CZ279909B6

CZ279909B6 - Tigogenin-beta-cellobiosidové sloučeniny a způsob jejich výroby

Info

Publication number: CZ279909B6
Application number: CS902890A
Authority: CZ
Inventors: Frank John Urban
Original assignee: Pfizer, Inc.
Priority date: 1989-06-13
Filing date: 1990-06-11
Publication date: 1995-08-16
Also published as: KR910000779A; NO902600L; KR920002146B1; HU210689B; JPH0637514B2; CZ289090A3; ZA904527B; FI902937A0; IL94650A0; DD295164A5; JPH0331297A; IE64057B1; DK0403150T3; HUT54708A; PL163258B1; PL289135A1; YU47515B; FI902937A7; CA2018722A1; HU903816D0

Abstract

Tigogenin-.beta.-cellobiosidové sloučeniny obecného vzorce I, ve kterých znamená R skupinu R.sup.4.n.CO a R.sup.1.n. a R.sup.2.n. jsou buďto oddělení a znamenají R.sup.1.n. skupinu R.sup.4.n.CO a R.sup.2.n. skupinu A, nebo R.sup.1.n. a R.sup.2.n. spolenčně znamenají zbytek B, a R.sup.4.n. představuje C.sub.1.n.-C.sub.4.n. alkyl. Tato sloučenina se připraví tak, že se do reakce uvádí heptaalkanoátcellobiosy s trichloracetonnitrilem v přítomnosti katalytického množství uhličitanu cesného v inertním rozpouštědle při teplotě okolí za vzniku .alfa.-acetimidátové sloučeniny, přičemž potom se tato imidátová sloučenina buďto uvede do reakce s tigogeninem v přítomnosti bromidu zinečnatého nebo magnesiumbromidetherátu za vzniku orthoesteru, který se potom zahřívá za vzniku heptaalkanoátu tigogenin-.beta.-cellobiosidu a tento heptaalkanoát se hydrolyzuje, nebo se tato .alfa.-acetimidátová sloučenina uvede do reakce s tigogeninem v přítomnosti bortrifluor- idetherátu za vzniku heptaalkanoátu tigogŕ

Description

Vynález se týká nových tigogenin-p-cellobiosidových sloučenin, které se používají při léčení hypercholesterolemie a aterosklerózy, a způsobu přípravy těchto sloučenin, při kterém se používá určitých nových meziproduktů.

Dosavadní stav techniky

Tigogenin-p-cellobiosid je známá sloučenina, používaná k léčení hypercholesterolemie a aterosklerózy (viz Malinow, patenty Spojených států amerických č. 4 602 003 a 4 602 005;

Malinow a kol., Steroids, sv. 48, str. 197 až 211, 1986). Každý z výše uvedených patentů popisuje jiný způsob přípravy této výše uvedené sloučeniny z. oktaacetátu β-cellobiosy, přičemž první z uvedených patentů popisuje postup, vycházející z heptaacetátu glykolylbromidu, který'se uvede do reakce s tigogeninem v přítomnosti uhličitanu stříbrného a potom se provede hydrolýza, a podle druhého patentu se provede přímá reakce oktaacetátu s tigogeninem v metylénchloridu, přičemž tato reakce je katalyzovaná chloridem cíničitým, a potom sé opět provede hydrolýza. Ve výše uvedené publikaci Malinowa a kol. se reakcí oktaacetátu cellobiosy s tetrabromidem titaničitým připraví heptaacetát glykosylbromidu, který se nechá reagovat s tigogeninem v přítomnosti kyanidu mědi a potom se provede hydrolýza. Všechny tyto způsoby mají nevýhodu v tom, že se tvoří poměrně objemný materiál, který je nutno zpracovávat.

V další publikaci, náležící do dosavadního stavu techniky, autor Schmidt, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., sv. 25, str. 212 až 235 (1986), je popsána syntéza a reakce O-glykosyltrichloracetamidátů, získaných reakcí cukrů, obsahujících 1-OH skupinu (přičemž ostatní hydro^yskupiny jsou chráněny, například benzylem nebo acetylem), s trichloracetonitrilem v přítomnosti bázické látky. Přitom se za použití hydridu sodného NaH jako bázické látky tvoří převážně a--anomer a za použití uhličitanu draselného K₂CO₃ jako bázické laťky se tvoří převážně β-anomer. Tento výše uvedený α-anomer tetrabenzylglukosyltrichloracetimidátu poskytuje při reakci s cholesterolem anomerní směsi, které se mění podle použitého katalyzátorů (p-toluensulfonová kyselina nebo bortrifluoridetherát) a použité teplotě (v rozsahu od -40 ^eC do +20 °C). Naproti tomu jak a- tak β-anomery tetraacetylglukosylanalogů poskytují výlučně β-anomerní produkty.

