucí účinky jako je horečka, stomatitida, kašel a náchylnost k herpes viru. Následující testy jsou prováděny jednou měsíčně kvůli vyhodnocení účinnosti léčby: Tuftova kvantitativní

-60neurologická zkouška (TQNE-Tufts Quantitative Neurological Exam), test koordinace očních bulev, respirační funkce kapacita vynuceného dýchání, inspirační průtok vzduchu. Odběry krve se provádějí jednou týdně v průděhu prvních čtyř týdnu a pak jednou měsíčně. V krvi se stanovuje množství plasmatického CNTF, potenciálně i protilátky proti CNTF, C-reaktivní protein, fibrinogen.

Chirurgický postup

Chirurgický postup implantace zapouzdřených buněk 3HK-CNTF je následující. Nejdříve je nutno zjednat i.v. přístup. Poté jsou preventivně podána antibiotika (cefazolin sodný, 1 gram i.v.i, pacient je uložen na operační stůl·, vhodná je genu-pektorálni posice nebo laterální dekubit s dopoředu vyhnutou oblastí bederní páteře. Operační místo vysteriiizcváno a přikryto tak, aby zůstaly odkryty dorsální oblasti pázeře od 3-1 do L-i a bylo umožněno sledování páteře pomocí fiouroskopu během operace. K ustavení lokální anestese bylo použito infiltrace 1,0 % lidokainem. Tím byla anestetizována pokožka, jakož i periosteum a další hlouběji položené tkáně včetně ligamenta flava.

V parasagitáíni rovině 1 až 2 cm nalevo či napravo od středové čáry byl veden 3 až 5 cm dlouhý řez pokožkou, který pokračoval dolů k iumbodorsáíní povázce. K zástavě krvácení bylo použito elektrokauteru. Touhyho jehla s 18 dílky byla za pomoci tradiční kostních orientačních bodů včetně krvsta iliaca a lumbálního trnového výběžku, jakož za pomoci flouroskopickéno navádění zavedena do subarachnoidálního prostoru mezi L-3 a L-4 šikmým paramediálním způsobem. Jehla je vedena tak, že vstoupí do prostoru pod mělkými nahoru směřujícím úhlem, který není větší než 30 až 35° vzhledem k míše jak v sagitáini tak i transversální rovině. Vhodná posice jehly je určena nasátím několika mililitrů mozkomisního moku (CSF), ve kterém jsou stanoveny

-61předimplantační koncenzrace katecholaminů, ankefalinu, glukosy, lidského CNTF, proteinů a počty buněk.

Hrdlo Touhyhc jehly je zkontrolováno aby se potvrdilo, že otvor na konci je orientován vzhůru (umístění otvoru je vyznačeno indexujícím zářezem pro uzávěr u hrdla jehly). Poté je do nitra jehly zaveden vodicí drát tak, aby ústí jehly přesahoval do subarachnoidálního prostoru o 4 až 5 cm (zjištěno měřením ještě před operací). Během zavádění drátu je nutno dbát zvýšené opazrnosti aby dráž nenarazil na žádný odpor ani mimo jehlu a aby si pacient nestěžoval na žádné významné neurogenní symptomy, což by mohlo obojí znamenat, že vodící drát je veden špatným směrem a může dojít k poškození nervového kořene nebo míchy.

Poté co je vodící dráž zaveden na vhodné místo v subarachnoidáiním prostoru, je Tcuhyho jehla separátně vytažena a udděler.a od vodícího drátu. Správná posice vodícího drátu ve szředov: od předpokládané posic bederních, křížových a nevysvětlitelných záhybů Po vyjmuzí Touhyhc jehly rovině míšního kanálu a anteriorně cauda equlr.a (snopce kořenů /ostřeních nervů) , bez smyče a = překontrolována řluoroskopioky. :y mělo býz možné vodícím drátem volně pohybovat ven a dovnitř subarachnoidálního prostoru pouze se slabým odporem, který je způsoben drsným povrchem drátu při jeho pohybu hustým a vláknitým ligamentem flavem.

Francouzský dilatátor 7 se nasadí na zaváděcí drát, který se použje k nasměrování dilatátoru při jeho jemném, ale rozhodném protlačování skrz fascium, paraspinální sval a ligamentum flavum až do subarachniodálního prostoru. Protlačování dilatátoru 7 se zastaví a dilatátor se sejme z vodícího drátu hned jak se ztratí odpor po průchodu dilatátoru ligamentem flavem. Důvodem je snaha vyhnout se dalšímu postupu a manipulaci s tímto poměrně tuhým dilatátorem v subarachnoidáiním prostoru.

