CZ299808B6

CZ299808B6 - Substituované 2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)izoindoliny a jejich použití za úcelem snížení hladin TNFalfa

Info

Publication number: CZ299808B6
Application number: CZ20001822A
Authority: CZ
Inventors: W. Muller@George; I. Stirling@David; Shen-Chu Chen@Roger; Man@Hon-wah
Original assignee: Celgene Corporation
Priority date: 1997-11-18
Filing date: 1998-11-17
Publication date: 2008-12-03
Also published as: AU752958B2; CY1106100T1; SI1308444T1; ES2192342T3; DE69811962T2; ATE233753T1; AU1413899A; FI20001192A; NO318737B1; DE69811962D1; ATE327228T1; NO20002529L; HK1054381A1; ES2262753T3; EP1062214B1; EP1710242A1; PT1308444E; CZ20001822A3; DK1308444T3; DE69834668D1

Abstract

2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)izoindoliny snižující u savcu hladiny zánetlivých cytokinu, jako napríklad TNF.alfa..

Description

Substituované 2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)izoindoIiny a jejich použití za účelem snížení hladin TNFa

Dosavadní stav techniky

Tumor nekrotizující faktor a, neboli TNFa, je cytokin, který je uvolňován primárně mononukleámími fagocyty jako odpověď na celou řadu imunostimulačních podnětů. Je to klíčový prozánětlivý cytokin v zánětlivé kaskádě, který ovlivňuje tvorbu a/nebo uvolňování dalších cytokinů a jiných látek. Po podání živočichům nebo člověku způsobuje zánět, horečku, kardiovaskulární účinky, krvácení, koagulaci krve a odpověď akutní fáze podobně jako je tomu u akutních infekcí a šokových stavů. Nadměrná nebo neregulovaná tvorba TNFa hraje proto roli v celé řadě one-. mocnění. Ty zahrnují endotoxémii a/nebo syndrom toxického šoku (Tracey et al. Nátuře 330, 662-664, 1987 a Hinshaw etal., Circ. Shock30, 279-292, 1990), kachexii (Dezube etal.,

Lancet, 335 (8690), 662, 1990), dále syndrom ARDS (Adult Respirátory Distress Syndrom), kde byly v plicních aspirátech pacientů s tímto syndromem nalezeny koncentrace TNFa přesahující 12 000 pg/ml (Millar et al., Lancet 2 (8665), 712-714, 1989). Systémová infuze rekombinantního TNFa měla také za následek změny typické pro ARDS (Ferrai-Baliviera etal., Arch. Surg. 124(12, 1400-1405, 1989).

TNFa hraje pravděpodobně roli v onemocněních s kostní resorpcí, včetně artrózy. Dojde-li k aktivaci leukocytů, vede tato aktivace ke kostní resorpcí, na které se pravděpodobně TNFa spolupodílí (Bertolini etal., Nátuře 319, 516-518, 1986 a Johnson et al., Endocrinology 124 (3), 1424-1427, 1989). U TNFa bylo také prokázáno, že stimuluje kostní resorpcí a inhibuje kostní tvorbu in vitro a in vivo prostřednictvím stimulace a aktivace tvorby osteoklastů kombinované s inhibici funkce osteoblastů. Ačkoli TNFa může hrát roli v mnoha onemocněních s kostní resorpcí včetně artrózy, přičemž nejvýznamnějším pojítkem s onemocněním je asociace mezi tvorbou TNFa nádorem nebo hostitelskou tkání a hyperkalcémií sdruženou s malignitou (Calci. Tissue Int. (US) 46 (Suppl.), S3-10, 1990). V reakci štěpu proti hostiteli byly zvýšené hladiny TNFa spojeny s hlavními komplikacemi po akutní alůgenní transplantaci kostní dřeně (Holler et al, Blood, 75 (4), 1011-1016,1990).

Mozková malárie je letální hypěrakutní neurologický syndrom sdružený s vysokými hladinami TNFa v krvi a nejtěžšími komplikacemi vyskytujícími se u pacientů s malárií. Hladiny TNFa v séru korelovaly přímo s tíží onemocnění a s prognózou pacientů s atakou akutní malárie (Grau et al., N. Engl. J. Med. 320 (24), í 586-1591, 1989).

O angiogenezí indukované makrofágy je známo, že je zprostředkovaná TNFa, Leibovich etal. (Nátuře, 329, 630-632, 1987) prokázali, že TNFa indukuje ve velmi nízkých dávkách za podmí40 nek in vivo tvorbu krevních kapilár v rohovce krys a vyvíjejících se kuřecích chorioalanto i nových membránách a naznačili, že by TNFa mohl být kandidátní látkou pro angiogenezí u zánětů, hojení ran a nádorového růstu. Produkce TNFa byla také spojena s nádorovými onemocněními, zejména s indukovanými nádory (Ching et al., Brit. J. Cancer, 1955, 72, 339-343, a Koch, Progress in Medicinal Chemistry, 22,166-242, 1985).

⁴⁵

TNFa hraje také roli v celé řadě chronických plicních zánětlivých onemocnění. Ukládání křemičitanových částic vede k silikóze, k onemocnění, které je charakterizováno progresivním respiračním selháním způsobeném ftbrotickou reakcí. Bylo prokázáno, že protilátky proti TNFa kompletně blokují fibrózu plic u myší indukovanou křemičitanovými částicemi (Pignet et al., Nátuře,

334, 245-247, 1990). Vysoká tvorba TNFa (v séru a v izolovaných makrofázích) byla prokázána na zvířecích modelech fíbrózy indukované křemičitanovými částicemi a azbestem (Bissonnette etal., Inflammation 13 (3), 329-339, 1989). Bylo také prokázáno, že alveolární makrofágy od pacientů s plicní sarkoidózou ve srovnání s makrofágy normálních dárců krve uvolňují spontánně masivní množství TNFa (Baughman et al., J. Lab. Clin. Med. 115(1), 36—42, 1990).

-1 CZ 299808 B6

TNFa hraje také roli v zánětlivé odpovědi, která následuje po reperfúzi. Jedná se o stav nazývaný reperfúzní poškození, který je hlavní příčinou poškození tkáně po přerušení průtoku krve (Vedder etaf, PNAS 87, 2643-2646, 1990). TNFa také narušuje vlastnosti endoteliálních buněk a má rozličné prokoagulační vlastnosti, jako jsou například zvýšení prokoagulační aktivity tkáňového faktoru a suprese antikoagulačně působícího proteinu C stejně tak jako zpětnovazebně snížení exprese trombomodulinu (Sherry et al., J. Cell Biol. 107, 1269-1277, 1988). TNFa má prozánětlivé vlastnosti, které spolu sjeho časnou tvorbou (během iniciální fáze zánětu) zněj tvoří pravděpodobný mediátor tkáňového poškození několika důležitých onemocnění zahrnujících, ale neomezující se pouze na, infarkt myokardu, mozkovou mrtvici a cirkulační šok. Specifický význam má exprese adhezních molekul na endoteliálních buňkách indukovaná TNFa. Mezi tyto adhezní molekuly patří například intercelulámí adhezní molekula (ICAM) nebo endoteliální leukocytární adhezní molekula (ELÁM) (Munro et af, Am. J. Path. 135 (1), 121-132, 1989).

Bylo prokázáno, že blokáda TNFa pomocí monoklonálních protilátek proti TNFa je prospěšná urevmatoidní artritidy (Elliot etal., Int. J. Pharmac. 1995 17(2), 141-145). Vysoké hladiny TNFa jsou sdružené sCrohnovou chorobou (von Dullemen etal., Gastroenterology, 1995, 109 (1), 129-135) a léčbou pomocí protilátek proti TNFa bylo dosaženo klinických úspěchů.

Navíc je nyní známo, že TNFa je silným aktivátorem retrovirové replikace, včetně aktivace HIV-1. (Duh etal., Proč. Nat. Acad. Sci. 86, 5974-5978, 1989; Poli etaf, Proč. Nat. Acad. Sci. 87, 782-785, 1990; Montoetaf, Blood 79, 2670, 1990; Clouse etal., J. Immunol. 142,431438, 1989; Poli etal., AIDS Res. Hum. Retrovirus, 191-197, 1992). AIDS vzniká v důsledku infekce T lymfocytů virem lidské imunodeficience (HIV). Byly identifikovány tři typy, neboli kmeny HIV, a to HIV-1, HIV-2 a HIV-3. V důsledku infekce HIV je narušena imunita zprostředkovaná T buňkami a u infikovaných jedinců dochází k manifestaci těžkých oportunních infekcí a/nebo neobvyklých neoplazmat. Vstup HIV do T lymfocytů vyžaduje aktivaci T lymfocytu. Jiné viry, jako například HIV-1, nebo HIV-2 infikují T lymfocyty po jejich aktivaci a exprese virových proteinů a/nebo replikace je zprostředkována touto aktivací T lymfocytů.

