CZ291931B6

CZ291931B6 - Trisoxazolová makrolidová sloučenina, její použití a způsob její výroby

Info

Publication number: CZ291931B6
Application number: CZ20002754A
Authority: CZ
Inventors: Tatsuo Higa; Gravalos Dolores Garcia; Jose Luis Fernandez-Puentes
Original assignee: Instituto Biomar S. A.
Priority date: 1998-01-27
Filing date: 1999-01-27
Publication date: 2003-06-18
Also published as: US6391900B1; RU2217433C2; JP4511027B2; BR9907748A; EP1051420A1; PT1051420E; CA2319032C; HUP0101321A2; IL137545A0; EP1051420B1; KR20010034413A; WO1999037653A1; AU760184B2; MXPA00007381A; CN1131869C; PL342040A1; DE69904294T2; DE69904294D1; HUP0101321A3; ES2186324T3

Abstract

Je pops na trisoxazolov makrolidov slou enina obecn ho vzorce I, kde Me znamen methyl a jej deriv ty vzorc HA-1 a TH-1. Zp sob jejich v²roby a jejich pou it pro l en savce s malign m n dorem citliv²m na trisoxazolovou makrolidovou slou eninu.\

Description

Trisoxazolová makrolidová sloučenina, její použití a způsob její výroby

Oblast techniky

Je popsána trisoxazolová makrolidová sloučenina a její deriváty HA-1 a ΊΉ-1. Je popsán také způsob jejich výroby a jejich použití pro léčení savce s maligním nádorem citlivým na trisoxazolovou sloučeninu.

Dosavadní stav techniky

Mořské organismy, zvláště měkké korály, houby a pláštěnci, poskytují mnoho sekundárních metabolitů a vykazují různý stupeň biologické aktivity (Faukner D.: Nat. Prod. Rep. 1997, 14, 259 až 302 a odkazy tam uvedené). Důležitou skupinou těchto metabolitů je skupina cytotoxických makrolidů, obsahujících tris(oxazol)ovou skupinu; v roce 1986 byla popsána struktura prvních tří trisoxazolových makrolidových sloučenin: ulapualidu A a B (Scheuer P. J. a spol.: J. Am. Chem. Soc. 1986, 108, 846 až 847.) a kabiramidu C (Fusetani N. a spol.:, J. Am. Chem. Soc. 1986,108, 847 až 849.).

ι

Ód té doby bylo publikováno přes 300 dalších trisoxazolových makrolidových sloučenin (Marině

Biotechnology, díl 1, red. David H. Attaway a Oskar R. Zaborsky, Plenům Press, New York

1993, str. 211 až 213 a odkazy tam uvedené.).

Podstata vynálezu

Předložený vynález se týká nových cytotoxických trisoxazolových makrolidových sloučenin obecného vzorce I

v němž Me znamená methyl, X znamená nižší alkyl, R¹ a R² znamenají atom vodíku nebo nižší alkyl, R^3a znamená atom vodíku a R^3h znamená skupinu

nebo

nebo R^3a a R^3b společně znamenají atom kyslíku, R⁴ znamená atom vodíku, nižší alkoxyskupinu nebo nižší alkyl, R⁵ znamená atom vodíku, karbamoyl nebo nižší alkanoyl, R^6a znamená atom vodíku, R^6b znamená hydroxyskupinu nebo R^6a a Ř^6b společně znamenají atom kyslíku, R⁷znamená atom vodíku, nižší alkyl nebo hydroxymethyl, R⁸ znamená nižší alkoxyskupinu nebo nižší alkyl, Y¹ znamená atom vodíku nebo methyl a Y² znamená atom vodíku nebo methyl a Y²znamená atom vodíku nebo Y¹ a Y² společně znamenají dvojnou vazbu.

V definicích skupin v obecném vzorci I nižší alkyl a nižší alkylová část nižšího alkanoylu nebo nižší alkoxyskupiny znamenají alkylovou skupinu s přímým nebo větveným řetězcem s 1 až

I atomy uhlíku, jako je methyl, ethyl, propyl, izopropyl, butyl, izobutyl, se^.-butyl, íerc.-butyl, pentyl, neopentyl a hexyl.