Podstata vynálezu

Úkolem uvedeného vynálezu je vyvinout způsob syntézy, při kterém by se nepoužívala toxická a/nebo drahá reakční činidla a kterým by se připravil čistý požadovaný tigogenin^-cellobiosid, který by se nemusel dále čistit zdlouhavými a drahými čisticími postupy.

1CZ 279909 B6

Nové tigogenin-p-cellobiosidové sloučeniny podle uvedeného vynálezu mají následující obecný vzorec I

ve kterém znamená:

R skupinu R⁴C0

Ί 9 * 1

R a R odděleně znamenají R skupinu R⁴C0 a R² znamená skupinu

CCln \ /

C

II

NH nebo R¹ a R² společně znamenají

a R⁴ představuje alkylovou skupinu, obsahující 1 až 4 atomy uhlíku.

Ve výhodném provedení představuje substituent R acetylovou skupinu a substituenty R^ a R₂ jsou oddělené, přičemž R^ znamená acetylovou skupinu a R₂ představuje skupinu

CCl^ \ / c

II

NH

-2CZ 279909 B6

Dalšími výhodnými sloučeninami obecného vzorce I podle uvedeného vynálezu jsou sloučeniny, ve kterých substituentem R je acetylová skupina a substituenty

R a R společně znamenají skupinu

Do rozsahu uvedeného vynálezu rovněž náleží způsob syntetické přípravy tigogenin-p-cellobiosidových sloučenin obecného vzorce I, jehož podstata spočívá v tom, že se (a) do reakce uvádí heptaalkanoát cellobiosy obecného vzorce II

(Π) ve kterém znamená

R skupinu R⁴CO a

R⁴ představuje alkylovou skupinu, obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, s trichloracetonitrilem v přítomnosti katalytického množství uhličitanu česného v inertním reakčním rozpouštědle při teplotě okolí za vzniku imidátové sloučeniny obecného vzorce III

-3CZ 279909 B6

CCI₃ (ΙΠ) ve kterém má substituent R již shora uvedený význam, (b) tato imidátová sloučenina obecného vzorce III se uvede do reakce s tigogeninem v přítomnosti bromidu zinečnatého nebo magneziumbromidéterátu ve stejném nebo v jiném inertním reakčním rozpouštědle při teplotě okolí za vzniku ortoesteru obecného vzorce IV

OTig (IV) ve kterém má R

Tig již shora uvedený význam, znamená skupinu

-4CZ 279909 B6 (c) takto získaný ortoester se zahřívá ve stejném nebo v jiném inertním reakčním rozpouštědle za vzniku heptaalkanoátu tigogenin-p-cellobiosidu obecného vzorce V

kde R má již shora uvedený význam, a (d) tento heptaalkanoát tigogenin-p-cellobiosidu se obvyklým způsobem hydrolyzuje za vzniku tigogenin^-cellobiosidu.

Ve výhodném provedení tohoto postupu je v uvedených sloučeninách substituentem R acetylová skupina a substituentem R⁴ je metylová skupina.

Podstata dalšího postupu syntetické přípravy tigogenin-p-cellobiosidu výše uvedeného obecného vzorce I podle vynálezu spočívá v tom, že se (a) do reakce uvádí heptaalkanoát cellobiosy obecného vzorce II

(Π) ve kterém znamená R alkanoylovou skupinu, obsahující 2 až 5 atomů uhlíku, s trichloracetonitrilem v přítomnosti katalytického množství uhličitanu česného v inertním reakčním rozpouštědle při teplotě okolí zá vzniku imidátové sloučeniny obecného vzorce III

-5CZ 279909 B6 (III)

kde R má již shora uvedený význam, (b) takto získaná imidátová sloučenina obecného vzorce III se uvede do reakce s tigogeninem v přítomnosti bortrifluoridéterátu ve stejném nebo jiném inertním reakčním rozpouštědle při teplotě okolí za vzniku heptaalkanoátu tigogenin-p-cellobiosidu obecného vzorce V

kde R má již shora uvedený význam, a Tig znamená

6CZ 279909 B6 a (c) takto získaný heptaalkanoát tigogenin-p-cellobiosidu se potom obvyklým způsobem hydrolyzuje za vzniku požadovaného tigogenin-p-cellobiosidu.

