CZ288583B6

CZ288583B6 - 1,3-Dioxo-6-(3-methylaminopropyl)-1,2,3,6-tetrahydro-4-(thiofen-3-yl)pyrrolo[3,4-c]karbazol, jeho použití a farmaceutický prostředek, který ho obsahuje

Info

Publication number: CZ288583B6
Application number: CZ19951997A
Authority: CZ
Inventors: Chris Allen Broka
Original assignee: F. Hoffmann-La Roche Ag
Priority date: 1994-08-04
Filing date: 1995-08-03
Publication date: 2001-07-11
Also published as: KR960007592A; MY117092A; EP0695755A1; JPH0859666A; HUT73437A; CN1123280A; CN1051551C; JP2672290B2; NO953052L; CO4410329A1; NZ272687A; MA23639A1; US5721267A; DE69505470T2; AU692563B2; AU2722095A; TR199500954A1; TW403652B; NO953052D0; KR100326790B1

Abstract

1,3-Dioxo-6-(3-methylaminopropyl)-1,2,3,6-tetrahydro-4-(thiofen-3-yl)pyrrolo[3,4-c]karbazol a jeho farmaceuticky p°ijateln soli jsou vhodn pro v²robu farmaceutick ho prost°edku pro oÜet°ov n malign ch onemocn n zvl Üt malobun n²ch plicn ch karcinom , karcinom tlust ho st°eva a n dor ledvin a prostaty.\

Description

Oblast techniky

Vynález se týká l,3-dioxo-6-(3-methylaminopropyl)-l,2,3,6-tetrahydro-4-(thiofen-3-yl)pyrrolo[3,4-c]karbazolu, jeho farmaceuticky přijatelné soli a jeho použití pro výrobu farmaceutických prostředků pro ošetřování maligních onemocnění zvláště maiobuněčných plicních karcinomů, karcinomů tlustého střeva a nádorů ledvin a prostaty.

Dosavadní stav techniky

Z evropského patentového spisu číslo EP-A-03 62695 jsou známy podobné sloučeniny jako podle vynálezu. Tyto sloučeniny mají však fenylovou skupinu místo thiofenylové skupiny a žádná ze jmenovaných sloučenin nemá monomethylaminopropylovou skupinu.

Výzkumu sloučenin za účelem získání nových účinných látek pro léčení zhoubných onemocnění se věnuje stálá pozornost. Vynález je výsledkem takového výzkumu.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je l,3-dioxo-6-(3-methylaminopropyl)-l,2,3,6-tetrahydro-4-(thiofen-3yl)pyrrolo[3,4-c]karbazol a jeho farmaceuticky přijatelné soli.

Farmaceutický prostředek podle vynálezu spočívá vtom, že obsahuje terapeuticky účinné množství 1,3-dioxo-6-(3-methylaminopropyl)-l ,2,3,6-tetrahydro-4-(thiofen-3-yl)pynOlo[3,4cjkarbazolu nebo jeho soli a farmaceuticky přijatelný excipient.

Farmaceutických prostředků podle vynálezu se používá k léčení maligních onemocnění zvláště maiobuněčných plicních karcinomů, karcinomů tlustého střeva a nádorů ledvin a prostaty savců zejména lidí podáváním při potřebě takového léčení terapeuticky účinného množství 1,3-dioxo6-(3-methylaminopropyl)-l,2,3,6-tetrahydro-4-(thiofen-3-yl)pynOlo[3,4-c]karbazolu nebo jeho soli.

Farmaceuticky přijatelnou solí může být jakákoli sůl odvozená od anorganické nebo od organické kyseliny. Farmaceuticky přijatelným aniontem se zde vždy míní aniont takovéto adiční soli s kyselinou. Sůl a/nebo anion jsou voleny tak, aby nebylo biologicky nebo jinak nežádoucí. Anionty jsou odvozeny od anorganických kyselin, jako je například kyselina chlorovodíková, bromovodíková, sírová (poskytuje síranové a hydrogensíranové soli), dusičná a fosforečná a od organických kyselin, jako je například kyselina octová, propionová, glykolová, pyrohroznová, šťavelová, jablečná, malonová, jantarová, maleinová, fúmarová, vinná, citrónová, benzoová, skořicová, mandlová, methansulfonová, ethansulfonová, salicylová a p-toluensulfonová.

Výraz „léčba“ nebo „léčení“ znamená jakoukoli léčbu nemoci savců včetně:

i) prevence této nemoci, to znamená klinické symptomy se nevyvinou, ii) inhibice nemoci, to znamená zastavení klinických symptomů a/nebo iii) zmírnění nemoci, to znamená vyvolání regrese klinických symptomů.

Výrazem „účinné množství“ se míní dávka dostatečná k zajištění léčení stavu onemocnění, který je ošetřován. Toto množství se řídí stavem pacienta, onemocněním a prováděnou léčbou.

-1 CZ 288583 B6 l,3-Dioxo-6-(3-methylaminopropyl)-l,2,3,6-tetrahydro-4-(thiofen-3-yl)pyrrolo[3,4-c] karbazol odpovídá obecnému vzorci I, kde znamená R² thiofenylovou skupinu, přičemž jednotlivé polohy jsou očíslovány následovně:

Výraz „rozpouštědlo“, „inertní organické rozpouštědlo“ nebo „inertní rozpouštědlo“ znamená rozpouštědlo inertní za podmínek popisované reakce, jako například benzen, toluen, acetonitril, tetrahydrofuran (THF), dimethylformamid (DMF), chloroform, methylenchlorid (nebo 10 dichlormethan), diethylether, methanol, pyrridin, pokud není uvedeno jinak.

