CZ297450B6 - Deriváty benzocykloheptapyridinoxidu, jejich pouzití pro inhibici farnesyl-proteintransferázy a farmaceutické prostredky je obsahující - Google Patents

Abstract

Deriváty benzocykloheptapyridinoxidu, mající vzorce 9.0, 38.0, 40,0, 42.0, 47.0 a 53.0. Tyto slouceniny jsou pouzitelné v inhibici nenormálního rustubunek, inhibice farnesyl-proteintransferázy a proprípravu léciva pro lécení rakovin. Resení se také týká farmaceutického prostredku je obsahujícího.

Description

Deriváty benzocykloheptapyridinoxidu, jejich použití pro inhibici farnesyl-proteintransferázy a farmaceutické prostředky je obsahující (57) Anotace:

Deriváty benzocykloheptapyridinoxidu, mající vzorce 9.0, 38.0,40,0,42.0,47.0 a 53.0. Tyto sloučeniny jsou použitelné v inhibici nenormálního růstu buněk, inhibice farnesylproteintransferázy a pro přípravu léčiva pro léčení rakovin.

Řešení se také týká farmaceutického prostředku je obsahujícího.

Deriváty benzocykloheptapyridinoxidu, jejich použití pro inhibici farnesyl-proteintransferázy a farmaceutické prostředky je obsahující

Oblast techniky

Tento vynález popisuje nové deriváty benzocykloheptapyridinoxidu, vhodné pro inhibici nenormálního růstu buněk, inhibici famesyl-proteintransferázy a léčení rakovin. Popisuje také jejich použití pro inhibici nenormálního růstu buněk, inhibici famesyl-proteintransferázy a léčení rakovin.

Dosavadní stav techniky

Biologický význam Ras-onkogenu a role Ras a enzymu, známého jako famesyl-proteintransferáza, v přeměně normálních buněk na rakovinné buňky, jsou popsány v PCT přihlášce WO 95/00497 a WO 95/10516. Obě tyto publikace také popisují rozdílné skupiny sloučenin, které inhibují aktivitu enzymu famesyl-proteintransferázy a tím famesylaci Ras-proteinu.

PCT přihláška WO 95/10516 se týká tricyklických amidových a močovinových sloučenin obecného vzorce 1.0

R⁶ —t —-R®

(1.0)

- 1 CZ 297450 B6 a jejich použití při inhibici funkce Ras a nenormálního růstu buněk. Je v ní popsána řada podskupin sloučenin vzorce 1.0, které zahrnují sloučeniny vzorců 5.0c, 5.1c a 5.2a,

stejně jako 11-R-izomer a 11-S-izomery sloučenin 5.0c a 5.1c. Je v ní také popsána řada konkrétních sloučenin v každé podskupině, stejně jako biologická aktivita těchto sloučenin.

-2CZ 297450 B6

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje nové tricyklické amidové sloučeniny, vybrané ze skupiny, obsahující

-3CZ 297450 B6

-4CZ 297450 B6

-5CZ 297450 B6

-6CZ 297450 B6

-8CZ 297450 B6

nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli nebo solváty.

Optické rotace sloučenin ((+)- nebo (-)-) jsou měřeny v methanolu nebo ethanolu při 25 °C. Tento vynález zahrnuje výše zobrazené sloučeniny v amorfním nebo krystalickém stavu.

Mezi sloučeniny tohoto vynálezu patří sloučeniny, vybrané ze skupiny, obsahující: sloučeniny 10.0, 11.0, 12.0, 13.0, 16.0, 17.0, 18.0, 19.0, 20.0, 21.0 a 22.0, nebo jejich farmaceuticky přijalo tělně soli, kde jsou zmíněné sloučeniny takové, jako bylo definováno výše.

Mezi sloučeniny tohoto vynálezu také patří sloučeniny, vybrané ze skupiny obsahující: sloučeniny 8.0, 9.0, 14.0 a 15.0, nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli, kde jsou zmíněné sloučeniny takové, jak bylo definováno výše.

Mezi sloučeniny tohoto vynálezu také patří sloučeniny, vybrané ze skupiny, obsahující: sloučeniny 23.0A, 24.0, 35.0, 36.0, 37.0, 38.0, 39.0, 40.0, 41.0, 42.0, 47.0, 48.0, 49.0, 50.0, 51.0, 52.0,

-9CZ 297450 B6

53.0, 54.0, 55.0, 56.0, 57.0, 58.0, 59.0 a 65.0, nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli, kde jsou zmíněné sloučeniny takové, jak bylo definováno výše.

Mezi sloučeniny tohoto vynálezu také patří sloučeniny, vybrané ze skupiny, obsahující: sloučeniny 43.0, 44.0, 45.0 a 46.0, nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli, kde jsou zmíněné sloučeniny takové, jak bylo definováno výše.

Mezi upřednostňované sloučeniny také patří sloučeniny 51.0 a 53.0.

Mezi upřednostňované sloučeniny také patří sloučeniny 40.0 a 42.0.

Více upřednostňovanými sloučeninami jsou sloučeniny 51.0 a 53.0.

Odborníci v oboru pochopí, zeje tento tricyklický systém číslován:

Odborníci v oboru také pochopí, že S a R prostorová uspořádání na vazbě C-l 1 jsou:

Inhibice famesyl-proteintransferázy tricyklickými sloučeninami tohoto vynálezu ještě nebyla popsána. Tento vynález tedy poskytuje způsob inhibice famesyl-proteintransferázy za použití tricyklických sloučenin tohoto vynálezu, které: (i) účinně inhibují famesyl-proteintransferázu, ale ne geranylgeranyl-proteintransferázu I, in vitro·, (ii) blokují fenotypickou změnu, indukovanou formou transformujícího Ras, která je akceptor famesylu, ale ne formou transformujícího Ras, která byla vytvořena tak, aby byla akceptorem geranylgeranylu; (iii) blokuje intracelulámí úpravu Ras, který je akceptorem famesylu, ale ne Ras, který byl vytvořen tak, aby byl akceptorem geranylgeranylu, a (iv) blokuje nenormální buněčný růst v kulturách, indukovaných transformujícím Ras.

Tento vynález poskytuje způsob inhibice nebo léčení nenormálního růstu buněk, včetně transformovaných buněk, podáváním účinného množství sloučeniny tohoto vynálezu. Nenormální růst buněk označuje buněčný růst, který je nezávislý na normálních regulačních mechanizmech (např. ztráta kontaktní inhibice). Zahrnuje nenormální růst: (1) nádorových buněk (nádorů), exprimujících aktivovaný Ras-onkogen; (2) nádorových buněk, ve kterých je Ras-protein aktivován jako výsledek onkogenní mutace v jiném genu; (3) benigních a maligních buněk jiných proliferativních poruch, ve kterých dochází k chybné aktivaci Ras.

Tento vynález také poskytuje způsob inhibice nebo léčení nádorového růstu (rakoviny) podáváním účinného množství tricyklických, zde popsaných, sloučenin, savci, (např. člověku), který takovouto léčbu potřebuje. Konkrétně tento vynález poskytuje způsob inhibice nebo léčení růstu nádorů, exprimujících aktivovaný Ras-onkogen, podáváním účinného množství výše popsaných sloučenin. Příklady nádorů, které mohou být inhibovány nebo léčeny, zahrnují, ale ne pouze,

- 10CZ 297450 B6 rakovinu plic (např. plicní adenokarcinom), rakovinu slinivky břišní (např. pankreatický karcinom, jako je např. oxokrinní pankreatický karcinom), rakovinu tlustého střeva (např. kolorektální karcinomy, jako je např. adenokarcinom tlustého střeva a adenom tlustého střeva), míšní leukémii (např. akutní myelogenní leukémii (AML)), rakovinu folikulů štítné žlázy, myelodisplastický syndrom (MDS), karcinom žlučníku, epidermální karcinom, rakoviny prsu a rakoviny prostaty.

Má se za to, že tento vynález také poskytuje způsob inhibice proliferativních poruch, jak benigních tak i maligních, kde jsou Ras-proteiny chybně aktivovány, jako výsledek onkogenní mutace v jiných genech - to jest, Ras-gen sám není aktivován mutací na onkogenní formu -, kde je zmíněné inhibice dosaženo podáváním účinného množství tricyklických, zde popsaných, sloučenin savci, (např. člověku), který takovouto léčbu potřebuje. Zde popsanými tricyklickými sloučeninami může být inhibována např. benigní proliferativní porucha neurofibromatóza, nebo nádory, ve kterých je aktivace Ras způsobena mutací nebo nadexpresí tyrosinkinázových onkogenů (např. neu, src, abl, lek a fýn).

Sloučeniny tohoto vynálezu inhibují famesyl-proteintransferázu a famesylaci onkogenního proteinu Ras. Tento vynález dále poskytuje způsob inhibice ras famesyl-proteintransferázy u savců, zejména u člověka, podáváním účinného množství tricyklických sloučenin, popsaných výše. Podávání sloučenin tohoto vynálezu pacientům, za účelem inhibice farnesyl-proteintransferázy, je užitečné při léčení výše popsaných rakovin.

Tyto tricyklické sloučeniny, užitečné v metodách tohoto vynálezu, inhibují nenormální růst buněk. Má se za to, že tyto sloučeniny mohou fungovat přes inhibici funkce G-proteinu, jako je ras p21, blokováním isoprenylace G-proteinu, což je činí užitečnými při léčení proliferativních poruch, jako je nádorový růst a rakovina. Má se zato, že tyto sloučeniny inhibují ras farnesylproteintransferázu a vykazují tedy antiproliferativní aktivitu u buněk transformovaných ras.

Když jsou zde použity, jsou následující termíny použity tak, jak je definováno níže, pokud není uvedeno jinak:

M⁺ - představuje molekulový ion molekuly v hmotnostním spektru;

MH⁺ - představuje molekulový ion plus vodík molekuly v hmotnostním spektru;

Pyridyl-N-oxidy jsou zde představovány skupinou

Následující rozpouštědla a činidla jsou představována uvedenými zkratkami: tetrahydrofuran (THF); ethanol (EtOH); methanol (MeOH); kyselina octová (HOAc nebo AcOH); ethylacetát (EtOAc); Ν,Ν-dimethylformamid (DMF); kyselina trifluoroctová (TFA); anhydrid kyseliny trifluoroctové (TFAA); 1-hydroxybenzotriazol (HOBT); kyselina /w-chlorbenzoová (MCPBA); triethylamin (Et₃N); diethylether (Et₂O); ethylchlormravenčan (ClCO₂Et); hydrochlorid l-(3dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimidu (DEC); hydrid diizobutylhliníku (DIBAL); izopropanol (iPrOH); dimethylsulfoxid (DMSO).

Některé sloučeniny předkládaného vynálezu mohou existovat v různých izomemích formách (např. enantiomery nebo diastereoizomery) včetně atropizomerů (to jest sloučenin, které mají 7členný kruh v ustálené konformací tak, že je uhlíkový atom v pozici 11 umístěn nad nebo pod rovinou fúzovaných benzenových kruhů, kvůli přítomnosti bromovému substituentu v pozici 10).

-11 CZ 297450 B6

Tento vynález zahrnuje všechny takovéto izomery jak v čisté formě tak i ve směsích, včetně směsí racemických. Enol formy jsou zahrnuty také.

Některé zásadité tricyklické směsi také vytvářejí farmaceuticky přijatelné soli, např. soli, vzniklé přidáním kyselin. Například, dusíkové atomy pyridinu mohou vytvářet soli se silnými kyselinami. Příklady vhodných kyselin pro tvorbu solí jsou kyselina sírová, fosforečná, octová, citrónová, oxalová, malonová, salicilová, jablečná, fumarová, jantarová, askorbová, maleinová, methansulfonová a jiné anorganické a karboxylové kyseliny, dobře známé v oboru. Tyto soli jsou připraveny setkáním formy s volnou bází s dostatečným množstvím požadované kyseliny pro vznik soli běžným způsobem. Formy s volnou bází mohou být obnoveny tak, že je na sůl působeno zředěným, vodným roztokem vhodné báze, jako je např. zředěný vodný NaOH, uhličitan draselný, hydrogenuhličitan sodný nebo amonný. Formy s volnou bází se trochu liší od jim odpovídajících solí v některých fyzikálních vlastnostech, jako je rozpustnost v polárních rozpouštědlech, ale soli kyselin nebo bází jsou jinak pro účely tohoto vynálezu rovnocenné formám s volnou bází.

Všechny takovéto soli jsou považovány za farmaceuticky přijatelné a pro účely tohoto vynálezu považovány za rovnocenné volným formám jim odpovídajících sloučenin.

Sloučeniny předkládaného vynálezu mohou být připraveny pomocí postupů, které jsou popsány níže.

Příprava piperidinových sloučenin

Sloučeniny tohoto vynálezu, mající piperidinový kruh (kruh IV):

mohou být připraveny, technikami, které jsou v oboru dobře známé, z odpovídajících neoxidovaných pyridylových sloučenin:

-12CZ 297450 B6

-13CZ 297450 B6

- 14CZ 297450 B6

- 15 CZ 297450 B6

- 16CZ 297450 B6

Piperidinové sloučeniny vzorce I tohoto vynálezu mohou být připraveny z výše zobrazených pyridylových sloučenin oxidací kyselinou meta-chlorperoxybenzoovou. Tato reakce je provádě5 na ve vhodném organickém rozpouštědle, např. dichlormethanu (obvykle bezvodém) nebo methylenchloridu, za vhodné teploty, za vzniku sloučenin tohoto vynálezu, které mají v pozici 1 kruhu I tricyklického systému N-O substituent.

Obecně je roztok výchozí tricyklické sloučeniny v organickém rozpouštědle před přidáním kyselo liny meta-chlorperoxybenzoové ochlazen na 0 °C. Reakční směs poté v průběhu reakce nechá zahřát na teplotu místnosti. Požadovaný produkt může být poté získán standardními separačními způsoby. Reakční směs může být například promyta vodným roztokem vhodné báze, např. nasyceným hydrogenuhličitanem sodným nebo NaOH (např. 1 N NaOH) a poté vysušena pomocí bezvodého síranu hořečnatého. Roztok obsahuj ící produkt může být zahuštěn ve vakuu. Produkt 15 může být purifikován standardními způsoby, např. chromatografií za použití silikagelu (např.

flash kolonovou chromatografií).

- 17CZ 297450 B6

Alternativně mohou být piperidinové sloučeniny vzorce I podle tohoto vynálezu vytvořeny z intermediátových sloučenin vzorců 8.1 až 65.1, za použití oxidačního postupu kyselinou mchlorperoxybenzoovou. Tyto oxidované intermediátové sloučeniny se poté nechají reagovat, za použití metod známých v oboru, aby vznikly sloučeniny tohoto vynálezu. Například, 3,8-dihalo5 genové sloučeniny mohou být vytvořeny z tohoto intermediátu:

který je vytvořen oxidací této pyridylové sloučeniny

kyselinou m-chlorperoxybenzoovou.

3,7,8-trihalogenové sloučeniny, 3,8,10-trihalogenové sloučeniny, 3,8-dihalogenové sloučeniny a 3,10-dihalogenové sloučeniny mohou být vytvořeny jednotlivě z těchto intermediátů:

halogen

Sloučeniny III až VI mohou být jednotlivě připraveny za použití výše popsaného oxidačního postupu kyselinou /«-chlorperoxybenzoovou a pyridylových sloučenin

-18CZ 297450 B6 halogen

halogen halogen

halogen halogen

jednotlivě za vzniku těchto sloučenin halogen

COOC₂H₅

Sloučeniny XI až XIV mohou být jednotlivě přeměněny na sloučeniny III až IV, metodami známými v oboru.