Ve výhodném provedení tohoto postupu je v uvedených použitých sloučeninách substituentem R acetylová skupina.

Výše uvedeným termínem inertní reakční rozpouštědlo, který byl použit ve shora uvedeném textu, se míní rozpouštědlo, které nereaguje s výchozími látkami, reakčními činidly, meziprodukty nebo s produkty způsobem, který by nepříznivě ovlivnil výtěžek požadovaného produktu. Obvykle se používá rozpouštědlo, tvořené jednou látkou, nebo rozpouštědlo, obsahující více složek.

Charakteristickým znakem uvedeného vynálezu je stereospecifická konverze heptaalkanoátu cellobiosy obecného vzorce II na klíčový meziprodukt, to znamená α-acetimidát obecného vzorce III. Při této konverzi se heptaalkanoát cellobiosy nechá reagovat s alespoň jedním molárním ekvivalentem (ve výhodném provedení podle vynálezu se použije 1 až 10 násobný molární přebytek) trihloracetonitrilu v inertním rozpouštědle, jako je například metylenchlorid, v přítomnosti katalytického množství uhličitanu česného (například asi 5 % molárních vzhledem k heptaacetátu cellobiosy). Teplota není pro uvedený postup rozhodující, ale reakce se s výhodou provádí při teplotě místnosti, aby se předešlo nákladům na zahřívání nebo chlazení. Tato stereospecifická tvorba α-anomeru s tímto katalyzátorem je velmi překvapující, neboť podle dosavadního stavu techniky (viz postup podle Schmidta, výše uvedená publikace) se pro tento typ transformace doporučuje použití jiného uhličitanu alkalického kovu, to uhličitanu draselného jako katalyzátoru pro selektivní tvorbu nežádoucího β-anomeru.

Vzniklý α-imidát obecného vzorce III se nechá potom reagovat s tigogeninem v inertním rozpouštědle v přítomnosti bortrifluoridéterátu, což se provede analogickým postupem, jako je postup podle Schmidta, jak bylo uvedeno výše. Po provedení tohoto reakčního stupně, který se rovněž výhodně provádí při teplotě místnosti nebo okolo teploty místnosti, se připraví známý heptaacetát tigogenin-p-cellobiosidu obecného vzorce V.

Podle uvedeného vynálezu bylo zjištěno, že použití buďto bromidu zinečnatého nebo magneziumbromidéterátu jako katalyzátoru za jinak stejných podmínek vede k tvorbě čistého meziproduktu, to znamená ortoesteru obecného vzorce IV. Tento ortoester může být v případě potřeby izolován. Avšak ve výhodném provedení podle uvedeného vynálezu se jednoduše reakční směs zahřívá, čímž proběhne přesmyk tohoto ortoesteru na další meziprodukt, to znamená heptaacetát tigogenin-p-cellobiosidu obecného vzorce V. Před izolaci tohoto meziproduktu je výhodné znovu zavést všechny alkanoylové skupiny, které byly tímto postupem odstraněny, a to reakcí s anhydridem příslušné alkanové kyseliny.

V konečném stupni se heptaacetát obecného vzorce V obvyklým způsobem hydrolyzuje nebo solvolyzuje, například postupem podle

Malinowa, viz výše uvedený citovaný odkaz, nebo způsobem, uvedeným dále v příkladech.

-7CZ 279909 B6

Příklady provedení vynálezu

Uvedené sloučeniny a postupy přípravy těchto sloučenin podle uvedeného vynálezu budou v dalším blíže ilustrovány pomocí příkladů provedení, přičemž tyto příklady vynález pouze ilustrují, aniž by jej jakýmkoliv způsobem omezovaly.

Příklad 1

Heptaacetát α-0-cellobíosyltrichloracetimidátu (III, R=acetyl)

Heptaacetát cellobiosy (10 g, 0,0157 mol, připravený z oktaacetátu způsobem podle citace Excoffier a.j. Carbohydrate Res., sv. 39, str. 368 až 373, 1975) se v atmosféře dusíku rozpustí ve 100 ml CH2CI2 v plamenem vysušené baňce a ochladí se na 0 až 5 °C. Injekční stříkačkou se přidá trichloracetonitril (4 ml) a potom se přidá CsCO₃ (0,52 g, 0,00158 mol) ve formě jemně rozemletého prášku. Směs se nechá ihned ohřát na teplotu místnosti, míchá se 5 hodin, potom se čistí filtrací přes diatomickou hlinku a filtrát se oddestiluje do směsi hexanu a etylacetátu a znovu se oddestiluje. Získá se 11 g produktu, uvedeného v názvu. Rekrystalizací ze směsi etylacetátu a hexanu se získá

6,1 g přečištěného produktu, uvedeného v názvu, t.t. 192 až 194 °C.

