SK131696A3 - Method for implanting encapsulated cells in a host - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobu prípravy opuzdrených (enkapsulovaných) buniek s cieľom ich implantácie do hostiteľského organizmu. Tieto bunky sú vystavené pôsobeniu jednej alebo viacerých reštriktívnych podmienok, ktoré sú blízke podmienkam v mieste implantácie, v čase dostatočnom na dostavenie sa požadovanej bunkovej vlastnosti, ako odpovede na tieto reštriktívne podmienky.

Doterajší stav techniky

Opuzdrené bunky produkujúce biologicky aktívne molekuly môžu byť po implantácii do hostiteľského organizmu použité na prevenciu alebo liečbu mnohých ochorení alebo zdravotných porúch, prípadne k tomu, aby zabezpečili, obnovili alebo posilnili jednu alebo viac metabolických funkcií organizmu.

Jedným z postupov používaných na opuzdrovanie buniek je takzvaná mikroenkapsulácia. Pri tomto postupe sú mikroskopické kvapôčky roztoku obsahujúceho bunky opuzdrené do maličkých guľôčok (Sefton a ďalší, Biotechnology and Bioengineering 29, strana 1135 až 1143 (1987), Sugamori a ďalší, Trans. Am. Soc. Artf. Intern. Organs 35, strana 791 až 799 (1989).

Iným postupom opuzdrovania buniek je takzvaná makroenkapsulácia. Pri tomto postupe sa určité množstvo buniek uzavrie do termoplastickej kapsule. Typicky sa bunkovou suspenziou najprv naplnia duté vlákna, ktoré sa potom na koncoch uzavrú. Z doterajšieho stavu techniky sú známe rôzne druhy makrokapsúl. Najmä Dionne a ďalší (WO 92/19195) opisujú makrokapsule, v ktorých sú bunky dispergované v matrici, a ktoré majú polopriepustnú obálku. Rovnako Aebischer (patenty Spojených štátov číslo 5,158,881, 5,283,187 a 5,284,761) opisuje bunkové kapsule tvorené vytlačovaním roztoku polyméru spolu s bunkovou suspenziou.

V prípade, že bunky určené na opuzdrenie a potom na implantáciu sú izolované priamo z tkaniva (primárne bunky), najprv sú typicky uvolnené väzby medzi jednotlivými bunkami a potom sú tieto opuzdrené, viď napríklad Aebischer a ďalší, Trans. Am. Soc. Artf. Intern. Organs 32, strana 134 až 137, (1986); Altman a ďalší, Diabetes 35, strana 625 až 633 (1986); Chang a ďalší, U.S. patent číslo 5,084,350; Darguay a Reach, Diabetológia 28, strana 776 až 780 (1985); Sugamori a Sefton, Trans. Am. Soc. Artf. Intern. Organs 35, strana 791 až 799, (1989).

V prípade, že bunky určené na opuzdrenie a potom na implantáciu pochádzajú z imortalizovaných bunkových línií, sú bunky typicky izolované z kultúr s vysokým obsahom živín, viď napríklad Aebischer a ďalší, Biomaterials 12, strana 50 až 55 (1981); Experimental Neurology 111, strana 269 až 275, (1981) (bunky PC12 sekretujúce dopamín) a Ward a ďalší, WO 93/22427 (bunky MOPC-31C sekretujúce IgG).

Opuzdrené bunky sú typicky kultivované v podmienkach in vitro a sú pred implantáciou funkčne charakterizované. Opuzdrené bunky sú v tejto pre-implantačnej fáze často kultivované v ochudobnenom médiu. Týmto médiom je často vyvážený roztok solí, v ktorom nie sú obsiahnuté živiny, viď napríklad Aebischer a ďalší, Trans. Am. Soc. Artf. Intern. Organs 32, strana 134 až 137, (1986); Altman a ďalší, Diabetes 35, strana 625 až 633 (1986); Chang a ďalší, U.S. patent číslo 5,084,350. V iných prípadoch sú opuzdrené bunky inkubované v médiu so živinami ako je napríklad RPMI 1640, ktoré obsahuje rôzne aminokyseliny, vitamíny, anorganické soli a glukózu (2 g/1, 11,11 mM) (Animal Celí Culture, editori Pollard a Walker, Humana Press Inc., Clifton New Jersey, strana 696 až 700 (1990)), a ktoré je typicky obohatené 5 až 15 % fetálneho teľacieho alebo konského séra.

Opuzdrené a do hostiteľského organizmu implantované bunky musia podstúpiť najmenej dve ťažké zmeny nutričných podmienok v porovnaní s podmienkami in vitro. K prvej zmene dochádza po opuzdrení. V porovnaní s podmienkami in vitro je prostredie opuzdrených buniek oveľa chudobnejšie na živiny. Toto ochudobnenie sa prejavuje dvoma spôsobmi. Prvým je existencia gradientu živín medzi vonkajším prostredím a vnútrom kapsule. Tento gradient sa prirodzene vytvára naprieč membránou a je ďalej zosilnený zťaženou difúziou medzi vonkajším hostiteľským tkanivom a bunkami v rôznych miestach vo vnútri kapsule. Bunky, ktoré sa nachádzajú blízko povrchu kapsule, majú ľahší prístup k živinám, ktoré difundujú cez obálku kapsule. Naviac sú produkty bunkového metabolizmu oveľa ľahšie eliminované v blízkosti povrchu kapsule, ako v jej centre.

K ďalšej výraznej zmene v koncentrácii živín (napríklad kyslíka a glukózy) dochádza po implantácii do hostiteľského organizmu vďaka tomu, že koncentrácia kyslíka a ďalších živín v podmienkach in vitro je všeobecne oveľa vyššia ako ich koncentrácia in vivo. Z toho vyplýva, že gradient podmieňujúci difúziu týchto molekúl do vnútra kapsule v podmienkach in vivo slabne.

Tieto zmeny nutričných podmienok môžu spôsobiť zmeny jednej alebo viacerých bunkových vlastností. Napríklad môže dôjsť k smrti buniek alebo k skráteniu ich dlhej životnosti. Naviac môže zmena okolitých podmienok po implantácii ovplyvniť ďalšie vlastnosti zostávajúcich živých opuzdrených buniek, ako napríklad rýchlosť bunkového rastu, alebo schopnosť buniek produkovať biologicky aktívne molekuly. Zmeny v rýchlosti rastu diskrétnych bunkových subpopulácii môžu viesť k prevládnutiu rýchlejšie rastúcej bunkovej populácie v kapsule a z toho plynúceho posunu ich výstupných charakteristík, alebo k iným nežiadúcim efektom.

Jedným z dôležitých rozdielov medzi prostredím in vivo po implantácii a prostredím in vitro je koncentrácia glukózy, na ktorú sú kultivované bunky adaptované. Ďalším rozdielom medzi podmienkami v tkanivovej kultúre a podmienkami v implantačnom mieste je množstvo pre bunky využiteľného kyslíka. Rovnako sa môžu líšiť koncentrácie ďalších živín v miestach na implantáciu a v kultivačnom médiu.

Vysoko metabolický aktívne bunky alebo tkanivá sú väčšinou velmi citlivé na nedostatok živín alebo kyslíka (hypoxia). Takto sa chovajú napríklad bunky mnohých endokrinných tkanív, ktoré sú normálne obklopené hustou sieťou kapilár a sú preto aklimatizované na vysoké koncentrácie kyslíka a živín. Napríklad bunky pankreatických Langerhansových ostrovčekov a adrenálne chromafinné bunky sú velmi citlivé na hypoxický šok.

Je známe, že zmeny v tenzii kyslíka alebo nedostatok živín môžu spôsobiť zmeny v expresii veľkého množstva génov, ktoré ovplyvňujú množstvo bunkových funkcií. Tieto zmenené môžu tiež ovplyvniť stabilitu a funkciu určitých mRNA. Nedostatkom živín môže byť ovplyvnená napríklad mRNA pre tyrozínhydroxylázu, enzým katalýzujúci medzikrok, ktorý určuje reakčnú rýchlosť produkcie dopamínu.

Nízkymi koncentráciami glukózy alebo aminokyselín môžu byť postihnuté taktiež gény pre proteíny tepelného šoku (heat shock proteins) a expresia génov pre metabolické enzýmy, ako napríklad pre enzýmy podieľajúce sa na intermediárnom metabolizme (napríklad pri glykolýze alebo glukoneogenéze).

Vysoko diferencované bunky môžu pri nedostatku kyslíka stratiť svoje tkanivovo špecifické funkcie v čase, dokiaľ sa spamätajú z hypoxického šoku (viď napríklad Wolffe a Tata, FEBS Letters 176, strana 8 až 15, (1984)). Medzi funkcie, pri ktorých takto dochádza k strate alebo zoslabeniu, patrí syntéza a modifikácia proteínov. Tým môže byť narušená aj produkcia a sekrécia terapeutických faktorov, ktoré mali bunky vylučovať do okolitého hostiteľského tkaniva. Navyše, hypoxické podmienky môžu za určitých okolností vyvolať maligné transformácie (viď napríklad Goldbaltt a ďalší, Biochemical Medicíne 7, strana 241 až 252, (1973)).

Výhodné je vyvinúť spôsob implantácie buniek do hostiteľského organizmu, zahrňujúci expozíciu alebo adaptáciu buniek na jednu alebo viac reštriktívnych podmienok ešte pred vlastnou implantáciou tak, aby sa obmedzili nežiadúce zmeny bunkových vlastností, ku ktorým dochádza v dôsledku zmeny prostredia po implantácii a tým sa minimalizovali aj nežiadúce účinky na hostiteľa. Taktiež je výhodné vyvinúť bunkové línie odvodené z takto pripravovaných buniek. Ďalej je výhodné zaistiť prostriedky na ex vi vo štúdium buniek, ktoré prešli zmenami v prostredí in vivo.

Podstata vynálezu

Vynález opisuje spôsob implantácie opuzdrených buniek do hostiteľského organizmu zahrňujúci in vivo alebo in vitro expozíciu buniek jednej alebo viacerým reštriktívnym podmienkam v čase potrebnom na dostavenie sa požadovaných vlastností ešte pred implantáciou buniek na požadované implantačné miesto v hostiteľskom organizme. Výhodné je, ak sa po implantácii do hostiteľského organizmu zachováva bunková vlastnosť dosiahnutá spôsobom podľa vynálezu. Opuzdrené bunky produkujú biologicky aktívne molekuly, ktoré môžu byť využité na prevenciu alebo liečbu ochorenia alebo poruchy, alebo na zabezpečenie, obnovenie alebo posilnenie metabolickej funkcie hostiteľského organizmu. Bunky podľa vynálezu môžu byť taktiež použité v aplikáciách in vitro, na diagnostické a iné účely.

Opis obrázkov;

Obrázok 1: na grafe je znázornená sekrécia NGF (nervového rastového faktoru) bunkami BHK kultivovanými in vitro pri tlaku kyslíka 50 mmHg v médiu, ktoré obsahovalo 0,8 g/1 glukózy (LOW O₂ /gl). BHK bunky boli uzatvorené do kapsulí typu 4 s dvojitým poťahom. Sekrécia NGF jednotlivých kapsulí bola testovaná 3, 7, 14, 21 a 28 dní a je znázornená výškou stĺpca. Na zvislej osi je udaná hmotnosť sekretovaného NGF v ng na jednu kapsulu v priebehu 24 hodín a na vodorovnej osi sú jednotlivé vlákna. Legenda: A-platí pre testy po 3 dňoch, B po 1 týždni, C po dvoch týždňoch, D po troch týždňoch a E po štyroch týždňoch.

Obrázok 2: znázorňuje opuzdrené bunky BHK inkubované in vitro pri tlaku kyslíka 142 mmHg v médiu, ktoré obsahovalo 5,5 g/1 glukózy (HIGH O₂/gl). Sekrécia

NGF jednotlivých kapsulí bola testovaná 3, 7, 14, 21 a 28 dní a je znázornená výškou stĺpca. Na zvislej osi je udaná hmotnosť sekretovaného NGF v ng na jednu kapsulu v priebehu 24 hodín a na vodorovnej osi sú jednotlivé vlákna.

Legenda: A-platí pre testy po 3 dňoch, B po 1 týždni, C po dvoch týždňoch, D po troch týždňoch a E po štyroch týždňoch.

Obrázok 3: znázorňuje časovú závislosť sekrécie NGF opuzdrenými bunkami BHK, kultivovanými in vitro v podmienkach LOW O₂/gl (ako na obr. 1). Bunky boli opuzdrené kapsulami typu 4 (T4) vyrobenými z (a) PAN/PVC (b) 12,5 % PAN/PVC alebo (C) 15 % PAN/PVC. Na zvislej osi je udané množstvo sekretovaného NGF v ng na jednu kapsulu v priebehu 24 hodín. Sekrécia NGF jednotlivých kapsulí bola testovaná 3, 7, 14, 21 a 28 dňa.

Obrázok 4: znázorňuje sekréciu norepinefrínu (NE) a epinefrínu (EPI) ako funkciu tlaku kyslíka. Opuzdrené adrenálne chromafinné bunky boli kultivované in vitro počas 14 dní pri tlakoch 20, 40, 60, 80 a 140 mmHgO₂. Sekrécia bola meraná po dvoch (A) a 14 dňoch (B). Na zvislej osi je za 30 minút nameraná sekrécia NE vyjadrená v pM, zatiaľ čo na vodorovnej je tlak kyslíka vyjadrený v mmHg. Časť A ukazuje bazálne hodnoty sekretovaného NE, časť B ukazuje draselnými iónami indukované hodnoty NE, časť C ukazuje bazálne hodnoty sekretovaného EPI a časť D ukazuje draselnými iónami indukované hodnotypy EPI.

Obrázok 5: znázorňuje sekréciu katecholamínov teľacími adrenálnymi chromafínnymi bunkami. Bunky boli opuzdrené kapsulami typu 2. Sekrécia bola meraná pred implantáciou (hodnoty A platia pre NE, hodnoty B C platia pre NE, hodnoty implantované v čase 6 je znázornená sekrécia 15 minút v pikomóloch.

Časť 5A ukazuje bazálnu sekréciu, v časti 5B je sekrécia indukovaná nikotínom a v časti 5C draselnými iónami.

pre EPI) a po nej (hodnoty D pre EPI). Bunky boli týždňov. Na zvislej osi katecholamínov v priebehu

Obrázok 6: znázorňuje sekréciu katecholamínov teľacími adrenáInými chromafínnymi bunkami. Bunky boli opuzdrené kapsulami typu 4. Sekrécia bola meraná pred implantáciou (hodnoty A platia pre NE, hodnoty B pre EPI) a po nej (hodnoty C platia pre NE, hodnoty D pre EPI). Bunky boli implantované v čase 6 týždňov. Na zvislej osi katecholamínov v priebehu

Časť 6A ukazuje bazálnu sekréciu, v časti 6B je sekrécia indukovaná nikotínom a v časti 6C draselnými iónami.

je znázornená sekrécia 15 minút v pikomóloch.

Obrázok 7: znázorňuje bazálnu (časť 7A) a 20 μΜ koncentráciou nikotínu stimulovanú (časť 7B) sekréciu katecholamínov opuzdrenými teľacími adrenálnymi chromafinnými bunkami. Bunky boli na 6 týždňov implantované do krysích subarachnoidálnych priestorov. Sekrécia bola meraná pred a po implantačnej perióde. Hodnoty označené A platia pre norepinefrín a hodnoty B pre epinefrín. Hodnoty na zvislej osi sú vyjadrené v pM.

Obrázok 8: ukazuje sekréciu dopamínu (hodnoty A) a L-dopa (hodnoty B) opuzdrenými bunkami PCI2 a PCI2A pred a po trojmesačnej perióde v striate krysy. Časti 8A a 8B znázorňujú pred implantačnú bazálnu sekréciu buniek PC12 resp. PC12A. Časti 8C a 8D znázorňujú po implantačnú bazálnu sekréciu buniek PC12 resp. PC12A. Zvislá os udáva 30 minútovú sekréciu kapsulí v pikomóloch.

Obrázok 9: porovnáva sekréciu katecholamínov buniek, ktoré boli aklimatizované in vivo za normálnych alebo znížených koncentrácií dopamínu. Nízke koncentrácie dopamínu boli spôsobené injekciou 6-hydroxydopamínu (6-OHDA) do krysej substantia nigra. Časť 9A znázorňuje hodnotu bazálnej sekrécie L-dopa buniek PC12 ako funkciu času aklimatizácie in vivo v poškodenej (hodnoty A) resp. nepoškodenej (hodnoty B) časti substantia nigra. Hodnoty sú udané v pikomóloch za 30 minút a jednu kapsulu. Časť 9B znázorňuje pomer bazálnych sekrečných rýchlostí L-dopa a dopamínu ako funkciu času aklimatizácie in vivo v poškodenej (hodnoty A) resp. nepoškodenej časti (hodnoty B) substantia nigra.

Obrázok 10: ukazuje sekréciu katecholamínov z opuzdrených buniek PC12 ako funkciu času aklimatizácie (v mesiacoch) in vivo v mozgu primátov. Prázdne štvorčeky znázorňujú body platné pre bazálnu sekréciu L-dopa, krúžkami je vyjadrená sekrécia dopamínu. Na zvislej osi je udaná sekrécia katecholamínov v pikomóloch za 15 minút na jednu kapsulu.