-19CZ 297450 B6

U výše zobrazených sloučenin představuje přerušovaná čára (- - -) volitelnou vazbu a X představuje CH, když tato volitelná vazba chybí, a C, když je tato volitelná vazba přítomna. N-O intermediáty se poté nechají dále reagovat, aby vznikly sloučeniny tohoto vynálezu.

Odborníci v oboru ocení, že tato oxidační reakce může být provedena u racemických směsí a izomery mohou být poté odděleny známými technikami, nebo mohou být izomery nejdříve odděleny a poté oxidovány na odpovídající N-oxidy.

Odborníci v oboru pochopí, že, když je prováděna oxidační reakce u sloučenin, majících v C-l 1 piperidinového kruhu IV dvojnou vazbu (např. sloučeniny 5.1, 6.1, 9.1 apod.), je upřednostňováno vyvarování se přebytku kyseliny m-chlorperoxybenzoové. V těchto reakcích by přebytek kyseliny w-chlorperoxybenzoové mohl způsobit oxidaci dvojné vazby v pozici C-l 1.

Intermediátové sloučeniny VII, VIII, IX a X jsou připraveny metodami známými v oboru, např. metodami, popsanými v WO 95/10516, v US 5 151 423, a těmi, popsanými níže. Například sloučeniny VII až X mohou být jednotlivě připraveny reakcí sloučenin

halogen

s C₂H₅OCOC1 a Et₃N v nějakém inertním rozpouštědle (např. CH2CI2).

Intermediátorové sloučeniny XV, XVI, XVII a XVIII, kde je pozice C-3 pyridinového kruhu tricyklické struktury substituována bromem, mohou být také připraveny postupem, obsahujícím následující kroky:

(a) reakci amidu vzorce

-20CZ 297450 B6 kde R¹¹ je Br, R⁵ je vodík a R⁶ je C]-C6-alkyl, aryl nebo heteroaryl; R^5a je Ci-C6-alkyl, aryl nebo heteroaryl a R^6a je vodík; R^5a a R^6a jsou nezávisle vybrány ze skupiny obsahující C|-C6-alkyl a aryl; nebo R^5a a R^6a, společně s dusíkovým atomem, na který jsou vázány, vytváří kruh, obsahující 4 až 6 uhlíkových atomů nebo obsahuje 3 až 5 uhlíkových atomů a jednu heteroskupinu, vybranou ze skupiny, obsahující -O- a -NR^9a-, kde R^9a je H, C|-C6-alkyl nebo fenyl; se sloučeninou vzorce

_R2a _R33 kde R^la, R^2a, R^3a a R^4a jsou nezávisle vybrány ze skupiny, obsahující vodík a halogen, a R^7a je Cl nebo Br, v přítomnosti nějaké silné báze, za získání sloučeniny vzorce

R²³

R³³ (b) reakci sloučeniny z kroku (a) s (i) POCI3 za získání kyanosloučeniny vzorce

nebo (ii) DIBALH (diizobutylaluminium hydrid) za získání aldehydu vzorce

(c) reakci této kyanosloučeniny nebo tohoto aldehydedu s derivátem piperidinu vzorce MgL

-21 CZ 297450 B6 kde L je odštěpovaná skupina, vybraná ze skupiny, obsahující Cl a Br, za získání buď ketonu nebo alkoholu vzorce:

(d) (i) cyklizací tohoto ketonu CF3SO3H, za získání sloučeniny vzorce

kde přerušovaná čára představuje dvojnou vazbu; nebo (d) (ii) cyklizací tohoto alkoholu kyselinou polyfosforečnou za získání intermediátové sloučeniny, kde přerušovaná čára představuje jednoduchou vazbu.

Způsoby pro přípravu těchto intermediátových sloučenin popsané v WO 95/10516, US 5 151 423 a popsané níže, využívají tricyklické ketonového intermediátu. Takovéto intermediáty vzorce

kde R^llb, R^la, R^2a, R^3a a R^4a jsou nezávisle vybrány ze skupiny, obsahující vodík a halogen, může být připraven pomocí následujícího postupu, který zahrnuje:

(a) reakci sloučeniny vzorce

-22CZ 297450 B6 (i) s aminem vzorce NHR^5aR^6a, kde R^5a a R^6a jsou definovány ve výše uvedeném postupu;

v přítomnosti palladiového katalyzátoru a oxidu uhličitého, za získání amidu vzorce

(ii) s alkoholem vzorce R^10aOH, kde R¹⁰ je nižší Cj—C^-alkyl nebo C3-C₆-cykloalkyl, v přítomnosti palladiového katalyzátoru a oxidu uhličitého, za získání esteru vzorce

a dále reakci tohoto esteru s aminem vzorce NHR^5aR^6a, za získání amidu;

(b) reakci tohoto amidu s benzylovou sloučeninou, substituovanou jodem, vzorce

_Rža _R3a kde R^la, R^2a, R^3a, R^4a a R^7a jsou definovány výše, v přítomnosti silné báze, za získání sloučeniny vzorce

_R2a

R³³ (c) cyklizací sloučeniny kroku (b) činidlem vzorce R^8aMgL, kde R^8a je C]-C₆-alkyl, aryl nebo heteroaryl a L je Br nebo Cl, kde se před cyklizací sloučeniny, kde je R^5a a R^6a vodík, nechají reagovat s vhodnou N-blokující skupinou.

(+)-Izomery sloučenin vzorce XVI

-23 CZ 297450 B6 kde X je CH mohou být připraveny vyšší enantioselektivitou, za použití postupu, který obsahuje enzymem katalyzovanou transesterifikaci. Přednostně se racemická sloučenina vzorce XVI, kde X je C a dvojná vazba je přítomna, nechá reagovat s enzymem, jako je ToYobo LIP-300 a nějakým acylačním činidlem, jako je trifluorethylizobutyrát; výsledný (+)-amid je poté hydrolyzován, například refluxováním s nějakou kyselinou, jako je H2SO4, za získání odpovídajícího opticky obohaceného (+)-izomeru, kde X je CH.

Alternativně je racemická sloučenina vzorce XVI, kde X je C a dvojná vazba je přítomna, nejdříve redukována na odpovídající racemickou sloučeninu vzorce XVI, kde X je CH, a poté se na ní působí enzymem (Toyobo LIP-300) a nějakým acylačním činidlem, jak jest popsáno výše, za získání (+)-amidu, který je hydrolyzován, za získání odpovídajícího opticky obohaceného (+)-izomeru.

Sloučenina příkladu 21 je získána v krystalickém stavu. Odborníci v oboru pochopí, že sloučeniny, získané v amorfním stavu, mohou být získány v krystalickém stavu krystalizaci amorfních látek z rozpouštědel nebo směsí rozpouštědel, jako je aceton, diethylether, ethylacetát, ethanol, 2-propanol, /erc-butylether, voda apod., podle postupů, v oboru dobře známých.

Odborníci v oboru také pochopí, že racemická směs sloučeniny 11.0 může být vytvořena podle níže popsaných postupů. Například, pro přípravu sloučeniny 11.0 může být použit intermediát příkladu 6.

Příprava piperazinových sloučenin

Sloučeniny tohoto vynálezu, mající piperazinový kruh

-24CZ 297450 B6

Keton XX může být připraven oxidací odpovídající pyridylové sloučeniny:

(XXI) kyselinou /w-chlorperoxybenzoovou.

Keton XX může být přeměněn na odpovídající C-l 1-hydroxysloučeninu, která může být přeměněna na odpovídající sloučeninu s chlorem v pozici C-l 1.

(XX)

Sloučenina XXIII může poté reagovat s piperazinem za vzniku tohoto intermediátu:

Intermediát XXIV může poté reagovat s těmi činidly, která poskytnou požadovaný konečný produkt.

Výše uvedené reakce jsou v oboru dobře známé a jsou objasněny v následujících příkladech.

Následující příklady mají objasňovat tento nárokovaný vynález a neměly by být chápány jako omezující popis nebo tento nárokovaný vynález.

-25CZ 297450 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Krok A:

CO₂Et

Smíchejte 10 g (60,5 mmol) ethyl-4-pyridylacetátu a 120 ml bezvodého CH₂C1₂ při -20 °C, přidejte 10,45 g (60,5 mmol) MCPBA a míchejte při -20 °C po dobu 1 hodiny a poté při 25 °C po dobu 67 hodin. Přidejte dalších 3,48 g (20,2 mmol) MCPBA (m-chlorperbenzoová kyselina) a míchejte při 25 °C po dobu 24 hodin. Zřeďte CH₂C1₂ a promyjte nasyceným NaHCO₃ (vodným) a poté vodou. Vysušte pomocí MgSO₄, zahustěte ve vakuu a chromatografujte (silikagel, 2%5,5% (10% NH₄OH v MeOH)/CH₂Cl₂) za získání 8,12 g produktu.

Hmot, spektr.: MH⁺ = 182,15

Krok B:

Ό-Ν *Ό-Ν

Smíchejte 3,5 g (19,3 mmol) produktu kroku A, 17,5 ml EtOH a 96,6 ml 10% NaOH (vodného) a tuto směs zahřívejte při 67 °C po dobu 2 hodin. Přidáním 2 N HC1 (vodné) a upravte pH na 2,37 a zahustěte ve vakuu. Přidejte 200 ml bezvodého EtOH, přefiltrujte přes celite® a filtrační koláč promyjte bezvodým EtOH (2x50 ml). Zahustěte smíchané filtráty ve vakuu za získání 2,43 g cílové sloučeniny.

Příklad 2

Cílová sloučenina byla připravena postupem, popsaným v PCT přihlášce WO 95/10516

-26CZ 297450 B6

Příklad 3

Krok A:

Smíchejte 14,95 g (39 mmol) 8-chlor-l l-(l-ethoxykarbonyM-piperidinyl)-l 1 H-benzo[5,6jcyklohepta[l,2-b]pyridinu a 150 ml CH2CI2, poté přidejte 13,07 (42,9 mmol) (nBu)₄NNO₃ a tuto směs ochlaďte na 0 °C. Pomalu (po kapkách), po dobu 1,5 hodiny, přidávejte roztok 6,09 ml (42,9 mmol) TFAA (2,2,2-trifluoracetamid) v 20 ml CH2CI2. Směs udržujte přes noc v 0 °C a poté ji postupně promyjte nasyceným NaHCO₃ (vodným), vodou a roztokem NaCl. Tento 10 organický roztok vysušte pomocí Na₂SO₄, zahustěte ve vakuu a chromatografujte (silikagel, EtOAc/hexanový gradient) za získání 4,32 g a 1,90 g dvou produktů 3 A(i) a 3 A(ii).

Hmot, spektr, pro sloučeninu 3A(i): MH' = 428,2.

Hmot, spektr, pro sloučeninu 3A(ii): MH⁺ = 428,3.

-27CZ 297450 B6

Krok B:

Smíchejte 22 g (51,4 mmol) produktu 3A(i) kroku A, 150 ml 85% EtOH (vodného), 25,85 g (0,463 mol) Fe prášku a 2,42 g (21,8 mmol) CaCl₂ a zahřívejte přes noc pod zpětným chladičem. Přidejte 12,4 g (0,222 mol) Fe prášku a 1,2 g (10,8 mmol) CaCl₂ ml a zahřívejte pod zpětným chladičem po dobu 2 hodin. Přidejte dalších 12,4 g (0,222 mol) Fe prášku a 1,2 g (10,8 mmol) CaCl₂ ml a zahřívejte pod zpětným chladičem po dobu dalších 2 hodin. Tuto horkou směs přefiltrujte přes celíte®, tento celíte® promyjte 50 ml horkého EtOH a filtrát zahustěte ve vakuu. Přidejte 100 ml bezvodého EtOH, zahustěte a chromatografujte (silikagel, MeOH/CH₂Cl₂ gradient) za získání 16,47 g produktu.

MH⁺ = 398.

Krok C:

Smíchejte 16,47 g (41,4 mmol) produktu kroku B a 150 ml 48% HBr (vodné) a ochlaďte na

-3 °C. Pomalu (po kapkách) přidejte 18 ml bromu, poté pomalu (po kapkách) přidejte roztok

8,55 g (0,124 mmol) NaNO₂ v 85 ml vody. Míchejte po dobu 45 minut při -3 až 0 °C a poté upravte pH na 10, přidáním 50% NaOH (vodného). Extrahujte EtOAc, extrakty promyjte roztokem NaCl a vysušte je pomocí Na₂SO₄. Zahustěte a chromatografujte (silikagel, EtOAc/hexanový gradient) za získání 10,6 g a 3,28 g dvou produktů 3C(i) a 3C(ii).

-28CZ 297450 B6

Hmot, spektr, pro sloučeninu 3C(i): MH⁺ = 461,2.

Hmot, spektr, pro sloučeninu 3C(ii): MH⁺ = 539.

Krok D:

Hydrolyzujte produkt 3C(i) kroku C rozpuštěním v koncentrované HCI a zahřátím na asi 100 °C na dobu 16 hodin. Směs ochlaďte a poté ji neutralizujte 1 M NaOH (vodným). Extrahujte CH2CI2, extrakty vysušte pomocí MgSO₄, přefiltrujte je a zahustěte ve vakuu za získání cílové sloučeniny.

Hmot spektr.: MH⁺ = 466,9.

Příklad 4

Krok A:

Smíchejte 25,86 g (55,9 mmol) ethylesteru kyseliny 4-(8-chlor-3-brom-5,6-dihydro-l 1Hbenzo[5,6]cyklohepta[l,2-b]pyridin-l l-yliden)-l-piperidin-l-karboxylové a 250 ml koncentrované H₂SO₄ při -5 °C, poté přidejte 4,8 g (56,4 mmol) NaNO₃ a míchejte po dobu 2 hodin.

-29CZ 297450 B6

Tuto směs přilijte k 600 g ledu a alkalizujte ji přidáním koncentrovaného NH₄OH (vodného).

Směs přefiltrujte a promyjte 300 ml vody, poté extrahujte 500 ml CH₂C1₂. Extrakt promyjte

200 ml vody, vysušte jej pomocí MgSO₄, poté jej přefiltruje a zahustěte ve vakuu. Chromatografujte (silikagel, EtOAc/CH₂Cl₂ gradient) za získání 24,4 g (výtěžek 86 %) produktu.

t.t. = 165 až 176 °C, hmot, spektr.: MH⁺ = 506 (Cl).

Prvková analýza: vypočteno - C-52,13; H-4,17; N-8,29 zjištěno-C-52,18; H-4,51; N-8,16.

Krok B:

Smíchejte 29 g (40,5 mmol) produktu kroku A a 200 ml koncentrované H₂SO₄ při 20 °C, poté směs ochlaďte na 0 °C. Ktéto směsi přidejte 7,12 (24,89 mmol) l,3-dibrom-5,5-dimethylhydantoinu a míchejte po dobu 3 hodin při 20 °C. Ochlaďte na 0 °C, přidejte další 1 g (3,5 mmol) dibromhydantoinu a míchejte při 20 °C po dobu 2 hodin. Tuto směs přilijte k 400 g ledu a zvyšte pH přidáním koncentrovaného NH₄OH (vodného) při 0 °C a výslednou pevnou látku shromážděte filtrací. Promyjte ji 300 ml vody, suspendujte ve 200 ml acetonu a přefiltrujte, za získání 19,79 g (výtěžek 85,6 %) produktu, t.t. = 236 až 237 °C, hmot, spektr.: MH⁺ = 584 (Cl).

