HUT75661A - Method for implanting encapsulated cells in a host - Google Patents

Description

A tudomány területe

Ez a találmány gazdába történő implantációhoz való bekapszulázott sejtek előállításával kapcsolatos, melyet úgy valósítunk meg, hogy a sejteket in vivő vagy in vitro körülmények között egy vagy több olyan korlátozó körülmény közé helyezzük, mely sokkal jobban megfelel a kívánt implantációs hely körülményeinek és olyan időtartamig, mely a kívánt sejt tulajdonságokat hozza létre a korlátozó körülményekre való válaszként.

A találmány háttere

Egy biológiailag aktív molekulát termelő bekapszulázott sejt, egy gazdába való implantációja során arra használható, hogy számos betegséget, vagy rendellenességet előzzön meg vagy felhasználható ezek kezelésében, vagy a gazdában egy vagy több metabolikus funkciót biztosíthat, visszaállíthat vagy fokozhat.

A sejtek bekapszulázásának egyik megközelítését mikrokapszulázásnak hívják, ahol parányi gömbök foglalnak magukba egy sejt tartalmú oldatból egy mikroszkopikus méretű cseppet (Sefton et al., Biotechnology and Bioengineering 29, pp. 1135-1143, 1987; Sugamori et al. , Trans. Am. Soc. Artf. Int. Organs 35, pp. 791-799, 1989).

A sejtek bekapszulázásának egy másik megközelítése a makrokapszulázás, ami számos sejt termoplasztikus kapszulába való bekapszulázását foglalja magába. Tipikusan ez úgy valósítható meg, hogy a sejteket egy üreges rostba helyezzük, majd a végeket lezárjuk. A tudomány e területén számos makrokapszula ismert. Különösen, Dionne et al (WO 92/19195) utal egy olyan makrokapszulára, mely egy mátrixban eloszlatott • · · · · • · · · ··· · • · · · · ··· ·· ··· · ·· sejteket, valamint egy szemipermeábilis felületi burkot foglal magába; ez a szabadalom a hivatkozás révén részét képezi a találmánynak. Lásd Aebischer, 5,158,881, 5,283,187 és 5,284,761 számú US szabadalmakat, melyek egy olyan sejt kapszulára hivatkoznak, melyet egy polimer oldat és egy sejt szuszpenzió ko-extrudálásával hoztak létre.

Tipikusan, amikor a bekapszulázáshoz és implantációhoz használt sejteket közvetlenül szövetből izolálják ezeket diszaggregálják, mossák, majd bekapszulázzák. Lásd például Aebischer et al. , Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs, 32, pp. 134-7, 1986; Altman et al., Diabetes, 35 pp. 625-33, 1986; Chang et al., 5,084,350 számú US szabadalom; Darquay and Reach Diabetologia 28, pp. 776-80, 1985; Sugamori and Sefton Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs, 35, pp. 791-9, 1989.

Amikor halhatatlanná tett sejteket vagy sejtvonalakat szándékoznak bekapszulázni és implantálni ezeket tipikusan tápanyagban gazdag tenyészetekből izoláljuk. Lásd például Aebischer et al. , Biomaterials, 12, pp. 50-55, 1981; Experimental Neurology 111, pp. 269-75, 1981 (dopamint szekretáló PC12 sejtek) és Ward et al. , WO 93/22427 (IgG-t szekretáló MOPC-31C sejtek).

A bekapszulázott sejteket általában in vitro inkubáljuk és az implantáció előtt funkcionálisan jellemezzük. A bekapszulázott sejteket gyakran egy meghatározott tápközegben tenyésztjük ebben az implantáció előtti állapotban. Gyakran a tápközeg olyan egyensúlyi sóoldat, melyből a tápközeg kiegészítők hiányoznak (például Aebischer supra; Altman supra, Chang et al, supra). Másik lehetőségként, a bekapszulázott sejteket olyan tápközegben inkubáljuk, mint az RPMI 1640, mely • · · különböző aminosavakat, vitaminokat, szervetlen sókat és glükózt (2 g/liter, 11,11 mM; Animál Cell Culture, Eds. Pollard and Walker, Humana Press Inc., Clifton, New Jersey, pp. 696700, 1990) tartalmaz és általában tipikusan 5 - 15 % magzati borjú vagy ló szérummal van kiegészítve.

Egy gazdába implantált és bekapszulázott sejtek legalább két komoly változáson kell átessenek a tápközeg körülményei között az in vitro körülményekhez képest. Az első a bekapszulázás során következik be.

Az in vitro körülményekhez viszonyítva a bekapszulázott körülmények között levő sejtek tápanyagban szegények. Ez a tápanyag szegénység két módon nyilvánul meg. Tápközeg grádiens van a külső környezet és a kapszula belseje között, mely természetes módon jön létre a membránon keresztül. Ez a grádiens később még fokozódik, mivel a molekulák nem diffundálnak szabadon a külső gazda szövet és a sejt között a kapszula minden pontján. A kapszula felszínéhez közel levő sejtek kedvezőbben jutnak hozzá a kapszula burkán átdiffundáló tápanyagokhoz. Továbbá, a kapszula felszínéhez közelebb levő sejtek hulladék termékei sokkal könnyebben távoznak el.

A másik komoly változás a tápanyagok koncentrációjában, például az oxigén és a glükóz koncentrációjában, a gazdába való implantációkor következik be. Ez azért van így, mert az in vitro oxigén és a tápanyagok közül legalább néhánynak a szintje általában sokkal magasabb, mint az in vivő szintek. így az ezen molekulák kapszulába irányuló diffúzióját irányító erők in vivő csökkennek.

A tápanyag közegben bekövetkező ezen változások egy vagy több sejt tulajdonság megváltozását eredményezhetik. Például • · sejt pusztulás vagy csökkent hosszútávű sejt túlélés következhet be. Azonkívül, az implantáció során bekövetkező környezeti körülményekben bekövetkező változások a maradék bekapszulázott sejtek más tulajdonságait is befolyásolhatják, mint például a szaporodási rátát, vagy a sejt biológiailag aktív molekulát termelő képességét. A diszkrét sejt szubpopulációk szaporodási rátájában bekövetkező változás azt eredményezheti, hogy a kapszulában egy gyorsabban szaporodó sejt szubpopuláció kerülhet fölénybe, ami potenciálisan a kapszula külső jellemezőinek nyilvánvaló változásához vezethet, vagy más nem kívánatos hatáshoz.

Az egyik lényeges különbség az in vivő implantációs körülmény és az in vitro körülmények között a glükóz koncentráció, melyhez a tenyésztett sejtek adaptálódtak. Másik eltérés a szövettenyészet és az implantációs hely közülményei között a sejtek számára elérhető oxigén mennyisége. Más tápanyagok is lehetnek jelentősen eltérő koncentrációban a tenyész tápközegben és az adott implantációs helyen.

A metabolikusan nagyon aktív sejtek vagy szövetek különösen érzékenyek a tápanyag és oxigén hiány (hipoxia) hatásával szemben. Hasonlóképpen, számos endokrin szövet, melyet normálisan sűrű kapilláris közeg tart fenn és így magas oxigén és tápanyag szintek közötti növekedéshez akklimatizálódott in vivő, ugyanezt a viselkedést mutatja; a Langerhans-féle hasnyálmirigy szigetek és az adrenális kromaffin sejtek különösen érzékenyek a hipoxiás sokkokkal szemben.

Az oxigén tenzióban bekövetkező változásról és a tápanyag stresszröl ismert, hogy megváltoztatja nagy számú gének expresszióját, ami számos celluláris funkciót befolyásol. Az ilyen változások hatással lehetnek bizonyos mRNS-ek stabilitására és funkciójára. Például, a tirozin hidroláz mRNS

- mely a dopamin termelés sebesség korlátozó lépését katalizáló enzimet kódolja - tápanyag stresszel befolyásolható.

Továbbá, számos hösokk gén és az olyan metabolikus enzimek

- mint amelyek a köztes anyagcserében is részt vesznek (például a glikolitikus és a glükoneogenikus reakcióutak) - expressziója is befolyásolható alacsony glükóz vagy aminosav szintekkel.

Fontos, hogy a nagy mértékben differenciálódott sejt típusok, melyek oxigén hiányban szenvednek, elveszíthetik szövet specifikus funkciójukat a hipoxiás sokkból való felépülés ideje alatt (lásd például Wolffe and Tata FEBS Letters, 176, pp. 8-15, 1984). Az elveszített vagy csökkent funkciók közé tartoznak a proteinek szintézise és módosítása. Ez hatással lehet éppen azon terápiás faktorok termelésére és szekréciójára, melyeket a sejtek a környező gazda szövetnek szándékoztak biztosítani. Továbbá, bizonyos esetekben a hipoxiás körülmények rosszindulatú transzformációkat is kezdeményezhetnek (lásd például H. Goldblatt et al., Biochemical Medicine, 7, pp. 241-52, 1973).

Kívánatos olyan implantációs módszert kifejleszteni, mely magába foglalja az implantáció előtt a sejtek egy vagy több korlátozó körülménynek való kitevését vagy ezekhez való akklimatizációját, annak érdekében, hogy csökkenjen a sejt tulajdonságokban bekövetkező változás, ami az implantáció révén a környezetben bekövetkezett változások hatására jön létre a sejt tulajdonságokban, ily módon csökkennek a gazdára nézve kedvezőtlen következmények. Kívánatos az ily módon előállított • · • · sejtvonalak kifejlesztése is. Kívánatos az in vivő környezetben változáson átesett sejtek ex vivő tanulmányozására szolgáló eszközöket is kifejleszteni.

A találmány összefoglalása

A találmány olyan módszerrel kapcsolatos, mely bekapszulázott sejtek egy gazdába való implantációjára szolgál, a módszer magába foglalja a sejtek in vitro vagy in vivő módon egy vagy több korlátozó körülménynek való kitevését olyan hosszú időtartamig, míg a kívánt sejt tulajdonság ki nem alakul a korlátozó körülményekre adott válaszként a gazdában való implantációs helyre való implantáció előtt. Előnyösen a találmány módszereivel kialakított sejt tulajdonságokat alapjában véve az implantáció után is fenntartjuk. A bekapszulázott sejtek olyan biológiailag aktív molekulát termelnek, mely hasznos lehet betegségek vagy rendellenességek megelőzésében vagy kezelésében vagy a gazdának egy metabolikus funkció biztosításában, visszaállításában vagy fokozásában. A találmány szerint előállított sejtek hasznosak lehetnek in vitro alkalmazásokban, diagnosztikai vagy más célokra is.

Az ábrák rövid leírása

Az 1. ábra az in vitro 50 mmHg, 0,8 g/1 glükózt tartalmazó tápközegben (alacsony 02/gl) inkubált bekapszulázott BHK sejtekből történő NGF szekréciót mutatja. A BHK sejteket középzárású 4-es típusú kettős borítású kapszulákba kapszulázzuk. A kapszulánként! és 24 óránkénti NGF szekréciót - az oszlopok magassága jelzi - a 3., 7., 14., 21., és 28. napon viszgáljuk.

A 2. ábra az in vitro 142 mmHg, 5,5 g/1 glükózt tartalmazó tápközegben (magas 02/gl) inkubált bekapszulázott BHK sejteket mutatja. A BHK sejteket közép-zárású 4-es típusú (T4) kapszulákba kapszulázzuk, a kapszulánként! és 24 óránkénti NGF szekréciót - az oszlopok magassága jelzi - a 3., 7., 14., 21., és 28. napon viszgáljuk.

A 3. ábra az in vitro az 1. ábra szerint, alacsony 02/gl tápközegben inkubált bekapszulázott BHK sejtekből történő NGF szekréciót mutatja közép-zárású 4-es típusú (T4) (a) 10% PAN/PVC-ből és (b) 12,5% PAN/PVC-ből vagy (c) 15% PAN/PVC-ből készült kapszulákban. A kapszulánként! és 24 óránkénti NGF szekréciót - az oszlopok magassága jelzi - a 3., 7., 14., 21., és 28. napon viszgáljuk.

A 4. ábra a 14 napig 20, 40, 60, 80 vagy 140 mmHg O2 értékeken in vitro tenyésztett bekapszulázott mellékvese chromaffin sejtek norepinefrin (NE) és epinefrin (EPI) felszabadítását mutatja az oxigén nyomás függvényében. A felszabadulást a 2. és a 14. napon mérjük. Az A panel az alap NE felszabadulást mutatja, a B panel a K⁺ által kiváltott NE felszabadulást, a C panel az alap EPI felszabadulást, a D panel pedig a K⁺ által kiváltott EPI felszabadulást.

Az 5. ábra a 2-es típusú kapszulába bekapszulázott borjú mellékvese chromaffin sejtek általi katekolamin felszabadulást mutatja, az implantáció előtt és a 6 hetes implantációs időszak utáni felépülés után. Az A panel az implantáció előtti és utáni NE és EPI felszabadulást mutatja. A B panel az implantáció előtti és utáni nikotin által stimulált NE és EPI ··· · ··· « • · · · · •·· ·· ··· · ·· felszabadulást mutatja. A C panel az implantáció időszak előtti és utáni K+ által stimulált NE és EPI felszabadulást mutatja.

A 6. ábra a 4-es típusú kapszulába bekapszulázott borjú mellékvese chromaffin sejtek általi katekolamin felszabadulást mutatja az implantáció előtt és a 6 hetes implantációs időszakból való felépülés után. Az A panel az implantációs időszak előtti és utáni alap NE és EPI felszabadulást mutatja. A B panel az implantációs időszak előtti és utáni nikotin által stimulált NE és EPI felszabadulást mutatja. A C panel az implantációs időszak előtti és utáni K⁺ által stimulált NE és EPI felszabadulást mutatja.

A 7. ábra a bekapszulázott borjú mellékvese chromaffin sejtek alap (A) és a nikotin által stimulált (B) katekolamin termelését mutatja az implantáció előtt és a 6 hónapos implantációs időszak utáni felépülést követően a gerinc szubarachnoid térben patkányok esetében.

A 8. ábra a bekapszulázott PC12 és PC12A sejtek általi dopamin és L-dopa felszabadulását mutatja az implantáció előtt és a 3 hónapig tartó implantációs időszak utáni felépülést követően patkány striatumban. Az A és B panelek az implantáció előtti alap termelést mutatja sorrendben PC12 és PC12A sejtek esetében. A C és D panelek az explantáció utáni alap termelést mutatja sorrendben PC12 és PC12A sejtek esetében.

A 9. ábra a normális vagy a 6-hidroxi-dopamin (6-OHDA) lézió következtében létrejövő csökkent dopamin szintekhez in vivő akklimatizálódott sejtek katekolamin termelését mutatja patkány substancia nigra-ban. Az A panel a PC12 sejtek alap sebességű L-dopa termelését mutatja az in vivő akklimatizációs idő függvényében a substancia nigra léziós (zárt oszlopok) vagy • ·· · ··· · • · · · · ··· · · ··· · ·· nem léziós (nyitott oszlopok) területein. A B panel az alap Ldopa:dopamin termelés sebességét mutatja az in vivő akklimatizációs idő függvényében a patkány substancia nigra léziós (zárt oszlopok) vagy a nem léziós (nyitott oszlopok) területein.

A 10. ábra a bekapszulázott PC12 sejtek katekolamin temelését mutatja az in vivő akklimatizációs idő (hónapokban) függvényében főemlős agyban. A nyitott négyszögek az alap Ldopát a nyitott körök az alap dopamin szinteket képviselik.

A 11. ábra az implantáció előtti és a 14 hónapos implantáció utáni HF 120794-6 egyrétegű burokkal rendelkező rostokba, Vitrogen mátrixba vagy mátrix nélkül bekapszulázott BHK-hNGF 23-as klón sejtek NGF termelését mutatja. A Sejt Bank (CB) sejtek nem akklimatizált BHK-hNGF 23 klón sejteket j elentenek.

A találmány részletes leírása

Egy sejt tulajdonság bármely olyan fenotipusos tulajdonság, mely mérhető, ideértve a sejt variabilitást, a szaporodási rátát és a biológiailag aktív molekula celluláris termelését. Egy kívánt sejt tulajdonság utalhat egy vagy több biológiailag aktív molekula termelési szintjének változására, mely változás a korlátozó körülmény hatására következik be, vagy két biológiailag aktív molekula termelési rátájának változására. Továbbá, a kívánt sejt tulajdonság vonatkozhat egy biológiailag aktív molekula termelésének stabilizálására, a korlátozó körülményre adott válaszként.

