CZ278542B6

CZ278542B6 - 1,5-bis(3-beta-d-glucosyloxy-4-hydroxyphenyl)pent-1-en-4-ine, process of its isolation and a preparation based thereon

Info

Publication number: CZ278542B6
Application number: CS832776A
Authority: CZ
Inventors: Siegfried Drewes; Roelof Wilke Liebenberg
Original assignee: Roecar Holdings Nv
Priority date: 1982-04-19
Filing date: 1983-04-19
Publication date: 1994-03-16
Also published as: DK159377B; NO163167C; ES521634A0; KR840004361A; AU551625B2; NZ203934A; NO163167B; PT76568A; IN159319B; AU1363583A; IE54837B1; JPH0450292B2; HU187039B; DE92226T1; EP0092226B1; ES8406501A1; EP0092226A2; GR78195B; PT76568B; DK159377C

Description

Oblast techniky

Vynález se týká přírodního glukosidu, obsaženého v rostlinách čeledi Hypoxidaceae, způsobjeho izolace a farmaceutických přípravků.na jeho bázi.

Dosavadní stav techniky

V publikacích že extrakty z rostlin čeledi Hypoxidaceae jsou u myší P388 při léčbě lymfocytové leukémie, v publikaci Distribution of Anticancer Activity in Higher Plants, A. Berclay a R. E. Purdue, Cancer Treatment Reports 1976, 60, 1081 až 1113. Pro účely uvedeného vynálezu se lymfocytová leukémie nepovažuje za běžný typ zhoubného nádoru a i kdyby jím byla, jsou v každém případě přípravky pro její léčbu vyloučeny z rozsahu nárokované ochrany. Extrakty z použity jako protizánětlivé látky a látky účinné proti hypertrofii prostaty, jak je č. 1 595 240, 1 417 272 a 1 z dosavadního stavu techniky bylo prokázáno, účinné in vivo jak je uvedeno rostlin rodu Hypoxis byly také uváděno

259 503.

v patentech Velké Británie

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je fenyl)pent-l-en-4-in vzorce

1,5-bis(3-p-D-glukosyloxy-4-hydroxyI

Předmětem vynálezu je dále způsob izolace 1,5-bis(3-β-Ο-glukosyloxy-4-hydroxyfenyl)pent-l-en-4-inu, vzorce I, který se vyznačuje tím, že se extrahuje rostlina z čeledi Hypoxidaceae vodou, alkoholem nebo směsí vody a alkoholu a takto získaný extrakt se popřípadě přefiltruje a potom lyofilizuje.

Ve výhodném provedení podle uvedeného vynálezu se extrahuje rostlina rodu Hypoxis, rodu Spiloxene, případně rostliny Hypoxis nitida, H. obtusa-nitida, H. acuminata, H. la'·folia, H. rigiduli, H. rooperi, H. obtusa-obtusa a Spiloxene schlechteri.

Sloučenina vzorce I je vhodná pro použití proti zhoubným nádorům, přičemž přípravky, použitelné proti těmto nádorům, obsahují sloučeninu uvedeného vzorce I, nebo ve výhodném provedení extrakt rostliny čeledi Hypoxidaceae ve vodě, alkoholu nebo ve směsi vody a alkoholu. Také tyto přípravky jsou předmětem vynálezu.

-1CZ 278542 B6

Při provádění postupu podle uvedeného vynálezu je možno použít všechny druhy rostlin čeledi .Hypoxidaceae, přičemž zvláště dobré výsledky byly získány při použití extraktu rostlin z rodu Hypoxis, například Hypoxis acuminata, Hypoxis nitida, H. obtusa-nitida, H. latifolia, H. rigiduli, H. rooperi. Výborné výsledky byly rovněž získány při použití ethanolových extraktů H. rooperi a Spiloxene schlechteri.

Extrakty, získané postupem podle uvedeného vynálezu, projevují protinádorovou účinnost, přičemž tato účinnost vyplývá z přítomnosti sloučeniny vzorce I.

Při aplikaci uvedené sloučeniny nebo extraktu, obsahujícího tuto sloučeninu obecného vzorce I, se dávky liší od případu k případu a závisí také na závažnosti onemocnění. Denní dávka sé obvykle pohybuje v rozmezí od 600 do 2 400 miligramů prášku, získaného extrakcí výše uvedených rostlin, nebo 300 až 1 200 miligramů sloučeniny vzorce I.