Prvková analýza: vypočteno - C-45,11; H-3,44; N-7,17 zjištěno - C^14,95; H-3,57; N-7,16.

Krok C:

Smíchejte 25 g (447 mmol) Fe náplní, 10 g (90 mmol) CaCl₂ a suspenzi 20 g (34,19 mmol) produktu kroku B v 700 ml směsi EtOH/voda (90 : 10) při 50 °C. Tuto směs zahřívejte pod zpětným chladičem přes noc, přefiltrujte ji přes celíte® a filtrační koláč promyjte 2x200 ml horkého

EtOH. Spojte filtrát a promytí a zahustěte ve vakuu. Extrahujte 600 ml CH₂C1₂, promyjte 300 ml

-30CZ 297450 B6 vody a vysušte pomocí MgSO₄. Přefiltruje a zahustěte ve vakuu, poté chromatografujte (silikagel,

EtOAc/CH₂Cl₂) za získání 11,4 g (výtěžek 60 %) produktu.

t.t. = 211 až212°C hmot, spektr.: MH⁺ = 554 (Cl).

Prvková analýza: vypočteno - C-47,55; H-3,99; N-7,56 zjištěno - C-47,45; H-4,31; N-7,49.

Krok D:

Pomalu (po částech) přidávejte 20 g (35,9 mmol) produktu kroku C k roztoku 8 g (116 mmol) NaNO₂ ve 120 ml koncentrované HC1 (vodné) při -10 °C. Výslednou směs míchejte při 0 °C po dobu 2 hodin, poté pomalu (po kapkách) při 0 °C, po dobu 1 hodiny, přidávejte 150 ml (1,44 mol) 50% H₃PO₄. Tuto směs míchejte při 0 °C po dobu 3 hodin, poté ji přilijte k 600 g ledu a alkalizujte přidáním koncentrovaného NH₄OH (vodného). Extrahujte 2 x 300 ml CH₂C1₂, extrakty vysušte pomocí MgSO₄, poté přefiltrujte a zahustěte ve vakuu. Chromatografujte (silikagel, 25% EtOAc/hexan) za získání 13,67 g (výtěžek 70 %) produktu, t.t. = 163 až 165 °C, hmot, spektr.: Μ1Γ = 539 (Cl).

Prvková analýza:

vypočteno - C-48,97; H-4,05; N-5,22 zjištěno - C—48,86; H-3,91; N-5,18.

Krok E:

-31 Smíchejte 6,8 g (12,59 mmol) produktu kroku D a 100 ml koncentrované HC1 (vodné) a míchejte přes noc při 85 °C. Tuto směs ochlaďte, nalijte ji na 300 g ledu a alkalizujte přidáním koncentrovaného NH₄OH (vodného). Extrahujte 2 x 300 ml CH₂CI₂, extrakty poté vysušte pomocí MgSO₄.

Přefiltrujte a zahustěte ve vakuu, poté chromatografujte (silikagel, 10% MeOH/EtOAc + 2%

NH₄OH (vodný)) za získání 5,4 (výtěžek 92 %) produktu, t.t. = 172 až 174 °C, hmot, spektr.:

MH⁺ = 467.

Prvková analýza: vypočteno - C-48,69; H-3,65; N-5,97. zjištěno - C-48,83; H-3,80; N-5,97.

Hydrolyzujte 2,42 g ethylesteru kyseliny 4-(8-chlor-3-brom-5,6-dihydro-l lH-benzo[5,6]cyklohepta[l,2-b]pyridin-l l-yliden)-l-piperidin-l-karboxylové podle v podstatě stejného postupu, jako je ten, který je popsán v kroku D příkladu 3, za získání 1,39 g (výtěžek 69 %) produktu.

MH⁺ = 389.

Krok B:

Smíchejte lg (2,48 mmol) produktu kroku A a 25 ml bezvodého toluenu, přidejte 2,5 ml 1 M

D1BAL v toluenu a tuto směs zahřívejte pod zpětným chladičem. Po půl hodině přidejte další

-32CZ 297450 B6 ml 1 M DIBAL v toluenu a zahřívejte pod zpětným chladičem po dobu 1 hodiny. (Reakce je sledována pomocí TLC, za použití 50% MeOH/CH₂C12 + NH4OH (bezvodý). Směs ochlaďte na pokojovou teplotu, přidejte 1 N HCI (vodnou) a míchejte 5 minut. Přidejte 100 ml 1 N NaOH (vodného) a poté extrahujte EtOAc (3 x 150 ml). Extrakty vysušte pomocí MgSO₄, přefiltrujte a zahustěte ve vakuu za získání 1,1 g cílové sloučeniny.

MH⁺ = 391.

Příklad 6

Smíchejte 16,6 (0,03 mol) produktu kroku D příkladu 4 s roztokem (3:1) CH3CN a vody (212,64 ml CH₃CN a 70,8 ml vody) a výslednou suspenzi míchejte přes noc při teplotě místnosti. Přidejte 32,833 g (0,153 mol) NaIO₄ a poté 0,31 g (2,30 mmol) RuO₂ a míchejte při teplotě místnosti (přidání RuO₂ je doprovázeno exotermní reakcí a zvýšením teploty z 20 °C na 30 °C). Tuto směs míchejte po dobu 1,3 hodiny (teplota asi po 30 min znovu klesne na 25 °C), poté ji přefiltrujte za účelem odstranění pevných látek a ty promyjte CH₂C1₂. Filtrát zahustěte ve vakuu a rozpusťte v CH₂C1₂. Přefiltruje za účelem odstranění nerozpustných pevných látek a ty promyjte CH₂C1₂. Filtrát promyjte vodou, zahustěte na objem asi 200 ml a promyjte louhem a poté vodou. Extrahujte 6 N HCI (vodnou). Vodný extrakt ochlaďte na 0 °C a pomalu přidávejte 50% NaOH (vodný), za účelem upravení pH na 4, a při tom udržujte teplotu nižší než 30 °C. Extrahujte dvakrát CH₂C1₂, vysušte pomocí MgSO₄ a zahustěte ve vakuu. Zbytek suspendujte ve 20 ml EtOH a ochlaďte na 0 °C. Shromážděte výsledné pevné látky filtrací a vysušte je ve vakuu, za získání 7,95 g produktu. ^]H NMR (CDC1₃, 200 MHz): 8,7 (s, 1H); 7,85 (m, 6H); 7,5 (d, 2H); 3,45 (m, 2H);3,15(m, 2H).

-33 CZ 297450 B6

Příklad 7

Krok A:

Smíchejte 15 g (38,5 mmol) ethylesteru kyseliny 4-(8-chlor-3-brom-5,6-dihydro-l 1 H-benzo[5,6]cyklohepta[l,2-b]pyridin-l l-yliden)-l-piperidin-l-karboxylové a 150 ml koncentrované H2SO4 při -5 °C, poté přidejte 3,89 g (38,5 mmol) KNO3 a míchejte po dobu 4 hodin. Tuto směs přilijte k 3 1 ledu a alkalizujte ji přidáním 50% NaOH (vodného). Extrahujte CH₂C1₂, vysušte pomocí MgSO₄, poté přefiltruje a zahustěte ve vakuu. Zbytek překrystalizujte z acetonu, za získání 6,69 g produktu.

'HNMR (CDC1₃, 200 MHz): 8,5 (s, 1H); 7,75 (s, 1H); 7,6 (s, 1H); 7,35 (s, 1H); 4,15 (q, 2H); 3,8 (m, 2H), 3,5 - 3,1 (m, 4H); 3,0-2,8 (m, 2H); 2,6-2,2 (m, 4H); 1,25 (t, 3H).

MH⁺ = 506.

Krok B:

Smíchejte 6,69 g (13,1 mmol) produktu kroku A a 100 ml 85% roztoku EtOH/voda, poté přidejte

0,66 (5,9 mmol) CaCI₂ a 6,56 g (117,9 mmol) Fe a tuto směs zahřívejte přes noc pod zpětným

-34CZ 297450 B6 chladičem. Horkou reakční směs přefiltrujte přes celite® a filtrační koláč promyjte horkým

EtOH. Filtrát zahustěte ve vakuu za získání 7,72 g produktu.

Hmot, spektr.: MH⁺ = 476,0.

Krok C:

Smíchejte 7,70 g produktu kroku B a 35 ml HOAc, poté přidejte 45 ml roztoku Br₂ v HOAc a tuto směs míchejte přes noc při teplotě místnosti. Přidejte 300 ml 1 N NaOH (vodného), poté ío 75 ml 50% NaOH (vodného) a extrahujte EtOAc. Extrakt vysušte pomocí MgSO₄ a zahustěte ve vakuu. Chromatografujte (silikagel, 20% EtOAc/hexan) za vzniku 3,47 g produktu (společně s dalšími 1,28 g částečně purifíkovaného produktu).

Hmot, spektr.: MH⁺ = 554.

’HNMR(CDC1₃, 300 MHz): 8,5 (s, 1H); 7,5 (s, 1H); 7,15 (s, 1H); 4,5 (s, 2H); 4,15 (m, 3H); 3,8 (br s, 2H); 3,4 - 3,1 (m, 4H); 9 - 2,75 (m, 1H); 2,7 - 2,5 (m, 2H); 2,4 - 2,2 (m, 2H); 1,25 (m, 3H).

Krok D:

Smíchejte 0,557 g (5,4 g mmol) dusitanu Z-butylnatého a 3 ml DMF a tuto směs zahřívejte při

- 70 °C. Pomalu (po kapkách) přidejte směs 2,00 g (3,6 mmol) produktu kroku C a 4 ml DMF, poté směs ochlaďte na teplotu místnosti. Přidejte dalších 0,64 ml dusitanu Z-butylnatého 25 při 40 °C a znovu směs zahřejte na 60 až 70 °C na dobu 30 min. Ochlaďte na teplotu místnosti a přilijte tuto směs k 150 ml vody. Extrahujte CH₂C1₂ vysušte pomocí MgSO₄ a zahustěte ve vakuu. Chromatografujte (silikagel, 10-20 % EtOAc/hexan) za získání 0,74 produktu.

Hmot, spektr.: MH⁺ = 539.

'H NMR (CDC1₃, 200 MHz): 8,52 (s, 1H); 7,5 (d, 2H); 7,2 (s, 1H); 4,15 (q, 2H); 3,9-3,7 (m,

2H); 3,5 - 3,1 (m, 4H); 3,0 - 2,5 (m, 2H); 2,4 - 2,2 (m, 2H); 2,1-1,9 (m, 2H); 1,26 (t, 3H).

-35 CZ 297450 B6

Krok E:

Smíchejte 0,70 g (1,4 mmol) produktu kroku D a 8 ml koncentrované HC1 (vodné) a zahřívejte přes noc pod zpětným chladičem. Přidejte 30 ml 1 N NaOH (vodného), poté 5 ml 50% NaOH (vodného) a extrahujte CH₂C1₂. Extrakt vysušte pomocí MgSO₄ a zahustěte ve vakuu za získání 0,59 g cílové sloučeniny.

Hmot, spektr.: MH⁺ = 467. t.t. = 123,9 až 124,2 °C

Příklad 8

racemická stejně jako (+)- a (-)- enantiomery

Připravte roztok 8,1 g cílové sloučeniny příkladu 7 v toluenu a přidejte 1 M roztok DIBAL v toluenu. Tuto směs zahřívejte pod zpětným chladičem a pomalu (po kapkách) přidávejte dalších ml 1 M roztoku DIBAL/toluen po dobu 40 min. Reakční směs ochlaďte na asi 0 °C a přidejte

700 ml 1 M HCI (vodné). Oddělte a odložte organickou fázi. Vodnou fázi promyjte CH₂C1₂ a extrakt odložte, poté vodnou fázi alkalizujte přidáním 50% NaOH (vodného). Extrahujte

-36CZ 297450 B6

CH₂C1₂, vysušte pomocí MgSO₄ a zahustěte ve vakuu za získání 7,30 g cílové sloučeniny, která je racemickou směsí enantiomerů.

MH⁺ = 469.

Krok B - oddělení enantiomerů:

Racemická sloučenina kroku B rozdělena preparativní chirální chromatografíí (Chiralpack AD, kolona 5 cm X 50 cm, za použití 20% iPrOH/hexanu + 0,2% diethylaminu), za vzniku (+)-enan10 tiomeru a (-)-enantiomeru cílové sloučeniny.

Fyzikálně chemické údaje pro (+)-enantiomer: t.t. = 148,8 °C

Hmot, spektr.: MH⁺ = 469; [cc]_D ^{25 =} +65,6° (112,93 mg/2 ml MeOH).

Fyzikálně chemické údaje pro (-)-enantiomer: t.t. = 112 °C

Hmot, spektr.: MH⁺ = 469; [oc]_D ^{25 =} -65,2° (3,65 mg/2 ml MeOH).

-37CZ 297450 B6

Příklad 9

Smíchejte 40 g (0,124 mol) výchozího ketonu a 200 ml H₂SO₄ a ochlaďte na 0 °C. Po dobu 1,5 hodiny přidávejte pomalu 13,78 g (0,136 mol) KNO₃, poté zahřejte na teplotu místnosti a míchejte přes noc. Reakční směs zpracujte za použití v podstatě stejného postupu, jako je ten, který byl popsán krok A příkladu 4. Chromatografujte (silikagel, 20%, 30%, 40%, 50% EtOAc/hexan. Poté 100% EtOAc) za získání 28 g 9-nitrosloučeniny, společně s menším množstvím 7-nitrosloučeniny a 19 g směsi 7-nitro- a 9-nitrosloučeniny.

MET = (9-nitro) = 367.

Krok B:

Nechte reagovat 28 g (76,2 mmol) a 9-nitrosloučeniny kroku A, 400 ml 85% roztoku EtOH/voda, 3,8 g (34,3 mmol) CaCl₂ a 38,28 g (0,685 mol) Fe, za použití v podstatě stejného postupu, jako je ten, který byl popsán pro krok C příkladu 4, za získání 24 g produktu. MH⁺ = 337.

-38CZ 297450 B6

Smíchejte 13 g (38,5 mmol) produktu kroku B, 140 ml HOAc a po dobu 20 min přidávejte pomalu roztok 2,95 ml (57,8 mmol) Br₂ v 10 ml HOAc. Tuto reakční směs míchejte při pokojové teplotě, poté zahustěte ve vakuu. Přidejte CH₂CI₂ a vodu, poté 50% NaOH (vodným) upravte pH na 8-9. Promyjte organickou fázi vodou, poté roztokem NaCl a vysušte pomocí Na₂SO4. Zahustěte ve vakuu za získání 11,3 g produktu.

’H NMR (CDClj, 200 MHz): 8,73 (d, 1H); 7,74 (d, 1H); 7,14 (s, 1H); 4,63 (s, 2H); 3,23 - 3,15 (m, 2H); 3,07 - 2,98 (m, 2H).