Výraz „q. s“ znamená přidání množství dostatečného pro dosažení udané funkce, například k přivedení roztoku do požadovaného objemu (to je 100 %).

Pokud není specifikováno opačně, zde popsané reakce se uskutečňují při atmosférickém tlaku v teplotním rozmezí od 5 °C do 100 °C, (výhodně od 10 °C do 50 °C, nejvýhodněji při teplotě místnosti nebo okolí, například 20 °C).

Pokud není určeno jinak, reakční doby a podmínky jsou považovány za přibližné, například 20 uskutečňující se při asi atmosférickém tlaku v teplotním rozmezí asi 5 °C až asi 100 °C (výhodně od asi 10 °C do asi 50 °C, nejvýhodněji asi 20 °C) po dobu asi 1 až asi 10 hodin (výhodně asi 5 hodin). Parametry uvedené v příkladech provedení jsou považovány za určité, ne přibližné.

Izolace a čištění sloučenin a mezi produktů zde popsaných mohou být prováděny, když je třeba, 25 jakýmkoli vhodným separačním nebo čisticím postupem jako je například filtrace, extrakce, krystalizace, sloupcová chromatografie, tenkovrstvá chromatografie nebo chromatografie na tlusté vrstvě, nebo kombinace těchto postupů.

Specifická znázornění vhodných separačních a izolačních postupů mohou být provedena 30 odkazem na zde uvedené příklady provedení. Avšak mohou být také použity jiné ekvivalentní separační nebo izolační postupy.

l,3-Dioxo-6-(3-methylaminopropyl)-l,2,3,6-tetrahydro-4-(thiofen-3-yl)pyrrolo[3,4-c] karbazol se může připravovat následujících způsobem:

-2CZ 288583 B6

Reakční schéma

vzorec 2

R^HO _r stupeň 2

vzorec 3 vzorec 4

vzorec 5 vzorec 4 stupeň 4a

vzorec 5a

Y je chránící skupina vzorec 5 nebo vzorec 5a stupeň 5

-3CZ 288583 B6

První krok převádění sloučeniny vzorce 1 na fosfoniovou sůl vzorce 2 se provádí způsobem popsaným v literatuře (Canadian J. Chem. 51, str. 792,1973).

Sloučenina vzorce 1 se rozpustí v protickém rozpouštědle, s výhodou v methanolu, a nechá se reagovat s přebytkem methyljodidu při teplotě 10 až 50 °C, s výhodou při teplotě 25 °C, po dobu 1 až 10 hodin, s výhodou 3 hodin. Přidá se přibližně 1 molámí ekvivalent trifenylfosfínu v polárním rozpouštědle, s výhodou v dimethylformamidu, a reakční směs se udržuje na teplotě 100 až 150 °C, s výhodou na teplotě zpětného toku, po dobu 6 až 24 hodin, s výhodou 16 hodin. Když je reakce v podstatě ukončena, izoluje se fosfoniová sůl a čistí se o sobě známými způsoby, s výhodou krystalizaci.

Při kroku 2 se fosfoniová sůl sloučenina vzorce 2 nechá reagovat s thiofenanhehydem vzorce R²CHO v přítomnosti zásady za získání vinylindolu vzorce 3.

Fosfoniová sůl sloučenina vzorce 2 se rozpustí v polárním aprotickém rozpouštědle, s výhodou v dimethylsulfoxidu, a nechá se reagovat thiofenaldehydem vzorce R²CHO v přítomnosti maskované přísady, s výhodou l,5-diazabicyklo[4,3,0]non-5-enu nebo 1,8-diazabicyklo[5,4,0]undec-7-enu. Reakce se provádí při teplotě 20 až 100 °C, s výhodou při teplotě 80 °C, po dobu přibližně 2 hodiny a reakční směs se následně míchá při teplotě 20 °C po dobu 6 až 48 hodin, s výhodou přibližně 16 hodin. Když je reakce v podstatě ukončena, izoluje se vinylindol a čistí se o sobě známými způsoby, s výhodou chromatografií na silikagelu nebo krystalizaci.

Při kroku 3 se vinylindol vzorce 3 nechá reagovat s l-jod-3-(terc.-butyl)difenylsilyloxypropanem a po odstranění chránící skupiny se získá N-hydroxypropylvinylindol vzorce 4.

Vinylindol vzorce 3 se rozpustí v polárním aprotickém rozpouštědle, s výhodou v dimethylformamidu nebo v dimethylsulfoxidu, a nechá se reagovat s hydridem alkalického kovu například s hydridem draselným nebo sodným, s výhodou s hydridem draselným při teplotě 0 až 50 °C, s výhodou při teplotě 25 °C. Po 5 minutách až 3 hodinách, s výhodou po 15 minutách, se přidá 1jod-3-(terc.-butyl)difenylsilyloxypropan a reakční směs se míchá při téže teplotě po dobu přibližně 1 až 24 hodin, s výhodou 16 hodin. Když je reakce v podstatě ukončena, izoluje se silylem chráněná sloučenina a čistí se o sobě známými způsoby, s výhodou chromatografií na silikagelu. Silylová skupina se odstraní zpracováním tetrabutylamoniumfluoridem nebo pyridinfluorovodíkovou kyselinou v tetrahydrofuranu nebo v dimethoxyethanu při teplotě 20 až 30 °C v průběhu 1 až 12 hodin, s výhodou 2 hodin. N-Hydroxypropylindol vzorce 4 se čistí s výhodou chromatografií na silikagelu.