Extrakty, získané postupem podle uvedeného vynálezu, je možno aplikovat jako takové, ve výhodném provedení se však tyto extrakty usuší rozprašováním nebo se lyofilizují na prášky, které je možno dále zpracovávat na tablety, kapsle, dražé, krémy, prášky, mazání a další běžné lékové formy. Rovněž je také možno k těmto lékovým formám přidat obvyklé pomocné látky k usnadnění zpracovávání na tablety, kapsle a podobně. Jednotlivá dávka obvykle obsahuje 100 až 50 miligramů extraktu, přičemž se aplikují 1 až 3 dávky třikrát denně.

Jak již bylo uvedeno, uvedené druhy rostlin je možno extrahovat vodou, alkoholem nebo směsí vody a alkoholu. Různé typy extrakcí budou uvedeny v následujících příkladech.

V následujících příkladech provedení jsou ilustrovány různé postupy extrakce podle vynálezu, přičemž jsou rovněž připojeny příklady, týkající se testů účinnosti získaných extraktů, eventuálně produktů z nich získaných, dále jejich toxicita a metody léčení za použití těchto extraktů.

Příklad 1

Podle tohoto provedení bylo 10 kilogramů čerstvého kormusu rostliny Hypoxis rooperi ve formě kaše extrahováno 25 litry ethanolu při teplotě místnosti po dobu 48 hodin. Takto získaný extrakt byl přefiltrován, potom byl odpařen za použití vakua a nakonec.byl lyofilizován, přičemž tímto postupem bylo získáno 729 gramů hnědého prášku. Tento materiál v množství 10 gramů byl přečištěn postupem preparativní vysokotlaké chromatografie v koloně za použití reverzní fáze, přičemž jako rozpouštědla, lylo použito směsi vody a methanolu v poměru 50 : 50, čímž bylo získáno 6,9 gramu obohacené frakce. Konečné dělení bylo provedeno tak, že byly odděleny 10-ti gramové podíly, které byly převedeny do kolony, naplněné silikagelem, o rozměrech 45 x 600 milimetrů, přičemž velikost částic tohoto silikagelu byla 0,07 0,038 nm a jako rozpouštědla bylo použito směsi 2-butanolu, benzenu, vody a methanolu v poměru 4 : 3 : 2 : 1. Z těchto 10-ti gramových frakcí bylo obvykle získáno 7,9 gramu krystalické sloučeniny

-2CZ 278542 B6 vzorce I po překrystalování z butanolu. Výtěžek produktu odpovídal 4,0 % z původního čerstvého materiálu. Teplota tání produktu se pohybovala v rozmezí od 147 do 148 °C.

Optická otáčivost : [ a ]²⁰ = -110° / \ 0,45 v methanolu/
Analýza pro	^C29^H34°14 ’	2 H₂O :
Vypočteno :	C = 54,20	H = 5,96	H₂0 =5,61	%
Nalezeno :	C = 54,18	H = 6,01
Spektrum v	infračerveném světle v	bromidu draselném má maximum

při 3. 150 až 3 500 cm“¹ /vodík vázaný ve skupině OH/.

Spektrum v ultrafialovém záření v methanolu má maxima při 247, 257 a 287 nm.

NMR-spektrum δ/CDgOD : 3,10 - 4,05 /14H, m, protony na C-3 a 12 glukosylových protonů/

4,74 /2H, 2 protony na C-l/,

6,06 /H, dt, J = 15,0 a J = 5,0 Hz/ proton na C-4,

6,.53 /1H, d, J = 15 Hz, proton na C-5/

6,56 - 6,90 /4H, m, aromatický vodík/, 7,07 /2H, d, aromatický vodík/.

Příklad 2

Následující další extrakce byly provedeny za účelem zjištění a vyhodnocení nej lepších způsobů a podmínek pro extrakci.

a/ Podle tohoto provedení bylo 10 kilogramů oškrábaného kormusu rostliny Hypoxis rooperi sušeno na vzduchu a 2,95 kilogramů tohoto produktu bylo hodinu extrahováno 20 litry vroucí vody. Tento extrakt byl potom sušen rozprašováním, přičemž bylo získáno 550 gramů ve vodě částečně rozpustného světle hnědého prášku, který obsahoval 20 % sloučeniny vzorce I.

b/ Podle tohoto provedení byl gumovitý produkt, získaný odstředěním pevného podílu z 10-ti kilogramů macerovaného kormusu rostliny H. rooperi, zředěn 1,5 litrem studené vody o teplotě 5 °C a po odstředění byly 4 litry takto získaného materiálu sušeny rozprašováním, čímž bylo získáno 900 gramů světle krémově zbarveného prášku, který byl částečně rozpustný ve vodě, přičemž tento prášek obsahoval 30 % sloučeniny vzorce I.