Zvláště pak se předložený vynález týká trisoxazolových makrolidových sloučenin vzorce HA-1

a vzorce ΊΉ-2

kde Me znamená methyl.

CTH-2),

Sloučeniny vzorce HA-1 a TH-2 byly získány chemickou modifikací známého kabiramidu B, respektive C.

Sloučenin vzorce HA-1 a TH-2 vykazují protinádorovou aktivitu. Konkrétně - sloučeniny vzorce HA-1 a TH-2 vykazují protinádorovou aktivitu na buněčné linie odvozené od lidských pevných nádorů, jako je lidský plicní karcinom, lidský karcinom tlustého střeva a lidský melanom a pravděpodobně jsou aktivní na jiné nádorové buněčné linie, jako je leukemie a lymfom. Tyto sloučeniny vzorce HA-1 a TH-2 mají in vitro protinádorovou selektivitu na pevné nádory.

Předložený vynález se týká také způsobu léčení savce s maligním nádorem citlivým na trisoxazolovou sloučeninu obecného vzorce I, který zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství této sloučeniny obecného vzorce I nebo jejího farmaceutického prostředku postiženému jednotlivci.

-3CZ 291931 B6

Předložený vynález dále poskytuje farmaceutické prostředky, které jako účinnou složku obsahují trisoxazolovou sloučeninu obecného vzorce I, a také způsoby jejich přípravy.

Dalším aspektem tohoto vynálezu je způsob výroby sloučenin vzorce HA-1 a ΊΉ-2, který zahrnuje chemickou modifikaci kabiramidu B, respektive C.

Mezi příklady farmaceutických prostředků patří jakékoliv pevné (tablety, pilulky, tobolky, granule atd.) nebo kapalné (roztoky, suspenze nebo emulze) prostředky s vhodným způsobem sestavení pro orální, místní nebo parenterální podávání a mohou obsahovat čistou sloučeninu nebo její kombinaci s jakýmkoliv nosičem nebo jinými farmakologicky účinnými sloučeninami. Tyto prostředky musí být sterilní, jestliže se podávají parenterálně.

Přesné dávkování farmaceutického prostředku obsahujícího sloučeniny obecného vzorce I bude různé podle farmaceutického přípravku, podle způsobu aplikace a podle příslušného místa, hostitele a nádoru, který je léčen. V úvahu se vezmou i další faktory, jako je věk, tělesná hmotnost, pohlaví, dieta, doba podávání, rychlost vylučování, stav hostitele, kombinace léčiv, citlivost reakce a intenzita onemocnění. Podávání se může provádět kontinuálně nebo periodicky v rámci maximální tolerované dávky.

Příklady provedení vynálezu

Protinádorová aktivita

Buňky byly udržovány v logaritmické fázi růstu v Eaglově minimálním esenciálním médiu s Earlyho vyrovnanými solemi, s 2,0mM L-glutaminem, s neesenciálními kyselinami bez hydrogenuhličitanu sodného (EMEM/neaa), doplněným 10 % hmotn. plodového telecího séra (FCS), ΙΟ'² M hydrogenuhličitanu sodného a 0,1 g/1 penicilinu G + streptomycinsulfátu.

Pro stanovení a srovnání protinádorové aktivity těchto sloučenin se provádí testováním upraveným způsobem podle Bergerona a spol. (Raymond J. Bergeron, Paul F. Cavanaugh ml., Steven J. Kline, Robert G. Hughes ml., Gare T. Eliot a Caři W. Porter: ,,Antineoplastic and antiherpetic acitity of spermidine catecholamide iron chelators“, Biochem. Bioph. Res. Comm. 1984,121, 848 až 854). Jako nádorové buňky byly použity P-388 (suspenzní kultura lymfoidního neoplasmu z myší DBA/2), A-549 (jednovrstvá kultura lidského plicního karcinomu), HT-29 (jednovrstvá kultura lidského karcinomu tlustého střeva) a MEL-28 (jednovrstvá kultura lidského melanomu).