Obrázok 11: ukazuje sekrečnú rýchlosť NGF buniek BHK-hNGF klonu 23 pred implantáciou a 14 mesiacov po implantácii. Bunky boli opuzdrené do jednoplášťových dutých vláken HF 120794-6 v matrici tvorenej Vitrogenom^R alebo bez matrice. Bunky z bunkovej banky (CB) sú neaklimatizované bunky BHK-hNGF klonu 23. Na zvislej osi je udaná sekrécia NGF v nanogramoch na ml za 24 hodín.

Legenda: (A) aklimatizované bunky v matrici tvorenej Vitrogenom^R, (B) aklimatizované bunky bez matrice, (C) CB bunky v matrici a (D) CB bunky bez matrice.

Podrobný opis vynálezu

Bunková vlastnosť podľa vynálezu je ľubovoľný fenotypový znak, ktorý môže byt kvantitatívne meraný, vrátane životaschopnosti, rýchlosti rastu a bunkovej produkcie biologicky aktívnej molekuly. Požadovanou bunkovou vlastnosťou sa môže rozumieť zmena v úrovni produkcie jednej alebo viacerých biologických molekúl v dôsledku reštriktívnej podmienky, alebo zmena produkčného pomeru dvoch biologicky aktívnych molekúl. Ďalej sa požadovanou bunkovou vlastnosťou podľa vynálezu môže rozumieť stabilizácia produkcie biologicky aktívnej molekuly v dôsledku pôsobenia reštriktívnej podmienky.

Reštriktívnou podmienkou podľa vynálezu sa rozumie prípad, kedy sa jedna alebo viac podmienok, za ktorých sú bunky bežne kultivované in vitro, zmenia tak, aby sa približovali aktuálnym alebo očakávaným podmienkam in vivo na mieste predpokladanej implantácie do hostiteľského organizmu.

Biologicky aktívnou molekulou podľa vynálezu je molekula, ktorá môže (a) pôsobiť vo vnútri bunky, v ktorej vznikla (napríklad molekuly bcl-2 pri prevencii apoptózy), (b) je exprimovaná na povrchu bunky a ovplyvňuje bunkové interakcie s ostatnými bunkami alebo biologicky aktívnymi molekulami (napríklad receptory neurotransmitérov alebo bunkové adhezívne molekuly) alebo (c) môže byť uvolňovaná alebo sekretovaná z bunky, v ktorej vznikla, a uplatňovať tak svoj vplyv na inú cieľovú bunku (napríklad neurotransmitéry, hormóny, rastové faktory, cytokíny, alebo ďalšie prenášače intra- či intercelulárnych signálov). Biologicky aktívne molekuly môžu byť využité na prevenciu alebo liečbu ochorení alebo poruchy hostiteľa, alebo na zabezpečenie, obnovenie či posilnenie metabolickej funkcie hostiteľského organizmu.

Hostiteľom alebo recipientom podľa vynálezu je vhodný zvierací subjekt, vrátane cicavcov a zvlášť človeka. Termínom recipient sa rozumie zviera, ktorého bunky boli vystavené pôsobeniu jednej alebo viacerých reštriktívnych podmienok tak, že bunky vykazujú požadovanú vlastnosť. Termínom hostiteľ alebo hostiteľský organizmus sa rozumie zviera, do ktorého sú opuzdrené bunky, vykazujúce požadovanú vlastnosť, implantované.

Bunkami podľa vynálezu sú bunky v ľubovoľnej forme vrátane (ale nie len) buniek zachovaných ako tkanivo, bunkových zhlukov a jednotlivo izolovaných buniek. Bunky podľa vynálezu produkujú biologicky aktívne molekuly. Takými bunkami môžu byť primárne bunky alebo deliace sa bunky prirodzene produkujúce biologicky aktívne molekuly, alebo bunky na to priamo geneticky upravené.

Biokompatibilnou kapsulou podľa vynálezu sa rozumie taká kapsula, ktorá po implantácii do cicavčieho hostiteľa nevyvolá takú obrannú reakciu, ktorá by nepriaznivo ovplyvnila jej funkciu alebo ktorá by dokonca spôsobila jej inaktiváciu. K inaktivácii kapsule môže dôjsť napríklad po uzavretí kapsule do fibrotickej štruktúry, ktorá obmedzí difúziu živín k opuzdreným bunkám. Ďalej môže nepriaznivo ovplyvniť funkciu kapsule jej úplné odmietnutie hostiteľom alebo uvoľňovanie toxických alebo pyrogénnych látok z kapsule do jej okolia (napríklad vedľajšie produkty vzniknuté pri syntéze polymérnej matrice).

Imunoizolačnou kapsulou sa podľa vynálezu rozumie taká kapsula, ktorá po implantácii do cicavčieho hostitela minimalizuje nepriaznivé pôsobenie imunitného systému hostitela na opuzdrené bunky vo svojom vnútri. Tým je dosiahnuté dlhodobé pôsobenie kapsule v podmienkach in vivo.

Termínom hydrogél sa rozumie trojrozmerná zosietená sieť hydrofilných polymérov. Táto sieť má formu gélu, ktorého podstatnú časť tvorí voda. Je výhodné, aj keď to nie je obmedzujúcou podmienkou, ak voda tvorí viac ako 90 % gélu. Zosietené hydrogély môžu byť považované za tuhé, pretože nemôžu tiecť, ani sa deformovať bez pôsobenia značného strižného napätia.

V jednom uskutočnení vynálezu sú bunky opuzdrené do biokompatibilnej kapsule a následne sú in vitro vystavené pôsobeniu jednej alebo viacerých reštriktívnych podmienok a potom implantované do určeného implantačného miesta v hostiteľskom organizme. Bunky sú vystavené pôsobeniu reštriktívnej podmienky alebo podmienok v čase potrebnom k tomu, aby sa vytvorila požadovaná bunková vlastnosť. Výhodne je táto vlastnosť z podstatnej časti udržovaná aj po implantácii opuzdrených buniek do hostiteľského organizmu.

Reštriktívnou podmienkou podľa vynálezu sa rozumie zmena teploty, pH, barometrického tlaku alebo efektívnej koncentrácie jedného alebo viacerých metabolitov či kofaktorov, ako napríklad cukru, alkoholu, karboxylových kyselín, aminokyselín, mastných kyselín, plynov kovových iónov alebo ľubovoľného iného biologického faktoru, ktorý sa podieľa na raste, funkcii či životaschopnosti buniek. K takejto zmene môže dôjsť pri jednej alebo viacerých podmienkach. Uvedená reštriktívna podmienka podľa vynálezu sa mení tak, aby sa kultivačné prostredie priblížilo in vivo podmienkam v požadovanom implantačnom mieste. Ďalej môže byť takou reštriktívnou podmienkou zmena v efektívnej koncentrácii jednej alebo viacerých biologicky aktívnych molekúl, napríklad hormónov, rastových faktorov, neurotransmiterov, cytokínov alebo iných biologicky aktívnych faktorov, ktoré sa zúčastňujú inter- či intramolekulárnej signalizácie.

Niektoré živiny alebo biologicky aktívne látky môžu byť v podmienkach in vivo v nižšej koncentrácii, ako v akej sa bežne používajú pri kultivácii in vitro. Na druhej strane, niektoré živiny alebo biologicky aktívne látky sa môžu in vivo vyskytovať vo vyšších koncentráciách, ako je tomu in vitro.

Ďalej sa reštriktívnou podmienkou podľa vynálezu rozumie spoločná kultivácia opuzdrených buniek v podmienkach in vivo alebo in vitro spolu s bunkami z cieľového tkaniva určeného na implantáciu, a to tak, že dôjde k vytvoreniu požadovanej bunkovej vlastnosti v opuzdrených bunkách. Viď napríklad Wainer a Heller, Neuronal Hybrid Celí Lines: Generation, Characterization and Utility (Hybridné neuronálne bunkové línie: Príprava, charakterizácia a využiteľnosť) v Neuronal Celí Lines, editor J. Wood, IRL Press, strana 20 (1992).

V spôsoboch podľa vynálezu môžu byť použité ľubovoľné vhodné kultivačné médiá. Odborník môže modifikovať ochudobnené minerálne kultivačné médium tak, aby bola dosiahnutá požadovaná koncentrácia živín, kritického plynu alebo iné obmedzujúce podmienky charakteristické pre dané implantačné miesto.

Ak sú bunky vystavované reštriktívnym podmienkam in vitro, kultivačné podmienky sa môžu meniť pomaly a spojité, alebo môžu byť zmenené v jednom alebo viacerých krokoch tak, až sú dosiahnuté požadované reštriktívne podmienky.

Vo výhodnom uskutočnení vynálezu sú bunky vystavené reštriktívnym podmienkam in vivo a to tak, že sú implantované do vhodného implantačného miesta v tele recipienta. Chemické prostredie v blízkosti takého implantačného miesta môže ovplyvniť bunkové vlastnosti a zapôsobiť na aklimatizáciu buniek. Napríklad koncentrácia jedného alebo viacerých biologicky aktívnych faktorov (napríklad hormónov, rastových faktorov, neurotransmitérov alebo cytokínov) môže ovplyvniť rastové schopnosti implantovaných buniek, ich schopnosť aklimatizácie tým, že dôjde k adaptácii ich génovej expresie, alebo môže bunky prinútiť k produkcii požadovaných terapeutických fakto13 rov. Potom, ako sú bunky vystavené reštriktívnym podmienkam in vivo tak, že dôjde k utlmeniu požadovanej bunkovej vlastnosti, sú bunky z recipienta odobrané a môžu byť implantované do určeného hostiteľského organizmu.

Vystavenie reštriktívnym podmienkam in vivo je výhodné preto, že požadovaná bunková vlastnosť je dosiahnutá súbežnou rovnováhou všetkých bunkových fenotypových znakov s pôsobiacimi reštriktívnymi podmienkami. Na druhej strane, v dôsledku pôsobenia reštriktívnych podmienok in vitro môže síce dôjsť k utlmeniu niektorých požadovaných bunkových vlastností, avšak po implantácii buniek do hostiteľského organizmu môže dôjsť ku zmene ďalších bunkových vlastností, čo môže mať vplyv na požadovanú cieľovú bunkovú vlastnosť alebo vlastnosti.

Výhodne sú ako recipientom, tak aj hostiteľom primáty. Ešte výhodnejšie je hostiteľom človek. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu je implantačné miesto v hostiteľovi a recipientovi totožné.

In vivo pripravené bunky podľa vynálezu môžu byť taktiež kultivované pri jednej alebo viacerých podmienkach a používané in vitro na diagnostické a ďalšie účely.

V ďalšom uskutočnení vynálezu sú bunky vystavené niekoľkým reštriktívnym podmienkam in vitro ešte pred svojím opuzdrením. Výhodne sú takto ošetrené bunky opuzdrené a potom ešte znovu vystavené ďalším reštriktívnym podmienkam ešte pred svojou implantáciou do hostiteľského organizmu. Takáto kultivácia pri reštriktívnych podmienkach ešte pred opuzdrením umožňuje selekciu iba tých buniek z pôvodnej populácie, ktoré prežili. Opuzdrené sú potom len tieto bunky. Ak sú použité bunky post-mitotické alebo iné nedeliace sa bunky, potom môžu byť z pôvodnej bunkovej populácie vybraté na základe prejavov ich zdravia a fenotypu. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu sú tieto vlastnosti merané produkciou požadovanej biologicky aktívnej molekuly. V prípade, že sa jedná o aktívne sa deliace bunky, potom v populácii rýchlo prevládnu prežívajúce bunky. Čas po14 trebný k tomu, aby došlo k utlmeniu požadovanej bunkovej vlastnosti v dôsledku kultivácie pri reštriktívnych podmienkach, závisí od druhu použitých buniek, ako aj od reštriktívnych podmienok. V typickom prípade bunky prejdú po expozícii reštriktívnym podmienkam prechodným obdobím, počas ktorého sa bunkový fenotyp mení tak, až sa vyvinie bunková vlastnosť odpovedajúca reštriktívnym podmienkam. Perióda tohto prechodu môže byť stanovená bežnými spôsobmi.

Vo výhodnom uskutočnení vynálezu sú používané bunky z obličiek mláďat škrečkov (BHK - baby hamster kidney), ktoré sú geneticky upravené tak, aby sekretovali nervový rastový faktor (NGF - nerve growth factor). Tieto bunky sú suspendované v matrici na báze kolagénu/Vitrogenu^R a potom sú opuzdrené v dutých, semipermeabiIných, na koncoch uzavretých vláknach. Príprava takýchto BHK-hNGF buniek bola opísaná napríklad v PCT/US94/09299. Kapsule sa potom in vitro aklimatizujú na nízky obsah kyslíka a glukózy a potom sa meria množstvo NGF uvolneného do prostredia ako funkcie in vitro aklimatizačného času. Rýchlosť produkcie NGF na jednu kapsulu vzrastá spolu s časom kultivácie in vitro (viď obrázok 1).

Vo výhodnom uskutočnení vynálezu sú opuzdrené bunky BHK-hNGF implantované do laterálnych mozgových komôr hostiteľa a aklimatizované in vivo. Potom sú kapsule explantované, aklimatizované bunky vybraté z kapsulí a kultivované pri opakovanom pasážovaní. Nakoniec sú in vivo aklimatizované bunky opäť opuzdrené a implantované do recipienta. Pred opätovnou implantáciou, a potom aj v rôznych časových úsekoch po implantácii, sú kapsule s in vivo aklimatizovanými bunkami aj s bunkami neaklimatizovanými testované na množstvo uvolňovaného NGF (obrázok 11).

V inom výhodnom uskutočnení vynálezu sú bunky PCI2 opuzdrené jednoplášťové semipermeabiIné membrány a potom kultivované in vivo v mozgu primátov počas 6 mesiacov. Po šesťmesačnej implantácii bunky vykazujú požadovanú bunkovú vlastnosť ako odpoveď na reštriktívne podmienky, čo znamená, že u nich došlo ku zmene produkcie neurotransmitérov meranej pomerom uvolneného L-dopa a dopamínu. Taktiež je možné pozorovať zmeny v relatívnych produkovaných množstvách ďalších katecholamínov v porovnaní so stavom pred implantáciou (viď obrázok 7).

V inom výhodnom uskutočnení vynálezu bunky PC12 opuzdrené a kultivované in vivo v substantia nigra v mozgu recipienta, kde je buď bežná koncentrácia dopamínu, alebo kde bola jednostranne jeho koncentrácia znížená predchádzajúcou administráciou 6-hydroxydopamínu (6-OHDA). Bunky, ktoré boli kultivované v týchto podmienkach in vivo počas 28 alebo 60 dní produkujú väčšie množstvo L-dopa ako bunky kultivované v kratšom časovom úseku. V bunkách, ktoré boli kultivované in vivo v normálnych koncentráciách dopamínu sa opätovnou implantáciou vytvára väčší pomer medzi množstvom L-dopa a dopamínu v porovnaní s bunkami, ktoré boli kultivované v mozgoch s 6-OHDA poškodením v oblasti substantia nigra a tým aj v nižších koncentráciách dopamínu (obrázok 9).

V ďalšom uskutočnení vynálezu sa adrenálne chromafinné bunky obalené v dvojplášťovej semipermeabilnej membráne vystavia pôsobeniu reštriktívnych podmienok v subarachnoidálnom priestore človeka. Po implantačnej perióde 55 až 84 dní vykazujú bunky zmeny v produkcii neurotransmitérov.

Miesta na .implantáciu podľa vynálezu zahrňujú centrálny nervový systém, vrátane mozgu, komorovej vody a sklovca. Výhodnými miestami v mozgu sú striatum, cerebrálny kortex, jadrá subtalamu a bazálne Meynertove jadro. Ďalším výhodným miestom je mozgomiechový mok, najlepšie v subarachnoidálnom priestore a v oblastiach laterálnych ventrikulov. Ďalej vynález opisuje implantáciu do subkapsulárnych oblastí obličiek a ďalej intraperitoneálne, subkutánne alebo ľubovoľným iným terapeuticky užitočným spôsobom.

V niektorých prípadoch je užitočné, ak sú miesta na implantáciu najprv modifikované, alebo ak sú modifikované súbežne s in vivo aklimatizáciou buniek. Tým je dosiahnuté optimálne prostredie. Napríklad pri známom modele Parkinsonovej choroby sa používa administrácia 6-hydroxydopamínu do substantia nigra. Tento toxín pôsobí selektívne na dopamínergné neuróny. Do takto modifikovanej substantia nigra môžu byť implantované bunky určené na aklimatizáciu. Bunky PC12, ktoré po implantácii do takto poškodeného mozgu sekretujú katecholamíny, vykazujú všeobecný nárast produkcie katecholamínov po 1 mesiaci implantácie in vivo. Navyše, pomer jednotlivých katecholamínov sa mení spolu s poklesom pomeru bazálneho L-dopa a dopamínu už približne po 14 dňoch in vivo.

Lokálne podmienky závisia na mieste zvolenom na implantáciu a na konkrétnom živočíšnom druhu. Taktiež je pravdepodobné, že lokálne podmienky v danom implantačnom mieste sa líšia aj medzi jednotlivými jedincami toho istého druhu. Koncentrácia metabolitov a plynov v danom implantačnom mieste môže byť približne určená podľa dostupnej literatúry alebo ju môže stanoviť odborník bez potreby zbytočného experimentovania.