Krok D:

Ochlaďte 100 ml koncentrované HC1 (vodné) na 0 °C, poté přidejte 5,61 g (81,4 mmol) NaNO₂ a míchejte po dobu 10 min. Pomalu (po částech) přidejte 11,3 g (27,1 mmol) produktu kroku C a tuto směs míchejte při 0 až 3 °C po dobu 2,25 hodin. Pomalu (po kapkách) přidejte 180 ml 50% H3PO4 (vodné) a nechte tuto směs stát přes noc při 0 °C. Po dobu 30 minut pomalu (po kapkách) přidávejte 50% NaOH, za účelem upravení pH na 9, poté extrahujte CH₂C1₂. Extrakt promyjte vodou, poté roztokem NaCl a vysušte pomocí Na₂SO₄. Zahustěte ve vakuu a chromatografujte (silikagel, 2% EtOAc/CH₂Cl₂) za získání 8,6 g produktu. MET¹ = 399,9.

'H NMR (200 MHz, CDC1₃): 8,75 (d, 1H); 7,77 (d, 1H); 7,56 (d, 1H); 7,21 (d, 1H) a 3,3 - 3,3 (m, 4H).

-39CZ 297450 B6

Příklad 10

racemická stejně jako (+)- a (-)- enantiomery

Krok A:

Smíchejte 13 g (33,3 mmol) cílové sloučeniny kroku D příkladu 4 a 300 ml toluenu při 20 °C, poté přidejte 32,5 ml (32,5 mmol) 1 M DIBAL v toluenu. Tuto směs zahřívejte pod zpětným chladičem po dobu 1 hodiny, ochlaďte na 20 °C, přidejte dalších 32,5 ml 1 M roztoku DIBAL ío a zahřívejte pod zpětným chladičem po dobu 1 hodiny. Směs ochlaďte na 20 °C a přilijte ji ke směsi 400 g ledu, 500 ml EtOAc a 300 ml 10% NaOH (vodného). Vodnou vrstvu extrahujte CH₂C1₂ (3 x 200 ml), organické vrstvy vysušte pomocí MgSO₄ a poté zahustěte ve vakuu. Chromatografujte (silikagel, 12% MeOH/CH₂Cl₂ + 4% NH₄OH)) za získání 10,4 g cílové sloučeniny jako racemátu. Hmot, spektr.: MH⁺ = 469 (FAB). částečná ’H NMR (CDC1₃, 400 MHz): 15 8,38 (s, 1H), 7,57 (s, 1H); 7,27 (d, 1H); 7,06 (d, 1H) a 3,95 (d, 1H).

-40CZ 297450 B6

Krok B - oddělení enantiomerů:

Racemická sloučenina kroku A byla rozdělena preparativní chirální chromatografií (Chiralpack AD, kolona 5 cm X 50 cm, za použití 5% iPrOH/hexanu + 0,2% diethylaminu), za získání 5 (+)-enantiomeru a (-)-enantiomeru cílové sloučeniny.

Fyzikálně chemické údaje pro (+)-enantiomer:

Hmot, spektr.: MH⁺ = 469 (FABS); [cc]D²⁵ = +43,5° (c = 0,402, EtOH). částečná *H NMR 10 (CDC13, 400 MHz): 8,38 (s, 1H), 7,57 (s, 1H), 7,27 (d, 1H); 7,05 (d, 1H) a 3,95 (d, 1H).

Fyzikálně chemické údaje pro (-)-enantiomer:

Hmot, spektr.: MH⁺ =469 (FAB); [ot]D²⁵ = -41,8° (c = 0,328 EtOH). částečná ’H NMR (CDC13, 15 400 MHz): 8,38 (s, 1H), 7,57 (s, 1H); 7,27 (d, 1H); 7,05 (d, 1H) a 3,95 (d, 1H).

-41 CZ 297450 B6

Příklad 11

Rozpusťte 1,160 g (2,98 mmol) cílové sloučeniny příkladu 3 ve 20 ml DMF (dimethylformamid), míchejte při teplotě místnosti a přidejte 0,3914 g (3,87 mmol) 4-methylmorfolinu, 0,7418 g (3,87 mmol) DEC (diethyl-karbonát), 0,5229 g (3,87 mmol) HOBT (hydroxybenztriazol) a 0,8795 g (8,37 mmol) kyseliny l~N-t-butoxykarbonylpiperidinyl-4-octové. Tuto směs míchejte při teplotě místnosti 2 dny, poté zahustěte ve vakuu a zbytek rozdělte mezi CH2CI2 a vodu. Organickou fázi promyjte postupně nasyceným NaHCO₃ (vodným), 10% NaH₂PO4 (vodným) a roztokem NaCl. Organickou fázi vysušte pomocí MgSO,₍, přefiltrujte a zahustěte ve vakuu. Chromatografujte (silíkagel, 2% MeOH/CH₂Cl₂ + NH₃) za získání 1,72 g produktu, t.t. = 94,0 až 94,5 °C, hmot, spektr.: MH⁺ = 614.

Prvková analýza: vypočteno - C-60,54; H-6,06; N-6,83. zjištěno - C-59,93,45; H-6,62; N-7,45.

Krok B:

Smíchejte 1,67 g (2,7 mmol) produktu kroku A a 20 ml CH₂C1₂ a míchejte při 0 °C. Přidejte ml TFA, směs míchejte po dobu 2 hodin, poté alkalizujte 1 N NaOH (vodným). Extrahujte

-42CZ 297450 B6

CH2CI2, organickou fázi vysušte pomocí MgSO₄, přefiltrujte a zahustěte ve vakuu za vzniku

1,16 g produktu, t.t. = 140,2 až 140,8 °C, hmot, spektr.: MH⁺ = 514.

Krok C:

Smíchejte 0,50 g produktu kroku B, 20 ml CH₂C1₂ a 4,5 ekvivalentů (CH₃)₃SiNCO a míchejte při pokojové teplotě po dobu 3 hodin. Tuto směs extrahujte nasyceným NaHCO₃ (vodným) a organickou fázi vysušte pomocí MgSO₄. Přefiltrujte a zahustěte ve vakuu za získání hrubého produktu. Tento hrubý produkt chromatografujte (silikagel, 5% MeOH/CH₂Cl₂ + NH₃) za získání 0,26 g produktu, t.t. = 170,2 až 170,5 °C, hmot, spektr.: MH⁺ = 557.

Příklad 12

Smíchejte 0,5 g (1,06 mmol) cílové sloučeniny příkladu 4, 0,4 g (2,61 mmol) cílové sloučeniny příkladu 1, 5 ml bezvodého DMF a 0,5 ml (4,53 mmol) 4-methylmorfolinu při 0 °C, poté přidejte 0,6 g (3,12 mmol) DEC a 0,4 g (2,96 mmol) HOBT a tuto směs míchejte přes noc při 20 °C. Zahustěte ve vakuu a extrahujte CH₂C1₂ (2 X 50 ml). Extrakty promyjte 25 ml vody, vysušte pomocí MgSO₄, poté zahustěte ve vakuu a chromatografujte (silikagel, 10% MeOH/EtOAc + 20% NH₄OH (vodný)) za získání 0,6 g (výtěžek 93,7 %) cílové sloučeniny. Hmot, spektr.: MH⁺= 602 (FABS); částečná 'HNMR (CDC1₃, 300 MHz): 8,48 (s, 1H); 8,16 (d, 2H); 7,61 (s, 1H); 7,29 (m, 1H); 7,18 (d, 2H); 7,04 (d, 1H); 3,71 (s, 2H).

Prvková analýza: vypočteno - C-48,81; H-4,10; N-6,57.

zjištěno - CM9,10; H-3,79; N-6,74.

-43CZ 297450 B6

Příklad 13

Rozpusťte 5,9 g (9,78 mmol) cílové sloučeniny příkladu 12 v 300 ml CH₂Cl₂/EtOAc (1:5) při 0 °C. Pomalu (po kapkách) přidejte 3 ml 4 N HC1 (vodné) a tuto směs míchejte při 0 °C po dobu 5 minut. Přidejte 200 ml Et₂O, shromážděte pevné látky filtrací a promyjte je 50 ml Et₂O. Vysušte je při 20 °C a 0,2 mm Hg za získání 5,9 g (výtěžek 96 %) cílové sloučeniny. Hmot, spektr.: MH⁺ = 602 (FABS); částečná *H NMR (DMSO-d₆, 300 MHz): δ 8,66 (d, 2H); 8,51 (s, 1H); 7,95 (s, 1H); 7,67 (d, 2H); 7,47 (m, 1H); 7,15 (m, 1H); 3,99 (s, 2H).

Prvková analýza: vypočteno - C-48,77; H-3,62; N-6,56. zjištěno - C-48,34; H-3,95; N-6,84.

Příklad 14

Krok A:

Smíchejte 0,501 g (1,28 mmol) cílové sloučeniny příkladu 5 a 20 ml bezvodého DMF, poté přidejte 0,405 g (1,664 mmol) kyseliny l-N-/-butoxykarbonylpiperidinyM-octové, 0,319 g (1,664 mmol) DEC, 0,225 g (1,664 mmol) HOBT a 0,168 g (1,664 mmol) 4-methyimorfolinu

-44CZ 297450 B6 a tuto směs míchejte přes noc při teplotě místnosti. Tuto směs zahustěte ve vakuu a zbytek rozdělte mezi 150 ml CH₂C1₂ a 150 ml nasyceného NaHCO₃ (vodného). Vodnou fázi extrahujte dalšími 150 ml CH₂C1₂. Organickou fázi vysušte pomocí MgSO₄ a zahustěte ve vakuu. Chromatografujte (silikagel, 500 ml hexanu, 1 1 1% MeOH/CH₂Cl₂ + 0,1% NH₄OH (vodný), poté 1 1 2%

MeOH/CH₂Cl₂ + 0,1% NH₄OH (vodný)) za získání 0,575 g produktu.

t.t. = 115 až 125 °C, hmot, spektr.: MH⁺ = 616.

Krok B

Smíchejte 0,555 g (0,9 mmol) produktu kroku A a 15 ml CH₂C1₂ a tuto směs ochlaďte na 0 °C. Přidejte 15 ml TFA a míchejte při 0 °C po dobu 2 hodin. Zahustěte ve vakuu při 40 až 45 °C a zbytek rozdělte mezi 150 ml CH₂C1₂ a 100 ml nasyceného NaHCO₃ (vodného). Vodnou vrstvu extrahujte 100 ml CH₂C1₂, spojte extrakty a vysušte je pomocí MgSO₄. Zahustěte ve vakuu za získání 0,47 g produktu, t.t. = 140 až 150 °C, hmot, spektr.: MH⁺ = 516.

Krok C:

Smíchejte 0,449 g (0,87 mmol) produktu kroku B, 20 ml CH₂C1₂ a 0,501 g (0,59 mmol) (CH₃)₃SiNCO a míchejte přes noc při teplotě místnosti. Přidejte 50 - 75 ml nasyceného NaHCO₃ (vodného) a míchejte po dobu 0,5 hodiny. Zřeďte CH₂C1₂, oddělte vrstvy a vodnou vrstvu extrahujte 2 X 100 ml CH₂C1₂. Spojené extrakty vysušte pomocí MgSO₄ a zahustěte ve vakuu. Chromatografujte (silikagel, 500 ml hexanu, 111% MeOH/CH₂Cl₂ + 0,1% NH₄OH; 1 1 2% MeOH/CH₂Cl₂ + 0,2% NFLjOH: poté 3% MeOH/CH₂Cl₂ + 0,3% NH₄OH) za získání 0,33 g cílové sloučeniny, t.t. = 145 až 155 °C, hmot, spektr.: MH⁺ = 559.

-45CZ 297450 B6

Příklad 15

Nechte reagovat cílovou sloučeninu příkladu 7 a cílovou sloučeninu příkladu 1, za použití v podstatě stejného postupu jako je ten, který byl popsán pro příklad 12, za získání 0,25 g cílové sloučeniny, která je racemickou směsí atropizomerů, hmot, spektr.: MH⁺ = 602.

t.t. = 167,2 až 167,8 °C.

Sůl HC1 cílové sloučeniny příkladu 15 je připravena mícháním po dobu 1 hodiny s HCI/CH2CI2 a poté zahuštěním ve vakuu za vzniku soli.

Příklady 16A a 16B

Cílová sloučenina příkladu 15 je racemickou směsí atropizomerů. Tyto atropizomery jsou odděleny preparativní chromatografií (HPLC), za použití kolony Chiralpack AD (5 cm X 50 cm) a 40% iPrOH/hexanu + 0,2% diethylaminu jako mobilní fáze, za získání jednotlivě (+) a (-)-enantiomerů, příkladu 16B a 16A.

Fyzikálně chemické údaje pro (-)-enantiomer, příklad 16A:

t.t. = 114,2 až 114,8 °C; [cc]_D ²⁵ = -154,6° (8,73 mg/2 ml MeOH).

Fyzikálně chemické údaje pro (+)-enantiomer, příklad 16B:

t.t. = 112,6 až 113,5 °C; [a]_D ²⁵ = +159,7° (10,33 mg/2 ml MeOH).

-46CZ 297450 B6

Příklad 17

Krok A:

Nechte reagovat 6,0 g (12,8 mmol) cílové sloučeniny příkladu 7 s 3,78 g (16,6 mmol) kyseliny l-N-z-butoxykarbonyl-piperidinyl-4-octové, za použití v podstatě stejných postupů jako jsou ty, které byly popsány pro krok A příkladu 14, za získání 8,52 g produktu. Hmot, spektr.: MH⁺ = 692 (FAB). ^]H NMR (CDC1₃, 200 MHz): 8,5 (d, 1H); 7,5 (d, 2H); 7,2 (d, 1H); 4,15 - 3,9 (m, 3H); 3,8 - 3,6 (m, 1H); 3,5 - 3,15 (m, 3H); 2,9 (d, 2H); 2,8 - 2,5 (m, 4H); 2,4 - 1,8 (m, 6H); 1,8-1,6 (br d, 2H); 1,4 (s, 9H); 1,25 - 1,0 (m, 2H).

Krok B:

Smíchejte 8,50 g produktu kroku A a 60 ml CH₂C1₂, poté ochlaďte na 0 °C a přidejte 50 ml TFA. Tuto směs míchejte při 0 °C po dobu 3 hodin, poté přidejte 500 ml 1 N NaOH (vodného) a následně 30 ml 50% NaOH (vodného). Extrahujte CH₂C1₂, vysušte pomocí MgSO₄ a zahustěte ve vakuu, za získání 7,86 g produktu. Hmot, spektr.: MH⁺ =592 (FAB). ^!H NMR (CDC1₃, 200 MHz): 8,51 (d, 1H); 7,52 (d, 2H); 7,20 (d, 1H); 4,1 - 3,95 (m, 2H); 3,8 - 3,65 (m, 2H); 3,5 3,05 (m, 5H); 3,0 - 2,5 (m, 6H); 2,4 - 1,8 (m, 6H); 1,4 - 1,1 (m, 2H).

-47CZ 297450 B6

Krok C:

Nechte reagovat 7,80 g (13,1 mmol) produktu kroku B s 12,1 g (105 mmol) (CH₃)₃SiNCO, za použití v podstatě stejného postupu jako je ten, který byl popsán pro krok C příkladu 14, za získání 5,5 g cílové sloučeniny, která je racemickou směsí atropizomerů. t.t. = 163,6 až 164,0 °C. Hmot, spektr.: MH⁺ = 635 (FAB). 'H NMR (CDC1₃, 200 MHz): 8,5 (d, 1H); 7,52 (d, 1H); 7,48 (d, 1H); 7,21 (d, 1H); 4,54 (s, 2H); 4,1 - 3,6 (m, 4H); 3,45 - 3,15 (m, 4H); 3,0 - 2,5 (m, 5H); 2,45-1,6 (m, 7H); 1,4-1,0 (m, 2H).