¹H-NMR (CDC1₃, 300 MHz, hodnoty δ v ppm):

8,63 (s, 1H), 6,45 (d, 1H), 5,50 (t, 1H), 5,1 (m, 3H),

4,9 (t, 1H), 4,52 (m, 2H), 4,37 (dd, 1H), 4,07 (m, 3H),

3,82 (t, 1H), 3,65 (m, 1H), 2,10 (s, 3H), 2,07 (s, 3H),

1,97 (m, 15H).

Analýza:

vypočteno 43,06 % C, 4,65 % H, 1,79 % N; nalezeno 43,02 % C, 4,49 % H, 1,81 % N.

Příklad 2

Ortoester, odvozený od heptaacetátu α-0-cellobiosyltrichloracetimidátu a tigogeninu (IV, R⁴ = CH₃).

Produkt podle příkladu 1 (1,2 g, 1,54 mmol), tigogenin (0,5 g, 1,2 mmol) a molekulární síta (0,5 g, typ 3A) se smísí ve 20 ml CH₂C1₂ při teplotě místnosti. Směs se 10 minut míchá, potom se přidá ZnBr₂ (0,21 g, 0,93 mmol) a směs se míchá 1,25 hodiny, přefiltruje se přes diatomickou hlinku, filtrát se promyje 0,5 M HC1, vodou a roztokem chloridu sodného, vysuší síranem horečnatým, oddestiluje a zbytek se rozmělní v hexanu. Získá se produkt, uvedený v názvu, ve formě bílé pevné látky, 0,55 g, t.t. 187,5 až

188,6 °C, chromatografie na tenké vrstvě Rf 0,3 (3 : 1 CHC1₃ : etylacetát).

-8CZ 279909 B6

Analýza:

nalezeno 61,14 % C, 7,54 % H; vypočteno 61,49 % C, 7,60 % H.

Alternativně lze produkt, uvedený v názvu, jednoduše připravit in šitu stejným způsobem, přičemž se vynechá filtrace a následující izolační stupně. Tvorba produktu, uvedeného v názvu, se monitoruje chromatografii na tenké vrstvě.

Tentýž ortoester se připraví stejným postupem, avšak místo bromidu zinečnatého se použije magneziumbromidéterát.

Příklad 3

Heptaacetát tigogenin-p-cellobiosidu (V, R = acetyl)

Způsob A

Produkt z předcházejícího příkladu, vzniklý z produktu podle příkladu 1 (1,15 g, 1,47 mmol), ve 20 mol CH₂C1₂, se připraví postupem podle předcházejícího příkladu. Monitorováním chromatograf ií na tenké vrstvě bylo prokázáno, že úplná konverze na ortoester proběhla během 2 hodin. Tento ortoester se potom převede na produkt, uvedený v názvu tohoto příkladu, zahříváním reakční směsi k varu po dobu 18 hodin, potom se směs ochladí na teplotu místnosti, přidá se acetanhydrid a reakční směs se míchá 3 hodiny, přičemž se nahradí částečné odstraněné acetylové skupiny. Za účelem izolace a čištění produktu se reakční směs přefiltruje, filtrát se promyje vodou a roztokem chloridu sodného, vysuší se síranem hořečnatým, oddestiluje se a zbytek se chromatografuje na silikagelu, za použití směsi CHC1₃ a etylacetátu 4 ; 1 jako elučního činidla. Výtěžek přečištěného produktu je 0,8 g (59 %), přičemž tento produkt je totožný se známým produktem.

Alternativně se po zpracování reakční směsi acetanhydridem reakční směs přefiltruje, promyje 0,5N HC1, vodou a roztokem chloridu sodného, vysuší se síranem hořečnatým, vydestiluje se na olej a zbytek se překrystaluje z izopropyléteru, 0,46 g (34%). Další produkt (0,09 g, 7%) se získá z matečných louhů oddestilováním a chromatografií podle předcházejícího odstavce.