Dojde—li k infekci aktivovaného T lymfocytů virem HIV, musí být T lymfocyt pro expresi genů

HIV a/nebo jeho replikaci udržován v aktivovaném stavu. Cytokiny, zejména TNFa, hrají roli v expresi proteinů viru HIV a/nebo jeho replikaci zprostředkované aktivovanými T lymfocyty prostřednictvím udržování aktivace T lymfocytů. Proto interference s aktivitou cytokinů, jako je například prevence nebo inhibice tvorby cytokinů, zejména TNFa, u jedinců infikovaných virem HIV pomáhá omezit aktivaci T lymfocytů způsobených HIV infekcí.

Monocyty,. makrofágy a příbuzné buňky,.-jako jsou například Kupfferovy buňky, nebo buňky gliové, hrají také roli v udržení HIV infekce. Tyto buňky, podobně jako T lymfocyty, jsou cílem virové replikace a stupeň vírové replikace je závislý na aktivaci těchto buněk. (Rosenberg et al.,

The Immunopathogenesis of HIV Infection, Advances in ímmunology, 57 (1989). Bylo prokázáno, že cytokiny, jako je například TNFa, aktivují replikaci HIV v monocytech a/nebo makrofázích (Poli etal., Proč. Nati. Acad. Sci, 87, 782-784, 1990), Z tohoto důvodu prevence nebo inhibice tvorby nebo aktivity cytokinů pomáhá omezit progresi HIV infekce v T lymfocytech. V dalších studiích bylo zjištěno, že TNFa funguje jako společný faktor pro aktivaci HIV ím vitro a že mechanismus jeho účinkuje zprostředkován nukleárním regulačním proteinem vyskytujícím se vcytoplazmě buněk (Osborn etaf, PNAS 86, 2336-2340). Tento fakt naznačuje, že snížení syntézy TNFa může mít antivirový efekt na HIV infekci prostřednictvím snížení transkripce a tím i produkce viru.

Latentní replikace viru HIV v buněčných liniích T lymfocytů a makrofágů může být indukována cytokinem TNFa (Folks etaf, PNAS 86, 2365-2368, 1989). Molekulární mechanismus virus indukující aktivity spočívá pravděpodobně ve schopnosti TNFa aktivovat genový regulační protein (NFkB) vyskytující se v buněčné cytoplazmě. Tento regulační protein podporuje replikaci HIV prostřednictvím vazby na sekvenci virového regulačního genu (LTR) (Osborn etaf,

-2CZ 299808 B6

PNAS 86, 2336-2340, 1989. U kachexie doprovázející AIDS hraje TNFa patrně také roli, neboť u tohoto stavu byly zjištěny zvýšené hladiny TNFa a také vysoká spontánní tvorba v monocytech periferní krve těchto pacientů (Wright et al., J. Immunol. 141 (1), 99-104, 1988). TNFa hraje roli také v jiných infekčních onemocněních, jako je například infekce virem cytomegalie (CMV), chřipky, adenovirem, nebo herpetickými viry, z podobných důvodů jako je uvedeno výše.

Nukleární faktorkB (NFkB) je pleiotropní transkripční aktivátor (Lenardo etal., Cell 1989, 58, 227-29). NFkB hraje roli jako transkripční aktivátor v celé řadě onemocnění a zánětlívých stavů aje předpokládáno, že reguluje hladiny cytokinů včetně, avšak nikoli pouze, TNFa a také že ío účinkuje jako aktivátor transkripce viru HIV. (Dbaibo, etal., J.Biol. Chem. 1993, 1.7 762-66;

Duh etal., Proč. Nati. Acad. Sci. 1989, 86, 5 974—78; Bachelerie etal, Nátuře 1991, 350, 70912; Boswas etal., J. Acquired Immune Deficiency Syndrome 1993, 6, 778-786; Suzuki etal,,

Biochem. And Biophys. Res. Comm. 1993, 193, 277-83; Suzuki etal., Biochem. And Biophys.

Res. Comm. 1992, 189, 1709-15; Suzuki etal., Biochem. Mol. Bio. Int. 1993, 31 (4), 693-700; 15 Shakhov et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 1990, 171, 35-47; a Staal et al., Proč. Nati. Acad. Sci.

USA 1990, 87, 9943—47). Z tohoto důvodu inhibice vazby NFkB může regulovat transkripci genů pro cytokiny a může tak býti prostřednictvím této modulace i jiných mechanismů užitečná v potlačení celé řady chorobných stavů. Sloučeniny popisované v předkládaném vynálezu mohou inhibovat účinek NFkB v jádře á tím napomáhat v léčbě celé řady onemocnění, které zahrnují, avšak nikoli výlučně, následující nemoci: revmatoidní artritis, revmatoidní spondylitis, osteoartrózu, jiná artritická onemocnění, septický šok, sepsi, roztroušenou sklerózu, systémový lupus erytematosis, ENL u lepry, HIV, AIDS a oportunní infekce u AIDS. Koncentrace TNFa a NFkB jsou ovlivňovány reciprokou zpětnou vazbou. Jak je uvedeno výše, sloučeniny, které jsou předmětem předkládaného vynálezu ovlivňují hladiny TNFa a NFkB.

Mnoho buněčných funkcí je řízeno hladinami 375' cyklického adenosin monofosfátu (cAMP). Tyto buněčné funkce se mohou spolupodílet na zánětlívých stavech a onemocněních včetně astmatu, zánětů, a dalších nemocí (Lowe a Cheng, Drugs of the Future, 17 (9), 799-807,4992). Bylo prokázáno, že elevace cAMP v zánětlívých leukocytech inhibuje jejich aktivaci a následné uvolnění zánětlívých mediátorů, včetně TNFa a NFkB. Fosfodiesterázy kontroluj í hladinu cAMP . prostřednictvím hydrolýzy a bylo prokázáno, že inhibitory fosfodiesteráz zvyšují hladiny cAMP.

Snížení hladin TNFa a/nebo zvýšení hladin cAMP proto tvoří významný terapeutický přístup v léčbě mnoha zánětlívých, infekčních, imunologických nebo maligních onemocnění. Tato one35 mocnění zahrnují, avšak nikoli výlučně, septický šok, sepsi, endotoxémický šok, hemodynamický šok a syndrom sepse, postischemické reperfúzní poškození, malárii, mykobakteriální infekci, . . meningitidu, psoriázu, městnavé srdeční selhání, fibrotická onemocnění, kachexii, odhojení štěpu, nádorová onemocnění, autoimunní onemocnění, oportunní infekce u AIDS, revmatoidní artritis, revmatoidní spondylitis, osteoartrózu, jiná artritická onemocnění, Crohnovu chorobu, ulceróz40 ní kolitidu, roztroušenou sklerózu, systémový lupus erytematosis, ENL u lepry, radiační poškození a hypertoxické alveolámí poškození. Předchozí úsilí namířené na potlačení účinků TNFa spočívalo v celé škále terapeutických postupů, od použití steroídů, jako jsou například dexametazon a prednisolon, až po použití polyklonálních i monoklonálních protilátek (Beutler et al., 234, 470-474, 1985; WO 92/11383).

Popis vynálezu

Předkládaný vynález je založen na objevu, že určité skupiny nepolypeptidových sloučenin, které jsou dále detailněji popsány, snižují hladiny TNFa, zvyšují hladiny cAMP a inhibují fosfodiesterázu. Předkládaný vynález se tedy týká 2-(2,6-dioxo-3-ftuoropiperidin-3-yl)izoindolinů, způsobu snížení hladin tumor nekrotizujícího faktoru a a dalších zánětlívých cytokinů u savců prostřednictvím podání těchto derivátů a farmaceutických preparátů obsahujících tyto deriváty.

-3CZ 299808 B6

Vynález se zejména týká (a) 2-(2,6-díoxo-3-fluoropiperidin-3-yl)izoindolinu charakterizovaného vzorcem:

kde

Y je kyslík nebo H₂ a každý zR¹, R², R³ a R⁴ nezávisle na jiných radikálech je vodík, halogen, alkyl obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, alkoxy nebo amino skupina.

b) kyselé adiční soli řečených 2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin3-yl)izoindolinů, které obsahují dusíkový atom schopný protonace.

Pouze v případě, že je definováno jinak, je termínem alkyl míněn nasycený větvený nebo alifatický uhlovodíkový řetězec obsahující 1 až 8 atomů vodíku. Příklady takových alkylových skupin jsou metyl, etyl, propyl, izopropyl, butyl, izobutyl, sec-butyl aterc-butyl. Alkoxy znamená alky20 lovou skupinu navázanou na zbytek molekuly prostřednictvím éterového kyslíkového atomu. Příklady takových alkoxy skupin jsou metoxy, etoxy, propoxy, izopropoxy, butoxy, izobutoxy, sec-butoxy, a terc-butoxy.