Napríklad v ľudskom tele sa parciálny tlak kyslíka pohybuje v rozmedzí 50 mmHg v arteriálnej krvi až po menej ako 1 mmHg pracujúceho svalového tkaniva. Ďalšie typické parciálne tlaky kyslíka sú: 40 mmHg v žilovej krvi, 47 mmHg v brušnej dutine a 59 mmHg v mozgomiechovom moku.

Podobne sa mení aj koncentrácia glukózy v rozmedzí 80 až 120 mg/100 ml (4,4 až 6,7 mM) v dobre prekrvených tkanivách a v rozmedzí 40 až 70 mg/100 ml v mozgomiechovom moku (CSF-cerebrospinal fluid). Viď Vedecké tabuľky Geigy, zväzok I., Merné jednotky, Telesné tekutiny, Zloženie tela, Výživa, vydanie 8., editor C. Lentner, CIBA-GEIGY, 1984. V týchto vedeckých tabuľkách je možné nájsť tento a ďalšie podobné príklady. V tabuľke 1 sú porovnané koncentrácie niektorých zlúčenín v krvnom sére a v CSF.

Tabuľka 1

Zlúčenina	MozaomiechovÝ mok	Krv fsérum)
Kyslík	59	mmHg	40	mmHg
Glukóza	100±20	mg/100 ml	55±15	mg/100 ml
Galaktóza	166±99	μΜ	17	μΜ
Glycerol	13,5±2,5	μΜ	120±65	μΜ
Laktát	l,6±0,2	mM	0,76±0,34	mM
Pyruvát	115±17	μΜ	32±19	μΜ
Fosfolipidy	5,21±0,9	μΜ	2,9±1,2	μΜ
Mastné kyseliny	3,5	μΜ	500	μΜ
cAMP	21±8	ηΜ	11±2,4	ηΜ
cGMP	2,4±0,8	ηΜ	9,5±2,1	ηΜ
Chloridy	125±3	mM	102,5±4,5	mM
Anorg.fosfát	0,52±0,07	mM	1,05±0,31	mM
Sodík	145±3,9	mM	140±2,38	mM
Vápnik	1,19+0,08	mM	2,44+0,1	mM
Horčík	0,8±0,17	mM	0,78±0,04	mM
Zinok	0,49±0,12	μΜ	16,7±3,1	μΜ
Železo	0,8±0,4	μΜ	17,2±0,75	μΜ
Meď	0,25±0,06	μΜ	16,25±0,75	μΜ
Mangán	21±6	ηΜ	10±2,4	ηΜ
Cholín	8,3±0,7	μΜ	15,5±2,3	μΜ
Histamín	87	ηΜ	3,4±0,7	ηΜ
Norepinefrín	1,4	ηΜ	1,65±1	ηΜ
Epinefrín	0,24	ηΜ	0,13±0,1	ηΜ
Sérotonín	3,9±l,08	ηΜ	50±20	ηΜ

Niektoré molekuly, ako je napríklad glukóza, aminokyseliny, laktát a ribonukleozidy, sú transportované cez hematoencefalickú bariéru do CSF. Tým dochádza k vyživovaniu oblastí, ktoré sú obmývané mozgomiechovým mokom, ako sú napríklad ventrikuly, subarachnoidálny priestor a miechový kanál. Typicky sú napríklad koncentrácie galaktózy v mozgomiechovom moku desaťnásobkom ich koncentrácií v krvnej plazme. Koncentrácia laktátu a pyruvátu je taktiež vyššia v CSF ako v plazme. Na druhej strane väčšina aminokyselín je v krvnej plazme 5 až 30-krát koncentrovanejšia ako v CSF (viď vyššie citované

Vedecké tabuľky Geigy, zväzok I., strana 169).

Ďalšie mikronutrienty ako je napríklad vitamín C, foláty (patria medzi vitamíny skupiny B), deoxyribonukleotidy, pyridoxín (vitamín B6) sú aktívne transportované cez hematoencefalickú bariéru do mozgomiechového moku. Navyše, koncentrácie iónov, ako sú sodíkové, draselné, horečnaté a chlóridové ióny, sú v mozgomiechovom moku veľmi starostlivo regulované (Spector a Johanson, Scientific American, strana 68 až 74, 1989).

Metabolity v kultivačnom médiu sú obyčajne zvolené tak, aby bol optimalizovaný rast a životaschopnost buniek v tkanivovej kultúre. Koncentrácia týchto látok v kultivačnom médiu sa zvyčajne líši od ich koncentrácie v danom implantačnom mieste. Často sú bunky kultivované vo vyšších koncentráciách glukózy a solí aké môžeme nájsť v danom implantačnom mieste. Napríklad médium RPMI 1640 obsahuje 11,1 mM glukózy, zatiaľčo koncentrácie glukózy sa pohybujú okolo 4,5 mM v krvnom sére a len 2,2 až 3,9 v CSF.

Podobne aj koncentrácia vápnika v médiu RPMI 1640 je 0,42 mM zatiaľčo jeho koncentrácia v CSF je 1,2 mM a 2,44 v krvnom sére (viď tabuľka 1). Zinkové ióny sa v krvnom sére vyskytujú v koncentrácii 0,5 μΜ, v CSF v koncentrácii 16,7 μΜ, zatiaľ čo v médiu RPMI 1640 úplne chýbajú.

Ďalším rozdielom je, že väčšina buniek je in vitro kultivovaná pri vonkajšom parciálnom tlaku kyslíka (142 mmHg) alebo v inkubátore s vlhkým vzduchom a s obsahom 5 až 7 % CO₂, (Aebischer a ďalší, Bio-materials viď vyššie, Ward a ďalší viď vyššie). Tieto parciálne tlaky kyslíka sú výrazne vyššie ako jeho parciálny tlak in vivo v zvolenom implantačnom mieste hostiteľského organizmu.

Ďalej sa kultivačné miesta odlišujú od podmienok in vivo tým, že neobsahujú molekuly s krátkym časom životnosti. Takéto molekuly sa veľmi rýchlo degradujú, ale sú v podmienkach in vivo neustále opäť syntetizované a doplňované. Niektoré kultivačné médiá sú obohacované o tepelne deaktivované fetálne teľacie alebo konské sérum, čo slúži k nahradeniu niektorých látok, avšak krátkodobé látky sa všeobecne v sére nevyskytujú, alebo sa vyskytujú len v malých koncentráciách. V takto obohatených médiách menej ako 20 % z celkovej hmoty média tvorí typicky sérum, z čoho vyplýva, že v najlepšom prípade budú tieto látky v médiu v pätinovej koncentrácii oproti samotnému séru. Naviac, takto obohatené médiá môžu obsahovať látky, ktoré sa v hostiteľskom organizme iného druhu nevyskytujú, a ktoré môžu mať nepriaznivý účinok na opuzdrené bunky. Ďalším problémom je to, že zatiaľčo koncentrácia väčšiny komponent krvného séra odpovedá ich koncentrácii v tkanivovom moku, koncentrácie niektorých špecifických látok sa môžu výrazne líšiť.

Použité bunky podľa vynálezu môžu byť vzhľadom k hostiteľskému organizmu allogénne (t. j. pochádzajú z rovnakého biologického druhu) alebo xenogénne (pochádzajú z iného biologického druhu). Vo výhodnom uskutočnení vynálezu sa do hostiteľského organizmu implantujú xenogénne bunky. Zvyčajne si príprava buniek na implantáciu do xenogénneho organizmu vyžiada iné reštriktívne podmienky, ako na implantáciu do organizmu allogénneho. Pri tom môže dôjsť ku vzniku fenotypovo odlišnej populácie s inými bunkovými vlastnosťami.

Bunky môžu byť získané buď priamo z darcovského organizmu (t. j. primárne bunky alebo tkanivá, vrátane dospelých neonatálnych a fetálnych buniek alebo tkanív), alebo z kultúr replikovaných in vitro ako imortalizované bunky alebo bunkové línie, vrátane geneticky modifikovaných buniek.

Primárne bunky môžu pochádzať z nedeliacich sa (post-mitotických) normálnych tkanív, z prirodzene sa deliacich (mitotických buniek), ako sú napríklad pečeňové bunky, alebo z pluripotentných kmeňových buniek, ako sú napríklad slezinné bunky alebo bunky kostnej drene. Mitoticky aktívnymi bunkami in vivo môžu byť taktiež rakovinové bunky (tumorové bunky).

Primárne bunky, ktoré môžu byť použité podľa vynálezu, sú napríklad zárodočné kmeňové bunky nervových, na rastové faktory senzitívnych buniek, odvodené z CNS cicavcov (Reynolds a Weiss, Science 255, strana 1707 až 1710, (1992), Richards a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, strana 8591 až 8595, (1992), Ray a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, strana 3602 až 3606, (1993)), ďalej primárne fibroblasty, Schwannove bunky, astrocyty, β-TC bunky, Hep-G2 bunky, ATT2 bunky, oligodendrocyty a ich prekurzory, myoblasty, myotuby, adrenálne chromafinné bunky alebo tkanivo drene nadobličiek. Výhodné je použitie nervových kmeňových buniek a adrenálnych chromafinných buniek.

Rovnako výhodné Schwanove bunky môžu byť pripravené podľa Bunga (PCT publikovaná prihláška WO 92/03536). Opuzdrené Schwanove bunky môžu byť implantované do vhodných oblastí mozgu ako prevencia pred degeneratívnym poškodením dopamínergných neurónov nigro-striatovej dráhy, ktoré sa prejavuje pri Parkinsonovej chorobe. Všeobecne možno povedať, že vhodné miesto na implantáciu bude v blízkosti striatu. Opuzdrenie buniek môže viesť ku zvýšenej sekrécii trofických faktorov vzhľadom k tomu, že bunky nie sú v priamom kontakte s neurónmi. Taktiež nedochádza k ich myelinizácii. K rovnakému účelu môžu byť opuzdrené a implantované aj iné typy gliových buniek, vrátane astrocytov a oligoadrenocytov.

Z doterajšieho stavu techniky sú známe spôsoby izolácie buniek alebo tkanív, ktoré produkujú zvolený produkt, alebo môžu byť tieto spôsoby odvodené zo známych techník. Napríklad Langerhansove ostrovčeky môžu byť izolované zo sliniviek veľkých zvierat (napríklad z bravčových alebo ľudských sliniviek) pomocou mechanického uvoľnenia a štiepenia kolagenázou (viď Scharp a ďalší, patent USA 4,868,121). Z malých zvierat, ako napríklad z krýs, môžu byť Langerhansove ostrovčeky izolované pomocou spôsobu Sharpa a ďalších, Diabetes 29, dodatok 1, strana 19 až 30, (1980).

Podobne aj hepatocyty môžu byť izolované z pečeňového tkaniva štiepením kolagenázou, po ktorom nasleduje frakcionácia tkaniva viď Sun a ďalší, Biomat. Art. Cells, Art. Org. 15, strana 483 až 496, (1987). Adrenálne chromafinné bunky môžu byť izolované známymi spôsobmi podľa Livetta, Physiology Reviews 64, strana 1103 až 1161, (1984), Sagen a ďalší, patent USA 4,753,635).

Imortalizované bunky môžu pochádzať z primárnych zdrojov, alebo môžu byť zvolené z buniek, ktoré boli transformované vírusmi, produktami vírusových proteínov, onkogénmi alebo inými génmi alebo ich produktami, ktoré spôsobujú imortalizáciu. Príkladom takýchto verejne dostupných bunkových línií vhodných na použitie podľa vynálezu sú, okrem iných, bunky z obličiek mláďat škrečkov (BHK), bunky z ovárií čínskych škrečkov (CHO), bunky myších fibroblastov (L-M), bunky myších embryí NIH-Swiss (NIH/3T3), bunkové línie z afrických zelených opíc (vrátane COS-a, COS-7, BSC-1, BSC-40, BMT-10 a Vero), krysie adrenálne pheochromocytómy (PC12), PC12A, krysie gliové tumorové (C6) bunky, RAJI (bunky z ľudských lymfómov), MOPC-31C plazmocytómové bunky, bunky MN9D, MN9H a bunky ripTAg odvodené z transgénnych myší. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu sú použité bunky BHK a PC12.

Spôsoby umožňujúce imortalizáciu buniek sú uvedené v prácach Land a ďalší, Náture 304, strana 596 až 602, (1983), a Cepko, Neurón 1, strana 345 až 353, (1988). Potenciálnymi bunkovými líniami sú, okrem iného, genetickým inžinierstvom upravené β-bunkové línie sekretujúce inzulín ako napríklad bunky NIT (Hamaguchi a ďalší, Diabetes 40, strana 842, (1991), alebo bunky RIN (Chick a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, strana 628 až 632, (1977), ATT bunky (Hughes a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, strana 688 až 692, (1992), CHO bunky (Matsumoto a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, strana 9133 až 9137, (1990) a B-TC-3 bunky (Tal a ďalší, Mol. Celí Biol. 12, strana 422 až 432, (1992).

Bunky podľa vynálezu buď prirodzene produkujú biologicky aktívne molekuly, alebo k tomu môžu byť upravené genetickou manipuláciou. Napríklad fibroblasty môžu byť transfekované expresívnym vektorom, ktorý zabezpečí produkciu zvolenej látky (napríklad nervového rastového faktoru, erytropoetínu, inzulínu, CNTF alebo faktoru VIII).

Príkladom biologicky aktívnych molekúl využiteľných na liečbu ochorení alebo porúch sú, okrem iných, inzulín, využiteľný na liečbu cukrovky, paratyroidálny hormón, ktorý môže byť použitý na liečbu hypoparatyroidizmu, erytropoetín, ktorý môže byť použitý na liečbu anémií a gama-amino-maslová kyselina, ktorá môže byť použitá na liečbu epilepsie.

Biologicky aktívne látky, ako napríklad trofické a rastové faktory, môžu byť použité na liečbu a prevenciu neurodegeneratívnych ochorení, ako sú napríklad Huntingtonova a Alzheimerova choroba, demencia sprevádzajúca AIDS a Parkinsonova choroba. Faktory biologickej odpovede, ako napríklad lymfokíny alebo cytokíny, môžu posilniť imunitný systém pacienta, alebo môžu pôsobiť ako protizápalové látky. Takéto biologicky aktívne látky môžu byť použité na liečbu niektorých chronických infekčných ochorení alebo niektorých foriem nádorového bujnenia. Ďalej môžu byť opuzdrenými bunkami uvoľňované katecholamíny, endorfíny, enkefalíny a ďalšie opoidné peptidy utišujúce bolesť.

Opuzdrené bunky podľa vynálezu môžu byť použité tiež na to, aby organizmu dodávali biologicky aktívne molekuly slúžiace na korekciu enzymatickej deficiencie. Príkladom takejto deficiencie je prudký pečeňový výpadok, pri ktorom nie je pečeňové tkanivo naďalej schopné odstraňovať toxíny alebo odpadové produkty metabolizmu. Ďalším príkladom je fenylketonúria, pri ktorej je tak produkovaná aminokyselina fenylalanín, až dosahuje nebezpečné koncentrácie v krvnom obehu postihnutého dieťaťa .

V inom uskutočnení vynálezu môžu opuzdrené bunky produkovať biologicky aktívne molekuly, ktoré uľahčia vylučovanie škodlivých alebo nežiadúcich produktov z tela hostiteľa. Opuz23 drené bunky môžu uvolňovať scavengery, ktoré pomáhajú vylučovať napríklad cholesterol.

Biologicky aktívnymi molekulami podľa vynálezu sú napríklad hormóny, cytokíny, rastové faktory, angiogénne faktory, trofické faktory, protilátky, krvné koagulačné faktory, lymfokíny, enzýmy a ďalšie terapeutické látky a agonisti, prekurzory, aktívne analógy alebo ich aktívne fragmenty. Takými sú napríklad katecholamíny, endorfíny, enkefalíny a ďalšie opioidné peptidy, dynorfín, inzulín, faktor VIII, erytropoetín, substancia P, nervový rastový faktor (NGF), neurotrofný faktor odvodený od bunkovej línie gliových buniek (GDNF-glial-cell-line derived neurotrophic factor), rastový faktor odvodený od krvných doštičiek (PDGF- platelet-derived growth factor, epidermálny rastový faktor (EGF), neurotrofný faktor odvodený z mozgu (BDGF-brain derived growth factor), neurotrofín 3 (NT-3), neurotrofín 4/5 (NT-4/5), skupina fibroblastových rastových faktorov, ciliárny neurotrofný faktor (CNTF), molekuly blízke CNTF a rastové faktory podobné inzulínu (faktory I, II a III).

V jednom uskutočnení vynálezu je biologicky aktívnou molekulou neurotransmiter. Takýmto neurotransmitérom môže byť napríklad dopamín, gama-amino-maslová kyselina (GABA), serotonín, acetylcholín, norepinefrín, epinefrín, kyselina glutamová, alebo iné peptidové neurotransmitéry. Ďalej môžu byť biologicky aktívnymi molekulami podľa vynálezu agonisti, analógy, deriváty alebo fragmenty neurotransmitérov vrátane napríklad L-dopa, ktorý funguje ako prekurzor dopamínu.