V kroku 4 se hydroxylová skupina ve sloučenině vzorce 4 převádí na methylaminoskupinu za získání sloučeniny vzorce 5.

Alkohol vzorce 4 se rozpustí v methylenchloridu nebo v chloroformu, s výhodou v methylenchloridu a zpracovává se v přítomnosti maskované zásady, například 2,6-lutidinu nebo 2,4,6kolidinu, s výhodou 2,6-lutidinu anhydridem kyseliny trifluormethansulfonové při teplotě -10 až 20 °C, s výhodou 0 °C, po dobu 15 minut až 1 hodiny, s výhodou 30 minut.

Produkt se nechává reagovat s nadbytkem methylaminu při teplotě 0 až 40 °C, s výhodou 25 °C po dobu přibližně 3 hodin, načež se reakční směs ponechá při teplotě 0 °C po dobu 6 až 24 hodin, s výhodou 12 hodin. Když je reakce v podstatě ukončena, izoluje se vinylamin vzorce 5 a čistí se o sobě známými způsoby, s výhodou chromatografií na silikagelu nebo se přímo použije v kroku 5.

Je také možné v kroku 4a převádět hydroxylovou skupinu ve sloučenině vzorce 4 na chráněnou methylaminoskupinu za získání sloučeniny vzorce 5a. V takovém případě se získaný vinylamin

-4CZ 288583 B6 rozpustí v inertním rozpouštědle v přítomnosti terciární zásady, s výhodou triethylaminu a nechá se reagovat se diterc.-butyldikarbonátem za získání terc.-butoxykarbamátového derivátu.

V kroku 5 se vinylamin vzorce 5 nebo chráněný vinylamin vzorce 5a, jako je vinyltrifluoracetamidová sloučenina vzorce 5a převádí na sloučeninu obecného vzorce I reakcí s maleimidem.

Vinylamin vzorce 5 nebo chráněný vinylamin vzorce 5a se v aromatickém uhlovodíku, s výhodou v toluenu, a vaří pod zpětným chladičem se 2 až 3 molámími ekvivalenty, s výhodou se 2 molámími ekvivalenty, maleimidu po dobu 6 až 24 hodin, s výhodou 16 hodin. Když je reakce v podstatě ukončena, izoluje se Diels-Alderův adukt a čistí se s výhodou chromatografií na silikagelu.

Tento adukt se rozpustí v inertním rozpouštědle, například v benzenu, v toluenu nebo v methylenchloridu, s výhodou v toluenu, a nechá se reagovat se 2 až 3 molámími ekvivalenty, s výhodou se 2 molámími ekvivalenty dichlordikyanbenzochinonu při teplotě 20 až 50 °C, s výhodou 25 °C, po dobu 15 minut až 3 hodin, s výhodou 30 minut. Když je reakce v podstatě ukončena, výsledný karbazol se izoluje konvenčními postupy.

Jestliže výchozí vinylamin má vzorec 5a, odstraní se chránící skupina Y. Odstranění chránící skupiny se může provést o sobě známými prostředky. Jestliže například je přítomna trifluoroctová chránící skupina, karbazol se zpracuje s anorganickou zásadou (hydroxid sodný, hydroxid draselný a podobně, výhodně hydroxid sodný) v protickém rozpouštědle (methanol, ethanol nebo jejich směsí, smísí se s tetrahydrofuranem po dobu asi 15 minut při asi 25 °C, aby se odštěpila trifluoroctová chránící skupina. Alternativně když je amin chráněn t.BOC skupinou (terc.-butoxykarbonyl), odstraní se tato chránící skupina zpracováním s kyselinou. Výsledný pyrrolokarbazol vzorce I se izoluje a vyčistí, výhodně silikagelovou chromatografií.

Sloučeniny vzorce I mohou být převedeny na odpovídající adiční soli s kyselinou. Přeměna se provede zpracováním se stechiometrickým množstvím příslušné kyseliny jako je kyselina chlorovodíková (například 3 molámí ekvivalenty k vytvoření trihydrogenchloridové soli). Typicky se volná báze rozpustí v polárním organickém rozpouštědle jako je methanol nebo ethanol a kyselina se přidá ve vodě methanolu nebo ethanolu. Teplota se udržuje při 0 až 50 °C. Odpovídající sůl se sráží spontánně nebo může být převedena z roztoku méně polárním rozpouštědlem.

Adiční soli s kyselinou sloučenin vzorce I mohou být rozloženy na odpovídající volné báze zpracováním s přebytkem vhodné zásady jako je hydrogenuhličitan amonný nebo sodný, typicky v přítomnosti vodného rozpouštědla a při teplotě mezi 0 °C až 50 °C. Forma volné báze se izoluje konvenčními prostředky jako je extrakce organickým rozpouštědlem.