Sloučeniny charakterizované vzorcem I jsou používány pod dohledem kvalifikovaného pracov25 nika k inhibici nežádoucích účinků TNFa i dalších zánětlivých cytokinú včetně IL— 1, IL—6 a IL12. Sloučeniny mohou být léčebně podány savcům ve formě perorální, rektální nebo parenterální, samotné nebo v kombinaci s jinými terapeutickými látkami, jako jsou antibiotika, kortikosteroidy, atd.

Sloučeniny, které jsou předmětem předkládaného vynálezu mohou být „použity místně v léčbě nebo profylaxi topických onemocnění zprostředkovaných nebo exacerbovaných nadměrnou tvorbou TNFa, jako jsou například virové infekce, např, způsobené herpetickými viry, nebo virová konjunktivitis, psoriasis, atopická dermatitis, atd.

Sloučeniny mohou být také použity ve veterinární léčbě savců jako prevence nebo inhibice tvorby TNFa. Mezi onemocnění zprostředkovaná TNFa, kde je možno tyto sloučeniny terapeuticky nebo profylakticky použít, patří onemocnění uvedená výše, zejména pak virové infekce. Mezi příklady patří infekce virem kočičí imunodefícience, koňské infekční anémie, kozí artritidy, dále infekce virem vesna a maedi, stejně tak jako jinými lentiviry.

Sloučeniny charakterizované vzorcem I mohou být snadno připraveny celou řadou způsobů.

V prvním provedení vynálezu je cyklický dusík z 2—(2,6—dioxopiperidin—3—yl)izoindolinu charakterizovaného vzorcem II chráněn konvenční amino chránící skupinou, což vede ke vzniku chráněného 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)izoindolinu charakterizovaného vzorcem III, Ten je poté fluorován, což vede ke vzniku chráněného 2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)izoindolinu charakterizovaného vzorcem IV, Po odstranění chránící skupiny dochází ke vzniku sloučeniny charakterizované vzorcem V:

-4CZ 299808 B6

V uvedených reakcích jsou R¹, R², R³, R⁴ a Y stejné, jako je definováno výše a X je amino chránící skupina. Je-li jakýkoli z radikálů R^l, R², R³ a R⁴ amino, měl by být před fluorovacím krokem chráněn.

Meziprodukty charakterizované vzorcem IV mohou být izolovány a purifíkovány před odstraněním chránící skupiny X, nebo mohou být konvertovány přímo in sítu na finální sloučeniny charakterizované vzorcem V.

Některé ze sloučenin charakterizovaných vzorcem II, které jsou zde využity jako meziprodukty, jsou známé, například l,3-dÍoxo-2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-4-aminoizoindolin a 1,3-dioxo2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-5-aminoizoindolin. Viz např. Jonsson, Acta Pharma. Succica, 9,

521-542 (1972). Další meziprodukty jsou popsány v US 5 798 368 (patentové přihlášce

č. 08/701 494), která je tímto začleněna do předkládaného vynálezu jako reference, nebo mohou být tyto meziprodukty připraveny analogickými metodami.

Fluorace může být dosaženo velkým množstvím činidel, jako například A-fluorobenzensulfon20 imidem, perchlorylfluoridem, A-fluorobenzendisulfon imidem apod., za přítomnosti silné zásady, jako je například n-butyl lithium, hydrid sodný, lithium diizopropylamid, lithium bi$(trimetylsilyl)amid apod.

Podle druhé metody je fluorován příslušně substituovaný diester glutamové kyseliny charakteri25 zovaný vzorcem VI, což vede ke vzniku korespondujícího d i esteru kyseliny fluoroglutamové, charakterizované vzorcem VI. Ten je poté konvertován na fluorovaný anhydrid kyseliny glutamové charakterizovaný vzorcem VIII, který je poté amidován, což vede ke vzniku sloučenin charakterizovaných vzorcem V:

- s CZ 299808 B6

V uvedených reakcích jsou R^l, R², R³, R⁴ a Y stejné, jakoje definováno výše a Z je nižší alkyl. Opět, je-li jakýkoli z radikálů R¹, R², R³ a R⁴ amino, měl by být před fluorovacím krokem chráněn.

Používané chránící skupiny zahrnují skupiny, které nejsou přítomny ve finálních sloučeninách, ale které jsou záměrně začleněny v určité fázi syntézy za účelem chránění skupin, které by jinak mohly porušeny v průběhu chemických reakcí. Tyto chránící skupiny jsou odstraněny v pozdější io fázi syntézy a sloučeniny s těmito chránícími skupinami jsou důležité zejména jako chemické meziprodukty (ačkoli některé deriváty vykazují také biologickou aktivitu). Z tohoto důvodu přesná struktura chránících skupin není kritická. Celá řada reakcí tvorby a odstranění těchto chránících skupin je popsána v standardních pracích zahrnujících například „Protective Groups in

Organic Chemistry“, Plenům Press, London a New York, 1973; Greene, Th. W. „Protective

Groups in Organic Synthesis“, Willey, New York, 1981; „The peptides“, Vol, I, Schroder aLubke, Academie Press, London a New York, 1965; „Methoden der organischen Chemie“, Houben-Weyt, 4. vydání, Vol. 15/1, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974, které jsou tímto zahrnuty do předkládaného vynálezu jako reference.

V jakékoli z uvedených reakcí může být nitro skupina nitro sloučenin zkonvertována na amino skupinu pomocí katalytické hydrogenace. Nebo může být chráněná amino skupina odštěpena za vzniku'korespondující amino sloučeniny. Amino skupina může být chráněna jako amid při použití acylové skupiny, kterou lze selektivně odstranit za mírných podmínek. Jedná se zejména o benzyloxykarbonyl, formyl, nebo nižší alkanoylovou skupinu, která je větvená v 1-, neboli a poloze karbonylové skupiny, dále zejména terciární alkanoyl, jako je například pivaloyl, nižší alkanoy lová skupina, která je substituovaná v a poloze karbonylové skupiny, jako je například trifluoroacetyl.

Uhlíkový atom, ke kterému je zobrazený atom fluoru navázán ve sloučeninách charakterizova30 ných vzorcem 1, tvoří centrum chirality, což vede ke vzniku optických izomerů:

-6Cl 299808 Bó

Jak racemáty těchto izomerů, tak i jednotlivé izomery jako takové, stejně tak jako diastereomery v případě přítomnosti druhého chirálního centra, jsou v rozsahu předkládaného vynálezu. Racemáty mohou být použity jako takové, nebo mohou být odděleny na své jednotlivé izomeiy mechanicky, jako například chromatograficky za použití chirálního absorbentu. Alternativně mohou být jednotlivé izomery připraveny v chirální formě nebo mohou být separovány chemicky ze směsi vytvořením solí s chirální kyselinou nebo zásadou, jako jsou například jednotlivé enantiomery 10-kamforosulfonové kyseliny, kamforové kyseliny, ct-bromokamforové kyseliny, metoxyoctové kyseliny, vinné kyseliny, diacetylvinné kyseliny, jablečné kyseliny, pyrrolidon-5io karboxylové kyseliny a podobně, s následným uvolněním jedné nebo obou rozpuštěných zásad a možným opakováním celého procesu tak, aby došlo k získání významně od sebe oddělených sloučenin, tj. ve formě mající optickou čistotu nad 95 %.

Předkládaný vynález se také týká fyziologicky přijatelných netoxických kyselých adičních solí sloučeniny charakterizované vzorcem I, které obsahují skupinu schopnou protonace; např. amino. Tyto soli zahrnují sloučeniny derivované z organických i anorganických kyselin, jakojsou například bez jakýchkoli omezení kyselina chlorovodíková, bromovodíková, fosforečná, sírová, metansulfonová, octová, vinná, mléčná, jantarová, citrónová, jablečná, maleinová, sorbová, akonitová, salicylová, ftalová, embonová, enantová a podobně.

Zejména preferované sloučeniny zahrnují l,3-dioxo-2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperÍdin-3-yl)izoindolin, 1,3-dioxo-2-(2,6-dÍoxo-3-fluoropiperidin-3-yl)-4-amÍnoizoÍndolin, l,3-dioxo-2(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3-yI)-5-amino izoindolin, l,3-dioxo-2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)-4-metyI izoindolin, 1,3-dioxo-2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)-5-mety 125 izoindolin, l-oxo-2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperÍdin-3-yl)-5-metylizoindolin, l,3-dioxo-2-(2,6dÍoxo-3-fluoropiperidin-3-yl)-4,5,6,7-tetrafluroizoindolin, l,3-dioxo-2~(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)-4,5,6,7-tetrachloroizoindolin, l,3-dioxo-2-(2,ó-dioxo-3-fluoropiperidin-3yl)-4,5,6,7-tetrametylizoindolin, l,3-dioxo-2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)-4,5,6,7tetrametoxyizoindolin, l-oxo-2-{2,6-d i oxo-3-fluoropiperidin-3-yl)-5-amino izoindolin, 130 oxo-2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)izoindolin, l-oxo-2-(2,6-dioxo-3-f1uoropiperidin3-yl)-4-aminoizoindolin, l-oxo-2-(2,6-dioxo-3-fluoropÍperidin-3“yl)-4,5,6,7-tetrafluroizoindolin, l-oxo-2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)-4,5,6,7-tetrach1oroizoindolin, l-oxo-2(2,6~dioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)-4,5,6,7-tetrametylÍzoindolin, l-oxo-2-(2,ó-dioxo~3fluoropiperidin-3-yl)-4,5,6,7-tetrametoxyizoindoIin. Z těchto sloučenin jsou obzvláště prefero35 vaně sloučeniny l,3-dioxo-2-(2,6-dÍoxo-3-fluoropiperidin-3-yl)izoindolin a l-oxo-2-(2,6dioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)Ízoindolin.