Buňky P-388 byly vysety do 16mm jamek v množství 1.10⁴ buněk na jamku v 1 ml podílu MEM 5FCS obsahujícím uvedenou koncentraci léčiv. Oddělená řada kultur bez léčiva byla vyseta jako kontrolní růst, aby se zajistilo, že buňky zůstaly v exponenciální fázi růstu. Všechna stanovení byla prováděna dvojmo. Po třech dnech inkubace při 37 °C v atmosféře s 10 % CO₂ a s 98% vlhkostí bylo stanoveno přibližné IC₅₀ srovnáním růstu v jamkách s léčivem s růstem v kontrolních jamkách.

Buňky A-549, HT-29 a MEL-28 byly vysety do 16mm jamek v množství 2.10⁴ buněk na jamku v 1 ml podílech MEM 5FCS obsahujících uvedenou koncentraci léčiv. Oddělená řada kultur bez léčiva byla vyseta jako kontrolní růst, aby se zajistilo, že buňky zůstaly v exponenciální fázi růstu. Všechna stanovení byla prováděna dvojmo. Po třech dnech inkubace při 37 °C v atmosféře s 10 % CO₂ a s 98% vlhkostí byly jamky obarveny 0,5% (hmotn.) krystalovou violetí. Bylo stanoveno přibližné IC50 srovnáním růstu v jamkách s léčivem s růstem v kontrolních jamkách.

-4CZ 291931 B6

Výsledky in vitro cytotoxických testů pro HA-1 a ΊΉ-2 s buněčnými liniemi P-388, A-549, HT-29 a MEL-238 jsou uvedeny v následující tabulce.

sloučenina	IC₅₀(uM)
P-388	A-549	HT-29	MEL-28
HA-1	0,010	0,001	0,001	0,001
TH-2	0,011	0,002	0,002	0,002

Tabulka ukazuje, že tyto sloučeniny vzorce HA-1 a HT-2 s koncovou aldehydmethylovou skupinou mají in vitro protinádorovou selektivitu na pevná nádoby, jako jsou A-549, HT-29 a MEL-28.

Izolace známého kabiramidu B a C

Vzorek neidentifikované černé houby (mokrá, hmotnost 13,2 kg) byl sebrán u ostrova Sichang v květnu 1997. Jeho dichlormethanový podíl (67 g) byl dělen nejdříve na oxidu křemičitém vakuovou bleskovou chromatografií (VFC, postupná eluce), potom na sephadexu (dichlormethan-methanol, 1:1) a nakonec HPLC na obrácených fázích (methanol-voda-ethylacetát, 3:2:1). Získá se jak kabiramid B (Fusatani N. a spol.: J. Org. Chem. 1989, 54,1360 až 1363.) tak kabiramid C (Fusetani N. a spo.: J. Am. Chem. Soc. 1986,108, 847 až 849.) (35,0 mg).

Syntéza HA-1

Sloučenina vzorce HA-1 byla vyrobena tak, že se kabiramid B (24,0 mg) nechá reagovat dvě hodiny v 10 ml vodného okyseleného dioxanu (0,5N HCl-dioxan; Scheuer P. J. a spol.: J. Am. Chem. Soc. 1986,108, 846 až 487; Fusetani N. a spol., J. Am. Chem. Soc. 1986,108, 847 až 849.) při 50 °C. Surový produkt se rozdělí HPLC na obrácených fázích. Získá se ta, 6,4 mg (28 % hmotn.) sloučeniny vzorce HA-1 jako sklo a 7,1 mg (30 % hmotn.) regenerovaného karbiramidu B.