Λ

c./ Podle tohoto prov-^oní bylo 10 kilogramů rozdrceného kormusu rostliny Hypoxis obtusa-nitida extrahováno 15 litry vody o teplotě 25 °C za občasného míchání, přičemž extrakce byla prováděna celkem 6 hodin. Potom bylo 12,78 litrů přefiltrovaného extraktu lyofilizováno, čímž bylo získáno 757 gramů světle hnědého prášku, který byl částečně rozpustný ve vodě. Tento prášek obsahoval 35 % sloučeniny vzorce I. Potom bylo 10,8 kilogramu zbývající vlhké kaše extrahováno 10,8 litry vroucího absolutního ethanolu po dobu 20 minut. Přefiltrovaný takto získaný extrakt

-3CZ 278542 B6 byl potom odpařen ve vakuu za účelem odstranění většiny alkoholu, potom byl zředěn 1 litrem vody a lyofilizován, čímž bylo získáno 361 gramů ve vodě téměř úplně rozpustného světle hnědého prášku, který obsahoval 43 % sloučeniny vzorce I.

d/ Podle tohoto provedení bylo 10 kilogramů rozdrceného kormusu rostliny H. obtusa-nitida ve formě kaše extrahováno 5 minut 15 litry vroucí vody. Potom bylo 10,4 litru získaného filtrátu lyofilizováno, čímž bylo získáno 742· gramů světle hnědého prášku, částečně rozpustného ve vodě, přičemž tento prášek obsahoval 37 % sloučeniny vzorce I.

e/ 'Podle tohoto provedení bylo 10 kilogramů kormusu rostliny H. obtusa-nitida ve formě kaše extrahováno 25 litry absolutního ethanolu o teplotě 25 °C za stálého míchání 66 hodin. Potom bylo 23 litrů takto získaného filtrátu odpařeno za použití vakua za účelem odstranění většiny použitého alkoholu. Potom byl takto získaný filtrát zředěn 1 litrem vody a lyofilizován, čímž bylo získáno 630 gramů ve vodě rozpustného tmavě hnědého prášku /i/, přičemž tento prášek obsahoval 45 % sloučeniny vzorce I. Potom bylo 8,05 kilogramu zbývající vlhké kaše extrahováno 20 litry vroucího absolutního ethanolu. Získaný filtrát byl zpracován stejně jako je uvedeno shora a potom byl lyofilizován, čímž bylo získáno 99 gramů tmavě hnědého prášku, který byl téměř úplně rozpustný ve vodě, přičemž tento prášek obsahoval 42 % sloučeniny vzorce I a je označen /ii/· f/ Podle tohoto provedení bylo 10 kilogramů tenkých řezů kormusu rostliny H. obtusa-obtusa lyofilizováno, čímž bylo získáno 3,086 kilogramu sušeného materiálu. Tento sušený materiál byl rozemlet, a 300 gramů mletého materiálu bylo extrahováno 5 minut 5 litry vroucího 50 %-ního vodného roztoku ethanolu. Takto získaný filtrát byl zpracováván stejným způsobem, jako je uvedeno shora a lyofilizován, čímž bylo získáno 116 gramů světle krémově zbarveného prášku, který byl rozpustný ve vodě, přičemž tento prášek obsahoval 35 % sloučeniny vzorce I.

g/ Podle tohoto provedení byl kormus mladých rostlin H. obtusa-nitida ve formě kaše extrahován 5 minut 5 litry vroucí vody. Takto získaný filtrát byl lyofilizován, čímž bylo získáno 54 gramů světle hnědého prášku, který byl částečně rozpustný ve vodě, přičemž tento prášek obsahoval 32 % sloučeniny vzorce I.

h/ Podle tohoto provedení byl mladý kormus rostlin H. obtusa-nitida extrahován stejně jako v provedení g/, avšak extrakce byla prováděna 20 minut, čímž bylo získáno 82,3 gramu poměrně nerozpustného tmavě hnědého prášku, který obsahoval 27 % sloučeniny vzorce I.