V inom uskutočnení vynálezu môžu byť použité aklimatizované bunky produkujúce látky potlačujúce bolesť, ako sú napríklad katecholamíny, enkefalíny, opioidné peptidy alebo ich agonisti či analógy, alebo ich zmesi. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu sú sekretované katecholamíny alebo enkefalíny, vo veľmi výhodnom uskutočnení vynálezu je sekretovaná ich zmes.

Kapsule podľa vynálezu majú typicky aspoň jednu vonkajšiu membránu alebo obálku, ktorá ohraničuje jadro s bunkami. Táto obálka umožňuje difúziu živín, biologicky aktívnych molekúl a iných zvolených zlúčenín. Kapsula je biokompatibilná a výhodne aj imunoizolačná. Jadro kapsule obsahuje izolované bunky či už suspendované v kvapalnom médiu, alebo imobilizované v hydrofilnej gélovej matrici.

Výber materiálu použitého pri výrobe obálky kapsule závisí na mnohých faktoroch a je podrobne opísaný v prihláške Dionne WO 92/19195. Na výrobu obálky kapsule môžu byť vo všeobecnosti použité rozličné polyméry alebo polymérne zmesi. Polymérne membrány tvoriace obálku kapsule môžu obsahovať polyakryláty, (vrátane akrylátových kopolymérov), polyvinylidény, kopolyméry polyvinylchloridu, polyuretány, polystyrény, polyamidy, acetáty celulózy, nitráty celulózy, polysulfóny, polyfosfoazény, polyakrylonitrily, PAN/PVC ako aj ich deriváty, kopolyméry a zmesi.

Kapsule podľa vynálezu môžu byť pripravené ľubovoľným spôsobom známym zo stavu techniky. Jedným takým spôsobom je spoločné vytláčanie polymeračného roztoku spolu s koagulantom, ako sú napríklad fragmenty biologických tkanív, organely alebo bunková suspenzia a/alebo iné terapeutické látky. Obálka môže byť jednoplášťová (typ 1, 2) alebo môže byť dvojplášťová (typ 4). Jednoplášťové duté vlákno môže byť pripravené rýchlym zrážaním len jedného povrchu polymeračného roztoku v priebehu jeho spoločného vytláčania s bunkovou suspenziou. Dvojplášťové duté vlákno môže byť pripravené chladením dvoch povrchov polymeračného roztoku v priebehu jeho vytlačovania. Typicky je pri vláknach typu 1 väčšia časť povrchu obsadená makropórami v porovnaní s dutými vláknami typu 4. Duté vlákna typu 2 obsahujú stredné množstvo makropórov. Viď napríklad Dionne WO 92/19195 a patenty USA 5,283,187 a 5,284,761.

Kapsule podľa vynálezu môžu mať rôzne tvary, napríklad valcový, diskový alebo guľový.

Veľkosť pórov v obálke kapsule určuje maximálnu molárnu hmotnosť molekuly, ktorá ešte môže prejsť semipermeabilnou membránou (MWCO- Molecular weight cut off). Molekuly s väčšou relatívnou molekulovou hmotnosťou, ako je hodnota MWCO, nemôžu z fyzikálnych dôvodov prechádzať membránou. Veľkosť pórov v membráne je preto zvolená tak, aby dané faktory produkované opuzdrenými bunkami mohli difundovať von z kapsule, ale aby zároveň nebol možný opačný pohyb faktorov imunitnej odpovede hostiteľa. Typicky je hodnota MWCO medzi 50 až 200 kDa, výhodne potom medzi 50 až 100 kDa. Vo veľmi výhodnom uskutočnení vynálezu taktiež zloženie membrány minimalizuje nežiadúce reakcie medzi efektorovými molekulami imunitnej reakcie hostiteľa a zložkami vonkajšieho povrchu kapsule.

Jadro imunoizolačnej kapsule podľa vynálezu je vytvorené tak, aby vytváralo vhodné podmienky pre konkrétne bunky. Jadro môže obsahovať kvapalné médium schopné zabezpečiť bunkový rast. Kvapalné jadrá sú vhodné na kultiváciu transformovaných buniek, ako sú napríklad bunky PCI2. V inom uskutočnení vynálezu môže jadro obsahovať gélovú matricu. Táto gélová matrica môže byť tvorená hydrofilným gélom (alginát, Vitrogen a tak ďalej), alebo zložkami extracelulárnej matrice (viď Dionne WO 92/19195).

Zlúčeniny, ktoré tvoria hydrofilné gély, môžeme rozdeliť do troch skupín. V prvej skupine sú gély nesúce čistý negatívny náboj (napríklad alginát). Druhou skupinou sú gély nesúce pozitívny náboj (napríklad kolagén a laminín). Komerčne dostupné zložky extracelulárnej matrice nesúce pozitívny náboj sú napríklad Matrigel™ a Vitrogen™. Do tretej skupiny môžeme zaradiť také gély, ktoré nenesú žiadny náboj (napríklad vysoko zosietený polyetylén oxid alebo polyvinylalkohol).

Jadrá tvorené hydrofilnou gélovou matricou sú zvlášť vhodné na kultiváciu buniek alebo tkanív, ktoré majú tendenciu na formovanie zhlukov alebo agregátov, ako sú napríklad bunky Langerhansových ostrovčekov alebo chromafinné adrenálne bunky.

Medzi faktory, ktoré ovplyvňujú množstvo buniek alebo tkaniva umiestneného do jadra kapsule podľa vynálezu, patria (1) veľkosť a tvar kapsule, (2) mitotická aktivita buniek v kapsuli a (3) požiadavky na viskozitu jadra a/alebo na viskozitu suspenzie pri plnení kapsúl. Tieto faktory sú podrobne opísané v prihláške Dionne WO 92/19195.

Implantované makrokapsule môžu byť ľahko odstránené z hostiteľského organizmu pomocou úponu pripevneného ku kapsuli. Mikrokapsule môžu byť odstránené odsatím alebo ľubovoľným iným vhodným spôsobom. Odstraňovanie mikrokapsulí je uľahčené použitím zberného zariadenia, ako je opísané v PCT/US93/07076.

Na uzavretie kapsuli môže byť použitý ľubovoľný vhodný spôsob, vrátane využitia polymérnych adhezív a/alebo obrubovania, zaväzovania alebo tepelného uzatvárania. Všetky tieto spôsoby sú známe v doterajšom stave techniky. Ďalej môže byť použitý ľubovoľný ''suchý spôsob uzatvárania. V takýchto spôsoboch je použitý neporézny inštalačný bod, ktorým je do kapsule vpravený roztok obsahujúci zvolené bunky. Po naplnení je kapsula okamžite uzavretá. Taký spôsob je opísaný V PCT/US94/07015.

Pred implantáciou kapsule do hostiteľského organizmu je vo výhodnom uskutočnení vynálezu najprv uskutočnená skúška funkčnosti v podmienkach in vitro. Na tieto účely môžu byť použité bežné skúšky alebo diagnostické testy, známe z doterajšieho stavu techniky (viď napríklad Methods in Enzymology, editor Abelson, Academic Press, 1993). Napríklad môže byť použitá ELISA (enzyme-linked imunosorbent assay, imunosorbčná enzymatická technika stanovenia), chromatografická alebo enzymatická skúška, alebo biologická skúška špecifická na konkrétny produkt. V prípade potreby je možné sledovať sekrečnú funkciu niektorého z implantátov v priebehu určitej periódy tým, že sú odoberané vhodné vzorky (napríklad sérum) z tela recipienta a tie sú potom podrobené analýze. V prípade, že recipientom je primát, môže byť použitá mikrodialýza.

Metabolická aktivita buniek môže byť monitorovaná sledovaním takých funkcií, ako je príjem kyslíka, využitie glukózy, alebo mitochondriálne funkcie. Príjem kyslíka môže byt meraný spôsobmi známymi zo stavu techniky (napríklad pomocou systému Diamond General Oxygen Uptake (č. 1271) a Čiarkovej elektródy (č. 731) s polyetylénovou membránou).

Genetická stabilita buniek, ktoré boli skonštruované kvôli expresii xenogénnych génových produktov, môže byť stanovená tak, že sa pomocou spôsobov známych zo stavu techniky určí počet kópií génového inzertu. Napríklad počet kópií plazmidu môže byť stanovený tak, že sa najprv enzymaticky naštiepi genómová DNA, preblotuje sa, hybridizuje sa sondou a nakoniec sa sila signálu porovná so známymi štandardami pomocou systému PhosphorImager^R.

Počet kapsulí a ich veľkosť by mala byť dostatočná na to, aby po implantácii došlo k liečebnému účinku. Tieto údaje sú stanovené podľa množstva biologickej aktivity nutnej na konkrétnu aplikáciu. V prípade sekrečných buniek produkujúcich terapeutické substancie sú na určenie množstva požadovanej terapeutickej substancie použité štandardné úvahy a kritériá na dávkovanie známe z doterajšieho stavu techniky. Faktory, ktoré je nutné brať do úvahy viď Dionne, WO 92/19195.

Implantácia opuzdrených buniek je uskutočnená v sterilných podmienkach. Kapsula je všeobecne implantovaná na miesto, ktoré umožní vhodnú distribúciu sekretovaného produktu a transport živín k implantovaným bunkám alebo tkanivám a ďalej taktiež uľahčí prístup ku kapsuli pre prípad jej vybratia alebo náhrady. Vynález bude podrobnejšie opísaný v nasledujúcich príkladoch, ktoré však nemožno v žiadnom prípade považovať za obmedzujúce pre uskutočnenie vynálezu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1: Sekrécia NGF opuzdrenými bunkami, ktoré sú vystavené prostrediu s nízkym obsahom kyslíka a glukózy

Produkcia bunkovej línie BHK-hNGF

BHK línia buniek, ktoré sekretujú NGF, bola produkovaná a ďalej ponechávaná v prostredí s nízkym obsahom kyslíka a glukózy.

2,51 kb fragment, obsahujúci približne 37 párov báz z 3' konca prvého intrónu, zdvojenú ATG sekvenciu považovanú za začiatok translácie proteínu pre-pro-NGF a kompletnú kódujúcu sekvenciu a celú 3'neprekladanú oblasť ľudského génu (Hoyle a ďalší, Neurón, 10, strana 1019 až 34, 1993) bol subklonovaný do expresívneho vektoru pNUT založeného na DHFR tesne vedľa promótora pre myší metallotioneín-1 proti smeru transkripcie (-650 až +7) a prvý intrón génu krysieho inzulínu II (Baetge a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci., 83, strana 5454 až 58 (1986)).

Bunky z obličiek mláďat škrečkov (BHK bunky) boli transfekované konštruktom pNUT-b-NGF s použitím kalcium-fosfátovej metódy. BHK bunky rástli v DMEM obsahujúcom 10% fetálne hovädzie sérum, lx pen/strep/amf B (0.8 g/1), a L-glutamín (GIBCO), v 5% oxide uhličitom a 37°C. Transfekované BHK bunky boli selektované v médiu obsahujúcom 200 μΜ metotrexátu (Sigma) počas 3 až 4 týždňov a rezistentné bunky boli ďalej udržované ako polyklonálna populácia v médiu buď s alebo bez 200 μΜ metotrexátu.

Príprava PAN/PVC vláken:

Semipermeabilné duté vlákna boli pripravené pomocou zvlákňovania prúdom vlhkého vzduchu (dry jet-wet spinning) (Cabasso, Hollow Fibers Membranes - Membrány dutých vláken, zväzok 12, Kirk-Othmerová Encyklopédia chemickej technológie,

Wiley, New York, 3. vydanie, strana 492 až 517, 1980, Dionne, boli odlievané z 10% a polyvinylchloridu a prudko ochladzované

WO 92/19195). Asymetrické duté vlákna roztoku kopolyméru polyakrylonitrilu (PAN/PVC) v dimetyl sulfoxide (w/w) priamo v koagulačnom kúpeli. Výsledné dvojplášťové vlákna boli zbierané do vodného kúpeľa bez rozpúšťadiel, glycerinované a sušené.

Príprava matrice ml kolagénu z chvosta krysy (Typ IV, Collaborative, lot 91 až 1083) bolo pridané k 1 ml PBS s fenolovou červeňou (Phosphate Buffered Saline - fosfátom pufrovaný fyziologický roztok) a pH tohto roztoku bolo upravené na 7,0. Ku 2 ml PBS s fenolovou červeňou bolo pridané 8 ml Vitrogenu^R (Celtrix, Palo Alto, CA, Lot 92H176). Matričný roztok bol vytvorený zmiešaním roztoku kolagénu a Vitrogenu v pomere 1:1.

Postup plnenia a uzatvárania vláken

Jednotlivé bunkové suspenzie BHK buniek produkujúcich NGF, ktoré rástli s 90% synchronizáciou, boli vypláchnuté PBS (bez vápnika a horčíka), štiepené trypsínom počas približne 1 minúty a peletované centrifugáciou pri 1000 otáčkach za minútu počas 3 minút. Bunky boli resuspendované v médiu na konečnú koncentráciu 2xl0⁷ buniek/ml. Táto bunková suspenzia bola potom zmiešaná v pomere 1 : 1 s kolagén/Vitrogen^R matričným roztokom, výsledná koncentrácia buniek bola lxlO⁷ buniek/ml.

Bunky boli jemne zamiešané do matrice tak, aby bola zaistená rovnomerná distribúcia koagulačnej hmoty pred opuzdrením. Vlákna boli potom plnené 2,5 ml koagulačnej matričnej hmoty obsahujúcej bunky (10,000 buniek/ml) s použitím zošikmenej špičky katétru a Hamiltonovej striekačky.

Kapsule boli uzavierané upevnením 1 až 1,1 cm dlhého úseku suchého dutého vlákna na dutý hriadeľ s priečne uzavretým proximálnym koncom. Z hriadeľa bol možný prístup injikova30 nia buniek do vnútra zariadenia. Potom, ako boli vlákna naplnené 2,5 ul bunkovej suspenzie, bolo odlomené septurn a prístupový otvor bol uzavretý pomocou svetlom polymérujúceho akrylátu (Luxtrak™ LCM 24, ICI Resins US, Wilmington, MA). Následne boli kapsule opatrené manipulačným očkom. Na každú kapsulu bola pripevnená 1,5 cm dlhá silikónová trubica (hadička) s priemerom 0,020 na akrylátové hrdlo.

Kapsule boli aklimatizované počas troch dní pri atmosférickom tlaku kyslíka a testované na bazálnu sekréciu NGF. Tri dni staré médium bolo vymenené 1 ml čerstvého média.

Potom boli kapsule umiestnené do jamiek 24-jamkových doštičiek, v ktorých bola buď nízka hladina glukózy (0,8 mg/1) a kyslíka (50 mmHg) alebo vysoká hladina glukózy (5,5 mg/1) a atmosférický tlak kyslíka (142 mmHg). Médiá boli vymieňané a merania NGF boli uskutočňované každých 7 dní. 1 deň pred výmenou boli v čerstvých médiách nastavené príslušné koncentrácie kyslíka na jednotlivé podmienky aklimatizácie. Opuzdrené bunky boli kultivované týmto spôsobom počas štyroch týždňov.

Hladiny NGF boli určované pomocou ELISA testu (enzyme-linked immunosorbent assay - imuno-enzymatické stanovenie na pevnej fáze) v dňoch 0, 3, 7, 14, 21 a 28. Reprezentatívne kapsule boli fixované 4% paraformaldehydom na histologické určenie životaschopnosti buniek.

Po fixácii v 4% paraformaldehyde boli zvolené kapsule premývané vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku (PBS), dehydratované v absolútnom alkohole do 95% a vložené do glykol-metakrylátového infiltračného roztoku (Historesine Mounting Médium, Reichert-Jung). Pomocou mikrotomu (Supercut 2065, Leica) boli narezané tri mikróny silné rezy, upevnené na sklíčka a zafarbené krezylovou violeťou.

NGF ELISA

Kvantifikácia hNGF uvoľneného z opuzdrených BHK/NGF buniek bola uskutočnená nasledovne. Mikrotitračné ELISA dosky (Nunc-immuno Maxisorp) boli potiahnuté protilátkou proti myšiemu b-NGF (2,5S), rozpustenou v poťahovacom pufre (lxPBS bez CaCl_a a bez MgCl₂/0,l% azid sodný, pH 9,6). Použitá koncentrácia protilátky bola 1 ng/ml, na potiahnutie každej jamky doštičky bolo použitého 150 μΐ tohto roztoku protilátky. Takto pripravené doštičky boli inkubované v 37°C počas najmenej 2 hodín alebo v 4°C cez noc.

Poťahovací roztok bol odstránený, jamky boli 3x prepláchnuté 300 μΐ premývacieho pufru (50 Tris-HCl/200 mm NaCl/1% Triton X-100/0,1% azid sodný, pH 7,0) a blokované 300 μΐ poťahovacieho roztoku, ktorý obsahoval BSA (10 mg/ml), pri izbovej teplote počas 30 minút. Potom boli bunky opäť 3x prepláchnuté 300 μΐ premývacieho pufru. Vzorky kondiciovaného média boli zriedené 1 : 1 v dvakrát koncentrovanom vzorkovom pufre (vzorkový pufor je rovnaký, ako premývací pufor, obsahuje naviac len 2% BSA). Do každej jamky bolo pridané 10 μΐ pripravených vzoriek. Doštičky boli inkubované počas najmenej dvoch hodín pri teplote 37°C alebo v 4°C cez noc.