Způsob B

K roztoku produktu podle příkladu 2 (0,014 mol) ve 100 ml CH2CI2 se přidá směs tigogeninu (4,7 g, 0,0113 mol), plamenem vysušených molekulárních sít (typ 3A, 10 g) a 100 ml hexanu, a vzniklá reakční směs se míchá 18 hodin při teplotě místnosti a potom se ochladí na 0 až 5 °C. Během 30 minut se přidá po kapkách BF₃.(C₂H₅)O (0,43 ml, 0,0055 mol) v 10 ml Po 2 hodinách se přidá pevný NaHCO₃ (5 g) a směs se míchá 10 minut, přefiltruje se a filtrát se promyje dvakrát nasyceným roztokem

NaHC0₃ a jednou roztokem chloridu sodného, vysuší se síranem hořečnatým a vydestiluje se na pevné látky, které se dvakrát

-9CZ 279909 B6 překrystalují z absolutního alkoholu. Získá se 5,32 g přečištěného produktu, uvedeného v názvu.

Příklad 4

Tigogenin-p-cellobiosid

Produkt z předcházejícího příkladu (7,8 g, 7,53 mmol) se v atmosféře dusíku a za bezvodých podmínek rozpustí v 78 ml směsi CH₃OH a tetrahydrofuranu 1 : 1 objemově. V jedné dávce se přidá metoxid sodný (0,020 g, 0,37 mmol) a reakční směs se zahřívá k varu 1 hodinu. Tetrahydrofuran se odstraní destilací při teplotě hlavy kolony 62 °C. Přidá se čerstvý metanol (80 ml) a v destilaci se pokračuje při teplotě 65 °C. Přidá se voda (8 ml) a směs se znovu zahřívá k varu, nechá se usadit a digeruje se při varu 2,5 hodiny a potom se pomalu za míchání ochladí na teplotu místnosti. Reakční směs se míchá přes noc a filtrací se získá 4,21 g produktu, uvedeného v názvu, který je totožný se známým produktem.

Farmakologické účinky.

Příklad 5

Účinek tigogenincellobiosidu na hladinu cholesterolu v plazmě.

V tomto příkladu bude ilustrován účinek tigogenincellobiosidu na hladinu cholesterolu v plazmě u opic Macaca fascicularis. Tento postup je popsán v J. Clin. Invest., 67 í 156 (1981).

Experimentální postup.

Testovaná zvířata byla rozdělena do skupin I a II. Skupina byla ošetřena 2% cholestyraminem, skupina II byla ošetřena 0,4% tigogenincellobiosidem. Každá skupina byla ještě rozdělena do dvou podskupin. Zvířata v první podskupině sloužila jako kontrolní pro porovnání hladiny cholesterolu, to znamená, že jim nebylo podáváno žádné léčivo, ale tato zvířata byla krmena cholesterolovou stravou. Zvířata ve druhé skupině dostávala léčivé prostředky a rovněž jim byla podávána cholesterolová strava.

Podskupina 1 : před zahájením experimentálního postupu byla odebrána kontrolní krev ode všech zvířat v obou skupinách, přičemž bylo stanoveno celkové množství cholesterolu a vysokohustotního lipoproteinového cholesterolu. Potom byla těmto zvířatům podávána cholesterolová strava. Po třech týdnech, kdy byla podávána tato strava, aniž by bylo prováděno léčení, byla odebrána krev od ošetřených opic a potom bylo stanoveno celkové množství cholesterolu a vysokohustotního lipoproteinového cholesterolu.

Podskupina 2 : Před zahájením testovacího režimu pro podskupinu byla zvířatům z podskupiny 1 podávána strava, neobsahující cholesterol, která byla poločištěná, po dobu pěti týdnů. Po pěti týdnech, kdy byla zvířatům podávána strava, neobsahující chole

-10CZ 279909 B6 sterol, byla znovu pro kontrolu odebrána krev ode všech zvířat, přičemž byl zjišťován obsah celkového cholesterolu a vysokohustotního lipoproteinového cholesterolu. Potom byla těmto zvířatům podávána cholesterolová strava v kombinaci s léčivými prostředky. Po třech týdnech, kdy byla těmto zvířatům podávána cholesterolová strava a prováděno vhodným způsobem léčení, byla všem těmto zvířatům odebrána krev a rovněž byl zjištěn obsah celkového cholesterolu a vysokohustotního lipoproteinového cholesterolu.

Testovaná zvířata a použitá strava.