Perorální dávkovači formy zahrnují tablety, kapsle, dražé á podobné tvarované, komprimované farmaceutické formy obsahující od 1 do 100 mg léku na dávkovači jednotku. Pro parenterální podání mohou být použity izotonické salínické roztoky o koncentraci od 20 do 100 mg/ml. Parenterální podání zahrnuje intramuskulámí, intrathekální, intravenózní a intraarteriální způsob podání. Rektální podání může být uskutečněno formou čípků tvořených konvenčními nosiči jako je například kakaové máslo.

Farmaceutické preparáty jsou tvořeny jednou nebo více sloučeninami charakterizovanými vzorcem l spolu s alespoň jedním farmaceuticky přijatelným nosičem, ředicí látkou nebo excipientem. Při přípravě těchto preparátů jsou aktivní látky obvykle smíšeny s nebo naředěny excipientní látkou nebo uzavřeny do nosiče, který může být ve formě kapsle nebo sáčku. Pokud excipientní látka slouží zároveň i jako látka ředicí, může být vehikulum, nosič, nebo médium pro aktivní látku ve formě pevné, polopevné nebo tekuté. Proto mohou být preparáty ve formě tablet, pilulek, prášků, elixírů, suspenzí, emulzí, roztoků, sirupů, měkkých a tvrdých želatinových-kapslí, čípků, sterilních injekčních roztoků a sterilně balených prášků. Vhodné excipientní látky zahrnují laktózu, dextrózu, sacharózu, sorbitol, mannitol, škrob, arabskou gumu, kalcium silikát, mikrokrystalickou celulózu, polyvinylpyrrolidinon, celulózu, vodu, sirup a metylcelulózu. Preparáty mohou navíc obsahovat lubrikaění látky jako je například talek, magnézium stearát a minerální olej,

-7CZ 299808 B6 zvlhčující látky, emulzifikující a rozpouštěcí látky, konzervační látky, jako jsou například metyl a propylhydroxybenzoáty, sladidla a dochucující látky.

Preparáty jsou přednostně připravovány v jednotkové dávkovači formě, což znamená fyzikálně diskrétní jednotky vhodné jako jednotkové dávky, nebo jsou předem určené frakce podávány člověku i jiným savcům v jedné nebo více dávkách, přičemž každá jednotka obsahuje předem určené množství aktivního materiálu, které je vypočítáno tak, aby došlo k požadovanému terapeutickému účinku ve spojení s vhodnou farmaceutickou excipientní látkou. Preparáty mohou být připraveny tak, aby umožnily okamžité trvalé, nebo opožděné uvolnění aktivní látky po podání pacientovi za pomoci postupů dobře známých v oboru.

Enzymově vázané imunosorbentní analýzy (ELJSA) na detekci TNFa mohou být provedeny konvenčním způsobem. PBMC jsou izolovány od zdravých dárců krve pomocí Ficoll-Hypaque denzitní centrifugace. Buňky jsou kultivovány v RPMI sup lemento váném 10% AB + séra, 2 mm

L-glutaminu, 100 U/ml penicilinu a 100 mg/ml streptomycinu. Léky jsou rozpuštěny v dimetylsulfoxidu (Sigma Chemical) a další ředění jsou prováděna pomocí suplementovaného RPMI. Finální koncentrace dimetylsulfoxidu v přítomnosti i za nepřítomnosti léku v suspenzi PBMC je 0,25 váhových procent. Léky jsou stanovovány v řadě vzorků ředěných vždy na polovinu s výchozí koncentrací 50 mg/ml. Léky jsou přidány kPBMC (10⁶ buněk/ml) v 96 jamkových destičkách jednu hodinu před přidáním LPS. PBMC (10⁶ buněk/ml) v přítomnosti i za nepřítomnosti léku jsou stimulovány pomocí LPS z bakterie Salmonela minnesota R595 (List Biological Labs, Campbell, CA) v koncentraci 1 mg/ml. Buňky jsou poté inkubovány při teplotě 37 °C po dobu 18-20 hodin. Supematanty jsou sebrány a okamžitě je v nich stanovena hladina TNFa, nebo zamraženy při teplotě -70 °C (na dobu kratší než 4 dny) než jsou analyzovány. Koncentrace

TNFa v supematantu byly stanoveny lidským TNFa ELISA kilem (ENDOGEN, Boston, MA) podle postupu uvedeného výrobcem.

Následující příklady slouží k další typizaci charakteru předkládaného vynálezu, ale jsou zamýšleny jako nikterak omezující rozsah tohoto vynálezu, který je definován cistě přiloženými patento30 vými nároky.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

K promíchané suspenzi l,3-dioxo-2-(2,6~ďioxopiperidm-3-yl)izoindolinu (2,0 g, 7,75 mmol) a di-terc-butyl dikarbonátu (1,86 g, 8,52 mmol) v 1,4 dioxanu (3,0 ml) je přidán při pokojové teplotě dimetylaminopyridin (1,00 mg). Roztok je míchán při pokojové teplotě po dobu 18 hodin a rozpouštědlo je poté odstraněno ve vakuu. Reziduum je promícháváno v éteru (30 ml) po dobu 30 minut, zfiltrováno a promyto éterem, což vede ke vzniku l,3-dioxo-2Hj-terc-butoxykarbonyl-2,6-dioxopiperidin-3-yl)izoindolinu.

Tento experiment v typickém provedení vede ke vzniku 2,5 g (90% výtěžek) l,3-dioxo-2-(lterc-butoxykarbonyl-2,6-dioxopiperidin-3-yl)Ízomdolinu, bod tání 274,0-275,0 °C; ^]HNMR (DMSO-de); δ 1,47 (s, 9H, CH₃), 2,08-2,15 (m, IH, CHH), 2,50-2,70 (m, IH, CHH), 2,69-2,82 (m, IH, CHH), 3,02-3,17 (m IH, CHH), 5,42 (dd, J=5,4, 12,9 Hz, IH, NCH), 7,90-7,94 (m, 4H,

Ar); ⁿCNMR(DMSO-d₆)5 21,ll, 27,03, 30,69, 48,77, 86,01, 123,52, 131,16, 134,99, 148,28,

169,99, 167,55, 169,99; Analytický výpočet pro C,₈H|₈N₂O₆; C, 60,33; H, 5,06; N, 7,82. Nalezeno; C, 60,01;H, 5,21;N, 7,47.

- x CZ 299808 B6

Příklad 2

Podobně jako v příkladu 1 jsou stejným postupem získány z l,3-dioxo-2-(2,6~dÍoxopiperidm3-y 1)-4,5,6,7-tetrafluoroizoindolinu, 1,3-dioxo-2-(2,6-dioxopiperidin-3-y 1)-4,5,6,7-tetrachloroizoindolinu, 1.3-dioxo-2-(2₎6-dioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)-4,5,6,7-tetrarnetylizoindolinu, l,3-dioxo-2-(2_J6-dioxopiperidin-3-yl)-4,5,6,7“tetrametoxyizoindolinu, l-oxo-2(2,6-dioxopiperidin-3-yl)izo indol inu, 1 -oxo-2-(2,6-dioxopiperidÍn-3-y 1)-4,5,6,7-tetrafluoroizoíndolinu, l-oxo-2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-4,5,6,7-tetrachloroizoindolinu, l-oxo-2-(2,6dioxopiperidin-3-y 1)-4,5,6,7-tetrametylizoindol inu, l,3-dioxo-2-(2,6-dioxopíperidin-3-yl)~4metylizoindolinu, l,3-dioxo-2^(2,6-dÍoxopiperidin-3-yl)-5-mety]izoindolinu, 1-οχο-2-(2,6dioxopiperidin-3-yl)-4-metylizoindolinu a 1-oxo-2-(2,6-dioxopiperidin-3-y 1)-4,5,6,7-tetrametoxyizoindolinu sloučeniny l,3-dioxo-2-(l-terc-butoxykarbonyl-2,6-dÍoxopiperidin-3-yl)4.5.6.7- tetrafluoroizoindolin, l,3-dioxo~2-(l-terc-butoxykarbonyl-2,6-dÍoxopiperidin-3-yl)4.5.6.7- tetrachloroizoindolin, l,3-dioxo-2-(l-tere-butoxykarbonyI-2,6-díoxopiperidin-3-yl)4.5.6.7- tetrametylizoindolin, l,3-dioxo-2-(l-terc-butoxykarbonyl-2,6-dioxopiperidin-3-yl)4.5.6.7- tetrametoxyizoindolin, 1 -oxo-2,-( 1 -terc-butoxykarbonyl-2,6-dioxopiperidin-3-yl)izoíndolin, l-oxo-2-(l-terc-butoxykarbony 1-2,6-dioxopíperidin-3-yl)-4,5,6,7-tetrafluoroizoindolin, l-oxo-2-(l-terc-butoxykarbonyl-2,6-dioxopiperidin-3-yl)-4.5,6,7-tetrachlorotzoindolin, 1 -oxo-2-( 1 -terc-butoxykarbonyl-2,6-dioxopiperidin-3-y 1)-4,5,6,7-tetrametylizoindolin, l,3-dioxo-2-(l-terc-butoxykarbonyl-2,6-dioxopiperidin-3-yl)-4-metylizoindolin, l,3-dioxo-2-(l-terc-butoxykarbonyl-2,6-dioxopiperidin-3-yl)-5-metylizoindoIín, l-oxo-2(l-terc-butoxykarbonyl-2,6-dioxopiperidin-3-yl)-5-metylizoindolin, 1-ox o-2-(l -tercbutoxykarbonyl-2, 6-dioxopiperidin-3-yl)-4-metylizoindolin a l-oxo-2-(l-terc-butoxykarbonyl-2,6-dioxopiperidin-3-yl)-4,5,6,7-tetrametoxyizoindolin.