Všetky jamky boli 3x prepláchnuté 300 μΐ premývacieho pufru a potom bolo do každej jamky pridané 100 μΐ konjugátu (4 U/ml) protilátky proti myšiemu b-NGF (2,5S)-b-gal. Doštičky boli inkubované v 37 °C najmenej 1 hodinu. Všetky jamky boli vyprázdnené, 3x prepláchnuté 300 μΐ premývacieho pufru a potom sa pridalo 200 μΐ b-D-galaktopyranozidového substrátového roztoku s chlórfenolovou červeňou (40 mg CPRG v 100 mM HEPES/150 mM NaCl/2 mM MgCl/0,1% azid sodný/1% BSA, pH 7,0). Doštičky boli inkubované pri teplote 37 °C pol hodiny až hodinu, alebo do toho času, než prebehla dostačujúca farebná zmena pre fotometrické stanovenie pri 570 nm.

Výsledky

Na obrázku 1 a 2 je znázornené uvoľňovanie NGF, vztiahnuté na jednu kapsulu, ako funkcia času v dvoch rôznych prostrediach pre 10% vlákna typu 4 s uzavretými hrdlami (hub sealed). Údaje sú vyjadrené v ng NGF uvolneného jednou kapsulou počas 24 hodín. Produkcia NGF vztiahnutá na jednu kapsulu počas sledovanej periódy rástla.

Príklad 2: Sekrécia NGF bunkami BHK aklimatizovanými po ich opuzdrení do kapsulí s rozdielnymi hydraulickými permeabi1itami

V tomto príklade boli používané BHK-hNGF bunky opísané v príklade 1. Duté vlákna boli pripravované rovnako, ako v príklade 1, pri výrobe makrokapsulí však bolo okrem 10% PAN/PVC v poťahovacom roztoku, použité, tiež 12,5% a 15% PAN/PVC. PAN/PVC dvojplášťové vlákna (T4) boli 1 cm dlhé a mali nasledujúce charakteristiky:

% sušiny Vnútorný priemer (/xm) Hydraulická priepustnosť

721 60

12,5 733 20

746 13 (hydraulická priepustnosť je udaná v ml/min/m²/mmHg)

BHK-hNGF bunky boli plnené do troch typov makrokapsulí a kapsule boli uzavierané rovnako, ako v príklade 1. Kapsule boli vystavené prostrediu s nízkym obsahom glukózy a kyslíka počas štyroch týždňov a testované na uvoľňovanie NGF tak, ako je to opísané v príklade 1.

Produkcia NGF z troch rôznych typov kapsulí vyjadrená ako funkcia času je ukázaná na obrázku 3. Priemerné uvolňovanie NGF z kapsule s 10% PAN/PVC bolo po štyroch týždňoch okolo 50 ng na kapsulu s 12,5% PAN/PVC. Kapsula s 15% PAN/PVC neprodukovala po 1, 2, 3 ani 4 týždňoch detegovateľné množstvo NGF. Histologické skúšky potvrdili, že zdravé zhluky buniek boli prítomné len v kapsulách s 10% a 12,5% PAN/PVC. V kapsulách s 15% PAN/PVC boli po štyroch týždňoch prítomné len mŕtve bunky.

Príklad 3: Opuzdrené BHK-hNGF bunky implantované do hostiteľského organizmu

Opuzdrené bunky z príkladu 1 boli vystavené prostrediu s nízkym obsahom kyslíka a glukózy ako v príklade 1 tak dlho, pokiaľ sekrécia NGF z BHK buniek za týchto reštriktívnych podmienok nebola stabilná. Opuzdrené bunky boli implantované do ľudského hostiteľského organizmu. Implantačné miesta zahrňovali laterálne komory a striatum mozgu. Postup implantácie kapsulí do mozgu viď Aebischer a ďalší,

WO 93/00127.

Príklad 4: Opuzdrené chromafinné bunky nadobličiek vystavené reštriktívnym podmienkam in vitro

Hovädzie chromafinné bunky nadobličiek boli z nadobličiek odobraté pomocou čiastočnej digescie kolagenázou tak, ako je opísané v práci Livett, Physiol. Rev., 64, strana 1103 až 62 (1984). Zhluky buniek nadobličiek boli imobilizované v 1,5% alginátovej matrici zosieťovanej pomocou CaCl_a a opuzdrené do dvojplášťových dutých vláken typu 4 z imunoizolačnej PAN/PVC membrány (s vnútorným priemerom 750 Mm, hrúbkou steny 85 μτα, MWCO 60 kD), ako je opísané v WO 92/19195.

Opuzdrené bunky boli kultivované počas 2 týždňov pri parciálnom tlaku kyslíka 20, 40, 60, 80 a 142 mmHg. Bunky boli testované na bazálnu sekréciu katecholamínov, evokovanú iónami K*, v dňoch 2 a 14. Po 14 dňoch boli kapsule fixované v 4% paraformaldehyde, spracované na histológiu, rozrezané a morfologicky testované.

Katecholamíny boli analyzované pomocou HPLC s použitím elektrochemickej detekcie. Chromatografický systém používal coulometrický multielektródový detektor (model 5100A, ESA, Inc.), čerpadlo Hitachi (Hitachi, Inc. ) a chromatografickú kolónu Hypersil 150 mm x 4,6 mm, 3 mikrón ODS (Keystone Scientific, Inc.) napojenú na MPLC kolónu NewGuard (Applied Biosystems, Inc.). Celý postup bol uskutočnený pri 26°C.

Mobilná fáza sa skladala z 75 mM NaH PO , 1,4 mM oktánsulfónovej kyseliny, 0,274 mM EDTA a 100 ml/1 CH_aCN. pH bolo upravené na 3,0 použitím koncentrovanej kyseliny fosforečnej. Prietoková rýchlosť bola udržovaná 1 ml/min.

Detektor bol vybavený preinjektorovým bezpečnostným článkom (model 5020), pracujúcim pri +450 mV a vysoko citlivým duálnym analytickým článkom (model 5011) operujúcim na oxidatívnom princípe s napätím -40 mV a +400 mV na prvej resp. druhej elektróde. Analyzované vzorky sa merali na druhom detektore.

Na overenie detekčných prahov boli použité trojité merania štandardov. Detekčný prah činil 52 fmol pre L-Dopa (L-3,4-dihydroxy-fenyl-alanín), Dopac (3,4-dihydroxy-fenyl octovú kyselinu), norepinefrín (NE), dopamín (DA) a 104 fmol pre HVA (homovanilovú kyselinu). Veľkosti štandardných odchýliek pre detekčné prahy bol 2 až 5%, 9 až 12%, 15 až 24% resp. 6 až 17%. Kalibračné krivky tvorené siedmymi bodmi (každý pochádzal z jedného merania) boli lineárne v celom meranom rozsahu od 104 do 6600 fmol pre HVA. Hodnoty r^s boli pre jednotlivé látky 0,999, 0,998, 0,999 resp. 0,998.

Dáta boli získané a piky integrované s použitím pristroja Waters 845 VAX Chromatography Workstation.

Výsledky sú znázornené na obrázku 4. Údaje sú vyjadrené v pikomóloch za 30 minút (základná produkcia) alebo v pikomóloch za 15 minút (produkcia vyvolaná iónami K*). Pri vyšších koncentráciách kyslíka základné, a najmä iónami K* evokované uvolňovanie ako norepinefrínu (NE), tak epinefrínu (EPI), bolo vyššie v 14. dni ako v 2. dni. Vystavenie opuzdrených buniek reštriktívnym podmienkam teda viedlo k ovplyvneniu jednej alebo viacerých bunkových vlastností.

Príklad 5: Opuzdrené chromafinné bunky nadobličiek vystavené in vivo reštriktívnym podmienkam

Hovädzie chromafinné bunky nadobličiek boli pripravené rovnakým spôsobom ako v príklade 4. Agregáty buniek nadobličiek boli imobilizované v 1,5% alginátovej matrici zosieťované pomocou CaCl₂ a opuzdrené buď do jednoplášťovej (typ 2) imunoizolačnej PAN/PVC membrány dutých vláken (vnútorný priemer 500 pm, šírka steny 70 až 90 pm, MVCO 60 kD) - alebo dvojplášťovej (typ 4) imunoizolačnej PAN/PVC membrány (vnútorný priemer 500 μιη, hrúbka steny 70 až 90 μπι, MWCO 60 kD) tak, ako je opísané v WO 92/19195.

Opuzdrené bunky boli vystavené reštriktívnym podmienkam in vivo implantáciou do striata krysích recipientov. Každej kryse boli implantované bilaterálne dve kapsule. Pozdĺž rezu vedeného v mediálnej osi bola do lebky vyvŕtaná diera v súradniciach +0,5 mm od bregmatu, 3 mm laterálne, pričom upevnenie celého stereotaktického zariadenia bolo 0,3 mm pod intra-aurálnou líniou. Kapsule boli vnorené 7 mm pod tvrdú blanu mozgovú.

Produkcia implantáciou a boli detegované katecholamínov kapsulami bola testovaná pred po 6 týždňovej perióde in vivo. Katecholamíny rovnakým spôsobom ako v príklade 4.

Obrázok 5 ukazuje výsledky dosiahnuté pri použití membrán typu 2. Údaje sú vyjadrené v pikomóloch na kapsulu za 15 minút. Úroveň bazálneho (panel A) a iónami K* navodeného (panel C) uvoľňovania NE a EPI boli podobné pred implantáciou a 6 týždňov po implantácii. Avšak úroveň nikotínom vyvolanej sekrécie NE a EPI (panel B) po 6 týždňoch trvajúcom vystavení buniek podmienkam in vivo bola vyššia, ako úroveň sekrécie pred implantáciou.

Obrázok 6 ukazuje výsledky dosiahnuté použitím membrán typu 4. Úroveň iónami K* navodenej sekrécie NE a EPI (panel C) bola podobná pred implantáciou a 6 týždňov po implantácii. Avšak úroveň nikotínom navodeného uvoľňovania NE a EPI (panel B) po 6 týždňoch v podmienkach in vivo bola vyššia, ako pred implantáciou. Navyše bol rozdiel medzi bazálnou úrovňou uvoľňovania katecholamínov pred implantáciou a 6 týždňov po implantácii (panel A).

Príklad 6: Opuzdrené chromafinné bunky nadobličiek vystavených in vivo reštriktívnym podmienkam

Hovädzie chromafinné bunky nadobličiek boli pripravené rovnakým spôsobom ako v príklade 4. Zhluky buniek nadobličiek boli imobilizované v 1,5% alginátovej matrici zosieťovanej pomocou CaCl₂ a opuzdrené vo vláknach typu 4 z dvojplášťovej imunoizolačnej PAN/PVC membrán (s vnútorným priemerom 500 pm, hrúbkou steny 70 až 90 pm, MWCO 60 kD), ako je opísané v WO 92/19195.

Opuzdrené bunky boli vystavené in vivo reštriktívnym podmienkam implantáciou do spinálneho subarachnoidálneho priestoru krysích recipientov. Chirurgický postup viď Aebischer a ďalší, WO 93/00127.

Produkcia katecholamínov kapsulami bola testovaná pred implantáciou a po 6 týždennej perióde in vivo. Katecholamíny boli detegované rovnakým spôsobom ako v príklade 4. Údaje sú vyjadrené v pikomóloch na kapsulu za 30 minút.

Obrázok 7 ukazuje rozdiel v úrovni produkcie NE a EPI pred a po implantácii. Opuzdrené bunky boli implantované na čas 6 mesiacov. Po 6 mesiacoch in vivo bola ako bazálna, tak nikotínom stimulovaná produkcia EPI signifikantne znížená, zatiaľčo produkcia NE bola signifikantne zvýšená.

Príklad 7: Opuzdrené PC12 bunky vystavené in vivo reštriktívnym podmienkam v mozgu primátov

PC12 bunky, kultivované v kultivačnom médiu RPMI doplnenom o 10% teplom inaktivovaného konského séra, 5% fetálneho teľacieho séra a o 100 jednotiek penicilinu/streptomycinu, boli odobraté z kultivačného média, centrifugované a supernatant bol odstránený.

Vysokomolekulárny chitosan Fluka (4,4 g) bol rozpustený v 150 ml sterilného 0,85% fyziologického roztoku pri 70 °C, za súčasného intenzívneho miešania, pH roztoku bolo upravené na 6,2 použitím 45 ml 100 mM pufrovaného fyziologického roztoku HEPES (pH 8,0). Roztok bol sterilné filtrovaný cez filter s póraiui o veľkosti 0,22 gm (Millipore).

Roztok chitosanu bol zmiešaný s rovnakým množstvom RPMI a požitý na resuspendovanie bunkového peletu na koncentráciu 5x10® buniek/ml. Roztok buniek v chitosane (približne 1,000 gl) bol vytlačovaný spolu s PAN/PVC tak, aby boli uzatvorené jednoplášťové XP11 imunoizolačné PAN/PVC membrány dutých vláken (s vnútorným priemerom 450 až 500 gm, hrúbkou steny 50 až 65 gm, MWCO 65 až 100 kD, s hydraulickou priepustnosťou 53 ml/min/m²/mmHg, s koeficientom transportu glukózy 8x10“* cm/s, koeficient priepustnosti odpovedal pórom takej veľkosti, ktorými neprejde 88% BSA). Tieto vlákna boli vyrobené použitím všeobecného postupu, ktorý je opísaný v patentoch Spojených Štátov č. 5,158,881, 5,283,187 a 5,284,761. Vlákna boli nastrihané na požadované rozmery (približne na 1 cm) a uzavreté tepelným obrúbením koncov.

Opuzdrené bunky boli implantované do troch opíc druhu Cynomolugus. Chirurgické zákroky boli uskutočnené podľa práce Aebischer a ďalší, WO 93/00127. Dve kapsule boli implantované na rôzne miesta v putamen. Spomenuté stereotaktické súradnice na implantáciu do putamen a do kaudálnej oblasti boli odvodené nasledovne: miesto v putamen 1 = 23,0 mm anteriorne od intra-aurálneho začiatku, 9,0 mm laterálne od šípového stehu a

16.5 mm ventrálne od povrchu mozgu, miesto v putamen 2 = 19,0 mm anteriorne od intra-aurálneho začiatku, 10 mm laterálne od šípového stehu a 19,5 mm ventrálne od povrchu mozgu a miesto v putamen 3 = 15,5 mm anteriorne od intra-aurálneho začiatku,

11.5 mm laterálne od šípového stehu a 21,0 mm ventrálne od povrchu mozgu. Miesto v kaudálnej oblasti 1 bolo 18 mm anteriorne od intra-aurálneho začiatku, 4,0 mm laterálne od šípového stehu a 15,0 mm ventrálne od povrchu mozgu, miesto v kaudálnej oblasti 2 bolo 22,0 mm, 4,5 18,0.

Opuzdrené bunky boli implantované na čas približne 6 mesiacov a potom boli opäť vyoperované. Pri kapsuliach boli stanovené pred aj po-implantačné koncentrácie bazálneho a draselnými iónami evokovaného L-dopa (L-d), norepinefrínu (NE), epinefrínu (EPI), dopac (dpc), dopamínu (DA), a homovanilovej kyseliny (HVA), viď príklad 4. V tabuľke 2 sú uvedené dáta vyjadrené v pikomóloch na kapsulu za 30 minút (pre bazálnu koncentráciu) alebo v pikomóloch na kapsulu za 15 minút (pre koncentrácie po indukcii iC-iónmi). Ako dokumentujú výsledky v tabuľke 2, vlastnosti opuzdrených buniek sa po 6-mesačnej expozícii v reštriktívnych podmienkach výrazne zmenili.

Vysvetlivky k tabuľke 2:

L-d L-dopa

NE norepinefrín

EPI epinefrín dpc dopac

DA dopamín

HVA homovanilová k.

C1,C2 kaudálne miesto

PI,2,3 putamen nez. nezistené

Tabuľka 2

Draslíkom indukovaná koncentrácia

u:

P* 03 CM

II

03 w m

•r» N Φ C

VO * o

m M·

II

ov n v

M· 03 *d

m vo rn

ŕ*3 CM

σι rd

vo CM

m o

g íc

n n m* CM

σΓ Ή

CM 03 vo*

(*1 00 o

P* ΡΊ

O rd VO* CM

M1 C*

•d rd rd VO

1*3 P* m* »d

03 vo 03* CM

O C σΓ rd

O CM P*

O 03 r** CM

o 03 rd CM

i tí!