Λ · · • · ·

A korlátozó körülmény kifejezés azt jelenti, hogy egy vagy több körülményt - melyek között normálisan vagy optimálisan a sejteket in vitro tenyésztjük - megváltoztatjuk, oly módon, hogy sokkal jobban megfeleljen az aktuális vagy várt in vivő feltételnek a kívánt gazda implantációs helyénél.

Egy biológiailag aktív molekula olyan molekula, mely (a) azon a sejten belül funkcionál, melyben termelődik, (b) a sejt felszínén expresszálódik és hatással van a sejt más sejtekkel vagy biológiailag aktív molekulákkal való kölcsönhatására (például egy neurotranszmitter receptor vagy sejt adhéziós molekula), vagy (c) kiszabadul vagy szekretálódik abból a sejtből, mely termeli és hatását egy külön cél sejten fejti ki (például egy neurotranszmitter, hormon, növekedési faktor, citokin, vagy más intra- vagy intercelluláris jelölő transzdukáló). A biológiailag aktív molekulák hasznosak lehetnek egy betegség vagy rendellenesség kezelésében vagy megelőzésében egy gazdában, vagy a gazdában egy vagy több metabolikus funkciót biztosíthatnak, állíthatnak vissza, vagy fokozhatnak.

A gazda vagy a recipiens kifejezések egy megfelelő állat alanyra utalnak, ideértve az emlősöket és különösen a humán alanyokat. A recipiens kifejezés egy olyan álltra vonatkozik, melyben a sejteket egy vagy több korlátozó körülmény hatásának tesszük ki oly módon, hogy a sejtek egy kívánt sejt tulajdonsággal rendelkezzenek. A gazda kifejezés egy olyan állatra utal, melybe a kívánt sejt tulajdonsággal rendelkező bekapszulázott sejteket implantáljuk.

A sejtek kifejezés bármilyen formában levő sejtekre utal, ideértve az ezekre való korlátozás nélkül a szövetben • ·* • *· • · * » · « t· «·« · »· visszatartott sejteket, a sejt csoportokat és az egyedileg izolált sejteket. A jelen találmányban a sejtek egy biológiailag aktív molekulát termelnek. A sejtek lehetnek primer sejtek, vagy olyan osztódó sejtek, melyek természetesen termelik a biológiailag aktív molekulát vagy lehetnek ilyen céllal génsebészetileg manipulált sejtek.

A biokompatibilis kapszula kifejezés azt jelenti, hogy egy gazda emlősbe való implantáció során nem vált ki a gazdából olyan reakciót, ami elegendő ahhoz, hogy károsan befolyásolja a kapszula funkcióját vagy nem teszi azt működésképtelenné. Az ilyen működésképtelenség előfordulhat például egy olyan fibrotikus szerkezet kapszula körüli létrejöttével, mely korlátozza a benne levő sejtekhez való tápanyagok bejutását. A káros körülmények közé tartoznak a kapszula kilökése, vagy toxikus vagy pirogén vegyületek (például szintetikus polimer melléktermékek) felszabadulása a kapszulából a környező gazda szövetbe.

Egy immunoizolációs kapszula kifejezés azt jelenti, hogy a kapszula egy emlős gazdába való implantációkor minimalizálja a gazda immun rendszerének kilökődési hatásait a magon belüli sejtekkel szemben, oly módon, hogy a kapszula in vivő hosszabb ideig funkciónál.

A hidrogél kifejezés kereszt kötéses hidrofil polimerek egy három dimenziós hálózatát jelenti. A hálózat olyan gél formájában van, mely alapjában véve vízből áll, azonban az ezekre való korlátozás nélkül olyan gélekből, melyek 90 %-nál több vizet tartalmaznak. Kereszt-kötéses hidrogélek szilárdnak tekinthetők, mivel ezek nem folynak, vagy nem deformálódnak észrevehető alkalmazott nyíró feszültség nélkül.

·» ·

Egy megvalósulásban a sejteket egy biokompatibilis kapszulába zárjuk és egy vagy több korlátozó körülmény hatásának tesszük ki in vitro mielőtt a gazdában az implantációs helyre implantálnánk. A sejteket a korlátozó körülménynek vagy körülményeknek olyan hosszú ideig tesszük ki, mely elegendő ahhoz, hogy a korlátozó körülményre válaszként a kívánt sejt tulajdonság kialakuljon.

Előnyösen a sejt tulajdonságot lényegében a bekapszulázott sejtek gazdában levő implantációs helyére történő implantáció után is fenntartjuk.

A tervezett korlátozó tulajdonságok közé tartoznak az alábbiak közül egynek vagy többnek a megváltoztatása: hőmérséklet, pH, vagy barométeres nyomás egy vagy több metabolit vagy kofaktor - ideértve az ezekre való korlátozás nélkül a cukrot, az alkoholt, a karboxil savat, aminosavat, zsírsavat, nukleinsavat, gázt, fém ionokat, vagy bármely más olyan biológiai tényezőt, mely hozzájárul a sejtek szaporodásához, működéséhez vagy életképességéhez - hatékony koncentrációjának megváltoztatása, az ilyen változtatások révén a tervezett implantációs helynél az in vivő körülmények jobban összeillenek. Továbbá, a korlátozó tulajdonságok megváltoztathatják egy vagy több biológiailag aktív molekula hatékony koncentrációját is ideértve ezek közé az ezekre való korlátozás nélkül a hormonokat, növekedési faktorokat, neurotranszmittereket, citokineket vagy más biológiailag aktív faktorokat, melyek részt vesznek az intra vagy intercelluláris jelzésben.

El kell fogadni, hogy néhány tápanyag vagy biológiailag aktív faktor alacsonyabb koncentrációban lehet jelen in vivő, • · · • · • · · ··· ·· ··· · mint az in vitro normális körülmények között. Másik lehetőségként, néhány tápanyag és biológiailag aktív faktor magasabb koncentrációban lehet jelen in vivő, mint normális esetben in vitro.

Továbbá, az ezen találmány során tervezett korlátozó körülmények közé tartoznak a bekapszulázott sejtek in vivő vagy in vitro módon történő egy kiválasztott implantációs helyről származó célsejteknek való kitevése a bekapszulázott sejtekben a kívánt sejt tulajdonság elérése céljából. Lásd például Wainer and Heller, Neuronal Hybrid Cell Lines: Generation, Characterization and Utility, in Neuronal Cell Line, J. Wood (Ed), IRL Press, p. 20, 1992.

Bármilyen megfelelő tenyésztápközeg felhasználható a találmány módszereiben. A tudomány e területén átlagosan képzett szakember egy definiált minimál szövet tenyésztési táptalajt módosíthat oly módon, hogy a tápanyagok, a kritikus gáz koncentrációk, vagy más korlátozó körülmények azokat a kívánt értéket érjék el, melyek a tervezett implantációs helyet j ellemzik.

Amikor a sejteket in vitro kitesszül a korlátozó körülményeknek, a tenyész körülmények lassan és folyamatosan változtathatók, vagy megváltoztathatók egy vagy több lépcsős változással a kívánt korlátozó körülmények elérése céljából.

Egy előnyben részesített megvalósulásban, a sejteket in vivő egy vagy több korlátozó körülmény hatásának tesszük ki, oly módon, hogy egy kiválasztott implantációs helyre implantáljuk egy recipiensben. A kiválasztott implantációs hely szomszédságában levő molekuláris környezet befolyásolhatja az implantált és a helyhez akklimatizálódott sejtek a helyhez akklimatizálódott * · tulajdonságait. Például egy vagy több biológiailag aktív faktor (például hormonok, növekedési faktorok, neurotranszmitterek vagy citokinek) koncentrációja befolyásolhatja az implantált sejtek azon képességét, hogy szaporodj anak, hogy akklimatizálódjanak az adott helyhez való gén expresszió adaptálódása révén, vagy hogy termeljék a kívánt terápiás faktort. Ha a sejteket in vivő kitesszük a korlátozó körülmények hatásának megfelelő ideig ahhoz, hogy a kívánt sejt tulajdonságot elérjük, a sejteket visszanyerjük és a gazdába implantálhatjuk.

Azért részesítjük előnyben, hogy a sejteket in vivő tegyük ki a korlátozó körülményeknek, mert a sejtek által mutatott kívánt cél sejt tulajdonság a korlátozó körülményekkel párhuzamosan az összes celluláris fenotipusos jellegzetesség beállításával jön létre. Ezzel szemben, a korlátozó körülményekhez való akklimatizálódás vagy az ezeknek való expozíció in vitro körülmények között csupán néhány kívánt sejt tulajdonság kialakulását eredményezheti. Azonban amikor ezeket a sejteket egy gazdába implantáljuk, más sejt tulajdonságok megváltozhatnak és hatással lehetnek a kívánt kialakult cél sejt tulajdonságra vagy tulajdonságokra.

Előnyösen, a recipiens és a gazda is főemlős, legelőnyösebben a gazda egy ember. Előnyösen a gazdában az implantációs hely ugyanaz, mint a recipiensben.

Az ezen megvalósulás szerint in vivő előállított sejtek egy vagy több korlátozó körülmény között tarthatók fenn és diagnosztikai vagy más célokra in vitro használhatók.

Egy másik megvalósulásban a sejteket többféle korlátozó körülmény hatásának vetjük alá in vitro a bekapszulázás előtt.

• ·

Előnyösen ezután a sejteket bekapszulázzuk és további korlátozó körülményeknek vetjük alá a gazdába való implantáció előtt. A bekapszulázás előtti egy vagy több korlátozó körülménynek való expozíció lehetővé teszi a kezdeti sejtpopulációból a túlélő sejtek kiválasztását és csupán ezen sejtek bekapszulázását. Ha a használt sejtek post-mitotikus vagy egyébként nem-osztódó állapotban vannak a sejtek a kezdeti populációból választhatók nyilvánvaló egészséges állapotuk, fenotípusuk alapján, amit előnyösen a kívánt biológiailag aktív molekula termelésének mérése alapján határozunk meg. Ha a használt sejtek aktívan osztódó sejtek a túlélő sejtek tipikusan túlnövik a kezdeti populációt.

A korlátozó körülményekre adott válaszként kialakuló kívánt sejt tulajdonság kiváltásához szükséges idő a használt sejtektől, valamint a korlátozó körülményektől függ. Tipikusan a sejtek átesnek egy tranziens perióduson, amikor kezdetben kitesszük ezeket a korlátozó körülménynek vagy körülményeknek, mely időtartam alatt a sejt fenotípus tovább változik egészen addig, míg a sejt tulajdonság ki nem alakul a korlátozó körülményre adott válaszként. Az átmenethez szükséges időtartam rutin vizsgálatokkal határozható meg.

Egy előnyben részesített megvalósulásban ideg növekedési faktor (NGF) szekretálására manipulált baby hörcsög vese sejteket (BHK sejtek) szuszpendálunk kollagén/Vitrogen mátrixban és üreges, szemi-permeábilis rostokba kapszulázzuk, melyek végeit lezárjuk. Az ilyen BHK-hNGF sejtek előállítása például a PCT/US94/09299 számú US szabadalomban került leírásra, mely a hivatkozás révén részét képezi a találmánynak. A kapszulákat in vitro alacsony oxigén és alacsony glükóz • · · • · · • · a körülményekhez akklimatizáljuk és a kapszulából kiszabaduló NGF mennyiségét az in vitro akklimatizációs idő függvényeként mérjük. Az NGF termelés kapszulánként! sebessége az in vitro akklimatizációs idővel növekszik (1. ábra).

Egy másik előnyben részesített megvalósulásban, a bekapszulázott BHK-hNGF sejteket egy gazda laterális kamráiba implantáljuk és in vivő akklimatizáljuk. a kapszulákat explantáljuk, az akklimatizált sejteket eltávolítjuk és ismételt átoltással szaporítjuk, majd újra bekapszulázuk az in vivő akklimatizált sejtek recipiensbe való implantációja céljából. A nem-akklimatizált vagy in vivő akklimatizált sejteket tartalmazó kapszulákat a re-implantáció előtt, majd a re-implantáció után különböző időpontokban NGF felszabadulásra vizsgáljuk a recipiensben (11. ábra).

Egy másik előnyben részesített megvalósulásban PC12 sejteket kapszulázunk be egy egyrétegű szemi-permeábilis membránba és in vivő korlátozó körülményeknek vetjük alá 6 hónapon keresztül főemlős agyakban. A 6 hónapos implantációs idő után a sejtek a kívánt sejt tulajdonsággal rendelkeznek a korlátozó körülményre adott válaszként -- azaz a sejt megváltozott neurotranszmitter termelést mutat, ahogy azt az Ldopa:dopamin alap sebességével mérjük, valamint más katekolaminok relatív termelésében bekövetkezett változás mérésével az implantáció előtti szintekhez viszonyítva (7.

ábra).

Egy másik előnyben részesített megvalósulásban a PC12 sejteket bekapszulázzuk és in vivő akklimatizáljuk substancia nigra agyrégiókban, melyek normális dopamin szintekkel, vagy csökkent dopamin szintekkel rendelkeznek, melyeket a 6• · · · · ··· · ··· · • · · · · • · · ·· ··· · ·· hidroxidopamin (6-OHDA) alkalmazás előtt unilaterálisan indukálunk. Az in vivő 28 vagy 60 napig akklimatizálódott PC12 sejtek az L-dopát magasabb szinteken termelik, mint a rövidebb ideig akklimatizálódott sejtek. A normális dopamin szintek jelenlétében in vivő akklimatizálódott sejtek magasabb Ldopa:dopamin termelési arányt valósítanak meg, ha egy recipiensbe újra-implantáljuk ezeket, mint a csökkent dopamin szintekkel rendelkező 6-OHDA léziós substancia nigrában akklimatizált sejtek (9. ábra).

Egy másik megvalósulásban a kettős burkolatú szemipermeábilis membránokba bekapszulázott mellékvese chromaffin sejteket in vivő korlátozó körülményeknek vetjük alá 55 és 84 napig emberekben a subarachnoid térben. Az implantációs időszak után a sejtek megváltozott neurotranszmitter termeléssel rendelkeznek.

Számos különböző implantációs helyet veszünk figyelembe. Ezek közé az implantációs helyek közé tartoznak a központi idegrendszer, ideértve az agyat és a szem vizes részeit és az üvegtestet. Az agyban előnyben részesült helyek közé tartoznak a striatum, a cerebrális cortex, a subtalamikus mag és a Meynert Basalis nukleusza. Másik előnyben részesített hely a cerebrospinális folyadék, legelőnyösebbek a subarachnoid tér és a laterális kamrák. Ez a találmány foglalkozik a vese subkapszuláris helyre való implantációval és az intraperitoneális és szubkután helyekkel, vagy bármely más terápiásán hatékony hellyel.

Bizonyos esetekben hasznos lehet az implantációs hely módosítása az optimális környezet létrehozása céljából az akklimatizáció előtt, vagy azzal egyidöben. Például, a • · · • ·

Parkinson betegség egy ismert modelje magába foglalja a 6hidroxidopamin alkalmazását az agy substancia nigra régiójában. Ez a toxin a dopaminerg neuronokra szelektív. A sejtek erre a léziós területre implantálhatók és akklimatizálhatok. A PC12 sejtek - melyek, ha ilyen léziós agy területre implantálják ezeket katekolaminokat termelnek - teljes katekolamin növekedést mutatnak in vivő körülbelül egy hónap után. Továbbá, a katekolamin típusok aránya változik, az alap L-dopa:dopamin aránya csökken in vivő körülbelül 14 nap után.

A helyi környezet az implantációs helyek és a különböző fajok között változik. Valószínűleg bármely adott implantációs hely helyi környezete változik ugyanazon faj egyedei között is. Általában, egy adott implantációs helyen jelen levő metabolit és gáz koncentráció megközelíthető a publikált adatokból, vagy a tudomány e területén képzett szakember túlzott vizsgálatok nélkül meghatározhatja.

Például emberek esetében, ismert, hogy a testben az oxigén tipikus parciális nyomása 90 mmHg érték (az artériás vérben) és 1 mmHg értéknél kisebb (a dolgozó izmokban) határok közötti. Más tipikus oxigén nyomások a következők: vénás vér (40 mmHg), peritoneális üreg (47 mmHg), cerebrospinális folyadék (59 mmHg).