Cílová sloučenina příkladu 17 je racemickou směsí atropizomerů. Tyto atropizomery jsou odděleny preparativní chromatografií (HPLC), za použití kolony Chiralpack AD (5 cm X 50 cm) a 20% iPrOH/hexanu + 0,2% diethylaminu jako mobilní fáze, při průtokové rychlosti 100 ml/min., za získání jednotlivě (+) a (-)-enantiomerů, příkladu 18B a 18A.

Fyzikálně chemické údaje pro (-)-enantiomer, příklad 18A:

t.t. = 142,9 až 143,5 °C; [oc]_D ²⁵ = -151,7° (11,06 mg/2 ml MeOH).

Fyzikálně chemické údaje pro (+)-enantiomer, příklad 18B:

t.t. = 126,5 až 127,0 °C; [oc]_D ²⁵ = +145,6° (8,38 mg/2 ml MeOH).

-48CZ 297450 B6

Příklad 19

Smíchejte 3,32 g (+)-enantiomeru cílové sloučeniny kroku B příkladu 8 a 2,38 g cílové sloučeniny příkladu 1, 1,92 g HOBT, 2,70 g DEC, 156 ml N-methylmorfolinu a 50 ml bezvodého DMF a míchejte při 25 °C po dobu 24 hodin. Zahustěte ve vakuu, poté zřeďte CH₂C1₂. Promyjte 1 N NaOH (vodným), poté nasyceným NaH₂PO4 (vodným) a vysušte pomocí MgSO₄. Zahustěte ve vakuu a chromatografujte (silikagel, 2% MeOH/CH₂Cl₂ + NH₄OH) za získání 3,82 g cílové sloučeniny. Hmot, spektr.: MH = 604 (FAB).

Sůl kyseliny chlorovodíkové byla připravena rozpuštěním cílové sloučeniny příkladu 19 v dichlormethanu, nasyceném chlorovodíkem. Zahuštěním ve vakuu byla získána cílová sloučenina příkladu 19 jako sůl HCI. t.t. = 166,5 °C; [a]_D ²² = +70,8° (9,9 mg/2ml MeOH).

(-)-enantiomer cílové sloučeniny kroku B příkladu 8 (3,38 g) se nechá reagovat s 2,20 g cílové sloučeniny příkladu 1, podle v podstatě stejného postupu, jako je ten, který byl popsán pro příklad 19, za získání 3,58 g cílové sloučeniny příkladu 20A.

Sůl HCI cílové sloučeniny příkladu 20A byla připravena rozpuštěním této cílové sloučeniny v CH₂C1₂, přidání 6M HCI (g) v CH₂C1₂, poté zahuštěním ve vakuu, za získání této soli.

t.t. = 129 °C; [a]_D ²⁵ = -72,3° (3,32 mg/2ml MeOH).

Racemická cílová sloučenina kroku A příkladu 8 se nechá reagovat s 2,20 g cílové sloučeniny příkladu 1, podle v podstatě stejného postupu, jako je ten, který byl popsán v příkladu 20A, za získání cílové sloučeniny příkladu 20B.

t.t. = 145,0 °C

-49CZ 297450 B6

Příklad 21

Nechte reagovat 1,33 g (+)-enantiomeru cílové sloučeniny kroku B příkladu 8 s 1,37 g kyseliny l-N-t-butoxykarbonyl-piperidinyl-4-octové, za použití v podstatě stejného postupu, jako je ten, který byl popsán v kroku A příkladu 14, za získání 2,78 g produktu. Hmot, spektr.: MH⁺ = 694,0 (FAB); [a]_D ²⁵ = +34,1° (5,45 mg/2ml MeOH).

Krok B:

Upravte 2,78 g produktu kroku A podle v podstatě stejného postupu, jako je ten, který byl popsán v kroku B příkladu 17, za získání 1,72 g produktu.

t.t. = 104,1 °C; Hmot, spektr.: MH⁺ = 594; [a]_D ²⁵ = +53,4° (11,42 mg/2ml MeOH).

-50CZ 297450 B6

Krok C:

Upravte 1,58 g produktu kroku B 6 ml (CH₃)₃SiNCO, za použití v podstatě stejného postupu, jako je ten, který byl popsán pro krok C příkladu 14, za získání 1,40 g cílové sloučeniny.

t.t. = 140 °C; Hmot, spektr.: MH⁺ =627; [a]_D ²⁵ = +49,1° (4,24 mg/2ml MeOH).

Překrystalizujte z acetonu za získání cílové sloučeniny jako pevné látky.

t.t. = 214,5 až 215,9 °C.

(-) enantiomer cílové sloučeniny kroku B příkladu 8 (3,38 g) byl přeměněn na cílovou sloučeninu (příkladu 22A) v podstatě stejným postupem, který byl popsán pro kroky A-C příkladu 21, za získání cílové sloučeniny příkladu 22A. t.t. = 152 °C; Hmot, spektr.: MH⁺ = 637;

[a]_D ²⁵ =-62,5 °C (1,12 mg/2ml MeOH).

Racemická cílová sloučenina kroku A příkladu 8 byla přeměněna na cílovou sloučeninu (příkladu 22B) v podstatě stejným postupem, který byl popsán pro kroky A-C příkladu 10, za získání cílové sloučeniny příkladu 22B. t.t. = 111 °C.

-51 CZ 297450 B6

Příklad 23

Krok A:

Nechte reagovat 1,35 g (+)-enantiomeru cílové sloučeniny kroku B příkladu 10 s 1,4 g kyseliny l-N-/-butoxykarbonylpiperidinyl-4-octové a dále postupujte v podstatě podle stejného postupu, který byl popsán v kroku A příkladu 14, za získání 2,0 g produktu. Hmot, spektr.: MH⁺ = 694,0 (FAB); částečná ’H NMR (CDC1₃, 300 MHz): 8,38 (s, 1H); 7,60 (s, 1H); 7,25 (d, 1H); 7,05 (m, 1H); 1,45 (s, 9H).

Krok B:

Upravte 1,95 g produktu kroku A v podstatě stejným postupem, který byl popsán pro krok B příkladu 17, za získání 1,63 g produktu.

Hmot, spektr.: MH⁺ = 594; částečná ‘HNMR (CDC1₃, 300 MHz): 8,38 (s, 1H); 7,60 (s, 1H); 7,25 (d, 1H); 7,03 (m, 1H); 4,64 (d, 1H); 3,90 (m, 2H).

-52CZ 297450 B6

Krok C:

Upravte 1,6 g produktu kroku B s 1,3 ml (CH₃)₃SiNCO, za použití v podstatě stejného postupu, který byl popsán pro krok C příkladu 14, za získání 1,27 g cílové sloučeniny.

Hmot, spektr.: MH⁺= 627 (FABS); [cc]D²⁵ = -33,1° (c = 0,58, EtOH). částečná 'H NMR (CDC13, 400 MHz): 8,38 (s, 1H); 7,60 (s, 1H); 7,25 (d, 1H); 7,04 (m, 1H); 4,60 (d, 1H); 4,41 (s, 2H).

Příklady 24A a 24B

(+) enantiomer cílové sloučeniny kroku B příkladu 8 (3,38 g) byl přeměněn na cílovou sloučeninu v podstatě stejným postupem, který byl popsán pro kroky A-C příkladu 21, za získání cílové sloučeniny příkladu 24A. Hmot, spektr.: MH⁺ = 637 (FABS); [a]D^{25 =} +32,4° (c = 0,57, EtOH). Částečná ’H NMR (CDC13, 400 MHz): 8,39 (s, 1H); 7,59 (s, 1H); 7,25 (d, 1H); 7,04 (m, 1H), 4,60 (d, 1H), 4,41 (s, 2H). Částečná *H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz): 8,42 (s, 1H); 7,88 (s, 1H);

7.41 (d, 1H); 7,29 (m, 1H); 5,85 (s, 2H); 4,20 (d, 1H).

Racemická cílová sloučenina kroku A příkladu 8 byla přeměněna na cílovou sloučeninu, příkladu 22B obdobným způsobem. Částečná ’H NMR (CDC1₃, 400 MHz): 8,38 (s, 1H), 7,59 (s, 1H); 7,25 (d, 1H); 7,04 (m, 1H); 4,60 (d, 1H); 4,41 (s, 2H). Částečná 'H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz):

8.42 (s, 1H); 7,88 (s, 1H); 7,41 (d, 1H); 7,29 (d, 1H); 5,85 (s, 2H); 4,20 (d, 1H).

-53CZ 297450 B6

Příklad 25

Nechte reagovat 2,6 g (+)-enantiomeru cílové sloučeniny kroku B příkladu 10 a 1,68 g cílové sloučeniny příkladu 1 v podstatě podle stejného postupu, který byl popsán pro příkladu 19, za získání 2,10 g cílové sloučeniny. Hmot, spektr.: MH⁺ = 604 (FAB);

[a]_D ²⁵ = +34,1° (10,98 mg/2M EtOH). Částečná 'H NMR (CDC1₃, 400 MHz): 8,38 (s, 1H); 8,15 (d, 2H); 7,58 (s, 1H); 7,26 (d, 1H); 7,15 (d, 2H); 7,03 (d, 1H); 4,57 (d, 1H).

Pro přípravu soli HCI cílové sloučeniny příkladu 25, rozpusťte 700 mg této cílové sloučeniny v 4 ml CH₂C1₂, přidejte 4 ml Et₂O, ochlaďte na 0 °C a pomalu (po kapkách) přidejte 1 ml dioxanu. Přidejte 2 ml Et₂O a míchejte při 0 °C po dobu 7 minut. Zřeďte 30 ml Et₂O, přefiltrujte, za účelem shromáždění pevného produktu a promyjte 30 ml Et₂O. Pevnou látku vysušte ve vakuu za získání 0,936 g soli HCI příkladu 14. [a]_D ²² = +64,8° (9,94 mg/2ml EtOH).

Příklady 26A a 26B

(-)-Enantiomer cílové sloučeniny kroku B příkladu 10 (0,60 g) se nechal reagovat s 0,39 g cílové sloučeniny příkladu 1, v podstatě stejným postupem, jako je ten, který byl popsán pro příklad 19, za získání 0,705 g cílové sloučeniny. Hmot, spektr.: MH⁺ = 604 (FABS); [a]o²⁵ = -41,8° (EtOH). Částečná 'HNMR (CDC1₃, 300 MHz): 8,38 (s, 1H); 8,15 (d, 2H); 7,58 (s, 1H); 7,26 (d, 1H); 7,15 (d, 2H); 7,03 (d, 1H); 4,57 (d, 1H).

Sůl HCI cílové sloučeniny příkladu 26A byla připravena v podstatě stejným postupem, jako je ten, který byl popsán pro příklad 25. [cc]_D ²⁵ = -63,2° (EtOH).

Racemická cílová sloučenina kroku A příkladu 10 byla přeměněna na cílovou sloučeninu příkladu 26B v podstatě podle stejného postupu, jako je ten, který byl popsán pro příklad 19. Částečná

-54CZ 297450 B6 ’Η NMR (CDC1₃, 400 MHz): 8,38 (s, 1H); 8,15 (d, 2H); 7,58 (s, 1H); 7,26 (d, 1H); 7,15 (d, 2H);

7,03 (d, 1H); 4,57 (d, 1H). Částečná ^]H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz): 8,77 (d, 2H); 4,47 (s, 1H);

7,95 (s, 1H); 7,74 (d, 2H); 7,43 (m, 1H); 7,27 (d, 1H); 4,35 (d, 1H).

Příklad 27

Cílová sloučenina příkladu 4 se nechá reagovat v podstatě stejnými způsoby, jako jsou ty, které byly popsány pro kroky A-C příkladu 17. Hmot, spektr.: MH⁺ = 635 (FAB); *H NMR (CDC1₃): 8,45 (s, 1H); 7,60 (s, 1H); 7,35 (d, 1H); 7,05 (d, 1H); 4,45 (s, 1H).

Příklad 28

-55 Rozpusťte 9,90 g (18,9 mmol) produktu kroku B příkladu 7 ve 150 ml CH₂C1₂ a 200 ml CH₃CN a zahřejte na 60 °C. Přidejte 2,77 g (20,8 mmol) N-chlorsukcinimidu a zahřívejte pod zpětným chladičem po dobu 3 hodin, za sledování reakce na TLC (30% EtOAc/H₂O). Přidejte dalších

2,35 g (10,4 mmol) N-chlorsukcinimidu a zahřívejte pod zpětným chladičem dalších 45 minut.

Ochlaďte reakční směs na teplotu místnosti a extrahujte 1 N NaOH a CH₂C1₂. CH₂C1₂ vrstvu vysušte pomocí MgSO₄, přefiltrujte a purifikujte flash chromatografií (1200 ml silikagelu, vymýváno 30% EtOAc/H₂O) za získání 6,24 g požadovaného produktu, t.t. = 193 až 195,4 °C. MH⁺ =

510.

Krok B:

K 160 ml koně. HCI přidejte při -10 °C 2,07 g (30,1 mmol) NaNO₂ a míchejte po dobu 10 minut. Přidejte 5,18g (10,1 mmol) produktu kroku A a tuto reakční směs zahřejte z -10 na 0 °C na 2 hodiny. Ochlaďte ji na -10 °C, přidejte 100 ml H₃PO₂ a nechte stát přes noc. Za účelem extrakce této reakční směsi ji nalijte na drcený led a alkalizujte 50% NaOH/CH₂Cl₂. Organickou vrstvu vysušte pomocí MgSO₄, přefiltrujte a zahustěte do sucha. Purifikujte flash chromatografií (600 ml silikagelu, vymývání 20% EtOAc/hexan) za získání 3,98 g produktu. Hmot, spektr.: MH⁺ = 495.

Rozpusťte 3,9 g produktu kroku B ve 100 ml konc. HCI a refluxujte přes noc. Směs ochlaďte, alkalizujte 50% w/w NaOH a výslednou směs extrahujte CH₂C1₂. CH₂C1₂ vrstvu vysušte pomocí MgSO₄ odpařte rozpouštědlo a vysušte ve vakuu za získání 3,09 g požadovaného produktu. Hmot, spektr.: MH⁺ = 423.

-56CZ 297450 B6

Krok D:

Za použití postupu, podobného tomu z v příkladu 8, získejte 1,73 g požadovaného produktu.

t.t. 196,6 až 170,1 °C; [cc]_D ²⁵ = +48,2° (c = 1, MeOH). Hmot, spektr.: MH⁺ = 425.

Krok E:

Použijte podobný postup jako v příkladu 14, s produktem kroku D jako výchozí látkou, za získání cílové sloučeniny, t.t. 152,3 až 153,3 °C; [oí.]d²⁵ = +53,0° (c = 1, MeOH). Hmot, spektr.: MH⁺ = 593.

Příklad 29

Nechte reagovat 15,0 g (44,4 mmol) produktu kroku B příkladu 9 s 6,52 g (48,90 mmol) Nchlorsukcinimidu způsobem, podobným tomu, který byl popsán v kroku A příkladu 28 a extrahujte tak, jak je popsáno, za získání 16,56 g požadovaného produktu.

t.t. 234,7 až 235,0 °C. MH⁺ = 370.

-57CZ 297450 B6

KrokB:

Upravte 16,95 g (45,6 mmol) produktu kroku A způsobem, který byl popsán v kroku B příkladu 28, za získání 13,07 g požadovaného produktu, t.t. 191,7 až 192,1 °C. MH⁺ = 356.