σι σι m

P- O ffl

VO CM r*

Γ3 N Φ C

O rd rd

σ» CM M·

en m x rd

P* oľ

P* 03 rd

m r* VO

P3 rd rn

03 03 CM

*3* rd P^

O CM CM

hd Ch M

CM CM rd

•o N QJ C

rd CM

•r, N Φ C

O VO o

•rv N Φ C

n r* H O

•f“l N Φ C

rd VO o

ΓΊ N Φ C

rd rd rd

P* P“ o

8» at stí

*

iŕ

m 03 CM

m vo

P* vo 03*

•n N Φ C

03 03 O

03 f*3 VO

P* σ o

o M· 00

03 P· rd

O vo cľ rd

CM CM

(*3 rd CM

O 03 r*

00 03 CM

a Λ s«:

O P* o

o 03 03

O vo o

03 O CM

O

VO CH rd

00 M· O

o vo tn

f*3 03 O

00 VO M*

03 03 O

O rd O

o rd M*

m σι CM

I Bazálna koncentrácia

03

09 VO í*ľ

O r* rd

o m o rd

^d ^d rd

n N Φ C

O m VO

VO M· H

o CM O ^4

rd P· CM

rd O vo

m 03

v σι rn

P* VO r*

O rd oí

g 03

03 co o rd

σι σι % CM

σ rd cí m

m N Φ C

•n N Φ C

VO vo rd

VO VO O

03 VO rn

rd CM 00

03 CM

03 03 oľ rd

rd 03 í*? rd

»d P- CM

03 00 O

U n, Ό 03

rn

O σι s rd rd

i-d O

CM O

P* P* o

VO o VO

03 •d

o 03 M· »d

m m CM

C*3 rd f*

P* CM rn

CM σι CM

O o 00

VO M· oT

W Oj u ffl

O n rd

O m o

CM O ΓΊ

CM n o

00 P· o

03 »ď o

CM 03 O*

P“l N Φ C

03 00 O

•ΡΊ N Φ C

p* m rd

Μ» 03 O

vo CM O

00 o o

§ 03

CM CM * »d

in vo x o

VO m c*?

•n N Φ C

•n N dl C

03 00 o

•n N Φ C

03 O

00 o

CM P* * O

rd 03 « rd

vo í*3 * rd

03 03 O

í*3 rd O

Ό Λ 09

CM r* rd

o CM CM

m CM CM

CM CM

o vo % rd

o rd CM H

σν rd

O 00 rd m

P* ť*3 K rd

o 00 o rd

OD VO

M· m K o

O VO % vo rd

o rd •d •d

Φ M Of

JJ n s

Φ M 0i

4J n s

Φ M 04

jJ n s

Q M 0i

ti <2

v M 0i

n S

XJ C0 H I*

·& >o eo c «0 Έ.Ο E cri i CL

*>> S XJ <0 k· C u II 1 03 <2

>o C0 e «0 C.G E cd * 1 W £

Miesto

rd υ

CM U

«d Qi

S1 Ch

<*3 Ch

Dátum implantácie

σι **s. 03

Tabuľka 2 (pokračovanie)

Tabuľka 2 (pokračovanie)

Draslíkom indukovaná koncentrácia

1 x.

os O

TV N ω C

CM CM

P* 00 o

ď) n CM

•o N 0) c

n S Φ C

•Π N V C

II °T'^

TV N Φ C

o CM v en

2,65

Γ- ΟΟ o

2

á

σν CM w H

σν r*

cn •—t vo CM

TV M Φ C

O σι % vo

P* 09 O

vo 00 K v

•n N Φ C

n v K vo vo

•n N Φ C

o Ή K ď> CM

O H T CM

m cn

tn vo « o

u Q. Ό *

m vo •n

ΓΊ N 0) C

VO 00 rľ

m N V C

m XT * CM

•rv N Φ C

«*» 00 % o

•n N OJ C

o 09 VO H

•rv N U C

CM m

CM VO VO

* * * sa

sa as ae

H Oj M VZ

m 00 o

ΡΊ N Φ C

o o

•rv N V C

CM H M

!“» N U C

o m o

•n N Φ C

VO m m

•ΡΊ M V C

«-Ι 00 «-♦

CM

*

as S8S ai

00 Ή

TV N Q) C

•H n

•rv N Q) C

00 VO -* CM

•o N 0) C

m σ o

•n N Φ C

o c* 00

•rv N 0) C

tn % n

σν o r?

au m sa

s* as sa *

o 1 J tŕ

σν m o

OS O

09 m o

•n N v C

P- m o

vo O

P* o

n N Φ C

σι «Η Ή

rv Ή O

o vo o

m o

O o

v O

I Bazálna koncentrácia

03

o CM

•-H OS CM

c* os rí

n N V C

o O n

•n N V C

n N 0) C

O P* H

O •-1 σ

O os

tn o P^

p* o «

09 «—i CM

VO o

á cQ

O O p-'

n 00 O

CM σι *. r* «Ή

•n N 0 C

00 CM CM

•n N Φ C

σν K o

•O N (U C

O O CM*

O o

OS n -J

σν o r*

σν o

CM «-Η O

U n Ό 03

o tn čí

Γ“ CM O

r* CM H

•ΓΊ N 0 C

n σ\ CM

•H CM O*

o 00 * o -H

•n N Φ C

O m u? CM

•n N Φ C

vo CM P^

O n o*

O* CM O

tn o o

W Oj U 03

o v rH

CM CM O

m CM «—1

CM O x o

ďl 00 * o

m 00 o

00 m o

m o o

O 09 OS

•n N U C

O 09 * CM

m os * rs

ao CM o

00 rv o

g CO

O σν * o

f—t N 0) C

•H σι r-i

•n N Q) C

o

•rv N V C

τη N Φ C

•rv N 0) C

O Ή H Ή

•n N 0) C

tn * m

H VO

sa aa

as sa a: aa

Ί3 1 i-3 03

o vo

O cn

O r* %

rv N 0) C

00 n

•rv N U C

vo vo Ή

•rv N ai c

O 09 tO

•rv N a> c

p· CM

P* 09 s Ή

O m •H

sa * sa za

w h Oj

AJ V) S

0) ä

JJ n s

v ä

AJ «1 á

Φ M Oj

AJ n 8,

« M Oj

AJ 0) s

'>» B Ό « C »- -Ξ g Q, B c .52 ,2 r

-►> e «u a B (3 •5.0 E ιλ έ a.

·>» B KJ 2 u s o 2 ε o. o e ’C .S Q. M £

C* *eá m B CO TxQ .E ’T Tn O CU

Miesto

υ

u

s!

5? Oj

Π Oj

Dátum implantácie

m 00

Príklad 8: Opuzdrené bunky PC12 sa implantujú človeku

Bunky PCI2 sa opuzdria a implantujú do recipientného organizmu tak, ako je opísané v príklade 7. Po 6 mesiacoch sa kapsule vyoperujú a stanoví sa pomer L-dopa a dopamínu. Potom sa bunky umiestnia na kultivačné dosky s viacerými jamkami a kultivujú sa pri rôznych parciálnych tlakoch kyslíka in vitro. Bunky sa v pravidelných intervaloch testujú na sekréciu L-dopa a dopamínu. Bunky, ktoré uvolňujú L-dopa a dopamín v požadovanom pomere, sa potom implantujú do ľudského mozgu tak, ako bolo opísané v WO 92/00127.

Príklad 9: Opuzdrené bunky PC12, exponované reštriktívnym podmienkam in vivo v striate krysy

Kapsule

Kapsule boli pripravené z dutých vláken na báze PAN/PVC pomocou techniky fázovej inverzie (vnútorný priemer 450 až 500 μπι), stena 50 až 65 μπι, MWCO 100 kDa, hydraulická permeabilita 53 ml/min/m²/mmHg.

Kultivácia buniek a ich opuzdrenie

PCI2 a PCI2A bunky boli kultivované v 500 ml nádobách umiestnených v rotore pri 80 otáčkach za minútu v bezsérovom médiu HL-1 (Ventrex Inc., Portland, Maine) pri teplote 37 °C. Atmosféra obsahovala 7% CO_a a nasýtenú vodnú paru. Bunky boli zahustené z kultivačného supernatantu centrifugáciou pri 800 g. Životaschopnosť buniek bola stanovená pomocou trypanovej modrej a odpovedala 90+/-5% pred opuzdrením.

Bunky boli resuspendované v médiu HL-1, pH 7,3 tak, aby ich koncentrácia bola 4xl0⁷ buniek/ml. Potom bol pridaný k bunkám PC12 a PC12A rovnaký objem roztoku 2% (w/v) chitosanu pH 6,7 nízkej viskozity (PROTOSAN^R, chlorid chotisanu, Protan Biopolymer, Drammen, Norsko). Výsledná koncentrácia buniek tak bola 2,0 x 10^v buniek/ml.

Jednotlivé kapsule boli dlhé 7+/“5 mm. Kapsule plnené bunkami PC12 a PCI2A boli vyrobené v dvoch jednotlivých dávkach a potom boli umiestnené do 24-jamkových dosiek na kultiváciu tkanivových kultúr. Každá jamka obsahovala 1 ml média HL-1.

až 7 dní po opuzdrení boli volne plávajúce kapsule dvakrát premyté 1 ml HBSS (HEPES buffered saline, fyziologický roztok pufrovaný N-(2-hydroxyetyl)piperazín-N'-(2-etánsulfónovou) kyselinou), ktorý obsahoval 10 μΜ kyselinu askorbovú. Tým bolo odstránené zbývajúce kultivačné médium. Jednotlivé vzorky boli inkubované 30 minút (bazálne uvolňovanie) v 250 μΐ HBSS. Pred oxidáciou boli všetky vzorky ochránené rýchlym prídavkom citrátového redukujúceho acidifikovaného pufru (CRAB). Tým vznikli stabilné vzorky v 10 mM citrátu, 20 μΜ metabisulfitu sodného a v 0,1 N kyseline chloristej. Dlhodobejšie skladovanie vzoriek prebiehalo pri teplote -80°C. Štandardy boli pripravené tak, že sa zásobné roztoky rozriedily HBSS a potom sa stabilizovali prídavkom CRAB a 0,1 N kyseliny chloristej.

Spotreba dopamínu v striate

Krysy boli anestézované intramuskulárnou injekciou zmesi ketamínu (33 mg/ml), xylazínu (1,7 mg/ml) a acepromazínu (10 mg/ml). Celková výdatnost dávky bola 1,0 ml/kg. Potom boli krysy umiestnené do Kopfovho stereotaxického prístroja. Krysám bolo infúziou podané celkom 12 μg/ml 6-OHDA (6 μΐ roztoku o koncentrácii 2 μg/ml 6-OHDA v 0,9% roztoku soli s prídavkom 0,2 μg/ml kyseliny askorbovej). Infúzia bola podávaná rýchlosťou 1 μΐ/min počas 5 minút a potom bola infúzna kanila pomaly vytiahnutá. Infúzne súradnice boli nasledujúce 4,2 mm posteriorne vzhľadom k bregmatu, 1,0 mm laterálne od stredovej čiary a 7,4 mm ventrálne vzhľadom k tvrdej blane mozgovej.

Implantácia kapsulí

Kapsule boli implantované 4 mesiace po ich lézii (2,75 mesiaca po poslednej injekcii apomorfínu). Krysy boli anestézované tak, ako bolo vyššie opísané a na hlave im bol urobený sagitálny rez. Potom im bol do lebky navŕtaný otvor, do ktorého bola umiestnená polymérna kapsula. Krysám boli kapsule implantované pomocou 18-dielneho teflónového katétru upevneného ku stereotaxickému rámu. Kanyla bola potom uzavretá tesniacim krúžkom z nehrdzavejúcej ocele, celá sústava bola umiestnená do mozgu. Tesniaci krúžok bol uvolnený vo chvíli, kedy bola vytiahnutá vonkajšia kanyla a tak sa kapsula samovoľne dostala do striata hostiteľa. Stereotaxické súradnice na implantáciu boli nasledujúce: 0,5 mm anteriorne vzhľadom k bregme, 3,8 mm laterálne od šípového stehu a 7,5 mm pod povrchom kortexu. Kontrolné krysy, ktorým neboli implantované kapsule, boli kvôli kontrole operované rovnakým spôsobom (tzn. boli anestezované, bol im uskutočnený rez na hlave, prevŕtaná lebka a prepichnutá tvrdá blana mozgová).

Biochemická analýza

Potom, ako boli dokončené testy chovania, boli krysy, ktorým boli implantované kapsule PC12, PCI2A (alebo žiadne kapsule) a taktiež polovica krýs s prázdnymi kapsulami, anestezované v komore s kysličníkom uhličitým a potom rýchle dekapitované. Ich mozgy boli vybraté z lebiek, kapsule odstránené, obe striata rozrezané na malé kúsky, umiestnené do plastikových mikroskúmaviek a zmrazené v kvapalnom dusíku. Potom, ako boli kapsule vybraté z mozgov krýs, boli na približne 30 minút umiestnené do 1 ml HBSS-fosfátového pufru.

Po inkubácii v tomto roztoku HEPES-HBSS. Podľa príkladu prítomných katecholamínov. Po boli kapsule prenesené do 1 ml 4 bola uskutočnená analýza stanovení katecholamínov boli kapsule prevedené do 4% paraformaldehydu a postúpené ďalej na morfologickú analýzu.

Obrázok 8 opisuje uvolňovanie dopamínu a L-dopa v priebehu 30 minút. Na grafe sú znázornené hodnoty na jednotlivé kapsule, z ktorých každá má pridelené identifikačné číslo. Ako je vidieť z obrázku 8, produkcia L-dopa a dopamínu 90 dní po implantácii sa veľmi líšila od produkcie pred implantáciou.

Príklad 10: Opuzdrené adrenálne chromafinné bunky vystavené reštriktívnym podmienkam in vivo v ľudskom subarachnoidálnom priestore

Podľa príkladu 4 boli pripravené hovädzie adrenálne chromafinné bunky. Agregáty chromafinných buniek boli imobilizované v 1,5% alginátovej matrici zosieťovanej pomocou CaCl₂ a potom boli opuzdrené do dvojplášťových imunoizolačných PAN/PVC dutých vláken typu 4 (vnútorný priemer 770 μιη, stena 70 μπι, MWCO 60 až 100 kDa viď WO 92/19195.

Opuzdrené bunky boli implantované do subarachnoidálneho priestoru dvoch pacientov v terminálnej fáze rakoviny, ktorých bolesti boli častejšie tlmené narkotikami a u ktorých sa neprejavuje žiadna aktívna infekcia alebo nádor a meningeálnej oblasti. Pacienti bolí informovaní a súhlasili s pokusom, ktorý bol povolený Etickým výborom Lekárskej fakulty Univerzity v Lausanne vo Švajčiarsku.

Na anestézu pokožky, okostice a ďalších hlbšie uložených tkanív až k ligamentu flávu, bola použitá lokálna infiltrácia 1,0% lidokainu. Bol uskutočnený 3 až 5 cm dlhý rez na pokožke v parasagitálnej rovine 1 až 2 cm naľavo alebo napravo od stredovej čiary, ktorý pokračoval smerom k lumbodorsálnemu povrazcu. Pomocou tradičných kostných referenčných bodov, ako sú napríklad krysta iliaca alebo bedrové tŕňové výbežky, ako aj s pomocou fluoroskopického zavedenia, bola do subarachnoidálneho priestoru medzi L-4 a L-3 šikmo paramediálne zavedená 18-dielna Touhyho ihla. Ihla bola smerovaná tak, že do subarachnoidálneho priestoru vstúpila pod malým, dohora nasmerovaným uhlom, ktorý nebol väčší ako 30 až °C, vzhľadom na miechu ako v sagitálnej, tak aj v transverzálnej rovine.

Potom bol do stredu ihly vložený zavádzači drôt, ktorý bol potom ponorený tak, aby presahoval 4 až 5 cm do subarachnoidálneho priestoru (merané predtým). Nakoniec bola Touhyho ihla vytiahnutá a drôt uvoľnený v subarachnoidálnom priestore.

Francúzsky dilatátor 7 bol nasadený na zavádzači drôt, ktorý bol použitý na nasmerovanie dilatátora pri jeho jemnom, ale rozhodnom pretláčaní cez fascium, paraspinálny sval a ligamentum flavum až do subarachnoidálneho priestoru.

Potom, ako bol zavádzači drôt predilatovaný (overdilated) Francúzskym dilatátorom 7, bol na zavádzači drôt nasadený Francúzsky dilatátor 6 zostavený spolu s kanylou. Francúzsky dilatátor 6 bol spolu s kanylou pomaly pretlačovaný do subarachnoidálneho priestoru pokiaľ nedosiahol začiatok kanyly 7 cm do subarachnoidálneho priestoru.

Keď bolo prekontrolované správne umiestnenie kanyly, bol odstránený najprv vodiaci drôt a potom aj Francúzsky dilatátor

6.

Opuzdrené adrenálne chromafinné bunky boli dodané v sterilnom kontajneri s dvojitou obálkou, naložené v transportnom médiu a úplne zostavené vrátane tubulárnych silikónových očiek. Do kanyly bola opatrne zavedená membránová časť. Kapsule boli tlačené dopredu, dokiaľ koniec membrány nedosiahol bod 2 až 10 mm od kraniálneho konca kanyly v subarachnoidálnom priestore. Potom, ako boli kapsule umiestnené pomocou výtlačného mechanizmu, bola kanyla aj tento výtlačný mechanizmus úplne vybratý. Výsledné umiestnenie kapsule bolo také, že 5 cm dlhá membránová časť bola ponorená do mozgomiechového moku v subarachnoidálnompriestore ventrálne vzhľadom ku cauda eguina.