K testování bylo použito dvanáct dospělých samiček cynomolgus (Macaca fascicularis), kterým byla podávána poločištěná strava, neobsahující cholesterol (SPD), po dobu tří týdnů, přičemž tato strava měla následující složení:

Složky g/100 g stravy

Kasein

Cukr

Med

Alfacel

Máslo

Kokosový olej slunečnicový olej vitaminy (OWP) soli (Hegsted IV) vitamin D-3 (2 000 IU/cal) banány (hmotnost za vlhka) proteiny (% kalorie) tuky (% kalorií) karbohydráty (% halorií)

8/5

2,5

0,2 ml

20,6

33,5

45,9

Tato strava případně obsahovala 0,118 gramu/100 gramů stravy cholesterolu.

Prováděný experimentální postup společně s výsledky je uveden'v následující tabulce A.

Výsledky (souhrnně uvedené v tabulce A) :

Opice byly rozděleny do dvou skupin (skupina I a skupina II) podle jejich reakce na cholesterol v séru, přičemž zvířata byla rozdělena a určena náhodně, čímž byly vytvořeny skupiny s podobným zvýšením cholesterolemie.

Kontrolní skupina I, vzorek I :

Pro analýzu byla odebrána kontrolní venózní krev, přičemž byla zjištěna střední hodnota obsahu cholesterolu v séru a tato hodnota byla 240 miligramů/dl u skupiny I a 228 mg/dl pro skupinu

II.

Potom byla opicím podávána poločištěná strava, obsahující 0,1 % cholesterolu, po dobu tří týdnů. Na konci tohoto časového období byl odebrán vzorek krve 2.

-11CZ 279909 B6

Cholesterolová strava, vzorek 2 :

Po třech týdnech po podávání cholesterolová stravy byla zjišťována střední hodnota cholesterolu, která byla 324 mg/dl u skupiny I a 316 mg/dl u skupiny II. Hladina cholesterolu byla podstatně vyšší u vzorků 2, přičemž stupeň přesnosti byl < 0,01.

Potom byla opicím podávána opět poločištěná strava bez obsahu cholesterolu po dobu pěti týdnů a na konci této periody jim byla odebrána krev.

Kontrolní skupina 2, vzorek 3 :

Po pěti týdnech po podávání stravy, neobsahující cholesterol, byla hladina cholesterolu u obou skupin snížena na 221 mg/dl u skupiny I a na 189 mg/dl u skupiny II.

Těmto zvířatům byla potom podávána poločištěná strava s 0,1 % cholesterolu, přičemž do této stravy bylo přidáno buďto 2 % cholestyraminu (skupina I), nebo 0,4 % cellobiosidu tigogeninu (skupina II), což bylo prováděno po dobu 3 týdnů. Na konci této periody byl získán vzorek 4.

Cholesterolová strava a léčení pomocí léčivých prostředků, vzorek 4 :

Po třech týdnech po podávání cholesterolová stravy, která byla kombinována s podáváním léčivých látek, byly zjišťovány hodnoty, týkající se obsahu cholesterolu v séru, které byly u skupiny I 226 mg/dl a u skupiny II byla tato hodnota 202 mg/dl.

Výsledky uvedené v tabulce A ukazují, že obě léčiva zabraňovala očekávanému zvýšení hladiny cholesterolu v séru. Při provádění tohoto testu se objevily malé nevýznamné odchylky u vysokohustotního lipoproteinového cholesterolu, které souvisely s absorpcí léčiva, viz vzorky 1, 2, 3 a 4 v části HDL cholesterolu v dále uvedené tabulce A. Přesto, že změny v hladině triglyceridů by mohly být přirozenou reakcí na požití stravy s vysokým obsahem cholesterolu, nebyly zjištěny při provádění tohoto testu žádné změny. Toto naznačuje, že oba léčivé prostředky zabraňovaly zvýšení hladiny nízkohustotního lipoproteinového cholesterolu.

-12CZ 279909 B6

Tabulka A

	Hladina cholesterolu v séru (mg/dl, střední hodnota + SE)^a Celkový obsah cholesterolu Cholestorel Cholesterolová
Perioda Vzorek	Kontrolní 1 Strava Kontrolní 2 strava + léčivo 12 3 4