Příklad 30

Zahřívejte 200 mg výchozí kyanaté látky v 17 g kyseliny polyfosforečné při 190 až 200 °C po dobu 45 minut. Výsledný směs nalijte na led, přidejte 30% HC1 a míchejte po dobu 30 minut. Extrahujte CH₂CI₂, promyjte roztokem NaCl, vysušte pomocí Na₂SO₄, přefiltrujte a zahustěte. Purifikujte preparativní TLC, za vymývání EtOAc/hexanem, za získání 21 mg požadovaného produktu (také je získáno 59 mg produktu, který je chlorován v pozici 10).

Příklad 31

Krok A:

Rozpusťte při teplotě místnosti 10 g (29,6 mmol) produktu kroku B příkladu 9 ve 150 ml CH₂C1₂ a 200 ml CH₃CN. Tuto směs zahřejte na 60 °C, přidejte 10,45 g (32,6 mmol) l-fluor-4-hydroxy-l,4-diazoniabicyklo[2,2,2]oktan-bis(tetrafluorborátu) a zahřívejte pod zpětným chladičem po dobu 4 hodin. Směs ochlaďte na pokojovou teplotu, extrahujte CH₂C1₂ a 1 N NaOH. CH₂C1₂ vrstvu vysušte pomocí MgSO₄, přefiltrujte a zahustěte do sucha. Výsledný zbytek purifikujte flash chromatografií, za použití 1400 ml silikagelu, za vymývání 10% EtOAc/CH₂Cl₂ + 2 kapky NH₄OH, za získání 2,00 g produktu, t.t. 130,2 až 103,5 °C, MH⁺ = 335.

-58CZ 297450 B6

Krok B:

1,80 g (5,1 mmol) produktu kroku A upravte za použití v podstatě stejného postupu, jako je ten, který byl popsán v kroku D příkladu 9. Hrubý produkt purifikujte flash chromatografií, za použití 5 200 ml silikagelu, za vymývání 20% EtOAc/hexanem. Hmot, spektr.: MH⁺ = 339.

Příklad 32 io Za použití vhodných výchozích látek a postupů, které jsou popsány výše, by mohly být připraveny následující sloučeniny:

-59CZ 297450 B6

-60CZ 297450 B6

Příklad 33

Krok A:

K roztoku 3-brom-8-chlor-5,6-dihydro-l 1 H-benzo[5,6]cyklopenta[l,2-b]pyridin-l 1-onu (2 g) (6,2 mmol) v bezvodém dichlormethanu (14 ml) byl při 0 °C v prostředí argonu po dobu 30 minut po kapkách přidáván roztok kyseliny 3-chlorbenzoové (1,76 g) (10,4 mmol) v bezvodém dichlormethanu (35 ml). Tato směs se nechala zahřát na pokojovou teplotu a po 18 hodinách byla přidána další kyselina 3-chlorbenzoová (0,88 g) (5,2 mmol) v bezvodém dichlormethanu (25 ml) a tato směs byla míchána po dobu 42 hodin. Směs byla zředěna dichlormethanem a promyta 1 N NaOH (200 ml). Vodná vrstva byla extrahována dalším dichlormethanem (2 X 200 ml) a spojené organické vrstvy byly vysušeny pomocí síranu hořečnatého, přefiltrovány a odpařeny do sucha. Produkt byl chromatografován na silikagelu, za vymývání 0,25%-0,5%-l% (10% konc. NH₄OH v methanolu) dichlormethanem, za získání cílové sloučeniny (výtěžek: 1,386 g, 66 %): ESIMS; m/z 338,1 (MH⁺); 5_C (CDC1₃): CH₂ : 30,5, 34,0; CH : 126,9, 127,6, 130,3, 132,5, 140,4; C: 121,0, 135,1, 138,3, 139,7, 141,6, 145,3, 188,0 ppm.

Krok B:

Cílová sloučenina příkladu 33A (1,3422 g) (3,96 mmol) byla rozpuštěna v methanolu (18 ml) a dichlormethanu (20 ml) a byl přidán hydrid sodno-boritý (0,219 g) (5,79 mmol). Tato směs byla míchána pod argonem při 0 °C po dobu 1 hodiny a poté se nechala zahřát 25 °C na dobu 1 hodiny. Směs byla zředěna dichlormethanem (800 ml) a promyta 1 N NaOH (150 ml). Vodná vrstva byla extrahována dichlormethanem (2 X 100 ml) a spojené organické vrstvy byly vysušeny pomocí MgSO₄, přefiltrovány a odpařeny do sucha. Produkt byl chromatografován na silikagelu, za vymývání 1% (10% konc. NH₄OH v methanolu) dichlormethanem, za získání cílové sloučeniny (výtěžek: 1,24 g, 92 %): ESIMS; m/z 340,1 (MH⁺); 8_C (CDC1₃): CH₂: 31,2, 32,0; CH: 69,1, 126,8, 129,5, 131,7, 136,7; C: 118,3, 134,7, 135,2, 139,7, 141,0, 148,9 ppm.

Krok C:

-61 Cílová sloučenina příkladu 33B (1,19 g) (3,49 mmol) byla rozpuštěna v bezvodém toluenu (22,5 ml) a tento roztok byl pod argonem ochlazen na 0 °C. Byl přidán thionylchlorid (0,472 g) (6,64 mmol) v bezvodém toluenu (5 ml) a tato směs byla při 0 °C míchána po dobu 1 hodiny.

Tato směs se nechala zahřát 25 °C na dobu 2,5 hodin. Roztok byl přidán k 20% roztoku ethylacetátu v dichlormethanu (800 ml) a byl promyt 1 N NaOH. Vodná vrstva byla extrahována dichlormethanem (2 X 200 ml) a spojené organické vrstvy byly vysušeny pomocí MgSO₄, přefiltrovány a odpařeny do sucha, za získání produktu, který byl použit bez další purifikace.

Krok D:

Cílová sloučenina příkladu 33C (3,49 mmol) byla rozpuštěna v bezvodém THF (10 ml) a byl přidán roztok piperazinu (1,505 g) (17,47 mmol) v bezvodém THF (20 ml) a tato směs byla míchána pod argonem při 25 °C po dobu 69 hodin. Tato směs byla přidána k dichlormethanu (800 ml) a byla promyta 1 N NaOH. Vodná vrstva byla extrahována dichlormethanem (2 X 200 ml) a spojené organické vrstvy byly vysušeny pomocí síranu hořečnatého, přefiltrovány a odpařeny do sucha. Produkt byl chromatografován na silikagelu, za vymývání 5% (10%konc. NH₄OH v methanolu) dichlormethanem, za získání cílové sloučeniny (výtěžek: 1,2772 g, 89 %): FABMS; m/z 408 (MH⁺); ó_c (CDC1₃): CH₂: 30,1, 30,4, 46,2, 46,2, 52,3, 52,3; CH: 64,6, 126,3, 130,3, 130,6, 133,6, 138,6, 138,6; C: 118,0, 133,9, 134,5, 139,8, 140,8, 148,8 ppm.

Krok E:

Cílová racemická sloučenina kroku D (1 pg) byla rozdělena na Chiralpak AD HPLC koloně (5 cm X 50 cm, velikost částic 20 μ), za použití směsi 2-propanol : hexan : diethylamin : 30 : 70 : 0,2 až 40 : 60 : 0,2; po projití 2 1, jako vymývací směsi, byl získán R(+)-enantiomer jako první frakce vymývání (0,486 g): FABMS m/z 408 (MH⁺); 8_C (CDC1₃): CH₂: 30,1, 30,4, 46,3, 46,3, 52,5, 52,5; CH: 64,7, 126,2, 130,4, 133,6, 133,6, 138,5; C: 118,1, 133,9, 134,4, 139,8, 140,8, 148,8; [oc]_D ²³ °^c =-85,9° (8,61 mg/2ml, MeOH).

-62CZ 297450 B6

Cílová sloučenina příkladu 33D (0,4 g) 0,979 mmol), Nl-oxid kyseliny 4-pyridyloctové (0,1948 g) (1,27 mmol), hydrochlorid l-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimidu (0,244 g) (1,27 mmol), 1-hydroxybenzotriazol (0,172 g) (1,27 mmol) a 4-methylmorfolin (0,14 ml) (1,27 mmol) byly rozpuštěny v bezvodém DMF (15 ml) a tato směs byla míchána při 25 °C po dobu 18 hodin. Tento roztok byl přidán k dichlormethanu (800 ml) a byl promyt 1 N NaOH. Vodná vrstva byla extrahována dichlormethanem (2 X 200 ml) a spojené organické vrstvy byly odpařeny do sucha. Zbytek byl chromatografován na silikagelu, za vymývání 3,5% (10% konc. NH₄OH v methanolu) dichlormethanem, za získání cílové sloučeniny (výtěžek: 0,4806 g, 90 %): LSIMS; m/z 543 (MH⁺); ó_c (CDC1₃): CH₂: 30,1, 30,5, 38,4, 42,1, 45,9, 50,4, 50,6; CH: 63,8, 126,5, 126,8, 130,3, 130,5, 133,4, 138,4, 139,0, 139,0; C: 118,4, 133,4, 133,9,

134,8, 139,8, 141,0, 148,8, 167,0 ppm. PMR: δ_Η (CDC1₃): 5,78 (s, 1H, H_n); 7,14 (d, 2H, Ar-H); 7,15 (s, 2H, Ar-H); 7,20 (d, 1H, Ar-H); 7,22 (d, 1H, Ar-H); 8,16 (d, 2H, Ar-H); 8,29 (s, 1H, Ar-H).

Příklad 35

K roztoku produktu kroku C příkladu 21 (1,06 g, 1,65 mmol) v dichlormethanu (50 ml) byla přidána kyselina meta-chlorperoxybenzoová (0,5 g, 57-86% čistota). Po míchání při teplotě místnosti po dobu 5 hodin bylo přidáno dalších 0,23 g meta-chlorperoxybenzoové a výsledná směs byla míchána při teplotě místnosti přes noc. Reakční směs byla promyta nasyceným vodným roztokem uhličitanu sodného, vysušena pomocí bezvodého síranu hořečnatého, přefiltrována a zahuštěna ve vakuu za získání světle žluté pěny. Purifikací flash kolonovou chromatografíí (silikagel), za použití 5% methanol-dichlormethanu, nasyceného hydroxidem amonným, byla získána cílová sloučenina (0,60 g, výtěžek 56 %, t.t. 170,5 až 175 °C), [oc]_D ²¹ °^c = +116,2° (c = 0,113, methanol).

-63 CZ 297450 B6

Příklad 36

Podle postupu z příkladu 35, s tou výjimkou, že místo produktu příkladu 19 byl použit produkt kroku C příkladu 21, byl získán produkt jako bílá pevná látka, t.t. = 174,2 °C.

Příklad 37

K produktu kroku C příkladu 23 (1,0 g, 1,48 mmol) v methylenchloridu (15 ml) byla při 0 °C přidána kyselina m-chlorbenzoová (50% 1,5 g, 4,36 mmol), poté byla tato směs míchána při 0 °C po dobu 5 hodin a při teplotě místnosti po dobu 3 hodin. Byla přidána voda (50 ml) hydroxid amonný (10 ml, konc.) a tato směs byla extrahována methylenchloridem (2 X 200 ml). Organická vrstva byla oddělena, vysušena pomocí síranu hořečnatého, přefiltrována a rozpouštědlo bylo odpařeno za získání pevné látky, která byla chromatografována na silikagelu, za vymývání směsí 10% v/v methanofmethylenchlorid, obsahující 2% hydroxid amonný, za získání cílového produktu jako bílé pevné látky (700 mg, 70%), [oc]_D ^{24 c} = 68,9° (c = 0,352, ethanol).

MS (FAB, MH, 653) HRMS Vypoč. (C27H32N4O3BrCl(81)Br) 655,0509 Měřeno 655,0518 'HNMR (CDC1₃) δ 8,31 (s, 1H); 7,28 (s, 1H); 7,19 (d, 1H); 7,11 (d, 1H); 5,37 (m, 1H); 4,60 (d, 1H); 4,42 (s, 2H); 3,86 (m, 3H); 3,41 (m, 3H); 2,89 (m, 4H); 2,42 (m, 1H); 2,20 (m, 3H); 2,04 (m, 1H); 1,78 (m, 2H); 1,66 (m, 1H); 1,48 (m, 2H); 1,16 (m, 3H).

-64CZ 297450 B6

Příklad 38

Podle stejného postupu jako v příkladu 37, s tou výjimkou, že místo produktu kroku C příkladu 23 bylo použito ekvivalentní množství produktu příkladu 26A, byl získán cílový produkt jako bílá pevná látka (výtěžek 73 %). [oc]_D ^{24 c} = -76,6° (c = 0,197, ethanol).

MS (FAB, MH 620) HRMS Vypoč. MH C26H25N3O3BrCl(81)Br) 621,9931 Měřeno 621,9942 'H NMR (CDC1₃) δ 8,32 (s, 1H); 8,22 (d, 2H); 7,29 (s, 1H); 7,19 (d, 1H); 7,18 (d, 2H); 7,10 (d, 1H); 5,37 (m, 1H), 4,58 (d, 1H); 3,78 (d, 1H); 3,66 (d, 2H); 3,41 (s, 2H); 3,38 (m, 1H); 2,95 (m, 3H); 2,50 (m, 1H); 2,28 (m, 1H); 1,63 (m, 1H); 1,45 (m, 2H).

Příklad 39

racemická racemická

Podle postupu příkladu 12 s tou výjimkou, že místo sloučeniny příkladu 3 je použit produkt kroku D příkladu 3, byl získán výchozí reaktant. Podle postupu příkladu 12, s tou výjimkou, že místo produktu kroku C příkladu 23 byl použit výše zmíněný reaktant, byla získána cílová sloučenina jako bílá pevná látka (100%).

MS (FAB, MH 540) HRMS Vypoč. MH C26H24N3O3BrCl (540,0690), Měřeno (540,0691) 'HNMR (CDC1₃) δ 8,45 (s, 1H); 8,14 (d, 2H); 7,26- 7,34 (m, 3H); 7,11 (d, 2H); 7,03 (d, 1H); 6,73 (d, 1H); 5,55 (d, 1H); 4,40 (m, 1H); 3,70 (m, 2H); 3,59 (d, 2H); 2,85 (m, 1H); 2,45 (m, 1H); 2,15 (m, 1H); 1,35 (m, 1H); 1,15 (m, 3H).

-65CZ 297450 B6

Příklad 40

Cílová sloučenina kroku E příkladu 33, R(+)-enantiomer (360,4 mg, 0,882 mmol), Nl-oxid kyseliny 4-pyridyloctové (175,5 mg, 1,146 mmol), hydrochlorid l-(3-dimethylaminopropyl)-3ethylkarbodiimidu (220 mg, 1,146 mmol), 1-hydroxybenzotriazol (155 mg, 1,146 mmol) a 4methylmorfolin (0,126 ml, 1,146 mmol) byly rozpuštěny v bezvodém DMF (11 ml) a tato směs byla míchána při 25 °C po dobu 18 hodin. Reakce byla zpracována tak, jak je popsáno v příkladu 34, a produkt byl chromatografován na silikagelu, za vymývání 4% (10% konc. NH₄OH v methanolu) dichlormethanem, za získání cílové sloučeniny (výtěžek: 441,1 mg, 92%): LCMS: m/z 543,1 (MH⁺); ó_c (CDC1₃): CH₂: 30,1, 30,6, 38,5, 42,1, 46,0, 50,5, 50,9; CH: 63,9, 126,5,

126,9, 126,9, 130,5, 130,6, 133,5, 138,5, 139,0, 139,0; C: 118,4, 134,0, 134,0, 134,9, 139,9, 141,0, 147,8, 167,1;

δ_Η (CDC1₃): 5,74 (s, 1H, H_n); 7,12 (d, 2H, Ar-H); 7,13 (s, 2H, Ar-H); 7,19 (d, 1H, Ar-H); 7,21 (d, 1H, Ar-H); 8,14 (d, 2H, Ar-H); 8,27 (s, 1H, Ar-H), [a]_D ²³ °^c = +69,2° (10 mg/2 ml, MeOH).