i/ Podle tohoto provedení byl čerstvý kormus rostliny Hypoxis acuminata rozdrcen na kaši přímo v ethanolu při teplotě místnosti, v poměru 1,5 kilogramu kormusu na 2 litry ethanolu. Takto získaná směs byla hodinu míchána a potom byla zfiltrována. Takto získaný filtrát byl odpařen za použití vakua 30 kPa při teplotě v rozmezí od 70 do 85 °C. Takto získaný podíl po odpaření byl lyofilizován, čímž byl získán žlutohnědě zbarvený produkt s výtěžkem 7 až 10 %, vztaženo na čerstvý materiál. Obsah sloučeniny vzorce I v tomto extraktu se pohyboval v rozmezí od 42 do

-4CZ 278542 B6 %, obvykle v závislosti na sezónním obsahu látky v rostlině.

j/ Podle tohoto provedení byl čerstvý kormus Hypoxis acuminata rozkrájen na plátky přímo v kapalném dusíku. Zmrazené plátky byly potom lyofilizovány a rozemlety na jemný prášek. Tento prášek. byl potom extrahován směsí vody a alkoholu v poměru 1 díl vody na 2 díly ethanolu nebo methanolu, přičemž bylo použito 6 litrů tohoto roztoku na 1 kilogram prášku uvedené rostliny. Tato směs byla 30 minut míchána a potom byla zfiltrována. Roztok byl odpařen stejným způsobem, jako je to uvedeno v provedení i/, čímž byl získán žlutohnědý produkt, přičemž výtěžek tohoto produktu se pohyboval v rozsahu 9 až 12 %, vztaženo na čerstvý materiál. Obsah sloučeniny I v extraktu se pohyboval v rozmezí od 49 do 56 %. Výtěžek závisel na sezónním proměnlivém obsahu sloučeniny I. v uvedené rostlině.

k/ Podle tohoto provedení byl kormus rostliny Spiloxene schlachteri zpracováván směsí vody a ethanolu, přičemž byl. získán extrakt, který měl vysoký obsah sloučeniny vzorce I.

Výše uvedené výsledky byly získány metodou komparativní chromatografické metody, prováděné v tenké vrstvě, a vysokotlakou kapalinovou chromatografickou analýzou.

Příklad 3

Za účelem demonstrování účinnosti extraktů, získaných postupem podle vynálezu byly provedeny .testy na cytotoxicitu in vitro v buněčných kulturách M/52/B.

Tyto buňky myšího sarkomu M/52/B byly pěstovány v jedné vrstvě na prostředí M.E.M. s přísadou fetálního telecího séra 106. Jakmile bylo dosaženo souvislé vrstvy buněk /obvykle v průběhu 3 až 4 dnů, v závislosti na počtu buněk, které byly vloženy do kultivační láhve/, byly buňky zpracovány působením trypsinu. Volná suspenze buněk byla zpracována prostředím M.E.M. s obsahem 10 % fetálního telecího séra k inaktivaci trypsinu.

Určitý podíl suspenze byl potom přenesen do čerstvého živného prostředí, přičemž celkový objem vzorku byl 5 mililitrů.

K tomuto vzorku byla přidána testovaná látka v různé koncentraci, a to buď k čerstvé připravené suspenzi buněk, nebo k buněčné kultuře, která z této suspenze vznikla inkubací za 24 hodin a v níž vrstva buněk splývala alespoň na 40 až 50 %.

Všechny postupy byly prováděny za sterilních podmínek v komůrce s laminárním průtokem.

Výsledky :

Přidání odpovídajícího množství testované látky vedlo k uhynutí buněk v průběhu 24 hodin. Projevilo se to tak, že přenesené buňky nepřilnuly ke dnu kultivační láhve, užívané pro pěstování tkáňových kultur, zatímco kontrolní buňky vytvořily souvislou vrstvu buněk v průběhu 48 až 72 hodin.

-5CZ 278542 B6 .

V případě, že bylo přidáno menší množství testované látky, než odpovídající účinné množství, dojde k určité regeneraci buněk v průběhu prvních 24 hodin. I v těchto případech však trvalo více než 10 dnů, než bylo dosaženo souvislé vrstvy na 40 až 60 % plochy, což znamená, že větší část buněk byla úplně zničena.

Výsledky tohoto testu jsou uvedeny v následující tabulce č.l.