Sloučeniny tohoto vynálezu jsou inhibitory proteinové kinázy C, užitečnými jako chemoterapeutické prostředky pro léčení savců, zejména lidí, majících různé maligní chorobné stavy zahrnující: malobuněčný plicní karcinom, střevní karcinom, prsní tumory odpovídající MCS7, MDA-MB-435 a MDA-N buněčným liniím a PKC přečnívajícím tumorům jako jsou ty, které odpovídají CHO/PKC-epsilon. Různé sloučeniny tohoto vynálezu vykazují větší účinnost vůči určitým tumorům oproti jiným, jak může být určeno běžně používanými metodami. Účinnost in vitro pro inhibici proteinové kinázy C se kvantitativně měří začleněním ³²P z gama-³²P ATP do syntetických peptidových substrátů.

Účinnost in vivo pro chemoterapeutické prostředky, zejména pro léčení maligních onemocnění, se určuje testy inhibice tumorů, například jak je popsáno Maneckjee, a kol., v Proč. Nati, Acad. Sci. USA, Sv. 89, 1 169-1 173 (únor 1992). Variace této zkoušky mohou být provedeny například za použití buněk HT-29 karcinomu střeva, SCLC H82 buněk, CHO/PKC-beta a CHO/PKC-epsilon buněk.

-5CZ 288583 B6

Sloučeniny vzorce I se podávají v terapeuticky účinné dávce, například v dávce dostatečné pro zajištění léčení pro stavy nemocí dříve popsaných. Podání sloučeniny tohoto vynálezu nebo její farmaceuticky akceptovatelné soli může být jakýmkoli akceptovaným způsobem podání pro prostředky, které slouží podobným využitím.

I když úrovně dávek je třeba pro sloučeniny tohoto vynálezu optimalizovat, obvykle je denní dávka od asi 0,1 do asi 20,0 mg/kg tělesné hmotnosti, výhodně asi 0,5 až 10,0 mg/kg tělesné hmotnosti a výhodněji asi 1,0 až 5,0 mg/kg tělesné hmotnosti. Tak pro podání 70 kg těžké osobě by dávkovači rozmezí bylo mezi asi 7,0 až 1 400 mg za den, výhodně asi 35,0 až 700 mg na den a nejvýhodněji asi 70 až 350 mg na den. Množství podávané aktivní sloučeniny však bude závislé na subjektu a stavu onemocnění, které má být léčeno, závažnosti postižení, způsobu a rozvrhu podávání a mínění předpisujícího lékaře.

Při využívání sloučenin tohoto vynálezu pro léčení výše uvedených stavů může být použití jakýkoli farmaceuticky akceptovatelný způsob podávání. Sloučeniny vzorce I mohou být podávány buď samotné, nebo v kombinaci s jinými farmaceuticky akceptovatelnými základy včetně tuhých, polotuhých, kapalných nebo aerosolových dávkovačích forem jako jsou například tablety, tobolky, prášky, kapaliny, suspenze, čípky, aerosoly a podobně. Sloučeniny vzorce I mohou být také podávány v trvalých formách nebo v dávkovačích formách řízeného uvolňování včetně depotních injekci, osmotických pump, pilulek, transdermálních (včetně elektrotransportních) náplastí a podobně, pro prolongované podávání sloučeniny předem stanovenou rychlostí výhodně v jednotkových dávkovačích formách vhodných pro jednotlivé podání přesného dávkování.

Směsi budou typicky zahrnovat konvenční farmaceutický nosič nebo základ a sloučeniny vzorce I nebo její farmaceuticky akceptovatelnou sůl. Navíc tyto směsi mohou zahrnovat jiné medicinální prostředky, farmaceutické prostředky, nosiče, základy atd. jako jsou multiléčivé odolnost rezervující prostředky.

Obvykle v závislosti na uvažovaném způsobu podávání bude farmaceuticky akceptovatelná směs obsahovat asi 0,1 % až 90 %, výhodně asi 0,5 % až 50 % hmotnostních sloučeniny nebo soli vzorce I, přičemž zbytek jsou vhodné farmaceutické základy, nosiče a tak dále.

Jedním výhodným způsobem podávání pro podmínky, které byly detailně uvedeny výše, je orální podání za použití obvyklého denního dávkovacího předpisu, který může být nastaven podle stupně závažnosti. Pro takovéto orální podávání se vytvoří farmaceuticky akceptovatelná netoxická směs začleněním kteréhokoli z normálně využívaných základů jako je například manitol, laktkóza, škrob, stearát hořečnatý, sacharinát sodný, talek, celulóza, sodná kroskarmelóza, glukóza, želatina, sacharóza, uhličitan hořečnatý a podobně. Takovéto směsi mají formu roztoků, suspenzí, tablet, dispergovatelných tablet, pilulek, tobolek, prášků, formulací s opožděným uvolňováním a podobně.

Výhodně mají směsi formu pilulek nebo tablet a tak taková směs obsahuje spolu s aktivní složkou ředidlo jako je laktkóza, sacharóza, fosforečnan dvojvápenatý a podobně, lubrikant, jako je stearan hořečnatý nebo podobně a pojivo jako je škrob, klovatina, polyvinylpyrrolidin, želatina, celulóza a její deriváty a podobně.