Po 84-dennej implantačnej perióde u pacienta 1 a 55-dennej implantácii u pacienta 2 boli kapsule explantované. Potom bola porovnaná úroveň sekrécie katecholamínov (norepinefrínu NE a epinefrínu EPI) po expozícii reštriktívnym podmienkam in vivo a pred ňou (viď tabuľka 3). Koncentrácie katecholamínov boli merané tak, ako bolo opísané v príklade 4. Údaje v tabuľke sú vyjadrené v pikomóloch na jednu kapsulu v priebehu 30 minút pre bazálne koncentrácie a v pikomóloch na kapsulu v priebehu 15 minút pre stimuláciu nikotínom (N-S). Produkcia katecholamínov bola po expozícii reštriktívnym podmienkam výrazne odlišná od stavu pred implantáciou.

Tabuľka 3: Sekrécia katecholamínov v kapsuliach implantované kapsule NE E vybraté kapsule NE E

Pacient 1: Implantácia na 84 dní

Bazálna

N-S

84 37

2932 2673 6366

3886

Pacient 2: Implantácia na 55 dní

Bazálna

N-S

120 4,1

5027 5063 10,6

69,3

Príklad 11: Aklimatizované a opakovane opuzdrené bunky BHK-hNGF vystavené reštriktívnym podmienkam in vitro

Opuzdrené BHK-hNGF bunky boli pripravené podľa príkladu 1, implantované do laterálnych ventrikúl v mozgu krysy a aklimatizované na reštriktívne podmienky in vivo 14-mesačnou expozíciou. Po 14 mesiacoch boli kapsule vybraté, aklimatizo48 vane bunky z dvoch kapsuli odobraté a namnožené pasážovaním v 10% FBS-DMEM médiu. Na experiment bola zvolená bunková línia, označená ako BHK-hNGF kloň 23. Tieto bunky boli rozdelené na alikvoty a jednotlivé skúmavky boli zmrazené v kvapalnom dusíku. Kontrolné bunky BHK-hNGF kloň 23, ktoré neboli aklimatizované pri kultivácii in vivo, boli pestované in vitro v 10% FBS-DMEM médiu (bunková banka BHK-hNGF kloň 23).

V nasledujúcom pokuse bolo testovaných týchto šesť skupín buniek a kapsuli:

Skupina 1: Bunky BHK-hNGF 23, (bunky aklimatizované, vybraté z in vivo kultivovaných kapsuli), opätovne opuzdrené v matrici Vitrogen^R, kapsule potom implantované do laterálnych ventrikúl do mozgu pokusných krýs.

Skupina 2: Bunky BHK-hNGF 23, (aklimatizované bunky), ktoré boli pred opuzdrením resuspendované v 10% FBS DMEM bez použitia matrice, kapsule boli potom implantované do laterálnych ventrikúl do mozgu pokusných krýs.

Skupina 3: Kontrolné bunky BHK-hNGF 23, (bunky z bunkovej banky, ktoré neboli nikdy predtým implantované), opuzdrené v matrici Vitrogen^R, kapsule potom implantované do laterálnych ventrikúl mozgov pokusných krýs.

Skupina 4: Kontrolné bunky BHK-hNGF 23, (bunky z bunkovej banky, ktoré neboli nikdy predtým implantované), pred opuzdrením boli resuspendované v 10% FBS DMEM bez použitia matrice, kapsule boli potom implantované do laterálnych ventrikúl do mozgu pokusných krýs.

Skupina 5: Kontrolné bunky BHK, (bunky z bunkovej banky, ktoré neboli predtým implantované), opuzdrené v matrici Vitrogen^R, kapsule potom implantované do laterálnych ventrikúl mozgov pokusných krýs.

Skupina 6: Kontrolné bunky BHK, (bunky z bunkovej banky, ktoré neboli predtým implantované), pred opuzdrením boli resuspendované v 10% FBS DMEM bez použitia matrice, kapsule boli potom implantované do laterálnych ventrikúl do mozgu pokusných krýs.

Kapsule

Aklimatizované bunky BHK-hNGF klonu 23 boli opuzdrené podľa príkladu 1. Väčšina kapsulí bola tvorená vláknami HF120794-6 a mala konečnú dĺžku 7 mm. Niektoré kontrolné kapsule boli z vláken 101-97-9, ktoré sú zrovnateľné s vláknami XP11 použitými v príkladoch 7 až 9.

Jednoplášťové duté vlákna HF120794-6 majú v priemere hrúbku steny 86,4 gm, vnútorný priemer 453,2 gm, vonkajší priemer 625,1 gm, hydraulickú permeabilitu (HP) 43 mm/min/m^a/ mmHg a podľa dextranového difúzneho testu prepúšťajú molekuly menšie (MWCO) ako je 187 kDa.

Jednoplášťové vlákna 101-97-9 majú v priemere hrúbku steny 59 gm, vnútorný priemer 541 gm, vonkajší priemer 625,1 gm, pevnosť v ťahu 31 g, hydraulickú permeabilitu 62 mm/min/ m²/mmHg a podľa dextranového difúzneho testu prepúšťajú molekuly menšie ako je 88 kDa.

Opuzdrenie

Bunky opuzdrované v matrici (skupina 1,3 a 5), boli resuspendované vo Vitrogene“, ktorý bol zriedený 1 : 1 médiom PC-l. Hustota buniek bola upravená na lxlO⁷ buniek/ml. Kapsule boli kultivované v médiu PC-l 5 až 7 dní pred implantáciou.

Bunky zo skupín 2,4 a 6 opuzdrované bez matrice, boli resuspendované v 10% médiu FBS-DMEM a kultivované v skúmavkách na trepačke v čase predchádzajúcom implantácii.

Implantácia kapsúlí

Náhodne zvolené kapsule s bunkami BHK-hNGF aklimatizovanými už predchádzajúcou implantáciou na podmienky in vi vo a kontrolné kapsule boli bilaterálne implantované do laterálnych ventrikúl krýs. Paralelné vzorky neaklimatizovaných buniek BHK-hNGF poslúžili ako kontrola.

Biochemická analýza

Kapsule zo skupín 1 až uvolňovaného NGF podľa príkladu obsahujúcich aklimatizované a boli testované na úroveň 1. Produkcia NGF v kapsuliach neaklimatizované bunky bola meraná pred implantáciou aj po nej počas 1 mesiaca. Úroveň produkcie NGF u kapsulí zo skupín 1 až 4 je znázornená na obrázku 11. Údaje pre NGF neprodukujúce kontrolné bunky nie sú uvedené. Po analýze produkcie NGF boli bunky fixované v 4% paraformaldehyde a postúpené na histologickú a morfologickú analýzu.

Príklad 12: Opuzdrené bunky PCI2 vystavené podmienkam in vivo v krysách s jednostrannou léziou v substantia nigra.

Bunkové kultúry a spôsob opuzdrenia

Bunky PC12 boli kultivované a potom opuzdrené tak, ako to bolo opísané v príklade 9.

Nedostatok dopamínu v substantia nigra

6-hydroxydopamín (6-OHDA) je selektívne toxický pre dopaminergné neuróny v substantia nigra. U krýs, pri ktorých bola podaním 6-OHDA poškodená substantia nigra, dochádza k vývoju príznakov podobných Parkinsonovej chorobe, spojených s nízkymi koncentráciami dopamínu. Krysy boli anestezované podľa príkladu 9 a umiestnené do Kopfovho stereotaxického prístroja.

Celkovo 10 μg 6-OHDA (40 μΐ roztoku, v ktorom bol 6-OHDA rozpustený v koncentrácii 2,5 μg/ml v 0,9% solnom roztoku s obsahom 0,2 μg/μl kyseliny askorbovej) bolo unilaterálne zavedených infúziou. Roztok bolo možné volne difundovať počas 5 minút a potom bola infúzna kanyla pomaly vytiahnutá. Infúzne súradnice boli nasledujúce: 3,2 mm posteriorne od bregmatu, 2,7 mm laterálne od stredovej čiary a 8,0 mm ventrálne od tvrdej blany mozgovej, s incíznou značkou nastavenou na +5,0 mm.

Implantácia kapsulí

Kapsule boli implantované bilaterálne dva až štyry týždne potom, ako bola krysám jadnostranne poškodená substantia nigra. Krysy boli anestezované a kapsule implantované s použitím tých istých procedúr a stereotaxických súradníc, ako v príklade 9.

Biochemická analýza

Kapsule boli vybraté 3, 10, 28 a 60 deň po implantácii. Krysy boli anestezované v C0₂ komore a rýchlo dekapitované. Mozgy boli z lebiek vybraté a potom boli z poškodených a nepoškodených (kontrolných) strán mozgu vybraté kapsule. Ako striatum, tak aj nuclei accumbens boli odobraté na analýzu katecholamínov, umiestnené do plastikových mikroskúmaviek (Eppendorf) a rýchlo zmrazené v tekutom dusíku. Kapsule boli inkubované približne 30 minút v 1 ml HBSS-fosfátového pufru. Potom bol tento pufor odstránený a kapsule boli premiestnené do 1 ml HEPES-HBSS pufru. Analýza katecholamínov bola uskutočnená tak, ako bolo opísané v príklade 4. Po stanovení katecholamínov boli kapsule fixované v 4% paraformaldehyde a použité na morfologické štúdium.

Obrázok 9 (časť A) ukazuje priemerné množstvo uvoľneného L-dopa v priebehu 30 minút. Na obrázku sú údaje pre 8 kapsulí pred implantáciou (Pre-) a pre kapsule vybraté 5, 14, 28 alebo 60 dní po implantácii a to ako z poškodených (nízka koncentrácia dopamínu), tak aj z nepoškodených (kontrolných ) striát. Časť A ukazuje, že relatívne množstvo katecholamínov produkované bunkami PC12 sa mení v závislosti na čase. Kapsule odobraté ako z poškodenej, tak aj z nepoškodenej strany vykazujú vyššiu rýchlosť produkcie L-dopa po aklimatizácii in vivo medzi druhým až tretím týždňom.

Obrázok 9 (časť B) ukazuje pomer uvoľneného L-dopa a dopamínu pre kapsule opísané v časti A. Časť B ukazuje, že po aklimatizácii in vivo pri nízkej koncentrácii dopamínu produkujú opuzdrené bunky L-dopa v nižšom pomere k dopamínu ako bunky aklimatizované v kontrolných podmienkach. Pomer L-dopa k dopamínu sa pomerne stabilizoval po približne 14 dňoch kultivácie in vivo. Kapsule po aklimatizácii in vivo vybraté ako z poškodených, tak aj zo zdravých strán vykazovali vyššie pomery koncentrácií uvoľneného L-dopa k dopamínu v porovnaní s koncentráciami pred implantáciou.

Príklad 13: Porovnanie pred- a poimplantačných koncentrácií uvoľnených katecholamínov u opuzdrených buniek PC12 aklimatizovaných v mozgu primátov

Údaje o koncentráciách uvoľnených katecholamínov pochádzajúcich zo štúdií, v ktorých boli použité bunky PC12 opuzdrené do vláken ekvivalentných vláknam XP11 a aklimatizované v mozgu primátov (viď príklad 7), boli porovnané s koncentráciami katecholamínov uvolnených z identických kapsulí pred implantáciou. Opuzdrené bunky PC12 boli pred implantáciou testované a bol stanovený pomer medzi bazálnou koncentráciou uvolneného L-dopa a dopamínu. Údaje v tabuľke 4 reprezentujú produkciu katecholamínov pred implantáciou. Kapsule boli potom implantované do mozgov primátov, kde sa aklimatizovali na podmienky in vivo počas 1; 2,5; 3; 4; 5 a 6 mesiacov. Po tomto čase boli kapsule vybraté a boli stanovené koncentrácie bazálne uvolneného L-dopa a dopamínu (obrázok 10).

Porovnanie súhrnných údajov z obrázku 10 a tabuľky 4 ukazuje, že produkcia pred implantáciou a produkcia po implantácii sa líši významným spôsobom. Predimplantačné dáta v prvom riadku tabuľky 4 korešpondujú s údajmi pre explantované kapsule na obrázku 11, ktoré boli merané počas jednomesačného intervalu. Podobne aj dáta v ďalších riadkoch tabuľky 4 korešpondujú s ďalšími mesačnými údajmi vynesenými na grafe na obrázku 11.

Tabuľka 4: Hodnoty udávajúce sekréciu katecholamínov z kapsulí s bunkami PCI2 pred ich implantáciou do mozgu primátov, kapsule sú z materiálu ekvivalentného vláknam XP-11 (S.D.-štandardná odchýlka)

Čas pred implantáciou odpovedajúci času in vivo	Bazálny L-dopa	Bazálny dopamín
	pM/15min/ml	pM/15min/ml
	priemer (S.D.)	priemer (S.D.)
1	2,02 (0,08)	2,95 (4,1)
(n=6)
2,5	0,78 (0,16)	nezistené
(n=6)
3	0,79 (0,25)	nezistené
(n=6)
4	10,6 (2,33)	2,39 (0,82)
(n=6)
5	1,06 (0,01)	4,26 (1,62)
(n=6)
6	3,09 (1,84)	21,3 (21,7)
(n=6)
Príklad 14: Produkcia	bunkových línií BHK	produkujúcich hCNTF

(BHK-CNTF)

Ľudský gén pre CNTF (hCNTF) bol vložený do expresívneho vektora pNUT založeného na dihydrofolát-reduktáze (DHFR).

Tento vektor obsahuje celú polylinkeru. Transkripcia cDNA, DHFR, je riadená promótorom SV40. koncom génu vírusu hepatitídy B sekvenciu pUC18 vrátane kódujúcej zmutovanú formu 3· koniec je sfúzovaný s 3' (HBV 3'), čím je zaistený dostatočný polyadenylačný a maturačný signál.

Gén hCNTF bol získaný polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) amplifikáciou z ľudskej DNA. Použité primery obsahovali cieľové miesto pre reštrikčnú endonukleázu EcoRI na mieste iniciačného kodónu prirodzeného hCNTF. Gén hCNTF bol na svojom 5' konci sfúzovaný so 150 bp dlhou sekvenciou pochádzajúcou z génu myšieho imunoglobulínu (Ig). Miesto pre EcoRI bolo použité tak, aby N-koncová časť proteínu hCNTF korešpondovala s prvými 18 aminokyselinami génu Ig. Na 3' koniec génu hCNTF bol klonovaný 325 bp dlhý Aval fragment z génu pre ľudský rastový hormón (hGH) obsahujúci polyadenylačnú sekvenciu a ďalšie sekvencie dôležité pre maturáciu 3' konca mRNA. Tento fragment bol vložený do miesta Spel v polylinkeri Bluescript, čím na 5' resp. 3' koncoch vznikli reštrikčné miesta BamHI resp. Nôti. Na 3' konci hCNTF bolo pripravené miesto BglII, ktoré bolo použité na ligáciu do miesta BamHI v polylinkeri.

Tento konštrukt bol vložený do pozície +6 vzhľadom k myšiemu rpomótoru MT-I a celý 3050 bp dlhý fragment MT/Ig/hCNTF/hGH KpnI-NotI bol vložený do KpnI-NotI miesta vektoru pNUT. Nakoniec bol do miesta Nôti vektora naklonovaný gén HSV-TK, čím bol oddelený gén DHFR od plazmidu pUC-18. Tento konečný konštrukt bol pomenovaný RP3224E2.

DNA vektora kmeni E. coli Qiagen-Plamid-Kit

RP3224E2 bola amplifikovaná v štandardnom HB101 a purifikovaná pomocou súpravy (Kontron). DNA bola transfekovaná pomocou bežnej kalcium-fosfátovej transfekčnej procedúry. Transfekované bunky boli selektované pomocou rastúcich koncentrácií metotrexátu. Selekcia bola uskutočňovaná kontinuálnym prídavkom metotrexátu k bunkám kultivovaným na médiu PC-1. Médium PC-1 je ochudobnené médium obsahujúce ľudské rekombinantné proteíny.

Po selekcii metotrexátom (25 až 200 μΜ) boli bunky BHK (BHK-CNTF) kultivované in vitro bez selekčných látok počas niekoľkých mesiacov. V tomto čase nedošlo k poklesu expresie CNTF, čo bolo dokázané v Northern blote, biologickým testovaním alebo ELISOU. Úroveň sekrécie CNTF bola podľa výsledkov v ELISE alebo biologických testov okolo 1,0 ng/10³ buniek/hodinu.

Príklad 15: BHK-CNTF bunky aklimatizované v ľudskom lumbálnom subarachnoidálnom priestore a potom reimplantované do ľudských pacientov a použité na liečbu amyotrofnej laterálnej sklerózy

Opuzdrenie buniek

BHK bunky sekretujúce CNTF (BHK-CNTF) podľa príkladu 14 boli opuzdrené tak, ako bolo opísané v príklade 1, s výnimkou toho, že bolo použité dlhšie očko, vhodné na implantáciu do ľudského lumbálneho subarachnoidálneho priestoru. Kapsule boli naplnené tak, aby výsledná koncentrácia činila 2x10® transfekovaných buniek na μΐ kolagénového roztoku (Zyderm). Sekrécia CNTF bola meraná tak, že bola každá jednotlivá kapsula ponorená do 2 ml čerstvého média PCI na čas 30 minút. Množstvo uvoľneného CNTF bolo potom stanovené R&D ELISA systémom z odobratého média. Zvolené boli také kapsule, ktoré intratekálne dodávali dávku 1 μΐ denne. Každému z pacientov bola implantovaná jedna kapsula.