Tabulka 1

Vznik souvislé-.vrstvy buněk v procentech po aplikaci extraktu H. obtusa-nitida z přikladu 2, provedeni e/, extrakt /i/

Látka	Dávka (mg/ml/	Vznik souvislé vrstvy v procentech, ve dnech
1	3	6	10	14
Kontrolní vzorek	0	60	90	vrstva rozrušena za 4 dny	-	-
Extrakt z příkladu 2, provedení e/, extrakt /i/	0,4	několik narostlých buněk	+ 5	i 10	+ 40	30 až 80
	0,8	/?/	n/g	n/g	n/g	+
	1,6	n/g	n/g	n/g	n/g	n/g
	2,4	n/g	n/g	n/g	n/g	n/g

n/g = žádný pozorovaný růst buněk, pouze izolované jednotlivé buňky, lnoucí ke spodnímu povrchu kultivační baňky

Příklad 4 a/ Vyhodnocení akutní toxicity extraktu z rostliny Hypoxis.

Vyhodnocení toxicity bylo prováděno za použití roztoků, které byly připraveny z extraktů, získaných postupem podle příkladu 2, provedení e/, extrakt /i/, přičemž byla testována skupina myší, u které byl stejný počet samců a samic.

Hmotnost pokusných zvířat se pohybovala v rozmezí od 22 do 30 gramů. Pokusná zvířata byla pozorována 7 dní po podání jednotlivé dávky.

Připravené roztoky byly před podáním zfiltrovány přes filtrační membrány s otvory o průměru 0,45 milimetru před poslední úpravou, za účelem odstranění veškerých částic, které by znesnadnily interpretaci získaných výsledků a za účelem získání sterilních roztoků.

Při perorálním nebo intraperitoneálním podání byly roztoky

-6CZ 278542 B6 užity've stavu, v jakém byly připraveny, to znamená bez předchozí filtrace.

Získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce č. 2

Tabulka 2

Celková úmrtnost v procentech po podání extraktu z rostliny H. obtusa-nitida podle příkladu 2, provedení e/, extrakt /i/.

Dávka /mg/kg/	Způsob podání	1	Celková 2	úmrtnost 3	v % 5	/dny/ 7
500’	P.O.	0	0	0	0	0
1000	P.O.	0	0	0	0	0
2000	P.O.	0	0	0	0	0
500	I.P.	0	0	0	0	0
1000	I.P.	10	20	20	20	20
2000	I.P.	60	75	⁸⁰	80	⁸⁰
500	I.V.	0	0	0.	. 0	0
1000	I.V.	20	25	25	25	25
2000	I.V.	80	100	-	-	—

P.O. = perorálně I.V. = intravenózně I.P, = intraperitoneálně b/ Vyhodnocení akutní toxicity sloučeniny vzorce I.

Při vyhodnocování akutní toxicity sloučeniny vzorce I byly připraveny roztoky sloučeniny vzorce I v destilované vodě v požadované koncentraci. Podávaný objem extraktu byl vždy 10 mililitrů/kilogram. V každém případě bylo použito pro jednotlivou dávku vždy stejné množství samců a samic. Všechna zvířata byla pozorována 7 dnů po podání, přičemž byla sledována toxicita a/nebo farmakodynamické účinky.

Všechna přežívající zvířata byla usmrcena a bylo provedeno vyhodnocení změn na jednotlivých orgánech.

Získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce č.3.

-7CZ 278542 B6

Tabulka· 3

Vyhodnocení akutní toxicity sloučeniny I při intraperitoneálním, perorálním a intravenózním podání.

Pokusné Způsob podání zvíře	Dávka /mg/kg/	Úmrtnost /rozmezí	Poznámka %/
myš	perorální	1000	0/20	U žádného z pokusných zvířat nebylo možno
		2000	0/20	prokázat.žádné makroskopické poškození
		4000	0/20
myš	intraperitoneálně	250	0/10	Po podání extraktu všechna zvířata jevila
		500	0/20	známky podráždění, které se zvětšovalo se
		1000	5/30	zvýšením dávky
			/10-30/
		2000	27/30

/80-100/ králík intravenózně

100 0/2

U těchto zvířat nebylo možno pozorovat ani makroskopické poškození ani příznaky tromboflebitidy v místě injekčního podání. Zvířata na pohled nejevila známky poškození

Závěry :

Z výše uvedených výsledků je patrné, že sloučenina vzorce I má velmi nízkou toxicitu. U přežívajících zvířat rovněž nebylo možno pozorovat po usmrcení žádné změny na orgánech.

c/ Vyhodnocení toxicity pro plod a teratogenního účinku sloučeniny vzorce I.