Podobně při použití ekvivalentních množství L3-dioxo-2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-4-aminoizoindolinu, l,3-dioxo-2-(2,6-dioxopiperidin-3-y1)-5-aminoizoindolinu, l-oxo-2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-5-aminoizoindolinua l-oxo-2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-5-aminoizoindolinu, ale při použití 3,72 g di—tec—butyl dikarbonátu dle postupu z příkladu 1, jsou získány příslušné sloučeniny 1,3-d ioxo-2-(l -terc-butoxykarbonyl-2,6-dioxopiperid in—3—y 1)-4-(1 -terc-butoxykarbonylamino)ízoindolin, !,3-dioxo-2-(l-terc-butoxykarbonyl-2,6-dioxopÍperÍdin-3-yl)-5(l-terc-butoxykarbonylamino)izoindolin, 1 -oxo-2-( 1 -terc-butoxy karbony 1-2,6-d ioxopiperidin-3-yl)-5-(l-terc-butoxykarbonylamino)izoindolin, a l-oxo-2-( 1-terc-butoxy35 karbonyl-2,6-dioxopiperidin-3-yl)-4-(l-terc-butoxykarbonylamino)izoindolin.

Příklad 3

K promíchanému roztoku 1,3-dioxo-2-(l-terc-butoxykarbonyl-2,6-dioxopiperÍdm-3-yl)izoindolinu (1,0 g, 2,8 mmol) v tetrahydrofuranu (10 ml) je při teplotě -78 °C přidáno n-butyl lithium (1,2 ml, 3,0 mmol, 2,5 M). Po 20 minutách je ke směsi přidán V-fluorobenzensulfonimid (0,8 g, 3,2 mmol). Směs je vytemperována na pokojovou teplotu a rozpouštědlo je odstraněno ve vakuu. Reziduum je promícháváno po dobu jedné hodiny s etyl acetátem (10 ml) a IN kyselinou chlorovodíkovou (10 ml). Organická vrstva je oddělena a rozpouštědlo je odstraněno ve vakuu, což vede ke vzniku l,3-dioxo-2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)izoindolinu, který může být dále chromatograficky purifikován.

Podobným způsobem je při teplotě -40 °C přidán k promíchanému roztoku l,3-dioxo-2-(l50 terc-butoxykarbonyl-2,6-dioxopiperidin-3-yl)ÍzoÍndolÍnu (7,16 g, 20 mmol) v tetrahydrofuranu (250 ml) lithium bis(trimetylsilyl)amid (24 ml, 24 mmol, 1,0 M). Po 1 hodině je ke směsi přidán AMluorobenzensulfonimid (7,6 g, 20 mmol). Směs je vytemperována na pokojovou teplotu a přes noc inkubována. Roztok je promícháván po dobu jedné hodiny s etyl acetátem (200 ml), vodným chloridem amonným (100 ml, nasycený) a vodou (100 ml). Vodná vrstva je oddělena a extrahována etyl acetátem (200 ml). Kombinované organické vrstvy jsou promyty vodou

-9CZ 299808 B6 (100 ml), salinickým roztokem a vysušeny síranem sodným. Rozpouštědlo je odstraněno ve vakuu. Reziduum je purifikováno chromatograficky (silika gel), což vede ke vzniku meziproduktu 1 J-dioxo-2HÚ~terc-butoxykarbonyl-2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)izoÍndolÍnu.

Tento experiment v typickém provedení vede ke vzniku 700 mg (10% výtěžek) l,3-dioxo-2-(lterc-butoxykarbonyl-2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)izoindolinu, bod tání 156,0-157,0 °C; 'H NMR (CDCb); δ 1,62 (s, 9H, CH₃), 2,41-2,72 (m, 2H, CH₂), 2,87-3,03 (m, IH, CHH), 3,523,65 (m, IH, CHH), 7,81-7,97 (m, 4H, Ar); ¹³CNMR (CDCb) δ 26,80 (²JC.F = 27 Hz), 27,39, 28,98, (³JC__F = 7,5 Hz), 67,15, 93,50 (J_C-_F = 218Hz), 124,31, 130,84, 135,29, 147,17, 161,80, ío (²Jc-f = 28 Hz), 165,93, 167,57; Analytický výpočet pro C_I8H_I7N₂O₆F: C, 57,45; H, 4,55; N,

7,44; F, 5,05. Nalezeno; C, 57,78; H, 4,62; N, 7,23; F, 4,94.

Meziprodukt I,3-dioxo-2-(l-terc-butoxykarbonyl-2,6-dÍoxQ-3-flu0ropiperidin-3-yl)izoindolin může být zkonvertován na 1,3—dioxo-2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)izoindolin promícháváním roztoku 1,3-dioxo-2-(l -terc-butoxy karbony 1-2, ó-díoxo-3-fluorop i per i din—3— yl)izoindolinu (620 mg, 1,64 mmol) a hydrogen chloridů v 1,4—dioxanu (15 ml, 4 M, 60 mmol) při pokojové teplotě po dobu 3 dnů. Rozpouštědlo je odstraněno ve vakuu a reziduum je promí' cháváno s éterem (10 ml) po dobu 1 hodiny a zfiltrováno, což vede ke vzniku 1,3-dioxo-2-(2,6dioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)ízoindolinu. Tento experiment v typickém provedení vede ke vzniku 350 mg (77% výtěžek) l,3-dioxo-2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)izoindolinu, bod tání 228,0-230,0 °C, 'HNMR(DMSO-d₆); δ 2,44-2,61 (m, 2H, CH₂), 2,84-2,99 (tn, IH, CHH), 3,24-3,31 (m, IH, CHH), 7,93 (brs, 4H, Ar), 11,49 (s, IH, NH); ¹³CNMR(DMSO-d6)626,91 (²JC-f - 27 Hz), 28,41 (³Jc__f = 8 Hz), 93,57 (J_C__F = 211 Hz), 123,75, 130,91, 135,29, 164,29 (³Jcf = 6Hz), 166,21 (¹Jc-f -1 Hz), 171,58 (³Jc-f = 6 Hz); Analytický výpočet pro

C_I3H₉N₂O₄F + 0,2 H₂O: C, 55,80; H, 3,99; N, 10,01; F, 6,79. Nalezeno: C, 55,74; H, 3,30; N, 9,86; F, 7,18.

Příklad 4

Je použit postup z příkladu 3, je však nahrazeno 0,76 g N-fluorobenzendisulfonimidu za 0,8 g Nfluorobenzensulfonimidu. Tímto je získán l,3-dioxo-2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperÍdin-3-yl)izoindolin, který může být dále purifikován sloupcovou chromatografií.

Příklad 5

K. promíchanému roztoku l,3-dioxo-2-(l-terc-butoxykarbonyl-2,6-dioxopÍperÍdin-3-yl)izoindolinu (Ig, 2,8 mmol) v tetrahydrofuranu (10 ml) je přidán lithium diizopropylamid (1,5 ml,

3,0 mmol, 2 M). Po 30 minutách je směsí probublán perchloryl fluorid (5 mmol). Směs je vytemperována na pokojovou teplotu a rozpouštědlo je odstraněno ve vakuu. Reziduum je promícháno s etylacetátem (10 ml) a IN kyselinou chlorovodíkovou (10 ml) po dobu 1 hodiny. Organická vrstva je oddělena a rozpouštědlo odstraněno ve vakuu, což vede ke vzniku 1,3-dioxo-2“(2,6dioxo-3-fluoropiperidÍn-3-yl)izoindolinu, který je možno dále purifi kovat chromatograficky.