-52Poté co byl zaváděcí drát předilatován-overdilated Francouzským dilatátorem 7, byl na zaváděcí drát nasazen Francouzský dilatátor 6 s kanylou. Francouzský dilatátor 6 byl spolu s kanylou pomalu protlačován do subarachniodálního prostoru dokud nedosáhl otevřený konec kanyly 7 cm do subarachniodálního prostoru. Tak jako Francouzský dilatátor 7 tak i dilatátor 6 a kanyia jsou směrovány vodícím drátem ve svém nitru. Správná posice v subarachncidálním prostoru je ověřena předchozím proměřením celého zařízení a v hrubých rysech potvrzena fluoroskopicky. Velkou pozornost je nutno věnovat manipulaci s dilatátory a s kanylou v subarachnoidálním prostoru, aby se zabránilo jakékoli chybě v nasměrování a možným neurologickým poraněním pacienta.

Když bylo překontrol odstraněn nejprve vodící z 5. V závislosti na poloze být výron CSF z kanyly př· uzavření kanyly nebo veim ováno správné umístění kanyly, žrát a pak i Francouzský dila:

pacienta na operačním stole ekvaplvě veliký, cgž si vyžádá rychlé umístění kapsulí ab byl .tor ,uze bud’ zabránilo zbytečným ztrátám mozkomísního moku.

Zapouzdřené aklimatizované buňky 3KK-CNTF jsou dodávány ve sterilním kontejneru s dvojitou obálkou, naložené v transportním mediu a zcela sestaveně včetně tubulárních silikonových oček. Před implantací skrz kanylu mohou být kapsuie umístěny do misky inserčního kitu, kde mohou být uloženy v transportním mediu a v takové poloze, která umožní jejich prohlídku k určení poškození nebo významných defektů.

Část kapsuie s očkem se vloží do vtlačovacího zařízení z nerezové oceli tak, že se drátem o malém půměru zachytí membránová část. Poté se do kanyly opatrně zavede membránová část. Kapsuie se tlačí kupředu, dokud konec membrány nedosáhne bodu 2 až 10 mm od kraniálního konce kanyly v subarachniodálním prostoru (opět předem přeměřeno). Tento

-63postup zajišťujě, že membránová část kapsule je chráněna kanylou po celou dobu svého transportu na určené místo.

Poté co se kapsule umístí pomocí výtlačného mechanismu na správné místo v subarachniodálním prostoru, použije se výtlačný mechanismus na přiďžování kapsule na tomto místě subarachniodálního prostoru, zatímco je kanyia pomalu zcela vytažena. Poté se vytažením drátku ze silikonového očka na kapsuli uvolní i výtlačný mechanismus. Použitím tohoto způsobu je dosaženo správného umístění kapsule, jejíž membránová část se nyní nachází zcela v mozkomíšním moku, který vyplňuje subarachniodální prostor ventrálně vzhledem ke cauda equina. Kapsule může být na svém kaudálním konci zakotvena na svém místě pomocí zhruba i až 2 cm z délky silikonového očka, které prochází subarachniodálním prostorem. Toto očko pak pokračuje dál a skrze durum, Iigamentum flavum. a paraspinální svalstvo pokračuje ven z těla pacienta. Z lumbodorsálního fascla je tak do volného prostoru vynořeno zhruba 10 až 12 cm silikonové hadičky, která je použita při vyjmutí kapsule z těla pacienta.

Vytékání C3P je minimalizováno injekcí zibrinového lepidla (Tissel®) do rány vyplněné silikonovým očkem v paraspinálním svalstvu a pak také těsným uzavřením otvoru v superficiální povázce kruhovým staženým švem (purse-string suture). Volný konec silikonového očka je poté zakotven pomocí neabsorbovatelného švu a’ zcela zakryt dvakrát sepnutou pokožkou a subkutánní tkání.

Pacient je poté převeden na oddělení rekonvalescence po neurochirurgických operacích. Zde je přísně dodržován klid na lůžku a odpočinek po dobu 24 hodin po operaci. Rovněž preventivní podávání antibiotik pokračuje 24 hodin po chirurgickém zákroku.

/ f. Ccí

ING. EDUARD HAKR patentový zástupce

Claims (1)

1. PATENTOVÉ NÁROKY o přípravy zapouzdřených buněk k implantaci do ntačního místa do hostitelského organismu, načující se tím, že se áky zapouzdří do biokompatibilní kapsule a ňky se vystaví působení alespoň jedné restriktivní imínky, jež se blízce podobá podmínce v lantačním místě, kterým se provede měřitelná změna alespoň jedné buněčné vlastnosti jako odpověď na .o restriktivní podmínku.

   i podle nároku 1, vyznačující se , že se zapouzdřené buňky vystaví působení .ktivní podmínky nebo podmínek in vitro.

   podle nároku 1, vyznačující se , že se zapouzdřené buňky vystaví působení ktivní podmínky nebo podmínek in vivo 'implantací lantačního místa do recipientního organismu.

   podle nároku 1, vyznačující se , že buňky jsou vzhledem k hostitelskému srnu xenogenní a kapsule je imunoisolační.

   podle nároku 1, vyznačující se že alespoň jednou restriktivní podmínkou je trace glukosy v rozmezí mezi přibližně 40 mg na a přibližně 70 mg na 100 ml.

   podle nároku 1, vyznačující se že alespoň jednou restriktivní podmínkou je ;race kyslíku v rozmezí mezi přibližně 5333 Pa a .ne 8666 Pa.