K tomuto testu byly použity dvě skupiny po 6 gravidních myších /druh Swiss Webster/, přičemž bylo podáváno perorálně 10 mililitrů/kg sloučeniny vzorce I jednou denně ve vodném roztoku ode dne 1 až do dne 8 gravidity. Po 20. dni gravidity byly myši lehce anestetizovány diethyletherem a byl proveden císařský řez. Tímto byl stanoven celkový počet plodů, přičemž všechny plody byly vyjmuty a potom byl stanoven:

- počet živých plodů

- počet hrubých anatomických abnormalit končetin a hlav plodů.

-8CZ 278542 B6

Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce č.4, přičemž pro srovnání jsou zde uvedeny i výsledky kontrolní skupiny.

Tabulka 4

Vliv perorálního podání sloučeniny vzorce I na plody gravidních myší.

	Kontrolní skupina . /podána voda/	Pokusná zvířata Dávka sloučeniny I
20 mg/kg	100 mg/kg
Počet zvířat	6	6	6
Počet implantací	56	58	58
Počet plodů	52	52	49
Počet živých plodů 51	50	45
Počet malformací	0 /?/	0	3 /2?/

d/ Vyhodnocení cytostatického a cytotoxického účinku sloučeniny vzorce I.

Podle tohoto testu byl zjišťován i cytostatický a cytotoxický účinek in vitro při použití extraktů rostliny Hypoxis rooperi z příkladu 2, provedení e/, extrakt /i/, obsahujících sloučeninu vzorce I. K tomuto pokusu bylo použito čtyř různých typů buněčných kultur :

myší sarkom - Ms 52 B myší melanom - Mel B1 - 6

- Heha 229, a myší fetální kožní fibroblasty - HFSF /kultura nezhoubných buněk/.

Postup testu byl následující. Trypsinizované buňky byly přeneseny do prostředí MEM a vhodným způsobem byly zředěny na počet dvakrát 10⁵ buněk v 1 mililitru. Láhev pro pěstování tkáňových kultur s obsahem 4-, 5 mililitru živného prostředí byla naočkována 0,5 mililitrem takto připravené buněčné suspenze. Kultura byla potom pěstována při teplotě 37’ C celkem 24 hodin, načež byl přidán roztok testované látky v 0,5 mililitru živného prostředí. Všechny kultury byly pěstovány tak dlouho, až bylo možno v kontrolní láhvi pozorovat 100 %-ní souvislou vrstvu buněk. V následující tabulce jsou uvedeny získané výsledky, z nichž je zřejmé, že buněčný růst byl testovanou látkou podstatně zpomalen a regrese růstu bylo možno pozorovat pro kultury MS 52 B, Mel B1 - 6 a Heha 229.

-9CZ 278542 B6

Tabulka 5 . Tvorba souvislé vrstvy v procentech po podání účinné látky

Časový	MS 52 1	B	Mel B1 - i	6	Heha 229		HFSF
interval	Ext.	I	Ext.	I	Ext.	I	Ext.	I
/hodiny/	80	40	80	40	80	40	100	40
24	50	40	40	40	50	50.	40	40
48	40	20	40	30	50	60	60	50
72	20	20	20	40 '	40	50	75	50
96	20	20	5	40	20	30	60	40
120	-	- .	-	30	-	-	-	-

Poznámky k tabulce č. 5 :

- Ve všech případech byla inkubace prováděna při teplotě 37° C, — Všechny kontrolní kultury vytvořily 100 %-ní. souvislou vrstvu v průběhu 96 hodin,

- Ext. znamená extrakt z rostliny Hypoxis rooperi, připravený postupem podle příkladu 2, provedení e/, extrakt /i/,

I je čistá sloučenina vzorce I, tak jak příkladu 1, v dávce uvedené v tabulce č. 1 sloučeniny.

je to uváděno v v ng pod údajem

Z výše uvedených výsledků je zřejmé, že i přes malý počet použitých zvířat pro uvedené testy je nepravděpodobné, že by sloučenina vzorce I v daných dávkách vyvolávala teratogenní účinky. Nebylo možno pozorovat známky sníženého růstu plodu v žádné z pokusných skupin, ani nepříznivé účinky na gravidní zvířata.