Skupina I N = 6	240 ±	19	324 + 24	221 + 19	226 + 16
léčivo: 2$ cholestyramin párový t-test
P: proti sloupci 2	0,01		-	0,01	0,01
proti sloupci 1			0,01	NS	NS
proti sloupci 3					NS
Skupina II N = 6	228 +	19	316 + 21	189 + 10	202 + 8
léčivo: 0,4 i tigogenin-
cellobiosid
párový t-test
p: proti sloupci 2	0,01			0,01	0,01
proti sloupci 1 proti sloupci 3			0,01	0,05	0,05
Skupina I N = 6	126 +	12	148 i 17	155 i 9	166 i 8
léčivo: 2 % cholestyramin párový t-test
P: proti sloupci 2	NS		CD	NS	NS
proti sloupci 1	-		NS	0,02	0,05
proti sloupci 3					NS
Skupina II N = 6	104 +	12	139 + 14	148 + 10	163 + 7
léčivo: 0,4 i tigogenin-
cellobiosid
párový t-test
p: proti sloupci 2	0,05		-	NS	NS
proti sloupci 1	-		0,05	0,05	0,01
proti sloupci 3	NS				NS

^aZkratky: HDL - cholesterol = vysokohustotní lipoproteinový cholesterol

N = počet zvířat, NS = nevýznamné

-13CZ 279909 B6

Příklad 6

Účinek syntetických glykosidů na intestinální absorpci cholesterolu u krys.

V tomto přikladu bude ilustrován účinek syntetických glykosidů na intestinální absorpci cholesterolu u krys. Metoda, použitá v tomto testu, je podrobně popsána Malinowem a kol. v Am. J. Clin. Nutr., 30: 2061 (1977).

Experimentální postup.

Při provádění tohoto testu byl krysám zaváděn do žaludku bolus o hmotnosti 2 miligramy, obsahující 4[”¹⁴C]cholestrol. Po dobu 72 hodin byly shromažďovány výkaly a potom bylo zjištěno množství označených neutrálních steroidů ve vyměšování.

Testované krysy byly rozděleny do tří skupiny I až III.

Ve skupinách I a II byla zvířata rozdělena do podskupin, ve ktrých bylo vždy 6 krys. První podskupina sloužila jako kontrolní , přičemž zvířatům v této podskupině nebyly podávány žádné léky a tudíž tato zvířata nebyla nijak ošetřována. Zvířata ve druhé a třetí podskupině byla ošetřována buďto sloučeninou podle uvedeného vynálezu, nebo jednou z jiných velice příbuzných sloučenin. To znamená, že ve skupinách I a II byly krysy ošetřovány tigogenincellobiosidem, diosgenincellobiosidem, tigogeninglukosidem a diosgeninglukosidem.

Souhrnné výsledky tohoto testu jsou uvedeny v následující tabulce B, přičemž tyto výsledky potvrzují, že tigogenincellobiosid snižuje intestinální absorpci cholesterolu v mnohem větší míře, než strukturně příbuzné sloučeniny, kterými v tomto případě byly diosgenincellobiosid, tigogeninglukosid a diosgeninglukosid. Tigogenincellobiosid byl při provádění tohoto testu o mnoho činnější než nejblíže příbuzný diosgenincellobiosid (viz skupina I, podskupiny 2a 3). V porovnání s kontrolní skupinou snižoval tigogenincellobiosid absorpci cholesterolu o téměř 50 % (s mírou přesnosti < 0,001). Tento tigogeninglukosid a diosgeninglukosid (viz skupina II, podskupiny 2 a 3, a porovnání skupiny I a II).

Skupina III byla rozdělena do dvou podskupin, přičemž v každé podskupině bylo 12 zvířat. Inhibování cholesterolové absorpce u krys, ošetřených tigogenincellobiosidem, bylo porovnáno s inhibováním cholesterolové absorpce u neošetřených kontrolních zvířat.

skupiny dosaženo 6), bylo dosaženo

12).

u kterých bylo při absorpce cholesterolu III při léčení zvířat absorpce cholesterolu ¹ absorpce cholesterolu pouze 53 % a~ absorpce % vzhledem k absorpci

I, inhibování u skupiny inhibování Kromě toho ošetření

Podobně j ako u tigogenincellobiosidem o 47 % (počet zvířat tigogenincellobiosidem o 41,5 % (počet zvířat u testovaných krys ve skupině I byla cholesterolu ve skupině III byla pouze 58,5 cholesterolu u kontrolní skupiny.