Hasonlóképpen, a tipikus glükóz értékek 80-120 mg/deciliter (4,4 - 6,7 mM) értékek között változik a vérrel ellátott szövetekben és 40-70 mg/deciliter (2,2-3,9 mM) a cerebrospinális folyadékban (CBF)(lásd Geigy Scientific Tables, Vol.l. Units of Measurements, Body Fluids, Composition of the Body, Nutrition, 8th Ed. Ed. C. Lentner, CIBA-GEIGY, 1984). Ilyen és ehhez hasonló példák találhatók a Geigy Scientific • · ·

Tables-ben, mely a hivatkozás révén részét képezi a találmánynak. Az 1. táblázat a vérszérumban és a CSF-ben levő számos vegyület koncentrációit hasonlítja össze.

1. táblázat

Vegyület Cerebrospinális folyadék Vér (szérum)

oxigén	59	mmHg	40	mmHg
glükóz	100 ± 20	mg/dl	55 ± 15	mg/dl
galaktóz	166 ± 99	μΜ	17	μΜ
glicerol	13,5 ± 2,5	μΜ	120 ± 65	μΜ
tej sav	1,6 ± 0,2	mM	0,76 ± 0,34	mM
piruvát	115 ± 17	μΜ	32 ± 19	μΜ
foszfolipidek	5,21 ± 0,9	μΜ	2,9 ± 1,2	μΜ
zsírsavak	3,5	μΜ	500	μΜ
cAMP	21 ± 8	nM	11 ± 2,4	nM
cGMP	2,4 ± 0,5	nM	9,5 ± 2,1	nM
klorid	125 ± 3	mM	102,5 ±4,5	mM
foszfor	0,52 ± 0,07	mM	1,05 ± 0,31	mM
nátriuum	145 ± 3,9	mM	140 ± 2,38	mM
kalcium	1,19 ± 0,08	mM	2,44 ± 0,1	mM
magnézium	0,89 ± 0,17	mM	0,78 ± 0,04	mM

• · ·

zink	0,49 ± 0,12	μΜ	16,7	± 3,1	μΜ
vas	0,8 ± 0,4	μΜ	17,2	± 0,75	μΜ
réz	0,25 ± 0,06	μΜ	16,25	± 0,75	μΜ
mangán	21 ± 6	nM	10 ±	2,4	nM
kolin	8,3 ±1,7	μΜ	15,5	± 2,3	μΜ
hisztamin	87	nM	3,4 ±	0,7	nM
norepinefrin	1,4	nM	1,65	±1,0	nM
epinefrin	0,24	nM	0,13	± 0,1	nM
serotonin	3,9 ± 1,08	nM	50 ±	20	nM

A glükózt, aminosavakat, laktatót és a ribonukleotidokat magába foglaló molekulák keresztül jutnak a vér-agy gáton a CSF-be, hogy ellássák a CSF-által érintett területeket, mint például a kamrákat, a subarachnoid teret és a gerinccsatornát. A gakatóz koncentrációk általában 10-szer magasabbak a CSF-ben és a piruvát és tej sav sokkal koncentráltabbak a CSF-ben, mint a vér plazmában. Ezzel szemben, a legtöbb aminosav 5 - 30-szor koncentráltabb a vérben, mint a CSF-ben (lásd Geigy Scientific Tables, Vol.I, supra, p. 169).

Más mikrotápanyagok , mint a C vitamin, a folátok (B vitamin komplexek tagjai) a dezoxiribonukleotidok és a piridoxin (B6 vitamin) aktívan transzportálódik át a vér-agy gáton a CSF-be. Ezenkívül, az ionok, mint például a nátrium, a kálium, a kálcium, a magnézium és a klorid koncentrációi szigorú szabályozás alatt vannak a CSF-ben (Spector and Johanson, Scientific American, pp. 68-74 (november, 1989) .

A tenyész tápközegben jelen levő metabolitokat tipikusan úgy választjuk meg, hogy a sejtek szaporodását és életképességét optimalizálja a szövet tenyészetben. Ezen vegyületek koncentrációja eltér egy adott implantációs helyen levő koncentrációktól. Gyakran a sejteket olyan só és glüküóz koncentrációkban szaporítjuk, melyek magasabbak, mint a kívánt implantációs helyen található koncentrációk. Például az RPMI 1640 tápközeg 11,1 mM glükózt tartalmaz, míg a vér szérumban a glükóz szintek csupán körülbelül 4,5 mM érték közüliek és csupán 2,2 - 3,9 mM érték körüliek a CSF-ben.

Hasonlóképpen, az RPMI 1640 tápközegben a kálcium szintek 0,42 mM értékűek, míg a CSF-ben 1,2 mM és a vér szérumban 2,44 mM (1. táblázat). A zink ionok 0,5 μΜ mennyiségben vannak jelen a CSF-ben, 16,7 μΜ mennyiségben a vér szérumban és hiányzik az RPMI 1640 tápközegbol.

Továbbá, a legtöbb sejtet in vitro szaporítjuk környezeti oxigén szinteken (142 mmHg) vagy inkubátorban környezeti nedvességtartalom mellett és 5 - 7% CO2 alatt (például Aebischer et al., Bio-materials, supra; Ward et al., supra). Ez jelentősen magasabb lehet, mint a gazdában a kiválasztott implantációs helyen levő in vivő oxigén koncentrációk.

Továbbá, az összes szövet tenyésztő tápközegbol hiányzanak a rövid életű molekulák, melyek in vivő jelen vannak. Ezek a rövid életű molekulák hamar lebomlanak és folyamatosan szintetizálódnak vagy újra feltöltődnek in vivő. Néhány tenyész tápközeg ki van egészítve hővel inaktivált magzati borjú, vagy ló szérummal bizonyos anyagok pótlása céljából, azonban a rövid életű molekulák általában kis mennyiségben vannak jelen a szérumban, vagy hiányoznak abból. Amikor szérummal egészítik ··· ··· ki, a teljes tápközeg tipikusan kevesebb, mint 20%-a szérum, így ezen molekulák mennyisége a tápközegben legjobb esetben is a szérumban található koncentráció csupán egy ötödé lesz. Továbbá, a szérummal kiegészített tenyész tápközeg tartalmazhat olyan molekulákat, melyek nem fordulnak elő egy disszonáns gazdában, és melyek nem kívánatos hatással lehetnek a bekapszulázott sejtekre. Végül, míg a legtöbb alkotórész szérum koncentrációja visszatükröződik az intersticiális folyadékban levő koncentrációban a specifikus anyagok koncentrációja szignifikánsan eltérhet a szérum és az intersticiális folyadék között.

A jelen találmányban használt sejtek lehetnek allogének a gazdára (azaz ugyanabból a fajból származhatnak, mint a gazda), vagy lehetnek xenogének a gazdával (azaz egy másik fajból származhatnak). Előnyben részesítjük, ha a sejteket egy xenogén gazdába implantáljuk. El kell fogadni, hogy egy xenogén gazdába való implantációhoz a sejtek előállítása más korlátozó körülményeket foglal magába, mint egy allogén gazdába való implantációhoz, és fenotipusosan eltérő sejt populációt hozhat létre, eltérő sejt tulajdonságokkal.

A sejtek előállíthatok egy donorból (azaz primer sejtek vagy szövetek, ideértve a felnőtt, neonatális és magzati sejteket vagy szöveteket), vagy olyan sejtekből, melyeket in vitro szaporítunk, mint például a halhatatlanná tett sejteket vagy sejtvonalakat, ideértve a genetikailag módosított sej teket.

A primer sejtek származhatnak nem osztódó (post mitotikus) szövetekből, természetesen osztódó (mitotikus) sejtekből, mint például a májban levő sejtekből, vagy pluripotens törzs • · · oligodendrocitákból és adócsövekből, mellékvese sejtekből, mint amilyenek a lépben és a csontvelőben vannak. Az in vivő nyert mitotikusan aktív sejtek származhatnak rákos sejtekből (tumor sejtekből).

A jelen találmány szerint használható primer sejtek közé tartoznak a növekedési faktor-érzékeny neurális ős törzs sejtek, melyek emlősök CNS-éből származnak (Reynolds and Weiss, Science, 255, pp. 1707-10, 1992; Richards et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, pp. 8591-95, 1992; Ray et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, pp. 3602-06, 1993), primer fibroblasztokból, Schwann sejtekből, asztrocitákból, beta-TC sejtekből, Hep-G2 sejtekből, ATT20 sejtekből, prekurzoraikból, mioblasztokból, chromaffin sejtekből vagy az adrenális medulla szövetéből származnak. Előnyben a neurális törzs sejteket és a mellékvese chromaffin sejteket részesítjük.

A szintén előnyben részesített Schwann sejtek a Bunge-féle módszer szerint is előállíthatok (WO92/03536 számú PCT közzétett szabadalmi alkalmazás). A bekapszulázott Schwann sejtek az agy megfelelő területeire implantálhatók a Parkinsonféle betegséggel kapcsolatos nigral striatal dopaminerg neuronok degenerációjának megelőzése céljából. Általában, az előnyben részesített implantációs hely a striátumban vagy ahhoz közel helyezkedok el. A sejtek bekapszulázása trofikus faktorok szekrécióját fokozhatja, mivel a sejtek nem lesznek közeli kapcsolatban a neuronokkal és a mielináció bekövetkezhet. Más gliás sejt típusok bekapszulázhatók és ilyen célból implantálhatók, ideértve az asztrocitákat oligodendrocitákat.

es az • ·· • · · · • · · · · • ·· · · ··· · ··

Egy szelektált terméket termelő sejtek vagy szövet izolálására szolgáló technikák jól ismertek, vagy ismert eljárásokból adaptálhatók. Például, a Langerhans szigetek izolálhatok egy nagy állati hasnyálmirigyből (például humán vagy sertés) mechanikus kitágítás és kollagenázos emésztés kombinációjával, amint azt a Scharp et al. leírták, vagy a 4,868,121 számú US szabadalomban leírásra került. A szigetek kis állatokból is izolálhatok, például patkányokból, Scharp et al módszerének megfelelően (Diabetes 29, auppl. 1., pp. 19-30,

1980) .

Hasonlóképpen, hepatociták máj szövetből izolálhatok a szövet frakcionálás után alkalmazott kollagenázos emésztést használva, ahogy azt Sun et al leírták (Biomat. Art. Cells, Art. Org., 15, pp. 483-496, 1987) . A mellékvese chromaffin sejtek ismert módszerekkel izolálhatok (Livett, Physiology Reviews, 64, pp. 1103-61, 1984; Ságén et al. , 4,753,635 számú

US szabadalom).

A halhatatlanná tett sejtek származhatnak primer forrásokból, vagy vírusokkal, virális gén termékekkel, onkogénekkel, vagy más halhatatlanná tevő génekkel vagy gén termékekkel transzformált sejtekből szelektálhatok. A jelen találmány gyakorlatának megvalósításához használható megfelelő nyilvánosan beszerezhető sejtvonalak közé tartoznak a baby hörcsög vese sejtek (BHK), a kínai hörcsög ovárium (CHO) sejtek, az egér fibroblaszt (L-M), a NIH svájci egér embrió (NIH/3T3) sejtek, az afrikai zöld majom sejt vonalak (ideértve a COS-a, a CCOS-7, a BSC-40, a BMT-10 és a Verő sejtvonalakat), a patkány adrenális feochromocitoma sejteket (PC12), a PC12A sejteket, a patkány gliás tumor sejteket (C6), a RAJI sejteket • ·· • · « ··« (humán limfoma), a MOPC-31C egér plazmacitoma sejteket, az MN9D, MN9H sejteket és a ripTAg transzgenikus egér eredetű sejteket. A BHK és a PC12 sejteket részesítjük előnyben.

A sejtek immortalizációjához való technikákat Land et al. (Natúré, 304, pp. 596-602, 1983) és Cepko (Neuron I pp. 345353, 1988) írták le. A jelöltként szóbajövő sejtvonalak közé tartoznak a genetikailag manipulált béta sejt vonalak, melyek inzulint szekretálnak, mint például a NIT sejtek (Hamaguchi et al., Diabetes 40, p. 842, 1991) és a RIN sejtek (Chick et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, pp. 628-632, 1977), az ATT sejtek (Hughes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, pp. 688692, 1992), a CHO sejtek (Matsumoto et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp. 9133-37, 1990) és a beta-TC-3 sejtek (Tál et al., Mól. Cell Bioi. 12, pp. 422-32, 1992).

A jelen találmány sejtjei vagy természetesen termelik a biológiailag aktív molekulát vagy genetikailag manipulálhatók, hogy termeljenek ilyet. Például, a fibroblasztok transzfektálhatók egy a kiválasztott termékhez (például ideg növekedési faktor, eritropoietin, inzulin, CNTF vagy VlII-as faktor) való expressziós vektorral.

A betegségek vagy rendellenességek kezelésére szolgáló biológiailag aktív molekulákra szolgáló példák közé tartoznak az inzulin, mely a diabetes kezelésére használható, a paratiroid hormon, mely a hipoparatiroidizmus kezelésére használható, az erithropoietin, mely az anémia kezelésére használható és a gamma-aminovajsav, mely az epilepszia kezelésére használható.

Hasonlóképpen, a biológiailag aktív molekulák, mint a trofikus és növekedési faktorok felhasználhatók a • ·ί c · · » « ··« «· • · « · · *»« ·· ·Λ· · ·· neurodegeneratív körülmények, mint például a Huntington-féle

chorea, az	Alzheimer betegség,	az AIDS-szel	kapcsolatos
dementia és	a	Parkinson kór	kezelésében	vagy annak
megelőzésében	. A	biológiai válasz	faktorok, mint például a
limfokinek	vagy	a citokinek	fokozhatják	a beteg

immunrendszerét, vagy gyulladásgátló anyagként működhetnek és bizonyos krónikus fertőző betegségek vagy a rák kezelésében lehetnek hasznosak. Továbbá, a katekolaminok, az endorfinok, az enkefalinok és más ópioid peptidek szintén biztosíthatók bekapszulázott sejtek alkalmazásával a fájdalom kezelésében.

A bekapszulázott sejtek felhasználhatók olyan biológiailag aktív molekulák biztosítása céljából, melyek egy enzimatikus hiányosságot korrigálnak. Egy ilyen hiányosságra példa a fulminális máj elégtelenség, ahol a máj szövet nem képes a toxinokat eltávolítani vagy a metabolikus hulladék termékeket kiválasztani. Másik példa a fenilketonuria, ahol a fenilalanin aminosav veszélyes szinteket ér el az érintett gyermek véráramában.

Másik lehetőségként a bekapszulázott sejtek termelhetnek olyan biológiailag aktív molekulákat, melyek megszüntetik a káros és nem kívánatos termékeket a gazdában. Például a bekapszulázott sejtek termelhetnek olyan biológiailag aktív molekulákat, melyek kisöprik a koleszterint a gazdából.

A jelen találmány biológiailag aktív molekulái közé tartoznak a hormonok, a citokinek, a növekedési faktorok, a trófikus faktorok, az angiogenezises faktorok, az antitestek, a vér koagulációs faktorok, alimfokinek, az enzimek és más terápiás anyagok, vagy agonisták, prekurzorok, aktív analógok, vagy ezek aktív fragmentjei. Ezek közé tartoznak a • · · • · · « · · a • · · • · · · · ··· katekolaminok, az endorfinok, az enkefalinok és más ópioid peptidek, a dinorfin, az inzulin, a VlII-as faktor, az erithropoietin, a P anyag, az ideg növekedési faktor (NGF), a gliás sejtvonal eredetű neurotróf faktor (GDNF), a vérlemezke eredetű növekedési faktor (PDGF) az epiderális növekedési faktor (EGF), az agy eredetű neurotróf faktor (BDNF), a neurotrofin-3 (NT-3) a neurotrofin-4/5 (NT-4/5) egy sor fibroblaszt növekedési faktor, ciliáris neurotróf faktor (CNTF), a CNTF-féle rokon molekulák és az inzulin-szerű I-es,

ΙΙ-es és III-as növekedési faktorok.

Egy megvalósulásban a biológiailag aktív molekula egy neurotranszmitter. Az ilyen neurotranszmitterek közé tartoznak a dopamin, a gamma-aminovajsav (GABA), a szerotonin, az acetilkolin, a norepinefrin, az epinefrin, a glutaminsav, és más peptid neurotranszmitterek. Továbbá, a biológiailag aktív molekula lehet egy agonista, egy analóg, vagy egy neurotranszmitter - ideértve az L-dopát, egy dopamin prekurzort - egy származéka vagy fragmentje.