Příklad 41

Cílová sloučenina kroku E příkladu 33, S(-)-enantiomer (374,8 mg, 0,917 mmol), Nl-oxid kyseliny 4-pyridyloctové (182,6 mg, 1,192 mmol), hydrochlorid l-(3-dimethylaminopropyl)-3ethylkarbidiimidu (229 mg, 1,192 mmol), 1-hydroxybenzotriazol (161 mg, 1,192 mmol) a 4methylmorfolin (0,131 ml, 1,192 mmol) byly rozpuštěny v bezvodém DMF (11 ml) a tato směs byla míchána při 25 °C po dobu 18 hodin. Reakce byla zpracována tak, jak je popsáno v příkladu 34, a produkt byl chromatografován na silikagelu, vymývaném 4% (10% konc. NH₄OH v methanolu) dichlormethanem, za získání cílové sloučeniny (výtěžek: 467,3 mg, 94%): LCMS: m/z 543,1 (MH⁺); 8_C (CDC1₃): CH₂: 30,0, 30,5, 38,4, 42,0, 45,9, 50,4, 50,8; CH: 63,8, 126,5,

126.8, 126,8, 130,4, 130,6, 133,4, 138,4, 138,9, 138,9; C: 118,4, 134,0, 134,0, 134,8, 139,8,

140.9, 147,7, 167,0,

-66CZ 297450 B6 δ_Η (CDClj): 5,76 (s, 1H, H_n); 7,13 (d, 2H, Ar-H); 7,15 (s, 2H, Ar-H); 7,21 (d, 1H, Ar-H); 7,23 (d, 1H, Ar-H); 8,16 (d, 2H, Ar-H); 8,29 (s, 1H, Ar-H), [a]_D ²³°^c = -65,5° (10,4 mg/2 ml,

MeOH).

Příklad 42

Cílová sloučenina kroku D příkladu 33, (±) (789,1 mg, 1,93 mmol), kyselina 1-Zerc-butoxykarbonyl-4-piperidinyloctová (610 mg, 2,51 mmol), hydrochlorid l-(3-dimethylaminopropyl)3-ethylkarbidiimidu (481,2 mg, 2,51 mmol), 1-hydroxybenzotriazol (339,2 mg, 2,51 mmol) a 4methylmorfolin (0,276 ml, 2,51 mmol) byly rozpuštěny v bezvodém DMF (30 ml) a tato směs byla míchána při 25 °C po dobu 21 hodin. Reakce byla zpracována tak, jak je popsáno v příkladu 34, a produkt byl chromatografován na silikagelu, vymývaném 0,5%-l% (10% konc. NH₄OH v methanolu) dichlormethanem, za získání cílové sloučeniny (výtěžek: 1,22 g, 100%): FABMS: m/z 633,3 (MH⁺); δ_ε (CDC1₃): CH₃: 28,5, 28,5, 28,5; CH₂: 30,2, 30,5, 32,2, 32,2, 39,5, 41,7, 43,8, 43,8, 45,8, 50,8, 51,2; CH: 33,3, 64,0, 126,5, 130,6, 130,6, 133,5, 138,5; C: 79,3, 118,3, 133,6, 134,8, 139,9, 140,9, 148,1, 154,8, 170,0;

δ_Η (CDC1₃): 1,46 (s, 9H, -Cme), 5,75 (s, 1H, H_n); 7,13 (d, 1H, Ar-H); 7,16 (s, 1H, Ar-H); 7,19 (s, 1H, Ar-H); 7,23 (d, 1H, Ar-H); 8,29 (s, 1H, Ar-H).

-67CZ 297450 B6

Cílová sloučenina kroku A (1,21 g, 1,91 mmol) byla rozpuštěna v methanolu (10,6 ml) a 10% (v/v) konc. H₂SO₄ v dioxanu (26 ml) a tato směs byla míchána pod argonem při 25 °C po dobu 1,5 hodiny. Tato směs byla zahuštěna a zředěna CH₂C1₂ a alkalizována IN vodným NaOH. CH₂C1₂ extrakt, obsahující pouze část produktu, kvůli jeho rozpustnosti ve vodě, byl vysušen (MgSO₄), přefiltrován a odpařen do sucha. Produkt byl chromatografován na silikagelu, za vymývání (10% (10% konc. NH₄OH v methanolu) dichlormethanem, za získání cílové sloučeniny (výtěžek: 87,7 mg, 10 %): FABMS: m/z 533,1 (MH⁺); ó_c (CDC1₃): CH₂: 30,2, 30,4, 32,4, 32,4, 39,6, 41,6, 45,7, 45,9, 45,9, 50,7, 51,2; CH: 32,7, 64,0, 126,5, 130,6, 130,6, 133,5, 138,5; C: 118,3, 135,5, 134,7, 139,9, 140,9, 148,1, 169,8, 169,8: δ_Η (CDC1₃): 5,73 (s, 1H, H_n); 7,12 (d, 1H, Ar-H); 7,15 (s, 1H, Ar-H); 7,18 (s, 1H, Ar-H); 7,21 (d, 1H, Ar-H); 8,28 (s, 1H, Ar-H).

Krok C:

Cílová sloučenina kroku B (99,1 mg, 0,189 mmol) a trimethylsilylizokyanát (0,384 ml, 2,83 mmol) byly rozpuštěny v bezvodém dichlormethanu (3 ml) a tato směs byla míchána při 25 °C pod argonem po dobu 20 hodin. K reakci byl přidán další a trimethylsilylizokyanát (0,0768 ml, 0,567 mmol) a nechala se běžet dalších 5 hodin. Směs byla zředěna dichlormethanem a promyta nasyceným vodným NaHCO₃, vysušena (MgSO₄), přefiltrována a odpařena do sucha. Produkt byl chromatografován na silikagelu, za vymývání 3,5% (10% konc. NH₄OH v methanolu) dichlormethanem, za získání cílové sloučeniny (výtěžek: 80,4 mg, 81 %): FABMS: m/z 576,1 (MH⁺); δ_ε (CDC1₃): CH₂: 30,1; 30,4, 32,0; 32,0, 39,2; 41,6; 44,4; 44,3; 45,7; 50,7; 51,1; CH: 32,9, 63,9; 126,4; 130,5; 130,6; 133,4; 138,4; C: 118,4; 133,5; 134,7; 139,8; 140,9; 148,0; 169,7; δ_Η (CDC1₃): 5,74 (s, 1H, Hn), 7,12 (d, 1H, Ar-H), 7,15 (s, 1H, Ar-H), 7,19 (s, 1H, Ar-H), 7,22 (d, 1H, Ar-H); 8,28 (s, 1H, Ar-H).

-68CZ 297450 B6

Příklad 43

Krok A:

Cílová sloučenina kroku E příkladu 33, R(+)-enantiomer (1 g, 2,45 mmol), kyselina \-tercbutoxykarbonyl-4-piperidinyloctová (487 mg, 3,181 mmol), hydrochlorid l-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimidu (610 mg, 3,181 mmol), 1-hydroxybenzotriazol (430 mg, 3,181 mmol) a 4-methylmorfolin (0,35 ml, 3,181 mmol) byly rozpuštěny v bezvodém DMF (30,5 ml) a tato směs byla míchána při 25 °C po dobu 66 hodin. Reakce byla zpracována tak, jak ίο je popsáno v příkladu 34 a produkt byl chromatografován na silikagelu, za vymývání 1% (10% koně. NH₄OH v methanolu) dichlormethanem, za získání cílové sloučeniny (výtěžek: 1,25 g, 81 %): LCMS: m/z 633,1 (MH⁺); 8_C (CDC1₃) CH₃: 28,5; 28,5; 28,5; CH₂: 30,2; 30,5; 32,2, 32,2; 39,4; 41,7; 43,6; 43,6; 45,8; 50,7; 51,2; CH: 33,3; 64,0; 126,5; 130,6; 133,5; 138,5; C: 79,3; 118,3; 133,6; 134,8; 139,9; 140,9; 148,1; 154,9; 170,0; δ_Η (CDC1₃): 1,46 (s, 9H, -CMe₃), 5,74 (s, 15 1H, H_n), 7,12 (d, 1H, Ar-H), 7,16 (s, 1H, Ar-H), 7,19 (s, 1H, Ar-H), 7,23 (d, 1H, Ar-H), 8,29 (s, 1H, Ar-H); [a]_D ²³’⁴°^c = +56,4° (9,05 mg/2 ml MeOH).

Krok B:

-69CZ 297450 B6

Cílová sloučenina kroku A (1,149 g, 1,812 mmol) byla rozpuštěna v methanolu (9,5 ml) a 10% (v/v) konc. H2SO4 v dioxanu (24,7 ml) a tato směs byla míchána pod argonem při 25 °C po dobu 1 hodiny. Tato směs se nechala projít přes vrstvu iontoměničové pryskyřice BioRad AG1X8(OH forma) a tato pryskyřice a byla promyta methanolem. Spojené eluáty byly odpařeny do sucha a produkt byl chromatografován na silikagelu, za vymývání 10% (10% konc. NH₄OH v methanolu) dichlormethanem, za získání cílové sloučeniny (výtěžek: 762,9 mg, 79 %): LSIMS: m/z 533 (MFT); δ₍. (CDC1₃): CH₂: 30,2, 30,5; 32,2; 32,2; 40,1; 41,7; 45,9; 46,4; 46,4; 50,8; 51,2; CH: 33,4; 64,0; 126,5; 130,6; 133,6; 138,6; C: 118,4; 133,6; 134,8; 139,9; 140,9; 148,2; 170,2; δ_Η (CDC1₃): 5,73 (s, 1H, H_n), 7,11 (d, 1H, Ar-H), 7,14 (s, 1H, Ar-H), 7,19 (s, 1H, Ar-H), 7,22 (d, 1H, Ar-H), 8,28 (s, 1H, Ar-H); [cc]_D ²³’⁴ °^c = +66,4° (10,90 mg/2 ml MeOH).

Krok C:

Cílová sloučenina kroku B (550 mg, 1,03 mmol) a trimethylsilylizokyanát (2,092 ml, 15,45 mmol) byly rozpuštěny v bezvodém dichlormethanu (16,4 ml) a tato směs byla míchána při 25 °C pod argonem po dobu 18 hodin. Směs byla zředěna dichlormethanem a promyta nasyceným vodným NaHCO₃, vysušena (MgSO₄), přefiltrována a odpařena do sucha. Produkt byl chromatografován na silikagelu, za vymývání 3,5% (10% konc. NH4OH v methanolu) dichlormethanem, za získání cílové sloučeniny (výtěžek: 570,3 mg, 99 %): FABMS: m/z 576,3 (MH⁺); δ_€ (CDC1₃): CH₂: 30,2; 30,5; 32,1; 32,1; 39,3; 41,7; 44,4; 44,5; 45,8; 50,8; 51,2; CH: 33,0; 64,0; 126,5; 130,6; 130,6; 133,5; 138,6; C: 118,4; 133,5; 134,8; 139,9; 141,0; 148,1; 157,9; 169,8; δ_Η (CDC1₃): 5,73 (s, 1H, H_n), 7,12 (d, 1H, Ar-H), 7,14 (s, 1H, Ar-H), 7,19 (s, 1H, Ar-H), 7,21 (d, 1H, Ar-H), 8,28 (s, 1H, Ar-H);

[oc]_d ²³’^{4 C} = +60,2° (10,28 mg/2 ml MeOH).

-70CZ 297450 B6

Příklad 44

Krok A:

Cílová sloučenina kroku E příkladu 33, S(-)-enantiomer (1 g, 2,45 mmol) kyselina \-tercbutoxykarbonyl-4-piperidinyloctová (487 mg, 3,181 mmol), hydrochlorid l-(3-dimethyiaminopropyl)-3-ethylkarboimidu (610 mg, 3,18 mmol), 1-hydroxybenzotriazol (430 mg, 3,181 mmol) a 4-methylmorfolin (0,35 ml, 3,181 mmol) byly rozpuštěny v bezvodém DMF (30,5 ml) a tato směs byla míchána při 25 °C po dobu 66 hodin. Reakce byla zpracována tak, jak je popsáno v příkladu 34 a produkt byl chromatografován na silikagelu, za vymývání 1% (10% konc. NH₄OH v methanolu) dichlormethanem, za získání cílové sloučeniny (výtěžek: 1,204 g, 78 %): LSIMS: m/z 633,5 (MH⁺); ó_c (CDC1₃) CH₃: 28,5; 28,5; 28,5; CH₂: 30,2; 30,5, 32,2; 32,2; 39,4; 41,7; 43,6; 43,6; 45,8; 50,7; 51,2; CH: 33,3; 64,0; 126,5; 130,5; 130,5; 133,6; 138,5; C: 79,3; 118,3; 133,6; 134,8; 139,9; 140,9; 148,1; 154,8; 170,0; δ_Η (CDC1₃): 1,46 (s, 9H,-CMe₃), 5,74 (s, 1H, Hn), 7,12 (d, 1H, Ar-H); 7,15 (s, 1H, Ar-H); 7,19 (s, 1H, Ar-H), 7,22 (d, 1H, Ar-H), 8,28 (s, 1H, Ar-H); [a]_D ²³’⁴°^c = -57,2° (9,09 mg/2 ml MeOH).

Krok B:

-71 Cílová sloučenina kroku A (1,104 g, 1,714 mmol) byla rozpuštěna v methanolu (9,13 ml) a 10% (v/v) konc. H₂SO₄ v dioxanu (23,75 ml) a tato směs byla míchána pod argonem při 25 °C po dobu 1 hodiny. Tato směs se nechala projít přes vrstvu iontoměničové pryskyřice BioRad AG1-X8(OH“ forma) a tato pryskyřice byla promyta methanolem. Spojené eluáty byly odpařeny do sucha a produkt byl chromatografován na silikagelu, za vymývání 10% (10% konc. NH₄OH v methanolu) dichlormethanem, za získání cílové sloučeniny (výtěžek: 771,1 mg, 83 %): LSIMS: m/z 533 (MH⁺); Ó_c (CDC1₃): CH₂: 30,3; 30,5; 33,0; 33,0; 40,0; 41,7; 45,8; 46,2; 46,2; 50,8; 51,2; CH: 33,3; 64,0; 126,5; 130,6; 130,6; 133,6; 138,6; C: 118,4; 133,6; 134,8; 139,9; 140,9; 148,2; 170,1; δ_Η (CDC1₃): 5,73 (s, 1H, Hn), 7,12 (d, 1H, Ar-H), 7,14 (s, 1H, Ar-H), 7,19 (s, 1H, Ar-H), 7,22 (d, 1H, Ar-H), 8,28 (s, 1H, Ar-H);

[cc]_D ²³’⁴ °^c = -66,9° (10,29 mg/2 ml MeOH).