Příklad 5

Podle tohoto příkladu byly extrakty z rostliny Hypoxis připraveny způsobem podle příkladu 2 a tyto extrakty byly použity k léčbě nemocných s různým typem zhoubného nádoru s následujícími výsledky :

a/ U muže starého 64 let, který dříve trpěl kožním zhoubným nádorem na obličeji a pažích, se vyvinul neoperovatelný nádor v blízkosti konečníku a kromě toho bylo zapotřebí provést operaci na tváři a na rtech. Potom byl tento muž léčen extraktem, připraveným postupem podle příkladu 2, provedení a/, v dávce 200 mg třikrát denně. Jeho stav se lepšil tak, že všechny známky zhoubného nádoru se zlepšovaly v prvních třech týdnech, až zmizely úplně. Léčba byla provedena před 6 lety a nemocný je dosud živ a bez známek dalšího zhoubného růstu.

-10CZ 278542 B6 b/ Muž starý '70 let byl operován na podezření na zhoubný nádor v břišní dutině. Bylo nutno mu operativně vytvořit umělý vývod. Na colon sigmoideum a na konečníku se nacházel velký neoperovatelný nádor, který prorůstal i do pobřišnice a zcela uzavíral střevo. Šlo o lymfosarkom, který byl rovněž potvrzen dalším zkoumáním.. Po chirurgickém zákroku bylo doporučeno ozařo-. vání. I po ozařování při dalším otevření dutiny břišní bylo stále možno pozorovat na stejném místě velkou nádorovou hmotu. Tato hmota již prorůstala do zadní břišní stěny a do postranních pánevních stěn. Po tomto zjištění bylo důvodné se domnívat, že nemocný bude žít nejvýše 2 měsíce. V této době počal nemocný dostávat extrakt rostliny Hypoxis rooperi, vyrobený postupem podle příkladu 2, provedení a/ a b/ v denní dávce třikrát 200 miligramů. Po 4 měsících byl nemocný stále ještě živ a byl mu proveden další chirurgický zákrok, při němž byla odebrána velká část tlustého střeva, nebyly však nalezeny další známky růstu nádoru v břišní dutině. Při zkoumání vyjmuté části tlustého střeva bylo možno pozorovat pouze intussuscepsi a otok se známkami zatvrdnutí, při mikroskopickém zkoumání tkáně bylo možno prokázat překrvení a zvředovatění sliznice, avšak žádné známky nádorového bujení. Nemocný byl ve zlepšeném stavu, přibyl na hmotnosti a byl mu dále podáván uvedený extrakt. Nyní je tento muž 79 let stár a je zcela zdráv. Není možno pozorovat žádné známky obnoveného růstu nádorů.

c/ Neoperovatelný karcinom plic byl zjištěn před 7 lety u ženy středního věku. Této ženě byl podáván extrakt rostliny Hypoxis rooperi, získaný způsobem podle příkladu 2, provedení a/ v dávce 600 miligramů denně. Žena nebyla ozařována, ani jí nebyly podávány žádné chemické' látky. V průběhu 1 měsíce se tato žena cítila subjektivně mnohem lépe a za 6 měsíců byla zcela zdráva. Po 7 letech žije, je jí stále podáván extrakt rostliny Hypoxis a její zdravotní stav je sledován alespoň dvakrát za rok.

d/ Nemocný muž, upoutaný na lůžko pro neoperovatelný nádor plic, byl ošetřen zářením a nejvyšší doba přežití byla odhadována na 2 měsíce. Tomuto muži byl podáván extrakt Hypoxis rooperi, připravený způsobem podle příkladu 2, provedení a/ a b/ v dávce 6 miligramů denně. Po této léčbě se nemocný mohl procházet, po 6 měsících byl stále živ, potom však byla léčba extraktem přerušena a po dalších 2 týdnech byl nemocný opět upoután na lůžko. Nemocnému byl potom znovu podáván extrakt, v průběhu týdne mohl nemocný opět opustit lůžko, přičemž po 4 měsících byla léčba opět přerušena, načež nemocný v krátké době zemřel.

e/ Ženě ve stáří 33 let bylo nutno odejmout mléčnou žlázu a následným ozařováním a ošetřením chemickými látkami. Vyvinul se stav metastáz v páteři, přičemž tyto metastázy vedly k destrukci jednoho obratle. Léčba byla zcela přerušena, nemocné však byl podáván extrakt rostliny Hypoxis obtu -nitida, připravený postupem podle příkladu 2, provedení e/, extrakt /i/ v dávce třikrát 300 miligramů denně.