NMR data (všechny chemické posuny jsou uváděny vzhledem k TMS (δ = 0 ppm)) sloučeniny vzorce HA-1: ‘HNMR (CDC1₃, δ): 9,75 (1 H, t, J = 2,5 Hz), 8,10 (1 H, s), 8,04 (1 H, s), 7,59 (1 H, s), 7,29 (1 H, m), 6,33 (1 H, d, J = 16,0 Hz), 5,18 (1 H, dt, J = 2,0, a 10,0 Hz), 5,02 (1H, dd, J = 8,0 a 12,0 Hz), 4,85 (1 H, s), 4,15 (1 H, m), 3,84 (1 H, m), 3,45 (3 H, s), 3,37 (3 H, s), 3,30 (3 H, s), 3,27 (1 H, dd, J = 4,0 a 7,5 Hz), 3,07 (1 H, m), 2,73 (1 H, m), 2,62 (1 H, m), 2,57 (1 H, m), 2,53 (2 H, m), 2,45 (1 H, m), 2,43 (2 H, m), 2,36 (1H, dd, J = 2,0 a 8,0 Hz), 2,25 (1 H, m), 2,09 (1 H, m), 1,85 (3 H, m), 1,75 (1 H, m), 1,72 (3 H, m), 1,46 (2 H, m), 1,35 (1 H, m), 1,05 (3 H, d, J = 7,0 Hz), 1,02 (3 H, d, J = 7,0 Hz), 1,01 (3 H, d, J = 7,0 Hz), 0,97 (3 H, d, J = 7,0 Hz), 0,93 (3 H, d, J = 7,0 Hz), 0,83 (3 H, d, J = 7,0 Hz). ¹³C NMR (CDC1₃, δ): 213,3 s, 201,8 d, 172,0 s, 163,9 s, 157,7 s, 156,5 s, 155,4 s, 145,5 d, 141,7 s, 137,2 d, 136,9 d, 135,7 d, 131,1 s, 129,8 s, 115,1 d, 87,5 d, 82,2 d, 72,2 d, 74,4 d, 73,5 d, 70,4 d, 68,2 d, 60,6 q, 57,9 q, 57,6 q, 48,71, 46,1 t, 45,3 t, 43,4 t, 42,8 t, 42,71, 41,7 t, 37,8 t, 37,3 d, 34,7 d, 34,61, 31,0 d, 25,3 t, 25,1 d, 18,3 q (2 C), 15,6 q, 13,4 q, 10,6 q a 9,2 q. IČ spektrum (CHC1₃): 3470, 3015,1720, 1650, 1460,1315,1215, 915 a 665 cm'¹.

Syntéza TH-2

Směs kabiramidu C (35,0 mg) se nechá reagovat dvě hodiny v 10 ml směsi 0,5N HCl-dioxan (Scheuer P. J. a spol.: J. Am. Chem. Soc. 1986,108, 846 až 847; Fusetani N. a spol: J. Am. Chem. Soc. 1986, 108, 847 až 849.) při 50 °C. Směs se roztřepe mezi ethylacetát a vodu. Organická vrstvy se zahustí. Surový produkt se rozdělí HPLC na obrácených fázích (acetonitril-voda-ethylacetát, 6:4:1). Získá se tak 11,0 mg (33 % hmotn.) sloučeniny vzorce ΊΉ-2 jako sklo a 18,3 mg (52 % hmotn.) regenerovaného kabiramidu C.

-5CZ 291931 B6

NMR data (všechny chemické posuny jsou uváděny vzhledem k TMS (δ = 0 ppm) sloučeniny vzorce ΊΉ-2: *H NMR (CDC1₃, δ): 9,75 (1 H, t, J = 2,3 Hz), 8,09 (1 H), s), 8,03 (1 H, s), 7,58 (1 H, d, J = 1,0 Hz), 7,46 (1 Η, δ, J = 16,0, 9,5 a 5,0 Hz), 6,29 (1 H, d, J = 16,0 Hz), 5,32 (1 H, m), 5,17 (1 H, t, J = 10,5 Hz), 4,80 (1 H, s), 3,84 (1 H, m), 3,67 (1 H, m), 3,45 (3 H, s), 3,43 (3 H, s), 3,33 (3 H, s), 3,30 (3 H, s), 3,27 (1 H, m), 3,01 (1 H, m), 2,81 (1 H, m), 2,72 (1 H, t, J = 8,0 Hz), 2,59 (1H, dd, J = 14,3 a 9,7 Hz), 2,52 (1 H, m), 2,44 (1 H, m), 2,41 (2 H, m), 2,36 (1H, m), 2,32 (1 H, m), 2,15 (1 H, m), 1,85 (1 H, m), 1,46 (1 H, m), 1,34 (1 H, m), 1,04 (3 H, d, J = 6,7 Hz), 1,01 (3 H, d, J = 7,0 Hz), 0,99 (3 H, d, J = 7,0 Hz), 0,94 (3 H, d, J = 7,0 Hz), 0,87 (3 H, d, J = 6,4 Hz), 0,83 (3H, d, J = 7,0 Hz). ¹³C NMR (CDC1₃, δ): 213,4 s, 201,8 d, 171,6 s, 163,2 s, 157,3 s, 156,4 s, 155,4 s, 142,0 d, 141,4 s, 137,1 d, 136,8 d, 135,6 d, 131,1 s, 129,9 s, 115,5 d, 87,4 d, 82,0 d, 79,2 d, 78,3 d, 74,0 d, 73,3 d, 69,3 d, 60,6 q, 57,9 q, 57,6 q, 57,5 q, 48,61, 46,01,45,01, 43,61, 42,91, 41,71, 40,4 d, 37,3 d, 34,5 d, 33,91, 32,91, 30,9 d, 25,0 d (2C), 18,2 q (2 C), 15,5 q, 13,3 q, 10,7 q a 8,4 q.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Trisoxazolová makrolidová sloučenina obecného vzorce I ι