Kapalné farmaceuticky podatelně směsi mohou být například připraveny rozpouštěním, dispergací a tak dále aktivní sloučeniny definované výše a volitelných farmaceutických základů v nosiči jako je například voda, fyziologický roztok, vodný roztok dextrosy, glycerol, glykoly, ethanol a podobně, čímž se vytvoří roztok nebo suspenze. Když je třeba, farmaceutická směs, která má být podávána, může také obsahovat malá množství netoxických pomocných látek jako jsou smáčecí prostředky, emulgační prostředky nebo solubilizační prostředky, pH pufrující prostředky a podobně, například octan sodný, citran sodný, deriváty cyklodextrinu, sorbitanmonolaurat, triethanolaminacetat, triethanolaminoleat atd.

-6CZ 288583 B6

Aktuální způsoby přípravy takovýchto dávkovačích forem jsou známy nebo jsou zřejmé odborníkům v tomto oboru, například viz Remingtonů Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 15. vydání, 1975. Směs neboli formulace, která má být podávána, bude v kterémkoli případě obsahovat takové množství aktivní sloučeniny, které je účinné k zmírnění symptomů subjektu, který je léčen.

Dávkovači formy nebo směsi obsahující aktivní složku v rozmezí 0,05 % až 95 % mohou být připraveny v rovnováze vytvořené z netoxického nosiče.

Pro orální podání se vytvoří farmaceuticky akceptovatelná netoxická směs začleněním kteréhokoli normálně využívaného základu jako jsou například farmaceutické jakosti manitolu, laktkózy, škrobu, stearanu hořečnatého, talku, derivátů celulózy, sodné kroskarmelózy, glukózy, sacharózy, uhličitanu hořečnatého, sodného sacharinu, talku a podobně. Takovéto směsi mají formu roztoků, suspenzí, tablet, tobolek, prášků, formulací trvalého uvolňování a podobně. Takovéto směsi mohou obsahovat 0,01 % až 95 % aktivní složky, výhodně 0,1 až 50 %.

Pro tuhou dávkovači formu, roztok nebo suspenze v například propylenkarbonatu, rostlinných olejích nebo triglyceridech, se výhodně zapouzdří vželatinové tobolce. Takovéto diesterové roztoky a jejich příprava a zapouzdření jsou zveřejněny v US patentech číslo 4 328 245, 4 409 239 a 4 410 545.

Pro kapalnou dávkovači formu, může být roztok například v polyethylenglykolu zředěn dostatečným množstvím farmaceuticky akceptovatelného kapalného nosiče například vody, aby bylo snadné odměřování při dávkování.

Alternativně kapalné nebo polotuhé orální směsi mohou být připraveny rozpouštěním nebo dispergací aktivní sloučeniny nebo soli v rostlinných olejích, glykolech, triglyceridech, propylenglykolesterech (například propylenkarbonatu) a pod., a zapouzdřením těchto roztoků nebo suspenzí do tvrdých nebo měkkých želatinových tobolkových pouzder.

Jiné užitečné formulace zahrnují ty, které jsou shrnuty v US patentech číslo Re 28 819 a 4 358 603.

Parenterální podání se obvykle provádí injekcí buď subkutánně, intramuskulámě, nebo intravenózně. Injektovatelné látky mohou být připraveny v konvenčních formách buď jako kapalné roztoky, nebo suspenze, v tuhých formách vhodných pro roztok nebo suspenzi v kapalině před injekcí, nebo jako emulze. Vhodné základy jsou například voda, fyziologický roztok, dextrosa, glycerol, ethanol nebo podobně.

Navíc, když je třeba, farmaceutické směsi, které mají být podávány, mohou také obsahovat malá množství netoxických pomocných látek, jako jsou smáčecí nebo emulgační prostředky, prostředky pufrující pH, prostředky zvyšující rozpustnost a podobně, jako je například octan sodný, sorbitanmonolaurat, thiethanolaminoleat, cyklodextriny a tak dále. Nověji navržený přístup pro parenterální podání využívá implantaci pomalu uvolňovacího nebo trvale uvolňovacího systému, tak, že se udržuje konstantní úroveň dávkování. Viz například US patent číslo 3 710 795.

Procentáž aktivní sloučeniny obsažené v takovýchto parenterálních směsích je velmi závislá na její specifické povaze stejně jako na aktivitě této sloučeniny a na potřebách subjektu. Jsou však využitelné procentáže aktivní sloučeniny v roztoku 0,01 % až 10 % a budou vyšší, když směs je tuhá látka, která bude následně zředěna na výše uvedenou procentáž. Výhodně bude směs obsahovat 0,2 až 2 % aktivního prostředku v roztoku. Mohou být také podávány nasální roztoky aktivní sloučeniny samotné nebo v kombinaci s jinými farmaceuticky akceptovatelnými základy.

-7CZ 288583 B6

Formulace aktivní sloučeniny nebo soli mohou být také podávány do respiračního traktu jako aerosol nebo roztok pro rozprašovač nebo jako mikrojemný prášek pro insuflaci, samotné nebo v kombinaci s inertním nosičem jako je laktkóza. V takovém případě mají částice formulací průměry menší než 50 mikrometrů, výhodně menší než 10 mikrometrů.