   -657. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že alespoň jednou restriktivní podmínkou je menší koncentrace dopaminu než je fysiologická koncentrace dopaminu v mozkomíšním moku nebo v mozkovém parenchymu.

   8. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že buňky se vyberou ze skupiny sestávající z adrenálních chromafinních buněk, ledvinových buněk mláďat křečků a buněk PC12.

   9.

   Způsob podle nároku tím, že buňkami recipientním organismu nebo déle.

   8, vyznačující se jsou buňky PC12 a jsou v implantovány na dobu 6 měsíců

   10. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že buňkami jsou adrenální chromafinní buňky a jsou v recipientním organismu implantovány na dobu 4 měsíců nebo déle.

   11. Způsob podle nároku 8, vyzná čující se tím, že buňkami jsou buňky PC12 a jsou v recipientním nebo déle. organismu implantovány na dobu 3 týdnů

   12.

   Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že buňky produkují biologicky aktivní molekuly vybrané ze skupiny tvořené neurotransmitery, analgetiky a růstovými faktory.

   13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že biologicky aktivní molekulou je katecholamin.

   -6614. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, ze se kapsule implantuje do recipientního organismu do implantačního místa vybraného ze skupiny tvořené mozkomíšním mokem a mozkovým parenchymem.

   15. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že hostitelským organismem je člověk.

   16. Způsob přípravy zapouzdřených buněk k implantaci do implantačního místa do xenogenního hostitelského organismu, vyznačující se tím, že se

   a) buňky kultivují za působení dvou nebo více restriktivních podmínek a

   b) buňky se zapouzdří do biokompatibilní kapsule a dále se zapouzdřené buňky vystaví působení alespoň jedné restriktivní podmínky, jež se blízce podobá podmínce v lmplantačním místě, kterým se provede měřitelná změna v alespoň jedné buněčné vlastnosti jako odpověď na tuto restriktivní podmínku.

   17. Buňky připravené k implantaci do vybraného implantačního místa do hostitelského organismu, vyznačující se tím, že byly připraveny způsobem, při kterém se

   a) buňky zapouzdří do biokompatibilní kapsule a

   b) buňky se vystaví působení alespoň jedné restriktivní podmínky, jež se blízce podobá podmínce ve vybraném implantačním místě, kterým se provede měřitelná změna v alespoň jedné buněčné vlastnosti jako odpověď na tuto restriktivní podmínku.

   18. Buňky podle nároku 17, vyznačující se tím, že byly připraveny vystavením zapouzdřených

   -67buněk působení restriktivní podmínky nebo restriktivních podmínek in vitro.

   19. Buňky podle nároku 17, vyznačující se tím, že byly připraveny vystavením zapouzdřených buněk působení restriktivní podmínky nebo restriktivních podmínek in vivo implantací do implantačního místa do recipientního organismu.

   20. Buňky podle nároku 19, vyznačující se tím, že byly zapouzdřené buňky implantovány do implantačního místa primáta jako recipientního organismu, přičemž buňky jsou vzhledem k recipientnímu organismu xenogenní, na dobu alespoň 6 měsíců k vytvoření buněčné vlastnosti jako odpovědi na restriktivní podmínku nebo restriktivní podmínky v místě implantace.

   21. Buňky podle nároku 19, vyznačující se tím, že jsou vybrány ze skupiny tvořené adrenálními chromafinními buňkami nepocházejícími z primátů, ledvinovými buňkami mláďat křečků a buňkami PC12.

   22. Buňky podle nároku 19, vyznačující se tím, že buňkami jsou adrenální chromafinní buňky nepocházející z primátů.

   23. Buňky podle nároku 19, v y znač u j ící s e tím , že jde o buňky PC12. 24 . Buňky podle nároků 22 nebo 23, v y z n a č u j í c í s e tím, že požadovanou buněčnou vlastností je

   změněná produkce katecholaminů buňkami.

   67a

   25. Buňky podle nároku 24, vyznačující se tím, že požadovanou buněčnou vlastností je zvýšená produkce katecholaminu buňkami.

   26. Buňky podle nároku 19, vyznačující se tím, že implantační místo v recipient organismu je vybráno ze skupiny tvořené mozkomíšním mokem a mozkovým parenchymem.

   27. Buňky podle nároku 17, vyznačující se tím, že hostitelským organismem je člověk.

   23. Biokompatibilní kapsule, vyznačující se tím, že obsahuje buňky připravené k implantaci do vybraného implantačního místa do hostitelského organismu, přičemž tyto buňky byly připraveny způsobem, při kterém se

   a) buňky zapouzdří do biokompatibilní kapsule a

   b) buňky se vystaví působení alespoň jedné restriktivní podmínky, jež se blízce podobá podmínce ve vybraném implantačním místě, kterým se provede měřitelná změna v alespoň jedné buněčné vlastnosti jako odpověď na tuto restriktivní podmínku.