Egy másik megvalósulásban az akklimatizált sejtek antinociceptikus anyagokat szekretálnak ideértve a katekolaminokat, az enkefalinokat, az ópioid peptideket, vagy ezek agonistáit vagy analógjait, vagy ezek keverékét. Előnyösen katekolaminok vagy enkefalinok szekretálódnak, legelőnyösebben a katekolaminok és enkefalinok keveréke szekretálódik.

A jelen találmányban hasznos kapszulák tipikusan legalább egy szemi-permeábilis külső felszín membránnal vagy burokkal rendelkeznek, mely egy a sejteket tartalmazó magot veszi körül. A burok lehetővé teszi a tápanyagok, biológiailag aktív molekulák és más szelektált termékek kapszulán keresztüli • · · diffúzióját. A kapszula biokompatibilis és előnyösen, immunoizolációs. A mag izolált sejteket tartalmaz, vagy egy folyadék tápközegben vagy egy hidrogél mátrixban immobilizálva.

A kapszula megszerkesztéséhez használt anyagok kiválasztását számos tényező befolyásolja, részletesen Dionne WO 92/19195 számú szabadalmában került leírásra. Röviden, számos polimer és polimer keverék használható a kapszula burkának létrehozásához. A kapszulát létrehozó polimer membránok közé tartozhatnak a poliakrilátok (ideértve az akril kopolimereket), a polivinilidének, a polivinil klorid kopolimerek, a poliuretánok, a polisztirének, a poliamidok, a cellulóz acetátok, a cellulóz nitrátok, a poliszulfonátok, a polifoszfazének, a poliakrilonitrilek, a PAN/PVC valamint ezek származékai, kopolimerei és keverékei.

A kapszulák a tudomány e területén ismert bármely módszerével létrehozhtaók. Egy ilyen módszer magába foglalja egy polimer öntő oldat és egy koaguláns - mely magába foglalhat biológiai szövet fragmenteket, organellumokat vagy sejtek és/vagy más terápiás anyagok szuszpenzióját - koextrúzióját. A burok lehet egyrétegű (1-es és 2-es típusú) vagy lehet kettős rétegű. (4-es típusú) . Egy egyrétegű üreges rost hozható létre a polimer oldat - mivel ko-extrudált - csupán egyik felszínének hűtésével. Egy kétrétegű üreges rost hozható létre a polimer oldat - mivel ko-extrudált - mindkét felszínének hűtésével.

Tipikusan, az 1-es típusú üreges rost nagyobb százalékát foglalják el makropórusok a 4-es típusú üreges rosthoz képest. A 2-es típusú üreges rost a kettő között található. Lásd például Dionne WO 92/19195 számú szbadalmát és az 5,158,881, • · ·

5,283,187 és 5,284,761 számú US szabadalmakat, melyek a hivatkozás révén részét képezik a találmánynak.

Számos kapszula konfiguráció lehetséges, például hengeres, korong alakú, vagy gömb alakú.

A hordozó burka olyan pórusméretű, mely meghatározza a permszelektív membrán molekulasúly méret határát (MWCO). Az MWOC-nál nagyobb molekulák fizikailag nem tudnak keresztül jutni a membránon. A membrán pórus méretet úgy választjuk meg, hogy lehetővé teszi a sejtek által termelt bizonyos faktorok hordozóból való diffúzióját, azonban megakadályozzák, hogy a gazda immunválasz faktorai bejussanak a hordozóba. Tipikusan az MWCO 50-200 kD értékek közötti, előnyösen 50-100 kD közötti. A legelőnyösebb membrán készítmény minimalizálja a kiválasztott implantációs helynél tudottan jelen levő gazda immun hatású molekulák és a hordozó külső membrán alkotórészei közötti kölcsönhatást.

Az immunoizolációs hordozó magját úgy szerkesztik meg, hogy megfelelő helyi környezetet biztosítson az abban izolált adott sejtek számára. A mag tartalmazhat egy folyadék tápközeget, mely elegendő a sejt szaporodás fenntartásához. A folyékony magok különösen alkalmasak az olyan transzformált sejtvonalak fenntartásában, mint a PC12 sejtek. Másik lehetőségként a mag állhat egy gél mátrixból. A gél mátrix állhat egy hidrogélböl (alginát, Vitrogen, stb), vagy extracelluláris mátrix komponensekből. Lásd például Dionne WO 92/19195 .

A hidrogéleket létrehozó készítmények három általános osztályba sorolhatók. Az első osztály tiszta negatív töltést hordoz (például alginát). A második osztály tiszta pozitív töltést hordoz (például kollagén és laminin). A kereskedelemben beszerezhető extracelluláris mátrix alkotórészekre szolgáló példák közé tartozik a Matrigel és a Vitrogen. A harmadik osztály tisztán semleges töltést hordoz (például erősen keresztkötött polietilén oxid, vagy polivinilalkohol).

A hidrogél mátrixból készített magok különösen alkalmasak olyan sejtek vagy szövetek fenntartására, melyek hajlamosak az agglomerációra vagy aggregálódásra, mint például a Langerhans szigetek sejtjei, vagy a mellékvese chromaffin sejtek.

A kapszula magjába helyezendő sejtek számát, vagy a szövet mennyiséget meghatározó tényezők (1) a kapszula mérete és geometriája; (2) a kapszulán belüli sejtek mitotikus aktivitása és (3) a mag elkészítéshez szükséges viszkozitás és/vagy terhelés. Ezek a tényezők részletesen a Dionne WO92/19195 szabadalomban kerültek leírásra.

Az implantált makrokapszulák könnyen visszanyerhetök a kapszulához erősített rögzítöszál (pányva) segítségével. A mikrokapszulák aspirációval vagy bármely más megfelelő módszerrel visszanyerhetök. Különösen a mikrokapszulák visszanyerését részesítjük előnyben egy erszényes eszközt használva, ahogy az a PCT/US93/07076 számú szabadalomban leírásra került.

A kapszula lezárásához bármilyen megfelelő módszer felhasználható, ideértve a polimer adhéziók és/vagy a perembehajtások, a csomózás és a hö zárás alkalmazását. Ezek a zárási technikák jól ismertek a tudomány e területén. Ezenkívül, mármely megfelelő száraz zárási módszer is felhasználható. Az ilyen módszerekben egy lényegében nem porózusos csöösszeköttetést biztosítunk, melyen keresztül a • · · sejteket tartalmazó oldatot bejuttatjuk. A töltés után a kapszulát lezárjuk. Ilyen módszer került leírásra a PCT/US94/07015 számú szabadalomban, mely a hivatkozás révén részét képezi a találmánynak.

Előnyösen egy vagy több in vitro kísérletet végzünk el a kapszulák funkcionalitásának meghatározása céljából az in vivő implantáció előtt. A tudomány e területén jól ismert vizsgálatokat vagy diagnosztikai teszteket lehet ebből a célból felhasználni. Lásd, például Methods in Enzymology, Abelson (Ed), Academic Press, 1993. Például ELISA (enzimhez kötött immunoszorbens vizsgálat), kromatográfiás vagy enzimatikus vizsgálat vagy a szekretált termékre specifikus biovizsgálat alkalmazható. Ha kívánatos, egy implantum szekréciós funkciója is nyomonkövethető az időben a recipiensböl való megfelelő minták (például szérum) gyűjtésével és ezek vizsgálatával. Ha a recipiens egy főemlős, mikrodializis használható. Az oxigén felvétel sebessége a tudomány e területén ismert módszerekkel mérhető (például a Diamond General Oxigén Uptake System (#1271) és egy polietilén membránnal ellátott Clark-tipusú elektród (#731) felhasználásával.

A heterológ géntermékek expresszálására manipulált sejtek genetikai stabilitását a gén inzertek kópia számának meghatározásával lehet megvizsgálni a tudomány számára ismert technikákat használva. Például a plazmid kópia szám enzimatikusan emésztett genom DNS mérésével, lenyomattechnikával, próbálási módszerrel, valamint a jel ismert standardokhoz való hasonlításával - Phosphorlmager (Molecular Dynamics) használva - határozható meg.

Az implantáció során bekövetkező terápiás hatást biztosító megfelelő kapszula számot és kapszula méretet az adott alkalmazáshoz szükséges biológiai aktivitás mennyisége határozza meg. Terápiás anyagokat felszabadító szekréciós sejtek esetében a tudomány e területén ismert standard dózis mérlegelés és kritérium módszerekkel határozzák meg a szükséges szekréciós anyagok mennyiségét. A figyelembe veendő faktorokat Dionne tárgyalja (WO 92/19195 szabadalmában).

A bekapszulázott sejtek implantációját steril körülmények között végezzük. Általában, a kapszulát a gazdában olyan helyre implantáljuk, mely lehetővé teszi a szekretált termék vagy működés gazdához való megfelelő szállítását, valamint a tápanyagok implantált sejtekhez vagy szövethez való szállítását és lehetővé teszi a kapszulához való hozzájutást a visszanyréshez vagy az újra behelyezéshez.

A továbbiakban a találmányt a következő példákkal szemléltetjük, melyekkel semmilyen módon nem korlátozni szándékoztuk a találmány körét.

Példák

1. példa

Alacsony oxigén és glükóz szintű környezetnek kitett bekapszulázott BHK sejtek NGF szekréciója

BHK sejtvonal termelés

Egy NGF-et termelő BHK sejtvonalat hozunk létre és alacsony oxigén és glükóz tartalmú környezetbe helyezzük.

• · · ···

Egy az első intron megközelítően 37 bázispár hosszúságú 3' végét tartalmazó 2,51 kilobázisú fragmentet, a pre-pro-NGF-hez való protein transzlációs startnak vélt kettős ATG szekvenciát és a teljes kódoló szekvenciát, valamint a humán gén teljes 3' nem-transziáit régióját (Hoyle et al., Neuron, 10, pp. 1019-34, 1993) a DHFR-alapú pNUT expressziós vektorba szubklónozzuk közvetlenül az egér metallotionein-1 promótertöl (-650 - +7) és a patkány II-es inzulin gén első intronjától downstream irányban (Baetge et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, pp. 5454-58, 1986) .

Baby hörcsög vese sejteket (BHK) transzfektálunk a pNUTbetaNGF szerkezettel a kalcium foszfátos módszert használva. A BHK sejteket 10% magzati borjú szérumot, 0,8 g/1 koncentrációjú 1 x pen/strep/amph B-t és L-glutamint (GIBCO) tartalmazó DMEMben 5% CO2-ben, 37 C° hőmérsékleten szaporítjuk. A transzfektált BHK sejteket 200 μΜ metotrexátot (Sigma) tartalmazó tápközegben szelektáljuk 3-4 hétig, majd a rezisztens sejteket poliklonális populációként tartjuk fenn 200 μΜ metotrexátban vagy anélkül.

A PAN/PVC rost előállítása

Permszelektív üreges rostokat állítunk elő száraz fuvókásnedves (jet-wet) forgató technikával (Cabasso, Hollow Fiber Membranes vol. 12, Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, Wiley, New York, 3rd ed. pp. 492-517, 1980; Dionne, WO 92/19195) . Az asszometrikus üreges rostokat a dimetil szulfoxidban levő 10%-os (w/w) poliakrilonitril polivinil klorid (PAN/PVC) kopolimer oldatból eltávolítjuk és közvetlenül • · egy koagulációs fürdőbe öntjük. A kapott kétrétegű (4-es típus) rostot összegyűjtjük egy nem-oldószeres vízfürdőbe, glicerináljuk és megszárítjuk.

A mátrix előállítása

Patkány farok kollagén (IV-es típus, Collaborative, 911083 sorozat) 8 ml mennyiségét adjuk hozzá 1 ml fenol vörös/foszfát puffereit sóoldathoz (PBS) és az oldat pH értékét 7,0 értékre állítjuk. 8 ml Vitrogen (Caltrix, Palo Alto, CA, 92H176-OS sorozat) adunk 2 ml fenol vörös/PBS-hez. A kollagén és a Vitrogen oldatok azonos mennyiségeit összekeverjük a mátrix oldat létrehozása céljából.

Töltési és zárási eljárás

A 90 %-os konfluenciáig szaporított NGF termelő BHK sejtek egysejt szuszpenzióját kálcium és magnézium mentes PBS-sel mossuk, körülbelül 1 percig tripszinizáljuk, majd centrifugálással pelletizáljuk 1000 rpm fordulatszámon 3 percen keresztül. A sejteket tápközegben reszuszpendáljuk, hogy a végső sejt koncentráció 2 x 10⁷ sejt/ml értékű legyen. Ezt a sejt szuszpenziót 1:1 arányban a kollagén/Vitrogen mátrix oldattal keverjük, így a végső sejt koncentráció 1 x 10⁷ sejt/ml értékű lesz.

A sejteket óvatosan belekeverjük a mátrixba, hogy az iszapot egyenletesen eloszlassuk a bekapszulázás előtt. A sejt/mátrix iszap 2,5 μΐ mennyiségeit (10000 sejt/μΐ) töltjük

egy rostszálba 24 adagolós ferde katéter csúccsal és egy Hamilton tűvel.

A kapszulákat úgy zárjuk le, hogy egy 1-1,1 cm hosszúságú száraz üreges rostot erősítünk a súlyponthoz egy szeptált rögzítővel a közeli végen, mely egy töltő bemenettel rendelkezik az eszköz üregébe injektálandó sejtek számára. Miután a sejt szuszpenzióból 2,5 μΐ mennyiséget beinjektálunk a szeptumot lepattintjuk és a bemeneti portát lezárjuk egy könnyű-vulkanizálású akriláttal (Luxtrak LCM 24, ICI Resins US, Wilmington, MA) (súlypont zárás) . A kapszulákat ezután rögzítjük, oly módon, hogy egy 1,5 cm 0,020 szilasztikus csövet helyezünk az akril közép fölé.

A kapszulákat három napig akklimatizáljuk környezeti oxigén szinteken, majd alap NGF szekrécióra teszteljük. A három napos tápközeget 1 ml friss tápközeggel helyettesítjük.

A kapszulákat ezután egy 24-üregű lemezre helyezzük, mely alacsony (0,8 mg/1) glükóz és alacsony (50 mmHg) oxigén vagy magas (5,5 mg/1) glükóz és környezeti (142 mmHg) oxigén szinteket tartalmaz. A tápközeget cseréljük és minden 7. napon NGF vizsgálatot hajtunk végre. Egy nappal a váltás előtt a friss tápközeget a megfelelő oxigén koncentrációkra hozzuk az egyes akklimatizációs körülmények számára. A bekapszulázott sejteket ily módon négy hétig tenyésztjük.

Az NGF szinteket ELISA (enzimhez kötött immunoszorbens vizsgálat) módszerrel határozzuk meg a 0., 3., 7., 14., 21., és 28. napon. A reprezentatív kapszulákat 4% formaldehiddel rögzítjük a sejt életképesség profilok hisztológiai meghatározása céljából.

A 4% formaldehidben való rögzítést kővetően a visszanyert kapszulákat foszfát puffereit sóoldattal (PBS) mossuk, alkohol grádiensben (95 %-osig tart) dehidratáljuk és glikol metakrilát infiltrációs oldatba (Historesins Mounting Médium, ReichertJung) helyezzük. Három mikronos szekciókat vágunk egy mikrotommal (Supercut 2065, Leica) üveg tárgylemezekre helyezzük és krezil ibolyával megfestjük.

NGF ELISA

A bekapszulázott BHK/NGF sejtekből kiszabadult hNGF mennyiségi meghatározását a következők szerint hajtjuk végre. Nunc-Immuno Maxisorp ELISA lemezeket üregenként burkoló pufferben (1 x PBS CaCl2 nélkül és MgCl2/0,l% nátrium azid nélkül, pH = 9,6) levő 150 μΐ anti-egér-beta (2,5S) NGF-fel burkolunk 1 ng/ml koncentrációban, majd 37 C° hőmérsékleten inkubáljuk legalább két órán keresztül vagy 4 C° hőmérsékleten egy éjszakán keresztül.