Vynález blíže objasňují, nijak však neomezují, následující příklady praktického provedení.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava sloučeniny vzorce 2

Roztok 2-N,N-dimethylaminomethylindolu (5,4 g) (Acta Chim. Acad. Sci. Hung. 34, str. 439, 1962) ve 40 ml methanolu se smíchá s methyljodidem (15 ml). Reakční směs se ponechá v klidu po dobu 3 hodin. Odpařením rozpouštědla se získá sklo, ke kterému se přidá trifenylfosfin (11,6 g) a dimethylformamid (100 ml). Reakční směs se vaří pod zpětných chladičem přes noc, většina dimethylformamidu se oddestiluje za sníženého tlaku a zbytek se trituruje s benzenem (75 ml). Vytvořené krystaly se odfiltrují, promyjí se malým množstvím benzenu a vysuší se ve vakuu. Tak se získá indol-2-methyltrifenylfosfoniumjodid (10,4 g).

Příklad 2

Příprava sloučeniny vzorce 3

Do roztoku 1,04 g indol-2-methyltrifenylfosfoniumjodidu v 60 ml dimethylsulfoxidu se přidá 175 μΐ thiofen-3-karboxaldehydu a následně 250 μΐ l,8-diazabicyklo[5,4,0]undec-7-enu. Reakční směs se míchá v prostředí dusíku při teplotě 40 °C po dobu 1 hodiny, pak při teplotě 80 °C po dobu 2 hodin a nakonec se míchá přes noc při teplotě 20 °C. Směs se vlije do vody a extrahuje se diethyletherem. Organická vrstva se vysuší, rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku a zbytek se nechá vykrystalovat z methanolu. Získá se 200 mg 2-[thiofen-3-yl)vinyl] indolu (44% výtěžek).

Příklad 3

Příprava sloučeniny vzorce 4

Rozpustí se 2-[2-(thiofen-3-yl)vinyl]indol (200 mg) ve 3 ml dimethylforamidu a přidá se 40 mg hydridu draselného a ponechá se na teplotě 20 °C po dobu 15 minut. Přidá se l-jod-3-(terc.butyldifenylsilyloxy)propan (500 mg) a reakční směs se míchá přes noc při teplotě 25 °C. Po rozdělení směsi mezi diethylether a vodu se organická vrstva vysuší a rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku. Zbytek se čistí preparativní chromatografií v tenké vrstvě TLC na silikagelu (za použití jako elučního činidla směsi 5:1 hexan/ethylacetát). Získá se 330 mg l-[3-(terc.-butyldifenylsilyloxy)propyl]-2-[2-(thiofen-3-yl)viny 1] indolu (71 % výtěžek).

Produkt se rozpouští ve 2 ml tetrahydrofuranu, přidají se 2 ml roztoku 1M tetrabutylamoniumfluoridu a ponechá se při teplotě 25 °C po dobu 2 hodin. Po rozdělení směsi mezi diethylether a vodu se organická vrstva vysuší a rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku. Zbytek se čistí preparativní chromatografií v tenké vrstvě TLC na silikagelu (za použití jako elučního činidla směsi 2:1 hexan/ethylacetát. Získá se 121 mg l-(3-hydroxypropyl)-2-[2(thiofen-3-yl)vinyl] indolu (68% výtěžek).

-8CZ 288583 B6

Příklad 4

Příprava sloučeniny vzorce 5a

Do roztoku l-(3-hydroxypropyl)-2-[2-(thiofen-3-yl)vinyl]indolu (121 mg) ve 3 ml methylenchloridu se přidá 120 μΐ 2,6-lutidinu a roztok se ochladí na 0 °C. Přidá se anhydrid trifluormethansulfonové kyseliny (100 μΐ, míchá se po dobu 30 minut, přidá se 5 ml 40% vodného roztoku methylaminu a reakční směs se míchá při teplotě 25 °C po dobu 3 hodin. Po dobu dalších 12 hodin se reakční směs míchá při teplotě 0 °C, rozdělí se mezi methylenchlorid a vodu, organická vrstva se vysuší a rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku. Zbytek se čistí preparativní chromatografií v tenké vrstvě TLC na silikagelu (za použití jako elučního činidla roztoku 10 % methanolu v methylenchloridu). Získá se 83 mg l-[3-(methylamino)propyl]-2-[2(thiofen-3-yl)vinyl]indolu (67% výtěžek).

Tento produkt se rozpustí ve 3 ml methylenchloridu obsahujícího 150 μΐ pyridinu a přidá se anhydrid trifluoroctové kyseliny (40 μΐ). Po 30 minutách se směs rozdělí mezi diethylether a hydrogenuhličitan sodný, organická vrstva se vysuší a rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku. Zbytek se čistí preparativní chromatografií v tenké vrstvě TLC na silikagelu za použití jako elučního činidla směsi 3:1 hexan/ethylacetát. Získá se 80 mg l-[3-(N-methyltrifluormethylacetamido)-propyl]-2-[2-(thiofen-3-yl)vinyl]indolu (73% výtěžek).

Příklad 5

Příprava sloučeniny vzorce I

Do roztoku l-[3-(N-methyltrifluormethylacetamido)-propyl]-2-[2-(thiofen-3-yl)vinyl]indolu (80 mg) ve 2 ml toluenu se přidá 40 mg maleimidu. Vaří se pod zpětným chladičem přes noc, rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku. Zbytek se čistí preparativní chromatografií v tenké vrstvě TLC na silikagelu. Získá se 20 mg Diels-Alderova aduktu (20% výtěžek).