Příklad 6

K. promíchanému roztoku l,3-dioxo-2-(l-terc-butoxykarbonyl-2,6-dioxopiperidin-3-yl)izo50 indolinu (1 g, 2,8 mmol) v dimetylformamidu (10 ml) je při pokojové teplotě přidán hydrid sodný (112 mg, 2,8 mmol, 60%). Po 30 minutách je směsí probublán perchloryl fluorid (5 mmol). Směs je promíchávána s metylen chloridem (10 ml) a IN kyselinou chlorovodíkovou (10 ml) po dobu 1 hodiny. Organická vrstva je oddělena a rozpouštědlo odstraněno ve vakuu, což vede ke vzniku l,3-dioxo-2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)izoindolinu, který je možno dále purifikovat ’ chromatograficky.

-10CZ 299808 B6

Příklad 7

K promíchanému roztoku l,3-dioxo-2-(l-tcrc-butoxykarbonyl-2_;6-dÍoxopipcridin-3-yl)izoindolinu (lg, 2,8 mmol) a tetramety lety lénu diaminu (0,5 g, 4,3 mmol) v tetrahydrofuranu v (10 ml) je při teplotě -78 °C přidáno n-butyl lithium (1,2 ml, 3,0 mmol, 2,5 M). Po 30 minutách je ke směsi přidán AMluorobenzensulfonimid (0,8 g, 3,2 mmol). Směs je temperována na pokojovou teplotu a rozpouštědlo je odstraněno ve vakuu. Reziduum je promícháno s etylio acetátem (10 ml) a IN kyselinou chlorovodíkovou (10 ml) po dobu 1 hodiny. Organická vrstva je oddělena a rozpouštědlo odstraněno ve vakuu, což vede ke vzniku l,3-dioxo-2-(2,6-dioxo-3fluoropiperidin-3_yl)izoindolinu, který je možno dále purifíkovat sloupcovou chromatografíí._;

Příklad 8

Postupy popsanými v příkladech 3, 4, 5, 6 nebo 7 je možno z výchozích sloučenin l,3-dioxo-2(l-terc-butoxykarbonyl-2,6-dioxopiperidin-3-yl)-4-(l-terc-butoxykarbonylamino)izoindolinu, 1,3-dioxo-2-(l -terc-butoxykarbony 1-2,6-dioxopiperidin-3-y 1)-4,5,6,7—tetrafl uoroizo20 indolinu, 1,3-dioxo-2-(l -terc-butoxykarbony 1-2,6-dioxopiperidin-3-y 1)-4,5,6,7-tetrachloroizoindolinu, 1,3-dioxo-2-( l-terc-butoxykarbonyl-2,6-dioxopiperidin-3-yl)-4,5,6,7-tetrametylizoindolinu, 1,3-dioxo-2-( 1 -terc-butoxykarbony 1-2,6~dioxopiperidin-3-y 1)-4,5,6,7-tetrametoxyizoindolinu, l-oxo-2-(l-terc-butoxykarbonyl-2,6-dioxopiperidin-3-yl)-5-(l-tercbutoxykarbonylamino)izoindolinu, l-oxo-2-(l-terc-butoxykarbony 1-2,6-díoxopiperidin-3-yl)25 izoíndolinu, 1-oxo-2-(l-terc-butoxykarbonyl-2,6-dioxopiperid in-3-y 1)--4-(1-terc-butoxykarbonylaminojizoindolinu, l-oxo-2-(l-terC”butoxykarbonyl-2,6-dioxopiperidin-3-yl)4.5.6.7- tetrafluoroizoindolinu, 1 -oxo-2-{l -terc-butoxy karbony 1-2,6-dioxopiperid in-3 -yl)4.5.6.7- tetrachloro izoíndolinu, l-oxo-2-( 1-terc-butoxykarbony 1-2,6—dioxopiperidin-3-yl)4.5.6.7- tetrametylizoindolinu, l,3-dioxo-2-(l-terc-butoxykarbonyl-2,6-díoxopiperidin-3-yl)30 4-metylizoindolinu, l,3~dioxo-2-(l-terc-butoxykarbonyl-2,ó-dioxopiperidin-3-yl)-5-metylizoindolinu, l-oxo-2-( 1-terc-butoxykarbony 1-2,6-dioxopiperidin-3-yl)-5-metyl izoíndolinu, l-oxo-2-(l-terc-butoxykarbony 1-2,6-dioxopiperidín-3-yl)-4-metylizoíndolinu, l-oxo-2-(lterc-butoxykarbony 1-2,6-dioxopiperidin-3-yl)M,5,6,7-tetrametoxy izoíndolinu, získat 1,3dioxo-2-(2,6Mioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)-4-amÍnoizoindolÍn, l,3-dioxo-2-(2,6Mioxo-335 fluoropiperidin-3-yl)-5-amÍnoízoindolín, l,3-dioxo-2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)4.5.6.7- tetrafluoroizoindolín, l,3-dioxo-2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3_y l>-4,5,6,7-tetrachloroizoindolin, l,3-dioxo-2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3-y 1)-4,5,6,7-tetrametylizoindolin. l,3-dioxo-2-(2,6-dioxo-3-fluoropÍpéridin-3-yl)-^:4,5,6,7-ťetrametoxyizoindolin, 1oxo-2-(2,6-dioxo-3MluoropÍperÍdin-3-yl)-5-aminoizoindolin, l-oxo-2-(2,6--dioxo-3-fliioro40 piperidin—3—yl)izoindolin, l-oxo-2-(2,6-dÍoxo-3-fluoropiperidÍn-3-yl)-4-aminoizoindolin, 1oxo-2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)-4,5,6,7-tetrafluoroizoindolÍn, l-oxo-2-(2,6-dioxo~ 3-fluoropiperidin-3-yl)M,5,6,7-tetrachloroizoindolm, l-oxo-2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin3-y 1)-4,5,6,7-tetrametylizoindolin, l,3-dioxo-2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)-4metylizoindolin, l,3-dioxo-2-(2,6-<iioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)-5-metylÍzoíndolin, 1-oxo45 2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)-5-mety]Ízoindolin, l-oxo-2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3-yl}-4-metylizoindolin, l-ox<y-2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)-4,5,6,7-tetrametoxyizoindolin.

Příklad 9

Část A. Roztok dimetylesteru kyseliny L-glutamové (2,6 g, 14,8 mmol), izoamyl nitritu (2,13 ml, 15,9 mmol) a kyseliny octové (0,22 ml) v benzenu (150 ml) je zahříván pod zpětným chlazením po dobu 1 hodiny. Roztok je promyt IN vodným roztokem kyseliny sírové, vodou, nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou a sálinickým roztokem (po 50 ml). Rozpouštědlo .11.

cz 299808 B6 je odstraněno ve vakuu, což vede ke vzniku dimetyl 2-diazopentan-l,5-dioátu, který je možno dále purifikovat sloupcovou chromatografii.

ČástB. K 5 ml studeného roztoku 70% hydrogen fluoridu v pyridinu a 1,2 g (6,7 mmol) A5 bromosuccinimidu v 10 ml éteru je přidán při teplotě 0 °C roztok dimetyl 2~diazopentan-l,5dioátu (1,1 g, 5,9 mmol) v éteru (10 ml). Směs je promíchávána při teplotě 0 °C po dobu 30 minut. Roztok je promyt vodou (20 ml), salinickým roztokem (20 ml) a vysušen síranem sodným. Rozpouštědlo je odstraněno ve vakuu, což vede ke vzniku dimetyl 2-bromo-2-fluorpentan-l,5-dioátu, který je možno dále purifikovat sloupcovou chromatografii.

ČástC. Směs dimetyl 2-bromo-2-fluorpentan-l,5-dioátu (1,0 g, 3,8 mmol) a ftalimidu draselného (0,79 g, 4,3 mmol) v dimetylformamidu (10 ml) je zahřívána při teplotě 80 °C po dobu 3 hodin. Rozpouštědlo je odstraněno ve vakuu a reziduum je promícháváno s etylacetátem (50 ml) po dobu 10 minut. Organická vrstva je promyta vodou a salinickým roztokem (po 20 ml) is a vysušena síranem sodným. Rozpouštědlo je odstraněno ve vakuu, což vede ke vzniku dimetyl

2-(l ,3-dioxoizoindolin~2-yl)2-fluoropenta-l,5-dioátu, který je možno dále purifikovat sloupcovou chromatografii.