A burkoló oldatot leöntjük az üregeket 3-szór mossuk 300 μΐ mosó pufferrel (50 mM tris-HCl/200 mm NaCl/l% Triton X100/0,1% nátrium azid elegye, pH = 7,0), majd 300 μΐ 10 mg/ml BSA-t tartalmazó burkoló oldattal blokkoljuk szobahőmérsékleten 30 percen keresztül. Ezután az üregeket 3-szor mossuk 300 μΐ mosó pufferrel. A kondicionált tápközeg mintákat 1:1 arányban az üregekbe töltött elkészített minták 10 μΐ mennyiségét tartalmazó 2-szeres minta pufferrel (a minta puffer ugyanabban a pufferben van mint a mosó puffer, csupán 2% BSA van benne) hígítjuk. A lemezeket legalább 2 órán keresztül inkubáljuk 37 C° hőmérsékleten vagy egy éjszakán keresztül 4 C° hőmérsékleten.

• · · · · *»· · · ··· ··«

Az összes üreget kiürítjük, 3-szor mossuk 300 μΐ mosó pufferrel és 100 μΐ 4 U/ml-es anti-egér-beta (2,5S) NGF-betagal konjugátumot adunk hozzá. A lemezeket 37 C° hőmérsékleten inkubáljuk legalább egy órán keresztül. Az egyes üregeket kiürítjük, 3-szor mossuk 300 μΐ mosó pufferrel és 200 μΐ klórfenol vörös-beta-D-galakto-piranozid szubsztrát oldatot (40 mg CPRG 100 mM Hepes/150 mM NaCl/2 mM MgCl2/0,l% nátrium azid/1% BSA, pH=7,0) adunk hozzá. A lemezeket 37 C° hőmérsékleten inkubáljuk 30 - 60 percen keresztül, vagy addig, amíg a szín képződés elegendő az 570 nm hullámhosszon történő fotometriás meghatározáshoz.

Az idő függvényében a kapszulánként! NGF felszabadítást a két környezeti körülmény alatt a 10 %-os 4-es típusú közép zárású rostok esetében az 1. és 2. ábrákon kerül bemutatásra.

Az adatokat kapszulánként! és 24 óránkénti ng NGF felszabadulásként expresszáljuk. A kapszulánként! NGF termelés az értékelési időszak alatt nő.

2. példa

A különböző hidraulikus permeabilitású kapszulákba történő bekapszulázás után akklimatizált BHK sejtek NGF szekréciója

Az 1. példában leírtak szerinti BHK-hNGF sejteket használjuk fel ebben a példában. Az üreges rostokat az 1. példában leírtak szerint állítjuk elő, azzal az eltéréssel, hogy makrokapszulákat használunk 12,5% és 15% PAN/PVC-t használva, valamint 10% PAN/PVC-t használva a kiöntő oldatban. A PAN/PVC kétrétegű rostok (T4) 1 cm hosszúságúak és a következő tulajdonságokkal rendelkeznek:

% szilárd anyag	I.D. (μπι)	Hidraulikus permeabilitás
10	721	60
12,5	733	20
15	746	13
(a hidraulikus	permeabilitás	ml/perc/m^/mmHg értékben van
kifejezve)
A BHK-hNGF	sejteket a	makrokapszulák három típusába
töltjük és az	1. példában	leírtak szerint lezárjuk. A

kapszulákat alacsony glükóz és alacsony oxigén körülmények közé helyezzük négy hétre és az 1. példában leírtak szerint teszteljük NGF felszabadításra.

A három különböző kapszulából történő NGF termelés (az idő függvényében) a 3. ábrán kerül bemutatásra. A 10%-os PAN/PVC kapszulából az átlagos NGF termelés körülbelül 50 ng/kapszula/24 óra négy hét után, a 30 ng/kapszula/24 óra értékhez hasonlítva a 12,5 %-os PAN/PVC kapszulához viszonyítva. A 15%-os PAN/PVC kapszula nem termelt detektálható szintű NGF-et 1, 2, 3 vagy 4 hét után. A kapszulák hisztológiai vizsgálata megerősíti, hogy az egészséges sejt csoportok jelen vannak a 10 és 12,5 % PAN/PVC kapszulákban. A 15%-os PAN/PVC kapszulákban csipán elpusztult sejtek vannak jelen négy hét után.

3. példa

Bekapszulázott BHK-hNGF sejteket gazdába történő implantációja

Az 1. példa bekapszulázott sejtjeit az 1. példa alacsony oxigén és glükóz koncentrációinak vetjük alá, míg a BHK sejtek ··** · ·« · ·>

• · · · · *·· -·· ··· · »*

NGF szekréciója stabillá válik ilyen korlátozó körülmények között. A bekapszulázott sejteket egy humán gazdába implantáljuk. Az implantációs helyek közé tartozik a laterális kamrák és az agy striatuma. A kapszulák agyba való implantációs eljárásai Aebischer et al WO 93/00137 szabadalmában kerültek leírásra, mely a hivatkozás révén részét képezi a találmánynak.

4. példa

In vitro korlátozó körülményeknek kitett bekapszulázott mellékvese chromaffin sejtek

Szarvasmarha mellékvese chromaffin sejteket nyerünk mellékvese mirigyekből kollagenázos emésztés segítségével a Livett által leírtak szerint (Physiol. Rév., 64, pp. 1103-62,

1984). A mellékvese sejt agregátumokat egy 1,5 %-os CaCl2-vel keresztkötött alginát mátrixban immobilizáljuk és kettős rétegű 4-es típusú, immunoizolációs PAN/PVC üreges rost membránokba kapszulázzuk (ID 750 μια, a fal 85 μτη, MWCO 60 kD) , alapjában véve a WO92/19195 szabadalomban leírtak szerint.

A bekapszulázott sejteket 2 hétig 20, 40, 60, 80 és 142 mmHg pŰ2 értéken tenyésztjük. A sejteket teszteljük az alap és a K⁺-kiváltott katekolamin felszabadulásra a 2. és a 14. napon. 14 nap után a kapszulákat 4% paraformaldehidben rögzítjük és a hisztológiához készítjük elő, szekciónáljuk és morfológiailag vizsgáljuk.

A katekolaminokat HPLC-vel analizáljuk elektrokémiai detektálást használva. A kromatográfiás rendszerben egy kolometriás multielektródos detektort (5100A model, ESA Inc.), • · · egy Hitachi L6200 pumpát (Hitachi Inc.) és egy Hypersil 150 nm x 4,6 mm mikron ODS oszlopot (Keystone Scientific Inc.) használunk, mely egy MPLC NewGuard Column-hoz (Applied Biosystems, Inc.) illeszkedik. A futtatásokat 26 C° hőmérsékleten végezzük.

A mobil fázis 75 mM NaH2PC>4-et, 1,4 mM oktán-szulfonsavat, 0,274 mM EDTA-t és 100 ml/1 O^CN-t tartalmaz. A pH értéket 3,0-ra állítjuk koncentrált foszforsavat használva. Az átfolyási sebességet 1,0 ml/perc értéken tartjuk.

A detektort felszereljük egy preinjektor védő cellával (5020-as model) , mely +450 mV értéken működik, és egy magas felbontású kettős analitikai cellával (5011-es model), mely oxidativ szkrínelési módban üzemel +400 mV értéken sorrendben az 1-es és a 2-es elektród esetében. Az analitokat a 2-es detektoron mérjük.

Háromszoros standardeket használunk az 52 fmolos detektálási küszöbök értékelésére L-dopa (L-3,4-dihidroxifenilalanin) esetében, Dopac (3,4-dihidroxi-fenil-eccetsav), norepinefrin (NE) és dopamin (DA) esetében és 104 fmol oszlopon levő HVA (homovanilinsav) esetében százalékos standard eltérés határok között sorrendben 2-5%, 9-12%, 15-24% és 6-16% küszöbértékeknél. Az egyedüli 7-pontos standard görbék lineárisak az 52-3300 fmol oszlopon levő analit határok között L-dopa, Dopac, NE, és DA esetében és 104-6600 fmol a HVA esetében sorrendben 0,999, 0,998, 0,999 és 0,999 r^ értékekkel.

Az adatokat egy Waters 845 VAX Kromathography Workstation segítségével rögzítjük és a csúcs területeket integráljuk.

Az eredményeket a 4. ábra mutatja. Az adatokat pikomol/30 perc értékekben fejezzük ki (alap hozam) vagy pikomol/15 perc értékekben (K⁺-kiváltott hozam) fejezzük ki. Magasabb O2 koncentrációk mellett az alap és még inkább a K⁺-kiváltott norepinefrin (NE) és epinefrin (EPI) felszabadulás magasabb a 14. napon, mint a 2. napon. így a bekapszulázott sejtek korlátozó körülményeknek való kitevése egy vagy több sejt tulajdonság megváltozását eredményezi.

5. példa

Az in vivő korlátozó körülményeknek kitett bekapszulázott mellékvese chromaffin sejtek

Szarvasmarha mellékvese chromaffin sejteket állítunk elő a

4. példában leírtaknak megfelelően. Az adrenális sejt agregátumokat egy CaCl2-vel kereszt kötött 1,5 % alginát mátrixban immobilizáljuk és vagy egyrétegű 2-es típusú immunoizolációs PAN/PVC üreges rost membránba (ID 500 μπι, fal 70-90 mm, fal 70-90 gm, MWCO 60 kD) vagy kettős rétegű 4-es típusú immunoizolációs PAN/PVC üreges rost membránba (ID 500 μιη, fal 70-90 μπι, MWCO 60 kD) kapszulázzuk, alapjában véve a WO 92/19195 szabadalomban leírtaknak megfelelően.

A bekapszulázott sejteket in vivő korlátozó körülmények hatásának vetjük alá oly módon, hogy patkány recipiensek striatumába implantáljuk. Patkányonként két kapszulát ülttetünk be bilaterálisán. A középvonalú bemetszést követően egy lyukat fúrunk a koponyába a bregma-tól 0,5 mm-re és 30, mm-re oldalt a bemetszési rúddal -0,3 mm-rel az intra-aurális vonal alatt. A kapszulákat 7 mm mélyen a dura alatt helyezzük el.

• · · ·

A kapszulákat katekolamin termelésre vizsgáljuk implantáció előtt és a hat hetes in vivő időszak után. A katekolamint a 4. példában leírtak szerint vizsgáljuk.

Az 5. ábra a 2-es típusú membránokkal elért eredményeket mutatja. Az adatokat pikomol/kapszula/15 perc értékekben fejezzük ki. Az alap (A panel) és K⁺-kiváltott (C panel) NE és EPI felszabadítási szintek a 6 hetes implantációs periódus előtt és után hasonlóak. Azonban, a nikotin-kiváltotta NE és EPI szintek (B panel) a 6 hetes in vivő kitettségi periódus után magasabbak mint az implantáció előtti szintek.

A 6. ábra a 4-es típusú membránokkal elért eredményeket mutatja. A K⁺-kiváltott (C panel) NE és EPI felszabadítási szintek a 6 hetes implantációs periódus előtt és után hasonlóak. Azonban, a nikotin-kiváltotta NE és EPI szintek (B panel) a 6 hetes in vivő kitettségi periódus után magasabbak mint az implantáció előtti szintek. Továbbá, eltérés található a katekolamin felszabadítás 6 hetes implantációs periódus előtti és utáni alap szintjei között is (A panel).

6. példa

Az in vivő korlátozó körülményeknek kitett bekapszulázott mellékvese kromaffin sejtek

A mellékvese chromaffin sejteket a 4. példában leírtak szerint állítjuk elő. Az adrenális sejt aggregátumokat CaCl2 vel keresztkötött 1,5%-os alginát mátrixban immobilizáljuk és 4-es típusú kétrétegű, immunoizolációs PAN/PVC üreges rost membránba (ID 500 μτη, fal 70-90 μτη, MWCO 60 kD) kapszulázzuk, alapjában véve a WO92/19195 szabadalomban leírtak szerint.

A bekapszulázott sejteket in vivő korlátozó körülményeknek vetjük alá patkány recipiensek gerinc subarachnoid terébe való implantáció révén. A sebészeti eljárást alapjában véve az Aebischer et al által leírt WO 93/00127 szabadalomban leírtak alapján végezzük el.

A kapszulákat katekolamin termelésre vizsgáljuk az implantáció előtt, valamint egy 6 hetes in vivő periódus után. A katekolamint a 4. példában leírtaknak megfelelően vizsgáljuk. Az adatokat pikomol/kapszula/30 perc értékben fejezzük ki.

A 7. ábra az NE és EPI termelés implantáció előtti és utáni különbségeit mutatja. A bekapszulázott sejteket 6 mónap időtartamra implantáljuk. A 6 hónapos in vivő időszak után az alap és a nikotin-stimulálta EPI termelés szignifikánsan csökken, míg az NE termelés szignifikánsan nő.

7. példa

Főemlős agyban in vivő korlátozó körülményeknek kitett bekapszulázott PC12 sejtek

A PC12 sejteket 10¾ hőinaktivált lószérummal, 5¾ magzati borjú szérummal és 100 egység penicillin/sztreptomicinnel kiegészített RPMI tápközegben szuszpenzióban tenyésztjük, összegyűjtjük, centrifugáljuk és a felülúszót leöntjük.

Fluka High MW chitozánt (4,4 g) oldunk fel 150 ml steril 0,85% sóoldatban 70 C° hőmérsékleten erős keverés mellett. Az oldat pH értékét 6,2-re állítjuk 45 ml 100 mM HEPES puffereit sóoldattal, melynek pH értéke 8,0. Az oldatot szűréssel strilezzük egy 0,22 μπι milliporusos szűrőn.

A kitozán oldatot azonos térfogatú RPMI-vel keverjük és a sejt pellet reszuszpendálására használjuk 5 x 10^ sejt/ml sejt koncentráció elérése céljából. A sejt/chitozán oldatot (megközelítően 1000 μΐ) PAN/PVC-vel koextrudáljuk, egyrétegű XP11 immunoizolációs PAN/PVC üreges rost membránok (ID 450-500 μνη, fal 50-65 μνη, MWCO 65-100 kD, hidraulikus permeabilitása 53 ml/perc/m²/mmHg, glükóz tömeg transzfer koefficiens 8 x 10“⁴ cm/s, pórus méret permeabilitás 88% BSA visszatartási koefficiens) létrehozása céljából. Ezeket a rostokat az 5,158,881, 5,283,187 és 5,284,761 számú US szabadalmakban leírt általános eljárásokat használva hozzuk létre. A rostokat a megfelelő dimenziójúra vágjuk (körülbelül 1 cm) és hővel és hajtogatással a végeket lezárjuk.

A bekapszulázott sejteket 3 cynomologus majomba implantáljuk. A sebészeti eljárást alapjában véve az Aebischer et al által leírt WO 93/00127 szabadalom alapján végezzük el. A kapszulákat különböző pozíciókban implantáljuk a kaudátumban és három kapszulát implantálunk a putamen különböző helyein. A putamenben és kaudátumban való implantáció névleges sztereotaxikus koordinátái a következőkből származnak putamen hely 1-23,0 mm anterior az intra aurális zérótól, 9,0 mm laterális irányban a sagitális suture-től és 16,5 mm ventrálisan az agy felszínétől; putamen hely 2-19,0 mm anterior az intra aurális zérótól, 10,0 mm laterális irányban a sagitális suture-től és 19,5 mm ventrálisan az agy felszínétől, putamen hely 3 - 15,5 mm anterior az intra-aurális zérótól, 11,5 mm laterálisán a sagitális suture-tól és 21,0 mm ventrálisan az agy felszínétől; caudate hely 1-18,0 mm anterior az intra-aurális zérótól, 4,0 mm laterálisán a sagitális • · · suture-töl és 15,0 mm ventrálisan az agy felszínétől, caudate hely 2-22,0 mm anterior az intra-aurális zérótól, 4,5 mm laterálisán a sagitális suture-től és 18,0 mm ventrálisan az agy felszínétől.