'H NMR (CDCLj): 7,96 (m, 1H), 7,35-7,15 (m, 4H), 7,13 (m, 1H), 7,02 (m, 1H), 4,40 (d, 1H), 4,13 (t, 2H), 3,73 (m, 2H), 3,45 (t, 2H), 3,12 (m, 2H), 3,06 (s, 3H), 2,02 (5, 2H).

Tento produkt se rozpustí ve 3 ml benzenu a přidá se 20 mg dichlordikyanbenzochinonu (DDQ). Po 10 minutách se přidá dalších 10 mg DDQ. Po 10 minutách se reakční směs vnese na desku pro preparativní chromatografii v tenké vrstvě a jako elučního činidla se použije směsi 2:1 hexan/ethylacetát. Získá se 18 mg l,3-dioxo-6-(N-methyltrifluormethylacetamidopropyl)l,2,3,6-tetrahydro-4-(thiofen-3-yl)pyrrolo[3,4-c]karbazolu v podobě žluté pěny.

Produkt se rozpustí ve 4 ml směsi methanol/tetrahydrofuran a přidá se 1 ml 1M roztoku hydroxidu sodného. Míchá se po dobu 15 minut a směs se rozdělí mezi methylenchlorid a vodu. Organická vrstva se oddělí a rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku. Zbytek se čistí preparativní chromatografií v tenké vrstvě TLC na silikagelu (za použití jako elučního činidla roztoku 10 % methanolu v methylenchloridu). Získá se 15 mg l,3-dioxo-6-(N-methyltrifluormethylacetamidopropyl)-l,2,3,6-tetrahydro-4-(thiofen-3-yl)pyrrolo[3,4-c]karbazolu.

'H NMR (d₆-DMSO): 8,96 (d, H), 8,00 (s, 1H), 7,95 (m, 1H), 7,74 (d, 1H), 7,62 (m, 3H), 7,35 (t, 1H), 4,59 (t, 2H), 2,55 (t, 2H), 2,29 (s, 3H), 1,97 (t, 2H).

HRMS pro C22H19N3O2S: vypočteno 389,1197, nalezeno 389,1198.

-9CZ 288583 B6

Následující příklady objasňují farmaceutické prostředky obsahující jako účinnou látku vždy 1,3dioxo-6-(N-methyltrifluormethylacetamidopropyl)-l,2,3,6-tetrahydro-4-(thiofen-3-yl)pyrrolo[3,4-c]karbazol.

Příklad 6

Tento příklad objasňuje přípravu farmaceutického prostředku pro orální podání.

Složka________________________________Množství v tabletě (mg) účinná látka 200 laktóza sušená rozprašováním 148 stearan hořečnatý 2

Složky se smíchají a zavedou se do želatinových tobolek s tvrdým pouzdrem.

Příklad 7

Tento příklad objasňuje přípravu dalšího farmaceutického prostředku pro orální podání.

Složka	Množství v tabletě (mg)
účinná látka kukuřičný škrob laktóza stearan hořečnatý	400 50 145 5

Složky se smíchají a lisují se za získání tablet s jedním vroubkem.

Příklad 8

Tento příklad objasňuje přípravu suspenze pro orální podání.

Složka________________________________Množství v tabletě (mg)

účinná látka	1,00 g
kyselina fumarová	0,50 g
chlorid sodný	2,00 g
methylparaben	0,10 g
zrnitý cukr	25,40 g
sorbitol (70% roztok)	12,85 g
Veegum K (Vanderbilt Co.)	1,10 g
ochucovací přísada	0,035 g
barvivo	0,50 g
destilovaná voda do	100,00 ml

Příklad 9

Tento příklad objasňuje injektovatelný prostředek pufrovaný na hodnotu pH 7,4.

-10CZ 288583 B6

Složka_______________________________Množství v tabletě (mg) účinná látka 0,2 g octan sodný (0,4M) jako pufr 2,0 ml

HCl(lN)dopH 7,4 voda (destilovaná, sterilní) do 20,0 ml

Příklad 10

Tento příklad objasňuje čípky o hmotnosti 2,5 g.

účinná látka 500,0 mg

WitepsolH-15 do 2,5 g

Witepsol H-l 5 je obchodní produkt společnosti Riches-Nelson, lne. New York, N.Y., přičemž jde o produkt na bázi triglyceridů nasycených rostlinných mastných kyselin.

Příklad 11

Určení aktivity in vitro využívající inhibičního testu proteinové kinázy C

Inhibiční aktivita proteinové kinázy C (PKC) se kvantifikuje měřením začlenění ³²P z gama-³²P ATP do syntetických peptidových substrátů. Inhibiční potenciál se měří za použití betal isoenzymu PKC z krysího mozku a syntetického peptidového substrátu ala-lys-arg-arg-arg-leuser-ser-leu-arg-ala.