-14CZ 279909 B6

Tabulka B

Účinek syntetických glykosidů na absorpci cholesterolu u krys

Skupina	Ošetřování	Počet zvířat	Dávka (mg)	Absorpce cholesterolu (H.D.)	P (Studentův t-test proti kontr.)	Relativní absorpce
I	žádné	6	0	74,8 + 1,6		100
	C-T	6	14	39,8 i 1,8	< 0,001	53
	C-D	6	14	53,7 + 1,3	< 0,001	72
II	žádné	6	0	74,6 + 2,3		100
	G-T	6	14	46,2 i 1,8	< 0,001	62
	G-D	6	14	52,6 + 3,7	< 0,001	71
III	žádné	12	0	75,2 + 1,8		100
	C-T	12	14	43,6 + 1,6	< 0,001	58,5

Střední hodnoty ± SE

Zkratky: C-D = cellobiosid diosgeninu C-T = cellobiosid tigogeninu

G-D = diosgeninglukosid

G-T = tigogeninglukosid

PATENTOVÉ

Claims

NÁROKY

1. Tigogenin-p-cellobiosidové sloučeniny obecného vzorce I ve kterém znamená:

R skupinu R⁴CO,

R¹ a R² oddělené znamenají R¹ skupinu R⁴CO a R² skupinu

-15CZ 279909 B6

CCln \ / C i NH

1 o nebo R a R společně znamenají a R⁴ představuje alkylovou skupinu, obsahující 1 až 4 atomy uhlíku.
2. Tigogenin-p-cellobiosidové sloučeniny podle nároku 1, kde R znamená acetylovou skupinu a substituenty R¹ a R² jsou oddělené, přičemž R¹ znamená acetylovou skupinu a R² představuje skupinu

CC1₃ \ /

C

II

NH
3. Tigogenin-p-cellobiosidové sloučeniny podle nároku 1, kde Ί 9

R znamená acetylovou skupinu a R a R společně znamenají

-16CZ 279909 B6
4. Způsob přípravy tigogenin-p-cellobiosidových sloučenin obecného vzorce I podle nároku 1, vyznačující se tím, že (a) do reakce uvádí heptaalkanoát cellobiosy obecného vzorce II (Π) ve kterém znamená

R skupinu R⁴C0, a

R⁴ je alkylová skupina, obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, s trichloracetonitrilem v přítomnosti katalytického množství uhličitanu česného v inertním reakčním rozpouštědle při teplotě okolí za vzniku imidátové sloučeniny obecného vzorce III ve kterém má substituent R již shora uvedený význam, (b) tato imidátová sloučenina obecného vzorce III se uvede do reakce s tigogeninem v přítomnosti bromidu zinečnatého nebo magneziumbromidéterátu ve stejném nebo v jiném inertním reakčním rozpouštědle při teplotě okolí za vzniku ortoesteru obecného vzorce IV

-17CZ 279909 B6 ve kterém má R již shora uvedený význam, a Tig znamená (c) takto získaný ortoester se zahřívá ve stejném nebo v jiném inertním reakčním rozpouštědle za vzniku heptaalkanoátu tigogenin-p-cellobiosidu obecného vzorce V kde R má již shora uvedený význam, a (d) tento heptaalkanoát tigogenin-p-cellobiosidu se obvyklým způsobem hydrolyzuje za vzniku tigogenin-p-cellobiosidu.
5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že v uvedených sloučeninách v tomto postupu je substituentem R acetylová skupina a substituentem R⁴ je metylová skupina.
6. Způsob syntetické přípravy tigogenin-p-cellobiosidu obecného vzorce I podle nároku 1, vyznačující se tím, že se (a) do reakce uvádí heptaalkanoát cellobiosy obecného vzorce II (Π) = 18 ve kterém znamená R alkanoylovou skupinu, obsahující 2 až 5 atomů uhlíku, s trichloracetonitrilem v přítomnosti katalytického množství uhličitanu česného v inertním reakčním rozpouštědle při teplotě okolí za vzniku imidátové sloučeniny obecného vzorce III

NH (ΙΠ) kde R má již shora uvedený význam, (b) takto získaná imidátová sloučenina obecného vzorce III se uvádí do reakce s tigogeninem v přítomnosti bortrifluoridéterátu ve stejném nebo jiném inertním rozpouštědle při teplotě okolí za vzniku heptaalkanoátu tigogenin-p-cellobiosidu obecného vzorce V kde R má již shora uvedený význam, a Tig znamená skupinu

-19CZ 279909 B6 a (c) takto získaný heptaalkanoát tigogenin-p-cellobiosidu se potom obvyklým způsobem hydrolyzuje za vzniku požadovaného tigogenin-p-cellobiosidu.
7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že v uvedených sloučeninách v tomto postupu je substituentem R acetylová skupina.