Krok C:

Cílová sloučenina kroku B (550 mg, 1,03 mmol) a trimethylsilylizokyanát (2,092 ml, 15,45 mmol) byly rozpuštěny v bezvodém dichlormethanu (16,4 ml) a tato směs byla míchána při 25 °C pod argonem po dobu 18 hodin. Směs byla zředěna dichlormethanem a promyta nasyceným vodným NaHCO₃, vysušena (MgSO₄), přefiltrován a odpařen do sucha. Produkt byl chromatografován na silikagelu, za vymývání 3,5% (10% konc. NH₄OH v methanolu) dichlormethanem, za získání cílové sloučeniny (výtěžek: 571,5 mg, 99 %): FABMS: m/z 576,3 (MH⁺); ó_c (CDC1₃): CH₂: 30,2; 30,5, 32,0; 32,0; 39,3; 41,7; 44,4; 44,5; 45,7; 50,7; 51,2; CH: 33,0; 64,0; 126,5; 130,6; 130,6; 133,5; 138,6; C: 118,4; 133,6; 134,8; 139,9; 141,0; 148,1; 157,9; 169,8; δ_Η (CDC1₃): 5,73 (s, 1H, Hn), 7,12 (d, 1H, Ar-H); 7,15 (s, 1H, Ar-H), 7,20 (s, 1H, Ar-H); 7,22 (d, 1H, Ar-H); 8,28 (s, 1H, Ar-H); [a]_D ²³’⁴°^c = -62,5° (9,54 mg/2 ml MeOH).

Příklad 45

Výchozí reaktant (0,1 g, 0,18 mmol) byl rozpuštěn v CH₂CI₂ (5 ml) a poté byl ochlazen na

-18 °C. Poté byla přidána kyselina w-chlorperoxybenzoová (0,18 g, 1,07 mmol) a reakční směs byla přes noc míchána při teplotě místnosti. Reakční směs byla rozdělena mezi CH₂C1₂ a nasycený NaHCO₃ (vodný). Vodná fáze byla dále extrahována CH₂C1₂. Spojené CH₂C1₂ frakce byly

-72CZ 297450 B6 vysušeny pomocí MgSO₄ a zahuštěny ve vakuu, za získání zbytku, který byl chromatografován na silikagelové desce, za vymývání 10% MeOH (nasycený NH₃j-CH₂C12, za získání cílové sloučeniny jako bílé pevné látky (0,013 g, výtěžek 13 %, t.t. = 146,8 až 147,4 °C, MH⁺= 577).

Výchozí reaktant byl získán za použití postupu příkladu 14 a výše popsaných postupů separace chirální chromatografií.

Cílová sloučenina byla připravena podle v podstatě stejného postupu, jako je ten, popsaný v příkladu 45 (t.t = 120 až 121 °C, MH⁺ = 577).

Příklad 47

Výchozí reaktant byl oxidován kyselinou zw-chlorperoxybenzoovou podle v podstatě stejného oxidačního postupu jako v příkladu 45, za získání cílové sloučeniny (t.t. = 109 až 110 °C, MH⁺ = 542).

Výchozí reaktant byl získán reakcí S(-) izomerů cílové sloučeniny příkladu 3 s cílovou sloučeninou příkladu 12. S(-) izomer racemátu příkladu 3 byl získán za použití výše popsaných postupů separace chirální chromatografií.

-73CZ 297450 B6

Příklad 48

Cílová sloučenina byla připravena podle v podstatě stejného postupu, jako je ten, popsaný v příkladu 47 (t.t. = 125,5 až 126,3 °C, MH⁺ = 542).

Příklad 49

FTP IC50 (inhibice famesyl-proteintransferázy, enzymatický pokus in vitro) byla stanovena podle postupů, popsaných ve WO 95/10516, publikovaném 20. dubna 1995. GGPT IC₅o (inhibice geranylgeranyl-proteintransferázy, enzymatický pokus in vitro), COS Cell IC₅o (na buňkách založený pokus), Cell Mat Assay a protinádorová aktivita (nádorové studie in vivo) mohly být stanoveny podle postupů, popsaných ve WO 95/10516. Popis WO 95/10516 je zde zahrnut odkazem.

Další pokusy mohly být provedeny podle v podstatě stejného postupu, jako je ten, popsaný výše, ale při nahrazení buněk T24-BAG jinými indikátorovými nádorovými buněčnými liniemi. Tyto pokusy mohly být provedeny za použití buď buněk lidského karcinomu tlustého střeva DLD-1BAG, exprimujících aktivovaný gen K-ras, nebo buněk lidského karcinomu tlustého střeva SW620-BAG, exprimujících aktivovaný gen K-ras. Za použití jiných nádorových buněčných linií, známých v oboru, by mohla být ukázána aktivita sloučenin tohoto vynálezu proti jiným typům rakoviny.

Soft Agar Assay:

Na podkladu nezávislý růst je vlastností tumorogenních buněčných linií. Lidské nádorové buňky mohou být suspendovány v růstovém médiu, obsahujícím 0,3% agarózu a uvedenou koncentraci inhibitoru famesyl-proteintransferázy. Tímto roztokem může být převrstveno růstové médium, zpevněné 0,6% agarózou, obsahující stejnou koncentraci inhibitoru famesyl-proteintransferázy. Po ztuhnutí horní vrstvy mohou být misky inkubovány po dobu 10 až 16 dní při 37 °C, pod 5% CO₂, což umožní růst kolonií. Po inkubaci mohou být kolonie barveny převrstvením agaru roztokem MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-difenyltetrazoliumbromid, Thyazolil blue) (1 mg/ml v PBS). Kolonie mohou být počítány a hodnoty IC₅₀ mohou být stanoveny.

FTP pM IC50 assay:

Enzymatická reakce probíhal v 50 mM Tris, 5 μΜ ZnCl₂, 5 mM MgCl₂, 0,01% Tritonu X-100, mM dithiothreitolu (DTT), pH 7,7 (pufr R) při 37 °C po dobu 1 hodiny. Purifikovaná lidská

FPT (>95% čistota) byla odvozena z expresního systému Baculovirus/Sf-9 expression systém.

Použitím peptidován substrátem byl biotin-CVLS (SynPep Corp., Dublin, CA) a (1-³H)-FPP (21,5 Ci/mmol) by zakoupen od New England Nuclear Life Science Products (Boston, MA).

Sloučeniny byly nejdříve rozpuštěny na konečnou koncentraci 4 mg/ml ve 100% DMSO a poté na 0,25 pg/ml ve 100% DMSO. Následná zředění těchto sloučenin byla prováděna v pufru R.

-74CZ 297450 B6

Enzymatická reakce probíhala v konečném objemu 100 μΐ. Reakce jsou prováděny na 96-jamkových destičkách. Konečné koncentrace lidské FPT, FPP a biotin-CVLS byly jednotlivě 30 pM, 176 nM a 100 nM, v objemu 100 μΐ. Typická reakce zahrnuje míchání FPT a FPP ve 40 μΐ při pokojové teplotě po dobu 15 minut, po čemž následuje přidání 40 μΐ roztoku obsahujícího testovanou sloučeninu. Roztok je dále míchán po dobu 15 minut při teplotě místnosti. Enzymatická reakce je nastartována přidáním 20 μΐ biotin-CVLS peptidového substrátu a nechá se probíhat při 37 °C po dobu 1 hodiny. Reakce je ukončena použitím 150 μΐ roztoku Stop Solution, obsahujícího 1,3 mg/ml scintilačních kuliček (straptavidinem obalené kuličky od Amersham (Arlington Heights, IL)), 250 mM EDTA, pH 8,0 a 0,5% BSA. Radioaktivita je měřena po 20 minutách při pokojové teplotě.

U sloučenin je stanovena jejich schopnost inhibovat tuto reakci, měřením na koncentraci závislé procento inhibice reakce. Zásobní roztoky těchto sloučenin 25 μΐ/ml (DMSO) byly zředěny v pufru R a poté v reakční směsi, jak je popsáno výše, za získání konečné koncentrace 0,01, 0,003, 0,001, 0,0003, 0,0001 a 0,00003 μΐ/ml reakční směsi. Enzymatická aktivita byla zjištěna měřením CPM/jamku, za použití scintilačního počítače Wallac 1204 Betaplate BS liquid scintilation computer. Kontrolní pokusy byly prováděny bez inhibitorů, za účelem získání hodnoty CPM pro neinhibovanou reakci. Dále byly prováděny reakce bez biotin-CVLS, pro získání signálu pro CPM hodnoty pozadí. Po korekci signálů na pozadí může být vypočteno procento inhibice pro každou koncentraci inhibitoru a může být interpolována hodnota IC₅₀ metodou nejmenších čtverců z údajů v rámci lineárního úseku inhibice.

Sloučeniny příkladů 34-49 a sloučenina 54.0 měly FTP IC₅₀ v rozmezí od 0,7 nM do > 174 nM. Sloučenina příkladu 40 měla FTP pM IC₅o 0,44 nM a sloučenina příkladu 43 měla FTP pM IC₅₀ 0,41 nM.

Sloučeniny příkladů 35, 36 a 40 měly COS Cell IC₅₀ v rozmezí od 0,9 nM do 85 nM a Soft Agar IC50 v rozmezí od 25 nM do 183 nM.

Příklad 51

Pro přípravu farmaceutických přípravků ze sloučenin popsaných tímto vynálezem mohou být inertní, farmaceuticky přijatelné nosiče buď pevné nebo tekuté. Přípravky v pevné formě zahrnují prášky, tablety, dispergovatelné granule kapsle a čípky. Prášky a tablety mohou obsahovat od asi 5 do asi 70 % aktivní látky. Vhodné pevné nosiče jsou známé v oboru, např. uhličitan hořečnatý, stearan hořečnatý, mastek, cukr, laktosa. Tablety, prášky, tobolky a kapsle mohou být použity jako pevné dávkové formy, vhodné pro orální podávání.

Pro přípravu čípků se nejdříve rozpustí vosk s nízkou teplotou tání, jako je směs glyceridů mastných kyselin nebo kakaové máslo, a aktivní látka je v něm poté homogenně dispergována např. mícháním. Rozpuštěná homogenní směs je poté nalita do forem vhodné velikosti, nechá se vychladnout a tím ztuhnout.

Přípravky v tekuté formě zahrnují roztoky, suspenze a emulze. Jako příklad mohou být zmíněny vodné nebo vodo-propylenglykolové roztoky pro parenterální injekci.

Přípravky v tekuté formě mohou také zahrnovat roztoky pro intranazální podávání.

Aerosolové přípravky, vhodné pro inhalaci, mohou zahrnovat roztoky a pevné látky ve formě prášku, které mohou být ve spojení s farmaceuticky přijatelným nosičem, jako je inertní stlačený plyn.

-75 CZ 297450 B6

Zahrnuty mohou být také přípravky v pevné formě, které mohou být krátce před použitím přeměněny na přípravky v tekuté formě pro orální nebo parenterální podávání. Takovéto tekuté formy zahrnují roztoky, suspenze a emulze.

Sloučeniny tohoto vynálezu mohou být také dopravovány transdermálně. Transdermální prostředky mohou být ve formě krámů, pleťových vod, aerosolů a/nebo emulzí a mohou být obsaženy v transdermálních náplastech matrixového nebo porézního typu, jak je v oboru pro tyto účely běžné.

Přednostně jsou sloučeniny podávány orálně,

Přednostně je tento farmaceutický prostředek v jednotkové dávkové formě. V takovéto formě je tento přípravek rozdělen do jednotkových dávek, obsahujících příslušné množství aktivní složky, např. množství, které je účinné pro dosažení požadovaného cíle.

Množství aktivní látky v jednotkové dávkové formě přípravku může být měněno nebo upraveno od asi 0,1 do 1000 mg, lépe od asi 1 do 300 mg, podle konkrétního použití.

Skutečné použité dávkování se může měnit v závislosti na potřebách pacienta a závažnosti léčeného stavu. Určení správného dávkování pro konkrétní situaci je v možnostech odborníka. Obecně, léčení je zahájeno menšími dávkami, které jsou menší než je optimální dávka této sloučeniny. Poté je dávkování zvyšováno po menších částech dokud není dosaženo optimálního účinku za daných okolností. Je-li to požadováno, může být celková denní dávka rozdělena a podávána po částech během dne.

Množství a frekvence podávání sloučenin tohoto vynálezu a jejich farmaceuticky přijatelných solí může být regulováno podle úsudku navštěvovaného lékaře, který zvažuje takové faktory, jak je věk, stav a velikost pacienta, stejně jako závažnost léčených příznaků. Obvyklým doporučeným režimem dávkování pro zastavení růstu nádoru je orální podávání od 10 mg do 200 mg/den, přednostně 10 až 1000 mg/den, ve dvou oddělených dávkách. Když jsou podávány v tomto dávkovém rozmezí, jsou tyto sloučeniny netoxické.

Příklady farmaceutických dávkových forem

Tablety

č.	Složka	mg/tableta	mg/tableta
1.	Aktivní látka	100	500
2.	Laktosa USP	122	113
3.	Kukuřičný škrob, Food Grade, jako 10% směs v čisté vodě	30	40
4.	Kukuřičný škrob, Food Grade	45	40
5.	Stearan hořečnatý	3	7
Celkově	300	700

Způsob výroby

Míchejte složky č. 1 a 2 ve vhodném míchadle po dobu 10 až 15 minut. Směs granulujte složkou

č. 3. Je-li to nutné, rozdrďte vlhké granule přes hrubé síto (např. 1/4, 0,63 cm). Vysušte vlhké

-76CZ 297450 B6 granule. Prohlédněte suché granule, je-li to nutné, a smíchejte je se složkou č. 4 a míchejte po dobu 10 až 15 minut. Přidejte složku č. 5 a míchejte 1 až 3 minuty. Směs stlačte na příslušnou velikost a zavažte na vhodném tabletovacím stroji.

Kapsle

č.	Složka	mg/kapsle	mg/kapsle
1.	Aktivní látka	100	500
2.	Laktosa USP	106	123
4.	Kukuřičný škrob, Food Grade	40	70
4.	Stearan hořečnatý NF	7	7
Celkově	300	700

Způsob výroby

Míchejte složky č. 1, 2 a 3 ve vhodné míchadle po dobu 10 až 15 minut. Přidejte složku č. 4 10 a míchejte 1 až 3 minuty. Směsí naplňte dvoudílné želatinové kapsle na vhodném stroji.

Zatímco byl předkládaný vynález popsán ve spojení s konkrétními provedením, uvedenými výše, odborníkovi v oboru bude zřejmých mnoho jeho alternativ, modifikací a variací. Všechny takovéto alternativy, modifikace a variace spadaj í do rozsahu a myšlenky předkládaného vynálezu.

-77 CZ 297450 B6

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (2)

1. Deriváty benzocykloheptapyridinoxidu vybrané ze skupiny, obsahující:

Br

-78CZ 297450 B6

-79CZ 297450 B6

-80CZ 297450 B6

-81 CZ 297450 B6

-82CZ 297450 B6

-83cz 297450 B6 _ne_boje_iiAfc_m^pfi>^»'^{Í ebOSO}'^1,y·

-84CZ 297450 B6

2. Deriváty benzocykloheptapyridinoxidu podle nároku 1 vybrané ze skupiny obsahuj ící

-85CZ 297450 B6