I v němž Me znamená methyl, X znamená nižší alkyl, R¹ a R² znamenají atom vodíku nebo nižší alkyl, R^3a znamená atom vodíku a R^3b znamená skupinu o

nebo nebo R^3a a R^3b společně znamenají atom kyslíku, R⁴ znamená atom vodíku, nižší alkoxyskupinu nebo nižší alkyl, R⁵ znamená atom vodíku, karbamoyl nebo nižší alkanoyl, R^6a znamená atom vodíku, R^6b znamená hydroxyskupinu nebo R^6a a Ř^6b společně znamenají atom kyslíku, R⁷znamená atom vodíku, nižší alkyl nebo hydroxymethyl, R⁸ znamená nižší alkoxyskupinu nebo nižší alkyl, Y¹ znamená atom vodíku nebo methyl a Y² znamená atom vodíku nebo Y¹ a Y²společně znamenají dvojnou vazbu;

ve shora uvedených definicích skupin v obecném vzorci I nižší alkyl a nižší alkylová část nižšího alkanoylu nebo nižší alkoxyskupiny znamenají alkylovou skupinu s přímým nebo větveným řetězcem s 1 až 6 atomy uhlíku, jako je methyl, ethyl, propyl, izopropyl, butyl, izobutyl, sekbutyl, íerc.-butyl, pentyl, neopentyl a hexyl.
2. Trisoxazolová makrolidová sloučenina podle nároku 1 vzorce HA.-1 kde Me znamená methyl.
3. Trisoxazolová makrolidová sloučenina podle nároku 1 vzorce TH-2

QHC

OH

OMe (TH-2), kde Me znamená methyl.
4. Trisoxazolová makrolidová sloučenina obecného vzorce I podle nároku 1 pro použití při léčení savce s maligním nádorem citlivým na tuto trisoxazolovou makrolidovou sloučeninu.
5. Trisoxazolová makrolidová sloučenina vzorce HA-1 podle nároku 2 pro použití při léčení savce s maligním nádorem citlivým na tuto trisoxazolovou makrolidovou sloučeninu.
6. Trisoxazolová makrolidová sloučenina vzorce TH-2 podle nároku 3 pro použití při léčení savce s maligním nádorem citlivým na tuto trisoxazolovou makrolidovou sloučeninu.
7. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že jako účinnou složku obsahuje trisoxazolovou makrolidovou sloučeninu obecného vzorce I podle nároku 1.
8. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že jako účinnou složku obsahuje trisoxazolovou makrolidovou sloučeninu vzorce HA-1 podle nároku 2 nebo ΊΉ-2 podle nároku 3.
9. Trisoxazolová makrolidová sloučenina obecného vzorce I podle nároku 1 v kombinaci s jiným nebo jinými protinádorovými činidly pro použití při léčení savce s maligním nádorem.
10. Způsob výroby trisoxazolové makrolidové sloučeniny vzorce HA-1 podle nároku 2 nebo vzorce TH-2 podle nároku 3, vyznačující se tím, že se kabiramid B, respektive kabiramid C, nechá reagovat s kyselinou chlorovodíkovou v dioxanu za vzniku trisoxazolové makrolidové sloučeniny vzorce HA-1 podle nároku 2, respektive trisoxazolové makrolidové sloučeniny vzorce TH-2 podle nároku 3.