In vivo aklimatizácia opuzdrených BHK-CNTF buniek v ľudskom lumbálnom subarachnoidálnom priestore.

Opuzdrené bunky BHK-CNTF boli implantované na jeden mesiac do lumbálneho subarachnoidálneho priestoru ľudským pacientom. Ďalšie kapsule boli aklimatizované in vivo počas šiestich mesiacov. Po jednom mesiaci vybraté kapsule boli testované na sekréciu CNTF podľa príkladu 12. Po stanovení CNTF boli kapsule fixované v 4% paraformaldehyde na morfologickú analýzu.

BHK-CNTF bunky aklimatizované in vivo boli vybraté z kapsulí, zhromaždené a okamžite umiestnené na kultivačné . médium PCI v reštriktívnych podmienkach nízkeho tlaku kyslíka a nízkej koncentrácie glukózy. Tieto podmienky boli zvolené • tak, aby sa čo najviac blížili podmienkam v subarachnoidálnom priestore pacientov. Paralelne boli kultivované bunky BHK-CNTF pri vonkajších podmienkach ako kontrola. Aklimatizované bunky môžu byť charakterizované a môžu byť adaptované na ďalšie reštriktívne podmienky.

V jednom rade experimentov sú in vivo aklimatizované bunky BHK-CNTF kultivované pri vonkajších alebo reštriktívnych podmienkách, potom sú opätovne opuzdrené (v podstate rovnakým spôsobom ako pri prvom opuzdrení) a implantované do hostiteľského organizmu.

V inom rade experimentov sú aklimatizované bunky implantované do ľudského hostiteľa najprv aklimatizované na in vitro reštriktívne podmienky v organizme primáta (okrem človeka).

Vhodnými subjektami na implantáciu sú pacienti s ALS, u ktorých sa prejavuje kombinácia deficiencií, ako u horných motorických neurónov, tak aj u dolných motorických neurónov na mnohých úrovniach, elektrofyziologickými chronickú denerváciu

Tieto nedostatky sú potvrdené štúdiami, ktoré ukazujú aktívnu a dvoch alebo troch končatín alebo bulbárnej muskulatúry, avšak neukazujú na žiadne neurologické poškodenie mimo volného motorického systému, žiadny dôkaz taktiež nepoukazuje na primárne ochorenie, ktoré by mohlo spôsobiť neurologické potiaže, najmä napríklad cervikálnu spondylolýzu alebo dyskráziu plazmatických buniek. Pacient je relatívne silný, môže chodiť bez cudzej pomoci a je v počiatočnom štádiu ochorenia. V čase začatia liečby má pacient vynútenú dychovú kapacitu (forced vital capacity) vyššiu ako 75% normálu.

Pacienti sú počas prvého týždňa každodenne sledovaní, od druhého do štvrtého týždňa sú sledovaní jeden raz za týždeň a potom jeden raz mesačne. Medzi inými sú sledované nežiadúce účinky, ako je horúčka, stomatitída, kašeľ a náchylnosť na herpes vírus. Nasledujúce testy sú uskutočňované jeden raz mesačne na vyhodnotenie účinnosti liečby: Tuftová kvantitatívna neurologická skúška (TQNE-Tufts Quantitative Neurological Exam), test koordinácie očných búlv, respiračné funkcie kapacita vynúteného dýchania, inspiračný prietok vzduchu. Odbery krvi sa uskutočňujú jedenkrát týždenne v priebehu prvých štyroch týždňov a potom jedenkrát mesačne. V krvi sa stanovuje množstvo plazmatického CNTF, potenciálne aj protilátky proti CNTF, C-reaktívny proteín, fibrinogén.

Chirurgický postup

Chirurgický postup implantácie opuzdrených buniek BHK-CNTF je nasledujúci. Najskôr je nutné prejednať i.v. prístup. Potom sú preventívne podané antibiotiká (cefazolín sodný, 1 gram i.v.), pacient je uložený na operačný stôl, vhodná je genu-pektorálna pozícia alebo laterálny dekubit s dopredu vyhnutou oblasťou krížovej chrbtice. Operačné miesto je vysterilizované a prikryté tak, aby zostali odkryté dorzálne oblasti chrbtice od S-l do L-l a bolo umožnené sledovanie chrbtice pomocou fluoroskopu počas operácie. Na dosiahnutie lokálnej anestézie bola použitá infiltrácia 1,0% lidokaínom. Tým bola anestezovaná pokožka, ako aj periosteum a ďalšie hlbšie uložené tkanivá vrátane ligamenta flava.

V parasagitálnej rovine 1 až 2 cm naľavo či napravo od stredovej čiary bol vedený pokožkou 3 až 5 cm dlhý rez, ktorý pokračoval dolu k lumbodorzálnemu povrazcu. Na zástavu krvácania bol použitý elektrokauter. Touhyho ihla s 18 dielikmi bola s pomocou tradičných kostných orientačných bodov vrátane krysta iliaca a lumbálneho tŕňového výbežku, ako aj s pomocou fluoroskopického navádzania zavedená do subarachnoidálneho priestoru medzi L-3 a L-4 šikmým paramediálnym spôsobom. Ihla je vedená tak, že vstúpi do priestoru pod plytkým nahor smerujúcim uhlom, ktorý nie je väčší ako 30 až 35 ° vzhľadom na miechu ako v sagitálnej, tak aj v transverzálnej rovine. Vhodná pozícia ihly je určená nasatím niekoľkých mililitrov mozgomiechového moku (CSF), v ktorom sú stanovené predimplantačné koncentrácie katecholamínov, enkefalínu, glukózy, ľudského CNTF, proteínov a počty buniek.

Hrdlo Touhyho ihly je skontrolované, aby sa potvrdilo, že otvor na konci je orientovaný nahor (umiestnenie otvoru je vyznačené indexujúcim zárezom pre uzáver pri hrdle ihly). Potom je do vnútra ihly zavedený vodiaci drôt tak, aby ústie ihly presahovalo do subarachnoidálneho priestoru o 4 až 5 cm (zistené meraním ešte pred operáciou). Počas zavádzania drôtu je nutné dbať na zvýšenú opatrnosť, aby drôt nenarazil na žiadny odpor ani mimo ihlu a aby si pacient nesťažoval na žiadne významné neurogénne symptómy, čo by mohlo oboje znamenať, že vodiaci drôt je vedený zlým smerom a môže dôjsť k poškodeniu nervového koreňa alebo miechy.

Potom, ako je vodiaci drôt zavedený na vhodné miesto v subarachnoidálnom priestore, je Touhyho ihla separátne vytiahnutá a oddelená od vodiaceho drôtu. Správna pozícia vodiaceho drôtu v stredovej rovine miechového kanálu a anteriórne od predpokladanej pozície cauda eguina (zväzky koreňov bedrových, krížových a kostrčových nervov), bez slučky a nevysvetliteľných záhybov je prekontrolovaná fluoroskopicky. Po vybratí Touhyho ihly by malo byť možné vodiacim drôtom volne pohybovať von a dovnútra subarachnoidálneho priestoru len so slabým odporom, ktorý je spôsobený drsným povrchom drôtu pri jeho pohybe hustým a vláknitým ligamentom flavom.

Francúzsky dilatátor 7 sa nasadí na zavádzači drôt, ktorý sa použije na nasmerovanie dilatátora pri jeho jemnom, ale rozhodnom pretláčaní cez fasciu, paraspinálny sval a ligamentum flavum až do subarachnoidálneho priestoru. Pretláčanie dilatátora 7 sa zastaví a dilatátor sa zoberie z vodiaceho drôtu hneď, ako sa stratí odpor po prechode dilatátora ligamentom flavom. Dôvodom je snaha vyhnúť sa ďalšiemu postupu a manipulácii s týmto pomerne tuhým dilatátorom v subarachnoidálnom priestore.

Potom, ako bol zavádzači drôt predilatovaný-overdilated” Francúzskym dilatátorom 7, bol na zavádzači drôt nasadený Francúzsky dilatátor 6 s kanylou. Francúzsky dilatátor 6 bol spolu s kanylou pomaly pretlačovaný do subarachnoidálneho priestoru dokedy nedosiahol otvorený koniec kanyly 7 cm do subarachnoidálneho priestoru. Tak ako Francúzsky dilatátor 7, aj dilatátor 6 a kanyla sú smerované vodiacim drôtom vo svojom vnútri. Správna pozícia v subarachnoidálnom priestore je overená predchádzajúcim rozmeraním celého zariadenia a v hrubých rysoch potvrdená fluoroskopicky. Veľkú pozornosť je nutné venovať manipulácii s dilatátormi a s kanylou v subarachnoidálnom priestore, aby sa zabránilo akejkoľvek chybe v nasmerovaní a možným neurologickým poraneniam pacienta.

Keď bolo prekontrolované správne umiestnenie kanyly, bol odstránený najprv vodiaci drôt a potom aj Francúzsky dilatátor

6. V závislosti na polohe pacienta na operačnom stole môže byť výron CSF z kanyly prekvapivo veľký, čo si vyžiada buď uzavretie kanyly alebo veľmi rýchle umiestnenie kapsulí, aby sa zabránilo zbytočným stratám mozgomiechového moku. Opuzdrené aklimatizované bunky BHK-CNTF sú dodávané v sterilnom kontajneri s dvojitou obálkou, naložené v transportnom médiu a úplne zostavené vrátane tubulárnych silikónových očiek. Pred implantáciou cez kanylu môžu byť kapsule umiestnené do misky inzerčného kitu, kde môžu byť uložené v transportnom médiu a v takej polohe, ktorá umožní ich prehliadku k určeniu poškodení alebo významných defektov.

Časť kapsule s očkom sa vloží do vtlačovacieho zariadenia z nerezovej ocele tak, že sa drôtom o malom priemere zachytí membránová časť. Potom sa do kanyly opatrne zavedie membránová časť. Kapsula sa tlačí dopredu, dokiaľ koniec membrány nedosiahne bod 2 až 10 mm od kraniálneho konca kanyly v subarachnoidálnom priestore (opäť dopredu rozmerané). Tento postup zaisťuje, že membránová časť kapsule je chránená kanylou po celý čas svojho transportu na určené miesto.

Potom, ako sa kapsula umiestni pomocou výtlačného mechanizmu na správne miesto v subarachnoidálnom priestore, použije sa výtlačný mechanizmus na pridržovanie kapsule na tomto mieste subarachnoidálneho priestoru, zatiaľčo je kanyla pomaly úplne vytiahnutá. Potom sa vytiahnutím drôtika zo silikónového očka na kapsuli uvolní aj výtlačný mechanizmus. Použitím tohto spôsobu je dosiahnuté správne umiestnenie kapsule, ktorej membránová časť sa teraz nachádza úplne v mozgomiechovom moku, ktorý vypĺňa subarachnoidálny priestor ventrálne vzhladom ku cauda eguina. Kapsula môže byť na svojom kaudálnom konci zakotvená na svojom mieste pomocou zhruba 1 až 2 cm z dĺžky silikónového očka, ktoré prechádza subarachnoidálnym priestorom. Toto a cez durum, ligamentum flavum pokračuje von z tela pacienta. Z lumbodorzálnej fascie je tak do volného priestoru vynorené zhruba 10 až 12 cm silikónovej hadičky, ktorá je použitá pri vybratí kapsule z tela pacienta.

očko potom pokračuje ďalej a paraspinálne svalstvo

Vytekanie CSF je minimalizované injekciou fibrínového lepidla (Tissel^R) do rany vyplnenej silikónovým očkom v paraspinálnom svalstve a potom tiež tesným uzavretím otvoru v superficiálnom zväzku kruhovým stiahnutím švom (purse-string suture). Volný koniec silikónového očka je potom zakotvený pomocou neabsorbovatelného švu a úplne zakrytý dvakrát zopnutou pokožkou a subkutánnym tkanivom.

Pacient je potom preložený na oddelenie rekonvalescencie po neurochirurgických operáciách. Tu je prísne dodržovaný kľud na lôžku a odpočinok počas 24 hodín po operácii. Rovnako preventívne podávanie antibiotík pokračuje 24 hodín po chirurgickom zákroku.

Claims (24)

1. Spôsob implantácie buniek do hostiteľského organizmu, vyznačujúci sa tým, že:

a) bunky sú opuzdrené do biokompatibilnej kapsule

b) bunky sú vystavené pôsobeniu jednej alebo viacerých reštriktívnych podmienok na čas dostatočný na to, aby sa ako reakcia na pôsobenie tejto reštriktívnej podmienky alebo podmienok dostavila požadovaná bunková vlastnosť a

c) implantáciou opuzdrených buniek do vhodného implantačného miesta v hostiteľskom organizme, pričom požadovaná bunková vlastnosť je v podstatnej miere zachovaná aj po implantácii.

2. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že opuzdrené bunky sú vystavené pôsobeniu reštriktívnej podmienky in vitro.

3. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že opuzdrené bunky sú vystavené pôsobeniu reštriktívnej podmienky in vivo implantáciou do vhodného implantačného miesta do recipientného organizmu.

4. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že bunky sú vzhľadom na hostiteľský organizmus xenogénne a kapsula je imunoizolačná.

5. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že aspoň jedna z reštriktívnych podmienok je koncentrácia glukózy v rozmedzí medzi približne 40 mg na 100 ml a približne 70 mg na 100 ml.

6. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že aspoň jedna z reštriktívnych podmienok je tlak kyslíka v rozmedzí medzi približne 40 mmHg a približne 65 mmHg.

7. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že aspoň jedna z reštriktívnych podmienok je menšia koncentrácia dopamínu ako je fyziologická koncentrácia dopamínu v mozgomiechovom moku alebo v mozgovom parenchýme.

8. Spôsob podľa nároku 3,vyznačujúci sa tým, že bunky sú zvolené zo skupiny pozostávajúcej z adrenálnych chromafinných buniek, obličkových buniek mláďat škrečkov a buniek PC12.

9. Spôsob podľa nároku 8,vyznačujúci sa tým, že bunky sú bunky PCI2 a sú v recipientnom organizme implantované na čas 6 mesiacov alebo dlhšie.

10. Spôsob podľa nároku 8,vyznačujúci sa tým, že bunky sú adrenálne chromafinné bunky a sú v recipientnom organizme implantované na čas 4 mesiacov alebo dlhšie.

11. Spôsob podľa nároku 8,vyznačujúci sa tým, že bunky sú bunky PC12 a sú v recipientnom organizme implantované na čas 3 týždňov alebo dlhšie.

12. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že bunky produkujú biologicky aktívne molekuly zo skupiny tvorenej neurotransmiterami, analgetikami a rastovými faktormi.

13. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že biologicky aktívnou molekulou je aspoň jeden katecholamín.

14. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že kapsula je implantovaná na miesto zvolené zo skupiny tvorenej mozgomiechovým mokom a mozgovým parenchýmom.

15. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že hostiteľským organizmom je človek.

16. Bunky, ktoré vykazujú požadovanú bunkovú vlastnosť v dôsledku pôsobenia reštriktívnej podmienky, vyznačujúce sa tým, že boli vyprodukované:

a) opuzdrením buniek do biokompatibilnej kapsule a

b) implantáciou opuzdrených buniek do implantačného miesta recipienta-primáta, pričom bunky sú vzhladom na recipientný organizmus xenogénne, a pričom implantačná perióda trvá aspoň 6 mesiacov, aby sa vytvorila požadovaná bunková vlastnosť ako odpoveď na reštriktívne podmienky v mieste implantácie.

17. Bunky podľa nároku 16,vyznačujúce sa tým, že sú zvolené zo skupiny tvorenej adrenálnymi chromafinnými bunkami nepochádzajúcimi z primátov, obličkovými bunkami mláďat škrečkov a bunkami PC12.

18. Bunky podľa nároku 17,vyznačujúce sa tým, že bunky sú adrenálne chromafinné bunky nepochádzajúce z primátov.

19. Bunky podľa nároku 17,vyznačujúce sa tým, že sa jedná o bunky PC12.

20. Bunky podľa nárokov 18 alebo 19, vyznačujúce sa tým, že požadovanou bunkovou vlastnosťou je zmenená produkcia katecholamínov.

21. Bunky podľa nároku 20,vyznačujúce sa tým, že požadovanou bunkovou vlastnosťou je zvýšená produkcia katecholamínov.

22.

23.

24.

Bunky podlá nároku 16,vyznačujúce sa tým, že kapsula je implantovaná na miesto zvolené zo skupiny tvorenej mozgomiechovým mokom a mozgovým parenchýmom.

Bunky podľa nároku 16, vyznačujúce sa tým, že hostiteľským organizmom je človek.

Spôsob implantácie buniek do xenogénneho hostiteľského organizmu, vyznačujúci sa tým, že:

a) bunky sú kultivované pod jednou alebo viacerými reštriktívnymi podmienkami

b) bunky sú opuzdrené do biokompatibilnej membrány a takto opuzdrené bunky sú ďalej vystavené pôsobeniu jednej alebo viacerých reštriktívnych podmienok na čas dostatočný na dostavenie požadovanej bunkovej vlastnosti, ako odpovede na tieto reštriktívne podmienky a

c) opuzdrené bunky sú implantované do implantačného miesta v hostiteľskom organizme a požadovaná bunková vlastnosť je v podstatnej miere udržovaná aj po implantácii.