A bekapszulázott sejteket megközelítően 6 hónapra implantáljuk majd visszanyerjük. A kapszulákat az implantáció előtti és utáni alap és K+-kiváltott L-dopa (L-d), norepinefrin (NE) , epinefrin (EPI) , dopac (dpc) , dopamin (DA) , és homovanilinsav (HVA) szintekre vizsgáljuk a 4. példában leírtak szerint. A 3. táblázatban bemutatott adatokat pikomol/kapszula/30 perc (alap) vagy pikomol/kapszula/15 perc (K⁺-kiváltott) értékekben fejezzük ki. Ahogy a 2. táblázat adatai mutatják, a bekapszulázott sejtek tulajdonságai jelentősen eltérnek a 6 hónapig tartó korlátozó körülményeknek való kitettség után.

c u ~ϊ) ΐ

5 X

2

w-

ra

a

«3

4-* 33

<r» »*

2

tr» 40 r~i

«» w«i

5

40 •w·

<·» d

s X

»»*

£

ο»

«=»

e*i

4·*.

v4

40

tr» m

0>

r»»·

*Ί r*^

4» -8-

A

o

•^a

«X» «·*

«»»

c? «rí

5

^5

w» «—»

55 4*4

t*-I

»Ί «*4

5

r**

Έ

a

2

g

<3

Έ

d

s

=

V». e>

Ξ

Ξ

SÉ X

g

<*»

tr»

a

s

41» «-> «βΐ

2

»Λ

40

·**· r-i

«—» L·

tr»

s

2 X

V» «0 «>

55

δ» c>

5

t£J

«ο tr» «·»

5

M> «·»

d

40

*r> tr»

o

X

ΓΜ

J t X r fj a- ó 5

MC £ ea

r-9Ϊ

-L·

r-t ea

έ

40

40

d

«·>*

s •0

«*» w> «·“

«

40 r-U

tr»

A

tr» «K> <=>

u-» 9* V* «L·

<r»

Z

£

•O

«ά

«Τ»

2

5£

s? «»·

u»

o

0»

$ A

te»

tíí

<s

*O «0

σι

tr»

«—» <»

zz

«r·.

Sí

—

tx*

5

—

«3»

s ·»»

Ζ»

d

Ο»

4*4 <n «í

Ί2

tr»

TB

r*^ «»

9» <3

40

«ο «3»

A

a

a

<S «3

Z

ÍS «3

s

r».

•o

A

4Τ» tr»

•S»

*-· r»·»

•M

« <L·

4-U

r·»

ΣΙ

e>

2S

n d

2

«

«2

0

*3K

z

5

£

5

£

£ -i

·£

JÉ _-«- <

_5> a

n X X

«4 o

Ck_

*·*

.„..Η

s

ü ··:··.··.

. · · · ·· · ··· ·· · · ^•8 . +οχ>Ιλ.ζχχ4 cLs J

á -fí 1 ) Ή * - J hj -Ő d

X W

oí

rH

4-4 «=>

=

«4

«0

l.t

00

o r*>

*A 4*í

3

c»

Α» m

ΙΟ

s

G»

4-4

tn

55

r-4 «Μ

r-* s

CO

to «3

0 m wli

3 «Α

tn

0-.

A* 00

tn «*»

-e- M

e>

—

CO O

a» «0

·-»

5

s

r—«

*n

00

=

ío A*

E

~3

s

’S

5

s

, s

S

·» o-

•S

2

10 e>

Ξ

s

04 «>

«->« tri

<r>

*A

r-» 4·»

«0

«Ο

rH •o

8

0» 4-0

CO

40 ü· 40

ΊΟ a-í

0*» ΙΛ «SÍ

<A

r^. O

-«0

<3

00 «=» *-4

o <S

<n r»> «·»

40 m o

5

<o Ο»

C*

00 rH

<o

xj V -F f N W &- d <t

35

r— <si

W»M rH

r-— o

V»

*O

«β» ·*«

52

en «—>

co 0»

s

»o

«Ο

3

•a

o <S

•S

co CO

«<* CO cg

CO rH

4Λ »1 Α»

s «í

S

4— tn «’ΐ

e»

co *0

o

«3»

«Ο Q

u>

•—4 <*

«0 eo

«Η

3

CO Γ-» •-Í

s

40

co

Π» <o

cr>

«r

4-4

53

0> «>

β» «5»

0> «2»

s

m

ca»

•n

a

r-» «X»

s

e»

00 •s«

eá

U> O Ο»

ΛΛΛ se

s.

er»

a

5

C2Z

3

ΙΛ eri

A* e>

a

40 ao 00

«=?

<3>

«0

2?

=

«Ο

Α»

o

5

—!

Jrt

—

es

4-0

rH

«Ξ

<ü

ö=

*«

<E

«£

·»

ss o

s

<c

*<

s

ss A <λ»

Ca »Í3

-Ω 4 3:

<z>

4—4

=

4-4 o_

«ο

li “ -tí

s

>5Z2S16«S »· crivV á

- ₄g • táblaz-a-é (•fob-yícL/bíLt')

-<

-P

S S

8. példa

A bekapszulázott PC12 sejtek emberbe való implantációja

A PC12 sejteket a 7. példában leírtak szerint bekapszulázzuk és egy recipiensbe implantáljuk. Hat hónap után a kapszulákat explantáljuk és L-dopa:dopa arányra vizsgáljuk. A sejteket soküregű lemezekre szélesztjük és in vitro O2 határok között tenyésztjük. A sejteket periodikusan L-dopa és dopamin termelésre vizsgáljuk. Azokat a sejteket, melyek a cél Ldopa:dopamin arányt termelik szelektáljuk és humán agyba implantáljuk alapjában véve a WO 92/00127 számú szabadalomban leírt sebészeti eljárásnak megfelelően.

9. példa

Patkány striátumban in vivő korlátozó körülményeknek alávetett bekapszulázott PC12 sejtek

Kapszulák

A kapszulákat üreges rostokból állítjuk eló fázis inverziós technika segítségével PAN/PVC üreges rostokat használva alapjában véve a 7. példában leírtaknak megfelelően (ID 450-500 μπι, fal 50-65 μπτ, MWCO 100 kD, hidraulikus permeabilitás 53 ml/perc/m^/mmHg).

Sejt befogás és bekapszulázás

PC12 és PC12AA sejteket tenyésztünk 500 ml forgó tenyésztekben 80 rpm értéken egy szérum mentes definiált HL-1 tápközegben (Ventrex Inc. Portland, Maine) 37 C° hőmérsékleten, vízzel telített, 7% CO2 környezeti légközi nyomású atmoszférában. A sejteket a forgó tenyészetek felülúszójának összegyűjtésével és 800 g értéken való centrifugálással gyűjtjük össze. Az életképességet a tripán kék exkluziójával vizsgáljuk és 90+5% értékűnek bizonyult a bekapszulázás előtt.

A sejteket HL-1 tápközegben reszuszpendáljuk, pH=7,3, 4 x 10⁷ sejt/ml koncentrációban. 2% (w/v) 6,7 pH értékű alacsony viszkozitású citozán (PROTOSAN, citozán klorid, Protan Biopolymer, Drammen, Norway) tartalmú oldat azonos térfogatú mennyiségét adjuk a PC12 és PC12A sejtekhez, így a végső sejt koncentráció 2,0 χ 10⁷ sejt/ml.

Az egyes kapszulák hossza 7+5 mm. A PC12-vel és PC12A-val töltött kapszulákat két különböző lépésben hozzuk létre és egy 1 ml HL-1 tápközeget tartalmazó 24 üregű szövettenyésztő lemezre helyezzük.

A bekapszulázás után 5-7 nappal a szabadon folyó kapszulákat kétszer mossuk 1 ml HBSS HEPES puffereit sóoldattal (10 μΜ aszkorbinsavat tartalmaz) a maradék tenyész tápközeg eltávolítása céljából. A mintavétel egy 30 perces 250 μΐ HBSSben történő inkubálást is magába foglal (alap termelés). Az egyes mintákat az oxidációtól úgy védjük meg, hogy gyorsan hozzáadunk cifrát redukáló savasító puffért (CRAB) és így egy ··· stabil minta készítményt kapunk 10 mM citromsavban, 20 μΜ nátrium metabiszulfitban és 0,1 N perklórsavban. A hosszabb ideig tartó tárolást -80 C° hőmérsékleten végezzük. A standardeket a törzs oldat HBSS-ben való hígításával kapjuk meg, majd CRAB-bel és 0,1 N perklórsavval stabilizáljuk.

A striátum dopamin kiürülése

Patkányokat anasztetizálunk 33 mg/ml ketamin, 1,7 mg/ml xilazin és 10 mg/ml acepromazin keverékét tartalmazó intramusculáris injekcióval (1,0 ml/kg) és egy Kopf stereotaxikus készülékbe helyezzük az állatokat. 12 μg 6-OHDA-t (6 μΐ 2 μg/μl koncentráció, 0,2 μg/μl aszkorbinsavat tartalmazó 0,9% sóoldatban feloldva)juttatunk be infúzióval 1,0 μΐ/perc sebességgel, majd 5 percig hagyjuk diffundálni, mielőtt az infúziós kanült lassan visszahúznánk. Az infúziós koordináták a következők: 4,2 mm posterior a bregmához viszonyítva, 1,0 mm laterálisán a középvonaltól és 7,4 mm ventrálisan a durától.

Kapszula implantáció

Négy hónappal a lézió után (2,75 hónappal az utolsó apomorfin injekció után) a kapszulákat implantáljuk. A patkányokat mint korábban, most is altatjuk és egy sagitális bemetszést ejtünk a fejbőrön és egy lyukat füzünk a polimer kapszula behelyezése céljából. A patkányokat úgy implantáljuk, hogy egy kapszulát helyezünk egy 18-as méretű teflon katéterbe, melyet a stereotaxikus kerethez erősítünk. Egy rozsdamentes acél obturátort helyezünk a kanülbe a készüléket az agyhoz közelítjük, míg az obturátort egy helyben tartjuk a külső kanült úgy emeljük meg, hogy passzívan behelyezze a kapszulát a gazda striátumába. Az implantáció stereotaxikus koordinátái a következők: 0,5 mm anterior a bregmához képest, 3,8 mm laterálisán a sagitális suturához képest és 7,5 mm mélyen a cortex felszíne alatt. Az implantumot nem kapó patkányokat tettetett sebészeti beavatkozásnak vetjük alá (anasztetizált, fejbőr bemetszés, koponya lékelés, és dura felszúrás).

Biokémiai analízis

A viselkedési tesztelés befejezése után a kapszula, PC12, PC12A nélküli patkányok, valamint az üres kapszulákkal ellátott patkányok felét CC>2 kamrában anasztetizáljuk és gyorsan dekapitáljuk. A koponyából eltávolítjuk az agyakat és kivesszük a kapszulákat, valamint a striátumokat is kiboncoljuk és Eppendorf csövekbe helyezzük és gyors-fagyasztjuk folyékony nitrogénben. A gazda striátumból való kapszula kinyerés után a kapszulákat 1 ml foszfát HBSS-be helyezzük körülbelül 30 percre. A foszfátos HBSS-t eltávolítjuk és 1 ml HEPES HBSS-t adunk hozzá. A katekolamin analízist a 4. példában leírtak szerint hajtjuk végre. A katekolaminos vizsgálat után az eszközöket 4% paraformaldehidbe helyezzük és morfológiai analízisnek vetjük alá.

A 8. ábra a dopamin és L-dopa termelést mutatja 30 perces idő során, melyet az egyes kapszulák esetében ábrázolunk, melyek mindegyike azonosító számot kap. Amint az a 8. ábrán látható az L-dopa és dopamin implantáció utáni 90 napos termelési szintje szignifikánsan eltér az implantáció előtti szintektől.

10. példa

Humán subarachnoid térben in vivő korlátozó körülményeknek kitett bekapszulázott mellékvese chromaffin sejtek

A szarvasmarha mellékvese chromaffin sejteket a 4. példában leírtaknak megfelelően állítjuk eló. A mellékvese sejt aggregátumokat CaCl2-vel keresztkötött 1,5% alginát mátrixszal immobilizáljuk és 4-es típusú kétrétegű immunoizolációs PAN/PVC üreges rost membránokba (ID 770 ml(ID 770 /xm, fal 70 μτη, MWCO 60-100 kD) kapszulázzuk alapjában véve a WO92/19195 szabadalomban leírtak szerint.

A bekapszulázott sejteket két humán beteg subarachnoid terébe implantáljuk, ezen betegek végső stádiumban levő rákos betegek, akiknek fájdalmát narkotikus terápiával szüntetjük meg, és akiknek nincs aktív fertőzése vagy tumora a meningeális üregben. A betegek hozzájárulása biztosított és az Etikai Bizottság jóváhagyását is megkaptuk a Faculty os Medicine of the University of Lausanne, Switzerland-tói.

% lidokaint használunk helyi infiltrációval, a bőr anesteziájának biztosítása céljából, valamint a periosteum és más mélyebben fekvő kapcsolódó szövet szerkezetek és ideértve a ligamentum flavum anasteziája céljából. Egy 3-5 cm-es bőr bemetszést ejtünk a parasagitális síkon a középvonaltól bal vagy jobb irányban és ezt a lubodorzális fascia mentén lefelé folytatjuk. A hagyományos csontos jelzéseket - ideértve a csípőcsontot és a deréktáji gerinc nyúlványok - valamint a fluoroszkópikus irányítást használva egy 18-as méretű Touchi tűt juttatunk be a subarachnoid térbe az L-3 és L-4 között egy rézsútos paramedián megközelítésen keresztül. A tűt úgy • · • · · irányítjuk, hogy az üregbe egy lapos, kiválóan irányított szögben lépjen be, ami nem nagyobb 30-35 foknál a gerincvelőt figyelembe véve, akár a sagitális vagy a transverzális síkon.

Egy irányító szálat engedünk le a Touchy tű közepének lumenén, míg az 4-5 cm mélyen be nem nyúlik a subarachnoid térbe (előzetes mérés alapján határoztuk meg) . A Touchy tűt a szálból kihúzzuk.

Egy 7-es French dilátort vezetünk ezután az irányító szálon és a szálat használjuk a dilátor irányítására amint azt óvatosan de határozottan átvezetjük a fascián, a paraspinális izmon és a ligamentum flavumon, nyomonkövetve a szál útját a subarachnoid téren.

Miután a szál nyomvonalát felül diláltuk a 7-es French dilátorral, egy 6-os French dilátort és egy kanül hüvelyt állítunk össze és helyezzük az irányító szálra. A 6-os French dilátort és kanült óvatosan bejuttatjuk a subarachnoid üregbe, míg a nyitó csúcsa a kanülnek az üregben 7 cm mélyre nem kerül.

Amikor a kanül megfelelő elhelyezéséről meggyőződünk, az irányító szálat és a 6-os French dilátort sorrendben óvatosan eltávolítjuk a kanül lumenéből.

A bekapszulázott mellékvese chromaffin sejtet egy steril kétrétegű tartóban a transzport tápközegbe ágyazva, és teljesen összeállítva - egy tubuláris szilikon rögzítőt is ideértve biztosítjuk. Az eszköz membrán részét óvatosan bejuttatjuk kanülbe. A kapszulát egészen addig juttatjuk be, míg a membrán csúcsa elér egy olyan ponthoz, ami 2-10 mm mélyen van a kanül craniális csúcsán a subarachnoid üregben. Miután a kapszulát egy toló segítségével pozícionáljuk a kanült és a töltő eszközt teljesen visszahúzzuk. A kapszula végső elhelyezése olyan, hogy “ ··· az eszköz membrán része teljesen a CSF-et tartalmazó subarachnoid térben fekszik vantrálisan a cauda equinától.

A kapszulákat az 1-es betegből 84 nap múlva, a 2-es betegből 55 nap múlva explantáljuk. A katekolamin norepinefrin (NE) és epinefrin (EPI) - termelést az in vivő korlátozó körülményeknek való kitevés után a preimplantációs szintekhez hasonlítjuk (3. táblázat) A katekolaminokat a 4. példában leírtak szerint mérjük. A 3. táblázatban szereplő adatokat pikomol/kapszula/30 perc (alap), vagy pikomol/kapszula/15 perc (nikotin stimulált:N-S) értékekben adjuk meg. A katekolamin termelés szignifikánsan különbözik a korlátozó körülményeknek való kitettség után az implantáció előttitől.

3. táblázat

A kapszula katekolamin termelése

Implant	Explant
Beteg 1:	NE 84 napos	E implantáció	NE	E
Alap	0	84	37	8
N-S	2932	2673	6366	3886
Beteg 2:	55 napos	implantáció
Alap	48	120	4,1	69,3
N-S	5027	5063	10,6	65

11. példa ···

In vivő korlátozó körülményeknek kitett akklimatizált és újra bekapszulázott BHK-hNGF sejtek

A bekapszulázott BHK-hNGF sejteket az 1. példa szerint állítjuk eló, patkány agy laterális kamrájába implantáljuk, akklimatizáljuk 14 hónapig tartó in vivő korlátozó körülményeknek való kitevéssel. 14 hónap után a kapszulákat explantáljuk és a kapszulából az akklimatizált sejteket összegyűjtjük és 10% FBS DMEM tápközegben való passzálással kibövítjük. Egy klónozott vonalat - amit BHK-hNGF 23-as kiónnak jelölünk - használunk ebben a kísérletben. Ezeket a sejteket azonos mennyiségűvé tesszük és a részeket lefagyasztjuk folyékony nitrogénben. A kontrol BHK-hNGF 23-as klón sejteket melyeket in vivő nem akklimatizáltunk - in vitro szaporítjuk 10% FBS DMEM tápközegben (BHK-hNGF 23-as klón sejt bank).