Reakční směs obsahující 25 mM tris-HCl, pH 7,5, 2,5 mM dusičnanu hořečnatého, 1,0 mM EGTA, 20 mikroM substrátu. 1 mikrog/ml fosfatidylserinu (PS), 5.10⁶ M-diacylglycerolu (diC8) a 50 mM ATP se obohatí gama-³²P ATP (> 5000 Ci/mmol) čímž se získá přibližně 10⁶ CPM na reakční směs a 0,08 mikrogramů/ml PKC v 50 mikrolitrech objemu na prohlubeň. Test probíhá s nebo bez testované sloučeniny přidané v různých koncentrací. Po 5 minutách inkubace při teplotě místnosti se reakce zastaví přídavkem 0,2 V 50% TCA roztoku.

mikrolitrový vzorek z každé prohlubně (kontrolní a testovaná sloučenina) se pak nakápne na Whatman P-81 iontoměnný chromatografický papír a začlenění ³²P se pak počítá na Beckman LS 5000 TA kapalinovém scintilačním čítači. Procentní inhibice PKC aktivované 5.10^-6 M di-C8 a jedním mikrogramem/ml fosfatidylserinu se určí podle vzorce:

% inhibice = 1,0 -/(vzorková CPM-bazální CPM/(celková CPM-bazální CPM/ . 100 a určí se koncentrace nutná k dosažení 50%ní inhibice.

Sloučeniny tohoto vynálezu jsou aktivními inhibitoiy proteinové kinázy C když jsou testovány touto metodou, například l,3-dioxo-6-(3-methylaminopropyl)-l,2,3,6-tetrahydro-4-(thiofen-3-yl)pynOlo[3,4cjkarbazol - IC₅₀ je 30 nM.

Příklad 12

Určení aktivity in vivo využívající Xenograft testu malobuněčného plicního karcinomu

Tento postup je modifikací postupu popsaného Maneckjee a kol. v Proč. Nati, Acad. Sci. USA, Sv. 89, 1 169-1 173 (únor 1992).

-11CZ 288583 B6

Buňky H82 malobuněčného plicního karcinomu se rozmrazí ze zmrazené zásoby a vypěstují v RPMI. Před injekcí se buňky trypsinizují, spočítají a resuspendují v PBS: solubilizovaný základní membránový přípravek (Matrigel^R) (1:2) na koncentrace 5:10⁵ nebo 1,5.10⁶ buněk/ml. Samičí athymické lysé myši, 4 až 5 týdnů staré (Harlan Sprague Dawley) obdrží 200R/myš ozáření jeden den před vyvoláním odezvy a je jim dáno 0,2 ml SCLC/myš subkutánní injekcí do boku (koncentrace 1.10⁵ nebo 3.10⁵ SCLC buněk/myš. Skupiny 30 myší se léčí intraperitoneálně jednou za den, testovanou sloučeninou v množství 10 mg/kg (solubilizované v DMSO a zředěné na finální vehikulovou koncentraci 20 % DMSO v PBS). Léčení jsou zahájena 2 hodiny po vyvolání odezvy a pokračují 45 dnů. Vehikulem léčené a neléčené myši jsou použity jako kontrola.

Statistická analýza: A Fisher Exact test (Kendail M., Stuart A., The Advanced Theory of Statistics, Sv. 2, (MacMillan Pub. Co. NY, 1979)) je použit pro srovnání podílů výskytu tumoru mezi skupinami. The Mann Whitney U test (Hollander N., Wolfe D.A., Non-parametric Statistical Methods (John Wiley and Sons, lne., NY, 1973)) je použit pro srovnání rozdílů doby přežití a A log rank test (Kalbfleisch J.D., Prentice R.L., The Statistical Analysis of Failure Time Data (John Wiley and Sons, lne., NY 1980)) je použit pro srovnání doby pro každý tumor, kdy dosáhne 2000 mm³.

Sloučeniny tohoto vynálezu inhibují růst tumorů, když jsou testovány tímto způsobem.

Příklad 13

Určení aktivity in vivo použitím xenograftového testu u karcinomu tlustého střeva

Postupem příkladu 12 a substitucí buněk H82 malobuněčného plicního karcinomu buňkami HT29 rakoviny tlustého střeva vypěstovanými do koncentrace 5.10⁶ buněk/ml a podávanými v koncentraci 1.10⁶ buněk/myš je určena účinnost vůči karcinomu tlustého střeva.

I když je vynález popsán s odkazem na určitá provedení, je pracovníkům v oboru zřejmé, že jsou možné různé modifikace v rámci vynálezu. Vynález všechny takové modifikace materiálů, směsí látek a způsobů v rozsahu patentových nároků zahrnuje.

Průmyslová využitelnost l,3-Dioxo~6-(3-methylaminopropyl)-l,2,3,6-tetrahydro-4-(thiofen-3-yl)pyrrolo[3,4-c]karbazol pro výrobu farmaceutických prostředků, který ho obsahuje pro ošetřování maligních onemocnění zvláště malobuněčných plicních karcinomů, karcinomů tlustého střeva a nádorů ledvin a prostaty.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. l,3-Dioxo-6-(3-methylaminopropyl)-l,2,3,6-tetrahydro-4-(thiofen-3-yl)pynOlo[3,4-c]karbazol a jeho farmaceuticky přijatelné soli.

2. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje l,3-dioxo-6-(3methylaminopropyl)-l,2,3,6-tetrahydro-4-(thiofen-3-yl)pynOlo[3,4-c]karbazol nebo jeho sůl podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelný excipient.

3. Použití 1,3-dioxo-6-(3-methylaminopropyl)-l ,2,3,6-tetrahydro-4-(thiofen-3-yl)pynOlo [3,4-c]karbazol nebo jeho soli pro výrobu farmaceutického prostředku pro ošetřování maligních onemocnění zvláště malobuněčných plicních karcinomů, karcinomů tlustého střeva a nádorů ledvin a prostaty.