ČástD. Směs dimetyl 2-(l,3-dioxoizoindolin-2~yl)2-fluoropenta-l,5-dioátu (1,3 g, 4,0 mmol), 20 metanolu (10 ml) a 4 A kyseliny chlorovodíkové (10 ml) je zahřívána při teplotě 80 °C po dobu hodiny. Rozpouštědlo je odstraněno ve vakuu, což vede ke vzniku 2-fluoro-2-(l,3-dioxoizoindolin-2-yl)-propan-l,3-dikarbocylové kyseliny. Taje rozpuštěna v anhydridu kyseliny octové (20 ml) a roztok je zahříván pod zpětným chlazením po dobu 30 minut. Rozpouštědlo je odstraněno ve vakuu, což vede ke vzniku anhydridu 2-fluoro-2-(l,3-dioxoizoindolin-2-yl)-propan25 1,3-dikarbocylové kyseliny, která je smíšena s amoniakem, v metanolu (35 ml, 2 M) a směs je promíchávána při pokojové teplotě po dobu 18 hodin. Rozpouštědlo je poté odstraněno ve vakuu a reziduum je promícháno s metylen chloridem (50 ml) po dobu 10 minut. Organická vrstva je promyta vodou a salinickým roztokem (po 40 ml) a vysušena síranem sodným. Rozpouštědlo je odstraněno ve vakuu a reziduum je zahříváno pod zpětným chlazením s karbónyl di imidazolem (0,65 g, 4 mmol) a dimetylaminopyridinem (50 mg) v tetrahydrofuranu (30 ml) po dobu 18 hodin. Extrakcí etyl acetátem je izolován I,3-dioxo-2-(2,6-dioxo-3-fluoropíperidin-3-yl)izoíndolin, který je dále chromatograficky purifikován.

Příklad 10

Promíchaná směs dimetylesteru kyseliny L-glutamové (2,0 g, 11,4 mmol) a anhydridu kyseliny ftalové (1,7 g, 11,4 mmol) v kyselině óčtové'(30 ml) je zahřívána pod zpětným chlazením pó dobu jedné hodiny. Rozpouštědlo je odstraněno ve vakuu, což vede ke vzniku dimetyl 2-(1,340 dioxoizoindolin-2-yl)-pentan-l,5-dioátu, který je dále chromatograficky purifikován.

K promíchanému roztoku dimetyl 2-( 1,3-dioxoizoindolin-2-yl)pentan-l,5-dioátu (1,0 g,

3,3 mmol) a tetramety lety len diaminu (0,5 g, 4,3 mmol) v tetrahydrofuranu (10 ml) je přidáno při teplotě -79 ^ĎC 2,5 M n-butyl lithium (1,6 ml, 4 mmol). Po 30 minutách je ke směsi přidán N45 fluorobenzensulfonimid (1 g, 3,2 mmol) a směs je poté vytemperována na pokojovou teplotu. Rozpouštědlo je odstraněno ve vakuu a reziduum je promícháváno s metylen chloridem (100 ml) po dobu 10 minut. Organická vrstva je promyta vodou a salinickým roztokem (po 30 ml) a vysušena síranem sodným. Rozpouštědlo je odstraněno ve vakuu, což vede ke vzniku dimetyl 2-(1,3dioxoizoindolin-2-yl)-2-fluoropentan-l,5-dioátu, který je dále chromatograficky purifikován a zkonvertován na 1,3-dioxo-2-(2,6-dioxo-3-fluoropiper i d in-3-yl) izo indolin, jak je popsáno výše v části D příkladu 9.

-12CZ 299808 B6

Příklad 11

Promíchaná směs etylbromofluoroacetátu (1,0 g, 5,4 mmol) a ftalidu draselného (1,0 g,

5,4 mmol) v dimetylformamidu (10 ml) je zahřívána při teplotě 80 °C po dobu 3 hodin. Směs je promíchávána s éterem (50 ml) a vodou (50 ml) a organická vrstva je promyta vodou a salinickým roztokem (po 30 ml) a vysušena síranem sodným. Rozpouštědlo je odstraněno ve vakuu, což vede ke vzniku etyl 2-(1.3-dioxoizoindolin-2-yl)-2-fluoroacetátu, který je dále chromatograficky purifikován.

¹⁰

K promíchanému roztoku etyl 2-(l,3-dioxoizoindolin-2-yl)-2-fluoroacetátu (0,8 g, 3,2 mmol) v tetrahydrofuranu (30 ml) je přidán při teplotě -79 °C lithium diizopropylamid (1,7 ml,

3,4 mmol, 2M) a 2,5 M n-butyl lithium (1,6 ml, 4 mmol). Po 30 minutách je ke směsi přidán tbutylacetát (0,42 g, 3,2 mmol) a směs je vytemperována na pokojovou teplotu. Rozpouštědlo je odstraněno ve vakuu a reziduum je promícháváno s metylen chloridem (50 ml) a vodou (30 ml) po dobu 10 minut. Organická vrstva je promyta vodou a salinickým roztokem (po 30 ml) a vysušena síranem sodným. Rozpouštědlo je odstraněno ve vakuu, což vede ke vzniku terc-butyl 4(l,3-dioxoizoindolin-2-yl>4-fIuoro-4-etoxykarbonylbutaoátu, který je dále chromatograficky purifikován.

Roztok terc-butyl 4-( 1,3-dioxoizoindoli n-2-yl )-4-fluoro-4-etoxy karbony lbutaoátu) (1,1 g, 3 mmol) a kyseliny trifluoroctové (5 ml) v metylen chloridu (5 ml) je promícháván po dobu 18 hodin a poté s metylen chloridem (50 ml) .po dobu 10 minut. Organická vrstva je promyta vodou a salinickým roztokem (po 30 ml) a vysušena síranem sodným. Rozpouštědlo je odstraně25 no ve vakuu, což vede ke vzniku 4-(l,3-dioxoizoindolin-2-yl)-4“fluoro-4-(etoxykarbonyl)-4fluorobutanové kyseliny, která může být purifikována chromatografií, nebo může být použita v dalším kroku bez další purifikace.

Směs 4-(l,3-dioxoizoindolin-2-yl)-4-fluoro-4-(etoxykarbonyl)-4-fluorobutanové kyseliny (0,9 g, 2,8 mmol), karbonyl di imidazolu (0,46 g, 2,8 mmol) a dimetylaminopyrimidinu (0,68 g,

5,6 mmol) v tetrahydrofuranu (30 ml) je zahříváno a pod zpětným chlazením po dobu 18 hodin. Rozpouštědlo je odstraněno ve vakuu a reziduum je promícháváno s metylen chloridem (50 ml) po dobu 10 minut. Organická vrstva je promyta vodou a salinickým roztokem (po 40 ml) a vysušena síranem sodným. Rozpouštědlo je odstraněno ve vakuu, což vede ke vzniku l,3-dioxo-235 (2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3yI)izoindolinu, který je dále purifikován sloupcovou chromatografií.

Příklad 12

Tablety, každá obsahující 50 mg l,3-dioxo-2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)izoindolinu, mohou být připraveny následujícím způsobem:

Složení (pro 1000 tablet) '

l,3-dioxo-2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)izoÍndolin 50,0 g laktóza 50,7 g pšeničný Škrob 7,5 g polyethylen glykol 6000 5,0 g talek 5,0 g magnézium stearát 1,8 g demineralizovaná voda q.s.

_ n.

Pevné složky jsou nejprve protlačeny přes síto o velikosti ok 0,6 mm. Poté je smíchána aktivní složka, laktóza, talek, magnézium stearát a polovina škrobu. Druhá polovina škrobu je rozpuštěna v 40 ml vody a tato suspenze je přidána k vroucímu roztoku polyetylén glykolů v 100 ml vody. Výsledná pasta je přidána k látkám způsobujících pulverizaci a směs je granulována, v případě potřeby po předchozím přidání vody. Granulát je přes noc vysušen při teplotě 35 °C, protlačen přes síto o velikosti ok 1,2 mm a stlačen do tablet o průměru přibližně 6 mm s konkávním tvarem na obou stranách.

ío Příklad 13

Tablety, každá obsahující 100 mg l-dioxo-2-(2,6-dioxo-3-fliioropiperidin-3-yl)izoíndolÍnih mohou být připraveny následujícím způsobem:

Složení (pro 1000 tablet)

-oxo-2~(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)izoindolin 100,0 g laktóza 100,0 g pšeničný škrob 47,0 g magnézium stearát 3,0 g

Pevné složky jsou nejprve protlačeny přes síto o velikosti ok 0,6 mm, Poté je smíšena aktivní složka, laktóza, magnézium stearát a polovina škrobu. Druhá polovina škrobu je rozpuštěna v 40 ml vody a tato suspenze je přidána k vroucímu roztoku polyetylén glykolů v 100 ml vody.

Výsledná pasta je přidána k látkám způsobujících pulverizaci a směs je granulována, v případě potřeby po předchozím přidání vody. Granulát je přes noc vysušen při teplotě 35 °C, protlačen přes síto o velikosti ok 1,2 mm a stlačen do tablet o průměru přibližně 6 mm s konkávním tvarem na obou stranách.