A következő hat sejtcsoportot és kapszulát teszteljük:

1- es csoport: BHK-hNGF 23-as sejtek (in vivő explantált kapszulákból származó akklimatizált sejtek) ; Vitrogen mátrixba újra bekapszulázott sejtek; patkány agy laterális kamrájába implantált kapszulák;

2- es csoport: BHK-hNGF 23-as sejtek (akklimatizált sejtek); a bekapszulázáshoz (nincs mátrix) 10% FBS DMEM-ben reszuszpendált; a kapszulákat a patkány agy laterális kamrájába implantálj uk;

3- as csoport: BHK-hNGF 23-as kontrol sejtek (a sejtbankból, korábban nem implantáltuk ezeket); Vitrogen mátrixba bekapszulázott; a kapszulákat patkány agy laterális kamrájába implantáljuk;

• · • · · · · ··· ·· · · · · · ·

4- es csoport: BHK-hNGF 23-as kontrol sejtek (sejtbankból, korábban nem implantáltuk); a bekapszulázáshoz 10% FBS DMEM-ben reszuszpendáljuk (nincs mátrix); a kapszulákat patkány agy laterális kamrájába implantáljuk;

5- ös csoport: BHK kontrol sejtek (bankból, korábban nem implantáltuk); Vitrogen mátrixba bekapszulázzuk; a kapszulákat patkány agy laterális kamrájába implantáljuk és

6- os csoport: BHK kontrol sejtek (bankból, korábban nem implantáltuk); a bekapszulázáshoz 10% FBS DMEM-ben reszuszpendáljuk (nincs mátrix); a kapszulákat patkány agy laterális kamráiba implantáljuk.

Kapszulák

Az akklimatizált BHK-hNGF 23-as klón sejteket alapjában véve az 1. példában leírtak szerint bekapszulázzuk. A legtöbb kapszulát HF120794-6 rostokból állítjuk eló és végső hosszúságuk 7 mm. Számos kontrol kapszulát készítünk 101-97-9 rostokból, melyek összehasonlíthatók a 7-9 példákban használt XPll-es rostokkal.

A HF120794-6 rostok egyrétegű rostok, átlagban fal vastagságuk 86,4 μ, a belső átmérő (I.D. 453,2 μ, a külső átmérő (O.D.) 625,1 μ, a hidraulikus permeabilitás 43,0 mm/perc/m²/mmHg és a molekulasúly méret (MWCO) a daxtrán diffúziós teszt alapján 187 kD.

A 101-97-9 rostok egyrétegű rostok, átlagban fal vastagságuk 59 μ, a belső átmérő (I.D.) 541 μ, a szakító szilárdságuk 31 g; a hidraulikus permeabilitás 62 mm/perc/m²/mmHg és a molekulasúly méret (MWCO) a daxtrán diffúziós teszt alapján 88 kD.

Bekapszulázás

A mátrixba (1-es, 3-as és 5-ös csoportok) bekapszulázott sejteket PC-1 tápközeggel 1:1 arányban hígított Vitrogen-ben reszuszpendáljuk a töltési sűrűség 1 x 10⁷ sejt/ml. A kapszulákat PC-1 tápközegben tartjuk 5-7 napig az implantáció előtt. A mátrix nélkül bekapszulázott 2-es, 4-es és 6-os csoportok sejtjeit 10% FBS DMEM tápközegben reszuszpendáljuk és forgódobon levő kémcsövekbe helyezzük a pre-implantációs tárolási időszak idejére.

Kapszula implantáció

A korábban in vivő akklimatizált BHK-hNGF sejteket tartalmazó kapszulákat valamint a kontrol kapszulákat tetszés szerint választjuk ki és bilaterálisán implantáljuk patkányok laterális agykamrájába. A nem akklimatizált BHK-hNGF sejtek párhuzamos mintái szolgálnak kontrolként.

Biokémiai analízis

Az 1-6 csoportokból származó kapszulákat NGF termelésre vizsgáljuk az 1. példában leírtak szerint. Az akklimatizált sejteket és a nem akklimatizált sejteket tartalmazó kapszulák NGF termelését implantáció előtt és egy hónapig tartó implantáció után mérjük. Az 1-4 csoportokból származó kapszulák NGF termelését a 11. ábrán mutatjuk be. Az NGF-et nem termelő kontrol sejtek adatait nem mutatjuk be. Az NGF termelési vizsgálat után a kapszulákat 4 % paraformaldehidben rögzítjük és histológiai, szekcionálási és morfológiai analízishez dolgozzuk fel.

• · · • · · · · ··· · · · · · · ··

12. példa

Unilaterális léziós patkányokban a substantia nigrában in vivő körülményeknek kitett bekapszulázott PC12 sejtek

Sejt tenyésztés és bekapszulázás

A PC12 sejteket alapjában véve a 9. példában leírtaknak megfelelően tenyésztjük és kapszulázzuk.

Sustantia nigra dopamin kiürítés

A 6-hidroxidopamin (6-OHDA) szelektíven toxikus a substantia nigrában levő dopaminerg neuronokra. A substantia nigrában 6-OHDA léziót kapó patkányokban Parkinson-betegség féle tünetek fejlődnek ki, ami alacsony dopamin szintekkel jár együtt. A patkányokat a 9. példában leírtak szerint anasztetizáljuk és egy Kopf stereotaxikus készülékbe helyezzük ezeket. 0,2 gg/μΐ aszkorbinsavat tartalmazó 0,9% sóoldatban feloldott 2,5 ^g/μΐ koncentrációjú 4 μg térfogatú összesen 10 μΐ 6-OHDA-t juttatunk infúzióval unilaterálisan, majd diffundálni hagyjuk 5 percig, mielőtt az infúziós kanült lassan visszahúznánk. Az infúziós koordináták a következők: 3,2 mm a koponyatetötól hátrafelé, 2,7 mm laterálisán a középvonaltól és 8,0 mm távolságra ventrálisan a durától, a bemetszési csík +5,0 mm.

A kapszula implantációja

A kapszulákat bilaterálisán implantáljuk 3-4 hétre miután a patkányok unilaterálisan lezionáltak. A patkányokat anasztetizáljuk és a kapszulákat a 9. példában leírt eljárást és stereotoxikus koordinátákat használva implantáljuk.

• · · · · ··· · · · · · « · · · · ··· · · ··· · ··

Biokémiai analízis « A szerkezetet az implantáció után 3, 10, 28 és 60 nappal eltávolítjuk. A patkányokat anasztetizáljuk CO2 kamrában és gyorsan dekapitáljuk. Az agyat eltávolítjuk a koponyából és a kapszulákat kiveszük az agy lezionált és nem lezionált (kontrol) oldalaiból. A striatumot és a nukleuszokat is kiboncoljuk a katekolamin analízishez, oly módon, hogy Eppendorf csövekbe helyezzük ezeket és a csöveket gyors fagyasztjuk folyékony nitrogénben. A kapszulákat 1 ml foszfát HBSS-be helyezzük körülbelül 30 percre. A foszfátos HBSS-t eltávolítjuk és 1 ml HEPES HBSS-t adunk hozzá. A katekolamin analíazist a 4. példában leírtak szerint hajtjuk végre. A katekolamin analízis után a kapszulákat 4% paraformaldehidbe helyezzük morfológiai analízis céljából.

A 9. ábra (A panel) az átlagos L-dopa termelést mutatja 30 perces időtartamon keresztül 8 kapszulából az implantáció előtt (pre) és az implantáció utáni 5., 14., 28. és 60. napon kimetszett kapszulák esetében a lezionált (alacsony dopamin) vagy a nem lezionált (kontrol) striátumból. Az A panel azt mutatja, hogy a bekapszulázott PC12 sejtek által termelt katekolamin relatív mennyisége az idó függvényében változik. A lezionált és a kontrol oldalakról explantált kapszulák magasabb L-dopa termelési sebességet mutatnak a 2-3 hétig tartó in vivő akklimatizáció után.

A 9. ábra (B panel) az L-dopa:dopamin termelés arányát mutatja a fent leírt A panel kapszuláiból. A B panel azt mutatja, hogy az alacsony dopamin körülmények közötti in vivő akklimatizáció után a bekapszulázott sejtek alacsonyabb L62 dopa:dopamin arányt termelnek, mint a kontrol környezetben akklimatizált sejtek. Az L-dopa:dopamin arány viszonylag stabillá válik az in vivő 14. nap után. A lezionált és a kontrol oldalakról explantált kapszulák magasabb L-dopa:dopamin arányokat mutatnak az in vivő akklimatizáció után, ha az implantáció előtti termelési szintekhez viszonyítjuk.

13. példa

A főemlős agyban akklimatizált bekapszulázott PC12 sejtek preés post-implantációs katekolamin termelési adatainak összevetése

A számos olyan vizsgálatból származó katekolamin termelési adatokat - ahol a PC12 sejtek XP11 ekvivalens rostba kapszulázzuk és főemlős agyban akklimatizáljuk a 7. példában leírtak szerint - az implantáció előtti ugyanezen kapszulákból történő katekolamin termelési adatokhoz hasonlítjuk. A bekapszulázott PC12 sejteket alap L-dopa és dopamin termelési arányra vizsgáljuk implantáció előtt. A 4. táblázatban bemutatott adatok az implantáció előtti katekolamin termelést képviselik. Ezután a kapszulákat főemlős agyba implantáljuk in vivő akklimat izáció céljából és 1, 2,5, 3, 4, 5 és 6 hónappal az implantáció után explantáljuk és az alap L-dopa:dopamin termelési arányokra analizáljuk (10. ábra).

A 10. ábrában és a 4. táblázatban szereplő összegző adatok összehasonlítása azt mutatja, hogy az implantáció előtti termelés és az explantációs termelés jelentősen különbözik. A 4. táblázat 1. sorának implantáció előtti adatai a 11. ábra 1 hónapos intervallumnál szereplő explantációs adatával egyezik • · meg. Hasonlóképpen, a 4. táblázat más soraiban szereplő adatok a 11. ábrán ábrázolt más hónapok adatainak felel meg.

. táblázat

Implantáció előtti értékek Főemlős PC12 kapszulák katekolamin termelése Explantált PC12 XP-ll-ekvivalens rostok

Az in vivő időnek megfelelő	Alap L-dopa	Alap pm/15	dopamin perc/ml
pm/15	perc/ml
pre-implantáció	átlag	(S.D.)	átlag	(S.D.)
1 (n=6)	2,02	(0,08)	2,95	(4,1)
2,5 (n=6)	0,78	(0,16)	nd
3 (n=6)	0,79	(0,25)	nd
4 (n=2)	10,6	(2,33)	2,39	(0,82)
5 (n=6)	2,06	(0,01)	4,26	(1,62)
6	3,09	(1,84)	21,3	(21,7)

(n=15) nd = nem detektáltuk ··· · ··· · • · · · · ··· ·· ··· · ··

14. példa hCNTF-et szekretáló BHK sejtvonal (BHK-CNTF) termelése

A humán CNTF (hCNTF) gént egy pNUT elnevezésű dihidrofolát reduktáz (DHFR) básiú expressziós vektorba inzertáljuk, mely expressziós plazmid a polikötőt is beleértve, a teljes pUC 18 szekvenciát tartalmazza. A DHFR-böl a mutánst kódoló cDNS transzkripcióját az SV40 promóter irányítja. A 3' vég a hepatitis B vírus gén (HBV 3') 3' végével fúziónál a hatékony poliadenilációs és érési szignálok biztosítása céljából.

A hCNTF gént PCR amplifikációval nyerjük humán DNS-ból. A használt primerek EcoRI helyet tartalmaznak a természetes hCNTF iniciációs kódon pozíciójánál. A hCNTF gént 5' végénél egy egér immunoglobulin (lg) gén 150 bázispár hosszúságú szekvenciájához fuzionáljuk. Az EcoRI helyet oly módon használjuk, hogy a hCNTF protein amino terminális része megfeleljen az lg gén első 10 aminosavának. A poliadenilációs szekvenciát és más az mRNS 3' végének éréséhez szükséges szekvenciákat tartalmazó humán növekedési hormon génből (hGH) származó 325 bázispár hosszúságú AVAI fragmentet a hCNTF gén 3' végéhez klónozzuk. Röviden, ezt a fragmentet a Bluescript polikötő Spal helyére juttatjuk be egy BamHI és egy NotI helyet hozva létre sorrendben az 5' és a 3' végeken. A BamHI helyet a BglII helyhez ligáljuk, mely a hCNTF 3' végéhez helyeződött a génsebészeti beavatkozás révén.

Ezt a szerkezetet az egér MT-I promóter +6 pozíciójához inzertáljuk és a teljes 3050 bázispár hosszúságú MT/lg/hCNTF/hHG KpnI-NotI fragmentet a pNUT vektor KpnI-NotI helyére inzertáljuk. Végül, a HSV-TK gént a vektor NotI helyére klónozzuk, így elkülönítjük a DHFR géntől a teljes pUC-18 plazmid segítségével. Ezt a végső szerkezetet hívják RP3224E2nek.

felhasználásával kalcium/foszfát transzfektálj uk szelektáljuk.

Az RP3224E2 vektor DNS-t egy standard E. coli törzsben (HB101) amplifikáljuk és Qiagen-Plasmid Kit (Kontron) tisztítjuk. A DNS-t egy standard transzfekciós eljárást használva és metotrexát növekvő koncentrációival

A sejteket folyamatosan szelektáljuk metotrexátban, mialatt PC-1 szövet tenyésztő tápközegben tartjuk fenn. A PC-1 tápközeg egy definiált tápközeg, mely humán rekombináns forrásokból származó proteint tartalmaz.

A gyógyszer szelekciót (25-200 μΐ metotrexát) követően a BHK sejteket (BHK-CNTF) in vitro gyógyszer szelekció nélkül tartjuk fenn több hónapon keresztül és a sejtek nem mutatnak CNTF expresszióbeli csökkenést, ahogy azt Northern lenyomat technikával, biovizsgálattal vagy ELISA-val értékeljük. A CNTF termelés szintje körülbelül 1,0 ng/10^ sejt/óra a biovizsgálat vagy az ELISA vizsgálat alapján.

15. példa

Humán lumbáris subarachnoid térben akklimatizált és az amitrofikus laterális sclerois kezelés céljából egy emberbe újra implantált BHK-CNTF sejtek

Sejt bekapszulázás

A 14. példa CNTF-et szekretáló BHK sejtjeit (BHK-CNTF) alapjában véve az 1. példában leírtak szerint kapszulázzuk be, azzal az eltéréssel, hogy egy hosszabb rögzítőt használunk, mely elegendő hosszúságú ahhoz, hogy humán lumbáris ··· · ··· · • · * · * ··· ·· ··· ··· subarachnoid térbe való implantációhoz használjuk. A kapszulákat 2 x 10^ transzfektált sejt/μΐ vagy kollagén oldattal (Zyderm) töltjük meg. Az egyes kapszulákból történő CNTF felszabadulást úgy mérjük, hogy a kapszulát 2 ml friss PCI tápközegbe merítjük 30 percre. A CNTF meghatározást ezután hajtjuk végre az összegyűjtött tápközegeket használva, R&D ELISA rendszert használva. A kapszulákat úgy választjuk meg, hogy 1 μ/nap CNTF dózist biztosítsanak intrathecálisan. Minden humán beteg egy kapszulát kap.

A bekapszulázott BHK-CNTF sejtek lumbáris subarachnoid térben való in vivő akklimatizációja

A bekapszulázott BHK-CNTF sejteket 1 hónapra humán alany lumbáris subarachnoid terébe implantáljuk. A további kapszulákat in vivő 6 hónapig akklimatizáljuk. Az egy hónapos explantációkor a kapszulánkénti CNTF felszabadítás sebességét a 12. példában leírtak szerint határozzuk meg. A CNTF vizsgálat elvégzése után a kapszulákat 4% paraformaldehidben rögzítjük a morfológiai analízishez.