Po 1 měsíci při rentgenologickém zkoumání změn po kostech nebylo možno pozorovat žádné známky zhoubného růstu a po dalším týdnu byla nemocná operována a zničený obratel byl přemostěn kostním můstkem. V průběhu zákroku nebylo možno pozorovat žádný zbytek zhoubného nádoru.

• -11CZ 278542 B6 f/ Dvěma ženám se zhoubným nádorem kůže byl podáván extrakt rostliny Hypoxis rooperi, připraveným postupem podle příkladu 2, provedení a/ v dávce třikrát 200 miligramů denně. Stav se úplně upravil v průběhu 60 dnů.

Příklad 6

Dvě ženy s histopatologicky prokázaným karcinomem byly ošetřeny dávkou. 600 miligramů extraktu rostiny Hypoxis čtyřikrát denně. Stav obou nemocných byl považován za nevyléčitelný v době, kdy byl tento extrakt podáván a z tohoto důvodu také nebyly nemocné ozařovány, ani jim nebyly podávány žádné cytostatické látky, byly podávány pouze látky, omezující bolest. Extrakt rostliny Hypoxis obsahoval 52 % sloučeniny I, přičemž tento extrakt byl připraven z H. acuminata postupem podle příkladu 2, provedení e/, extrakt /i/· a/ Nemocná ve stáří 77 let trpěla infiltrací zhoubného nádoru mléčné žlázy do poplicnice. Po 64 dnech léčby extraktem rostliny Hypoxis bylo možno pozorovat snížení počtu a velikosti metastáz a nebylo již zapotřebí odvádět výpotek z dutiny hrudní. Celkový stav nemocné se zlepšil a bolesti úplně zmizely.

b/ Nemocná ve stáří 54 let trpěla vážným adenokarcinomem vaječníku, který prorůstal do pobřišnice a do mesentaria a v břiše se vytvořil výpotek. Tato nemocná byla léčena extraktem rostliny Hypoxis, přičemž po době 2,5 měsíce se stav této nemocné zlepšil a výpotek se přestal tvořit, aniž by bylo nutno jej odvádět nebo užívat močopudné látky.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. 1,5-bis(3-p-D-glukosyloxy-4-hydroxyfenyl)pent-l-en-4-in vzorce I

2. Způsob izolace 1,5-bis(3-p-D-glukosyloxy-4-hydroxyfenyl)pent-l-en-4-inu vzorce I podle nároku 1, vyznačující se tím, že se extrahuje rostlina z čeledi Hypoxidaceae vodou, alkoholem nebo směsí vody a alkoholu a takto získaný extrakt se popřípadě přefiltruje a potom lyofilizuje.

-12CZ 278542 B6

3 . Způsob podle nároku 2, v y z n a .č u j í c í se t í m, že se extrahuje rostlina rodu Hypoxis. 4. Způsob podle nároku 2, v y z n a č u j í c í se t i m, že se extrahuje rostlina rodu Spiloxena. 5. Způsob podle nároku 2, v y z n a č u j í c í s é t í m, že se extrahují-rostXiny Hypoxis_nitida • f H . obtusa-nitida, H. acuminata, H. latifolia, H. rigiduli, H. rooperi, H. obtusa-

obtusa a Spiloxene schlechteri.

6. Prostředek pro prevenci a léčbu zhoubných nádorů, vyznačující se tím, že jako účinnou látku obsahuje

1,5-bis(3-B~D-glukosyloxy-4-hydroxyfeňyl)pent-l-en-4-in vzorce I

HO (I)

7. Prostředek podle nároku 6, vyznačující se tím, že jako účinnou složku obsahuje extrakt rostliny z čeledi Hypoxidaceae ve vodě, alkoholu nebo v jiném prostředí.

8. Prostředek tím, že Hypoxis.

podle nároku 6, jako účinnou složku vyznačující se obsahuje extrakt z rostlin

9.

Prostředek tím, že Spiloxene.

podle nároku jako účinnou složku

6, vyznačující se obsahuje extrakt z rostlin rodu

10.Prostředek podle nároku 6, vyznačující se tím, že jako účinnou složku obsahuje extrakty rostlin Hypoxis nitida, H. obtusa-nitida, H. acuminata, H. latifolia, H. rigiduli, H. rooperi, H. obtusa-obtusa a Spiloxene schlechteri.

Konec dokumentu