Příklad 14

Tablety ke žvýkání, každá obsahující l~oxo-2-(2,6-<lioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)izoindolinu, mohou být připraveny následujícím způsobem:

Složení (pro 1000 tablet) l-oxo-2-(2,6-{lÍoxo-3-fluoropiperidin-3-yl)izoindolÍn 75,0 g mannitol 230,0 g laktóza 150,0 g talek 21,0 g pšeničný škrob 7,5 g glycin 12,5 g stearová kyselina 10,0 g sacharin 1,5 g

5% roztok želatiny q,s.

Pevné složky jsou nejprve protlačeny přes síto o velikosti ok 0,25 mm. Poté je smíšen mannitol a laktóza, směs je granulována přidáním roztoku želatiny, protlačena přes síto o velikosti ok

2 mm, vysušena při teplotě 50 °C a opět protlačena přes síto o velikosti ok 1,7 mm. l-Oxo-2(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)izoindolin, glycin a sacharin jsou pečlivě smíchány, je přidán mannitol, laktózový granulát, kyselina stearová a talek a směs je důkladně promíchána a stlačena

-14CZ 299808 Bó ii do tablet o průměru přibližně 10 mm s konkávním tvarem na obou stranách a půlícím žlábkem na horní straně.

Příklad 15

Tablety, každá obsahující 10 mg l,3-dioxo-2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperÍdin-3-yl)-4,5,6,7tetrafluoroizo indol inu, mohou být připraveny následujícím způsobem:

Složení (pro 1000 tablet)

1,3-dioxo-2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)-M,5,6,7-tetrafluoroizoindolin 10,0 g

laktóza 328,5 g kukuřičný škrob 17,5 g is polyetylén glykol 6000 5,0 g talek 25,0 g magnézium stearát 4,0 g demineralizovaná voda q.s.

Pevné složky jsou nejprve protlačeny přes síto o velikosti ok 0,6 mm. Poté je smíchána aktivní imidová složka, laktóza, talek, magnézium stearát a polovina škrobu. Druhá polovina škrobu je rozpuštěna v 65 ml vody a tato suspenze je přidána k vroucímu roztoku polyetylén glykolu v 260 ml vody. Výsledná pasta je přidána k látkám způsobujících pulverizaci a směs je granulována, v případě potřeby po přidání vody. Granulát je přes noc vysušen při teplotě 35 °C, pro25 tlačen přes síto o velikosti ok 1,2 mm a stlačen do tablet o průměru přibližně 10 mm s konkávním tvarem na obou stranách a půlícím zářezem na horní straně.

Příklad 16 30

Kapsle plněné suchou želatinou, každá obsahující 100 mg l-oxo-2-(2,6-dioxc^3-fluoropiperidin-3-yl)-5-aminoizoindolinu, mohou být připraveny následujícím způsobem:

Složení (pro 1000 kapslí)

1-oxo-2^(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)-5-aminoizoindolin 100,0 g řnikrokrysťalícká celulóza 30,0 g sodium lauryl sulfát 2,0 g magnézium stearát 8,0 g

Sodium lauryl sulfát je protlačen přes síto o velikosti ok 0,2 mm do l-oxo-2-(2,6-dioxo-3fluoropiperidin-3yl)-5-aminoizoindolinu a tyto dvě složky jsou důkladně promíchávány po dobu 10 minut. Poté je přidána přes síto o velikosti ok 0,9 mm mikrokrystalícká celulóza a směs je důkladně promíchávána po dobu 10 minut. Nakonec je přidán magnézium stearát přes síto o veli45 kosti ok 0,8 mm a po dalším 3-minutovém promíchávání je směs rozdělena do částí po 140 mg, kterými jsou plněny kapsle ve tvaru 0 (protáhlé) plněné suchou želatinou.

- is CZ 299808 Bó

Příklad 17

0,2% injekční nebo infuzní roztok může být připraven například následujícím způsobem:

l,3-dioxo-2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidín-3-yl)-5-aminoÍz0Índolm hydroehlorid 5,0 g chlorid sodný 22,5 g fosfátový pufr pH 7,4 300,0 g demineralizovaná voda ad 2500 ml l,3-dioxo-2-(2,6-dioxo-3-fluoroptperidin-3-y])-5-aminoizoindolin hydroehlorid je rozpuštěn v 1000 ml vody a zfiltrován přes mikrofiltr. Je přidán roztok pufru a celkový objem je doplněn vodou do 2500 ml. K. přípravě dávkovačích jednotkových forem jsou připraveny části od 1,0 do

2,5 ml, které jsou umístěny do skleněných ampuíí (každá obsahující 2,0 až 5,0 mg imidu).

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Sloučenina vybraná ze skupiny složené z

a) 2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)izoindolinu charakterizovaného vzorcem:

kde

Y je kyslík nebo H₂ a 30 každý z R¹, R², R³ a R⁴ nezávisle na jiných radikálech je vodík, halogen, alkyl obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, alkoxy obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, nebo amin o skupina,

b) kyselých adičních solí řečených 2-(2,6-4 ioxo-3-fluoropiperidÍn-3-yI)izoíndolinů, které obsa35 hují dusíkový atom schopný protonace.
2. Sloučenina podle nároku 1, kde R¹, R², R³ a R⁴ jsou vodík.
3. Sloučenina podle nároku 1, kde R¹, R², R³ a R⁴ jsou stejné a každý žních chloro, fluoro, 40 metyl nebo metoxy.
4. Sloučenina podle nároku 1, kde R³ je amino a R¹, R² a R⁴ jsou vodík.
5. Sloučenina podle nároku 1, kde R⁴ je amino a R¹, R² a R³ jsou vodík.
6. Sloučenina podle nároku 1, kde R³ je metyl a R¹, R² a R⁴ jsou vodík.

-16CZ 299808 B6
7. Sloučenina podle nároku 1, kde R⁴ je metyl a R¹, R² a R³ jsou vodík.
8. Sloučenina podle nároku 1, kde sloučeninou je l,3-dioxo-2-{2,6-dioxo-3-f1uoropiperidin3-yl)izoindolin.
9. Sloučenina podle nároku 1, kde sloučeninou je l,3-dioxo-2-(2_}6-dioxo-3-fluoropiperidin3-yl)-4-amÍnoizoindolin.
10. Sloučenina podle nároku 1, kde sloučeninou je l,3-dioxo-2-(2_t6-dioxo-3-fluoropiperidinio 3-yl)-5-aminoizoindolin.
11. Sloučenina podle nároku 1, kde sloučeninou je l,3-dioxo-2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin3-yl)-4,5,6,7-tetrafluoroizoÍndolÍn.

15
12. Sloučenina podle nároku 1, kde sloučeninou je l_í3-dioxo-2-(2,6-díoxo-3-fluoropiperidin3-yl)-4,5,6,7-tetrachloroizoindolin.
13. Sloučenina podle nároku 1, kde sloučeninou je l,3-dÍoxo-2-(2,6-dÍoxo-3-fluoropiperidin3-yl)—4,5,6,7-letrametyl izoindol in.
14. Sloučenina podle nároku 1, kde sloučeninou je 1.3-dioxo-2—(2,6—dioxo—3-fluoropiperÍdín3-yl)-4,5,6,7-tetrametoxyizoindolin.
15. Sloučenina podle nároku l, kde sloučeninou je l-oxo-2~(2,6-dioxo~3“ťluoropiperidin-325 yI)-5-amÍnoizoindolin.
16. Sloučenina podle nároku 1, kde sloučeninou je l-oxo-2-(2.6-dioxo-3-fluoropiperidin-3yl)izoindolin.

30
17. Sloučenina podle nároku 1, kde sloučeninou je l-oxo-2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3yl)—4—aminoizoindolin.
18. Sloučenina podle nároku 1, kde sloučeninou je l-oxo-2-(2,6-dioxo-3-f1uoropiperidin-3yl)-4,5,6.,7-tetrafluoroizoindolin.
19. Sloučenina podle nároku 1, kde sloučeninou je l-oxo-2-(2,ó-dioxo-3-fluoropiperidin-3yl)-4_}5,6,7-tetrachloroizoindolin.
20* Sloučenina podle nároku 1, kde sloučeninou je l-oxo-2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-340 yl)—4,5_?6,7—tetramety 1 izoindolín.
21. Sloučenina podle nároku 1, kterou je l-oxo-2-(2,6-dioxo-3-fluorpiperidin-3-yl)-4,5,6,7tetramethoxy izoindol i n.

45
22. Použití sloučeniny podle nároku 1 pro přípravu léčiva na snížení nebo léčení nežádoucí hladiny zánetlivých cytokinú u savce.
23. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu podle nároku 1 v množství postačujícím při podávání v režimu jedné nebo více dávek ke snížení hladi50 ny zánětlivých cytokinú u savce, v kombinaci s nosičem.