Az in vivő akklimatizált BHK-CNTF sejteket eltávolítjuk a kapszulából, összegyűjtjük és azonnal PCI tápközegben szaporítjuk alacsony oxigén és glükóz korlátozó körülmények között, melyet úgy választottunk meg, hogy legközelebb essen az alany subarachnoid tér környezetéhez. A BHK-CNTF sejteket környezeti körülmények között tenyésztjük párhuzamos kontrolként. Az akklimatizált sejteket jellemezzük és ezek tovább akklimatizálhatok más korlátozó körülmények alatt.

Egy kísérlet sorozatban az in vitro környezeti vagy korlátozó körülmények között tenyésztett in vivő akklimatizált • · ··* · ··· · • · · · · ··· · · · · · ···

BHK-CNTF sejteket újra bekapszulázzuk (alapjában véve az első bekapszulázáshoz használt eljárást követve) és a gazda alanyba implantáljuk.

Egy másik kísérletsorozatban a humán gazdába implantált akklimatizált sejteket először in vitro korlátozó körülmények között akklimatizáljuk egy nem humán főemlős recipiensben.

Az alanyok olyan betegek, akiknél ALS-t diagnosztizáltak, ami a felső motoros neuronok és az alsó motoros neuronok hiányának kombinációjában manifesztálódik több szinten; a megerősítő elektrofiziológiai vizsgálatok aktív és krónikus denervációt mutatnak 3 végtagban vagy 2 végtagban és a bulbáris masculaturában; nincs neurológiai folyamat a spontán motoros rendszeren kívül; nincs bizonyíték olyan primer betegségre, ami neurológiai deficitet okozna, különösen a plazma sejt dyscrasia cercikális spondilosisát. A beteg viszonylag erős, azaz segítség nélkül képes járni és a betegség korai stádiumában van. A beteg erőltetett vitái kapacitása a normális érték 75%ánál nagyobb a belépés idején.

A betegeket minden nap vizsgáljuk az első hét során, és a második héttől a negyedik hétig hetente egyszer ezután pedig havonta egyszer, inter alia olyan mellékhatásokra mint péládul a láz, stomatitis, köhögés és a herpes újra aktiválódása. A következő teszteket végezzük el havonta egyszer a hatásfok értékeléshez: Trufts Mennyiségi Neurológiai vizsgálat (Trufts Quantitative Neurological Exam = TQNE), bulbáris koordináció, Respirációs funkció - erőltetett vitálkapacitás, belégzési áram. Az első négy héten hetente egyszer vérmintát veszünk, majd ezután havonta egyszer a plazma CNTF, a CNTF-fel szembeni ··· · ··« · • · · · · ··· · · ··· · ·· lehetséges antitestek, a C-reaktív protein és fibrinogén detektálása céljából.

Sebészeti eljárás

A bekapszulázott BHK-CNTF sejtek implantációjának sebészeti eljárása a következő: Miután IV hozzáférést biztosítunk és profilaktikusan antibiotikumot alkalmazunk (cefazolin nátrium, 1 g IV) A beteget a műtőasztalra helyezzük általában vagy laterális fekvésben vagy genu-pektorális pozícióban a lumbáris gerincet előrehajlítva. Az operálandó területet sterilezzük, és úgy fedjük le, hogy a középvonalú dorzális lumbáris régió kilátsszon az S-l - L-l szintekből, és lehetővé téve a lumbáris gerinc intraoperatív megjelenítését a C-karú fluoroszkópia segítségével. 1,0% lidokainnal való helyi infiltrációt használunk a bőr és a periosteum és más mélyebben fekvő kapcsolódó szövet szerkezetet - ideértve a ligamentum flavumot is - érzéstelenítése céljából.

Egy 3-5 cm-es bemetszést végzünk a parasagitális felületen a középvonaltól 1-2 cm-re jobbra vagy balra és ezt egészen a lumbodorsális fasciáig folytatjuk elektrokautert használva a hemostasishoz. A hagyományos csontos útjelzőket használva ideértve a csípőtaréjt és a lumbáris gerinc nyúlványokat, valamint a fluoroskopiás irányítást - egy 18-as méretű Touchy tüt juttatunk be az L-3 és L-4 közötti subarachnoid térbe egy ferde paramedián megközelítéssel. A tűt úgy irányítjuk, hogy a térbe egy lapos, pontosan irányított szögben lépjen be, ami nem nagyobb 30-35 foknál a gerincvelőhöz viszonyítva a sagitális vagy a transvers síkon. A tű hegyének megfelelő elhelyezését néhány ml cerebrospinális folyadék (CSF) kinyerésével erősítjük • · • · · meg az implantáció előtti katekolamin, enkefalin, glükóz, humán CNTF és protein szintek és sejtszám meghatározása céljából.

A Touchy tű közepét ismét megvizsgáljuk annak megerősítése céljából, hogy a csúcs nyílása pontos orientációjú-e (a nyílás irányultságát a tű közepén levő obturátor jelölő rovátkájával jelöljük meg) és az irányító szálat a tü lumenén leeresztjük míg elér 4-5 cm mélyen a subarachnoid térben (előzetes méréssel állapítottuk meg) . Vigyázni kell a szál haladása közben arra, hogy ne legyen ellenállás a szál tűből való kijutásában és a beteg ne panaszkodjon jelentős neurogén szimptomákról, melyek megfigyelése az irányító szál félre irányítást jelzi vagy lehetséges fenyegető ideg gyökér vagy gerincvelő sérülést jelez.

Miután úgy tűnik, hogy az irányító szál megfelelő helyre kerül a subarachnoid térben a Touhy tűt külön visszahúzzuk és eltávolítjuk a szálból. A gerincsatorna középvonalában levő szál pozíciója a cauda equine várt elhelyezkedése előtt, csomók és megmagyarázhatatlan haj lások nélkül ezután fluoroszkopáiásan megerősítésre kerül. A Touchy tű eltávolítása után az irányító szálat szabadon vissza kell tudjuk húzni és be kell tudjuk dugni csupán egy kis ellenállást érezve ami a szál durva felszínének köszönhető amint a sűrű és rostos ligamentum flavumon keresztül jut.

Ezután a 7-es French dilátort helyezzük az irányító szálra és ezt használjuk, arra hogy a dilárot óvatosan, de határozottan keresztül juttatssuk a fascián, a paraspinous izmon és a ligamentum flavumon a szál nyomát követve a subarachnoid tér felé. A 7-es French dilátor előrehaladását megállítjuk és a dilátort eltávolítjuk a száltól amint a • · • ·· · ··· · • · · · · ··· ·· ··· · ·· ligamentum flavumon való áthaladás után az ellenállás észlelése megszűnik. Ezt azért végezzük el, hogy elkerüjük ennek a viszonylag merev dilátornak a legcsekélyebb mértékű előrejutását és manipulását a subarachnoid téren belül.

Miután a szál nyomát felüldiláltuk a 7-es French dilátorral egy összeszerelt 6-os dilátort és kanül hüvelyt helyezünk az irányító szál fölé. A 6-os dilátort és a kanült óvatosan vezetjük a subarachnoid térbe míg a kanül nyílás csúcsa 7 cm mélyen bekerül a térbe. Mint a 7-es French dilátor esetében az összeállított 6-os French dilátort és kanült a szál irányítja a dilátor lumenén belül. A subarachnoid téren belüli helyzetet az eszköz előzetes mérésével határozzuk meg és megközelítően fluorometriával erősítjük meg. Nagyon óvatosan kell eljárni a dilátorok és a kanül subarachnoid téren belüli manipulálásakor a félre irányítás és a lehetséges neurológiai sérülések elkerülése céljából.

Amikor a kanül megfelelő elhelyezkedése biztosított, egymás után óvatosan eltávolítjuk a szálat és 6-os French dilátort a kanül lumenéből. A beteg műtőasztalon levő pozíciójától függően a kanülön keresztüli CSF áramlás ezen a ponton érzékelhető és gyors kell legyen, ez pedig a kanül lezárását vagy a kapszula implantum azonnali behelyezését teszi szükségessé a nagyobb mennyiségű CSF veszteség elkerülése céljából.

A bekapszulázott, akklimatizált BHK-CNTF sejtek egy steril, egy hordozó tápközegbe merített kettős rétegű tartóban biztosíthatók és teljes mértékben összeszerelve - ideértve a tubuláris szilikon rögzítőt is. A kanülön keresztüli, a subarachnoid térbe való implantáció előtt a kapszula az ··· · ··· · • · · · · ··· ·· ··· · · · inzertációs kit tálcára helyezhető, ahol olyan pozícióba helyezzük, hogy lehetőség legyen a kapszula transzport tápközegben való fenntartására, míg durván átvizsgáljuk sérülések vagy komolyabb hibák után vizsgálódva.

A kapszula rögzítő részét a rozsdamentes acél töltőbe helyezzük úgy, hogy a töltő kis átmérőjű szál részét az eszköz membrán részére helyezzük és azt óvatosan a kanülbe juttatjuk. A kapszulát egészen addig juttatjuk előre, míg a membrán csúcsa eléri a 2-10 mm-es pontot a subarachnoid térben levő kanul craniális csúcsában. Ezt az elhelyezést úgy érjük el, hogy előzetesen megmértük a kanült és a kapszula rögzítő töltő összeszerelét, és ez biztosítja, hogy a kapszula membrán részét a kanül védi egész idő alatt, míg az előrehaladás állapotában van.

Miután a kapszulát behelyezzük a kanülbe, a töltőt használjuk a kapszula subarachnoid térben való pozícióban tartására (előretolás vagy visszahúzás nélkül), míg a kanült teljesen vissza nem húzzuk a kapszula és a töltő felöl. Ezután a töltőt eltávolítjuk a kapszuláról oly módon, hogy annak szál részét a szilikon rögzítőről lecsúsztatjuk. Ezt a módszert használva a kapszula végső pozíciója olyan, hogy a kapszula membrán része teljesen a CSF-et tartalmazó subarachnoid térben van ventrálisan a cauda equinától. Ez rögzíthető a caudális végen egy körülbelül 1-2 cm hosszúságú szilikon rögzítő segítségével, ami keresztül halad a subarachnoid térén mielőtt a rögzítő a durán és a ligamentum flavumon keresztül kilép. A rögzítő külsőleg folytatódik erről a szintről a paraspinous izmon keresztül és kiemelkedik a lumbodorzális fascián általában 10-12 cm szabad rögítő anyagot hagyva, ami az eszköz biztosítását szolgálja.

A CSF szivárgást fibrin ragasztó (Tissel) a rögzítő által elfoglalt a paraspinous izomban levő nyomvonalba való injektálásával minimalizáljuk valamint óvatosan lezárva a nyomvonal felszíni fasciális nyílást egy varattal. A rögzítő szabad végét ekkor egy nem abszorbálódó varrattal rögzítjük és a bőrt és a szubkután szövetet kétrétegű záróval teljesen beborítjuk.

A beteget ezután egy idegsebészeti gyógyító osztályra viszik és szigorú ágynyugalomban tartják 24 órán keresztül. Az antibiotikum profilaxist még 24 órán keresztül folytatjuk az implantációs eljárást kővetően.

Claims (22)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Sejtek gazdába történő implantációjára szolgáló módszer azzal jellemezve, hogy (a) a sejteket egy biokompatibilis kapszulába bekapszulázzuk;

   (b) a sejteket megfelelő ideig olyan korlátozó körülmények közé helyezzük, mely a korlátozó körülmény vagy körülményekre válaszként a kívánt sejt tulajdonságot létrehozza:

   (c) a bekapszulázott sejteket egy gazdában az implantációs helyre implantáljuk, a sejt tulajdonságot az implantáció után alapjában véve fenntartjuk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a bekapszulázott sejteket in vitro korlátozó körülménynek vagy körülményeknek kitesszük.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a bekapszulázott sejteket in vivő korlátozó körülménynek vagy körülményeknek vetjük alá, oly módon, hogy egy recipiensben egy implantációs helyre implantáljuk.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a sejtek a gazdával xenogének és a kapszulát immunoizolációs tulajdonsággal készítjük.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy legalább egy korlátozó körülmény a glükóz koncentrációt • · · · · ·· ·»» * ·· jelenti, ahol a glükóz koncentráció 40 mg/liter - 70 mg/deciliter határok között változik.
6. 6. Az 1. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy legalább vegy korlátozó körülmény az oxigén koncentrációját jelenti, ami körülbelül 40 mmHg - körülbelül 65 mmHg között változik.
7. 7. Az 1. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy legalább egy korlátozó körülmény a dopamin koncentráció, mely a cerebrospinális folyadékban vagy az agy parenchimában található fiziológiás dopamin koncentrációnál alacsonyabb értéket mutat.
8. 8. A 3. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a sejteket a mellékvese chromaffin sejteket, a baby hörcsög vese sejteket és a PC12 sejteket magába foglaló csoportból szelektáljuk.
9. 9. A 8. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a sejtek PC12 sejtek és a sejteket a recipiensbe 6 hónapra vagy ennél hosszabb időre implantáljuk.
10. 10. A 8. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a sejtek mellékvese chromaffin sejtek és a recipiensbe 4 hónapra vagy ennél hosszabb időre implantáljuk.
11. 11. A 8. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a sejtek PC12 sejtek és a recipiensbe 3 hétre vagy ennél hosszabb időre implantáljuk.

    • · · • 4 · · • · « · • · · » · · · « · ·
12. 12. Az 1. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a sejtek egy a neurotranszmittereket, analgesikumokat és növekedési faktorokat magába foglaló csoportból szelektált, biológiai szempontból aktív molekulát termelnek.

    13 . A 12 . igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a biológiailag aktív molekula legalább egy katekolamint j elent. 14 . Az 1. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve,

    hogy a kapszulát a gazdában a cerebrospinális folyadékot és az agy parenchimát magába foglaló csoportból szelektált implantációs helyre implantáljuk.
13. 15. Az 1. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a gazda egy embert jelent.
14. 16. Egy a korlátozó körülményekre válaszként egy kívánt sejt tulajdonsággal rendelkező sejt azzal jellemezve, hogy a sejtet az alábbiak szerint hozzuk létre:

    (a) a sejteket egy biokompatibilis kapszulába bekapszulázzuk, (b) Egy főemlős recipiensbe egy implantációs helynél a bekapszulázott sejteket implantáljuk, a sejtek xenogének a recipienssel legalább 6 hónapig, így a kívánt sejt tulajdonság az implantációs hely körüli korlátozó körülményekre való válaszként kialakul.

    « « · V · •·· « ··· * « · · · · ··· ·· ··· · *»
15. 17. A 16. igénypont szerinti sejtek azzal jellemezve, hogy a sejteket a nem-föemlös mellékvese chromaffin sejteket, a baby < hörcsög vese sejteket és a PC12 sejteket magába foglaló csoportból szelektáljuk.
16. 18. A 17. igénypont szerinti sejtek azzal jellemezve, hogy a sejtek nem főemlős mellékvese chromaffin sejteket jelentenek.
17. 19. A 17. igénypont szerinti sejtek azzal jellemezve, hogy a sejtek PC12 sejteket jelentenek.
18. 20. A 18. vagy 19. igénypontok szerinti sejtek azzal jellemezve, hogy a kívánt sejt tulajdonság a sejt megváltozott katekolamin termelését jelenti.
19. 21. A 20. igénypont szerinti sejtek azzal jellemezve, hogy a kívánt sejt tulajdonság a sejt megnövekedett katekolamin termelését jelenti.
20. 22. A 16. igénypont szerinti sejtek azzal jellemezve, hogy a kapszulát a cerebrospinális folyadékot és az agy parenchimát magába foglaló csoportból szelektált implantációs helyre implantáljuk.
21. 23. A 16. igénypont szerinti sejtek azzal jellemezve, hogy a gazda embert jelent.
22. 24. Sejtek egy xenogén gazdába való implantációjára szolgáló módszer azzal jellemezve, hogy ··· • · ·· · • · ( · ··« ·· ··· · »· (a) a sejteket egy vagy több korlátozó körülmény között tenyésztjük, * (b) a sejteket egy biokompatibilis kapszulába bekapszulázzuk, majd a sejteket a továbbiakban egy vagy több korlátozó körülmény hatásának tesszük ki megfelelő ideig ahhoz, hogy a korlátozó körülményre válaszként a kívánt sejt tulajdonság kialakuljon, és (c) a bekapszulázott sejteket egy gazda implantációs helyére implantáljuk, a sejt tulajdonságot alapjában véve az implantáció után is fenntartjuk.