CZ259796A3

CZ259796A3 - Benzothiophene, benzofuran and indolethiazepinones, oxazepinones and diazepinones as cellular adhesion inhibitors and as hiv inhibitors

Info

Publication number: CZ259796A3
Application number: CZ962597A
Authority: CZ
Inventors: Diane Harris Boschelli; David Thomas Connor; James Bernard Kramer; Paul Charles Unangst
Original assignee: Warner Lambert Co
Priority date: 1994-03-07
Filing date: 1995-01-30
Publication date: 1997-06-11
Also published as: KR100325881B1; RO117919B1; PH31163A; SK114196A3; CA2181354A1; ATE187728T1; BG62698B1; US5489586A; AU688466B2; MD1688F2; NO963744D0; WO1995024408A1; CZ292009B6; NO963744L; FI963462A; RU2144033C1; ES2141922T3; PL180457B1; MD960230A; FI963462A0

Description

NJ, US;

(72) Původce:

Boschelli Dianě Harris, Plymouth, MI, US; Connor David Thomas, Ann Arbor, MI, US; Kramer James Bernard, Sylvania, OH, US; Unangst Paul Charles, Ann Arbor, MI, US;

(74) Zástupce:

Čermák Karel Dr., Národní 32, Praha 1, 11000;

(54) Název přihlášky vynálezu:

Benzothiofen, benzofuran a índolthiazepinony, oxazepinony a diazepinony jako inhibitory buněčné adheze a jako inhibitory HIV

CZ 2597-96 A3 (57) Anotace:

Benzothiofén, benzofuran, a indolthiazepinony, oxazepinony, a diazepinony, vzorce (I), způsob jejich přípravy. Jsou popsány jako činidla, která inhibují adhezní schopnost leukocytů, k vaskulárnímu endotelu a činidla, která jsou účinná při therapii zánětlivých onemocnění; tyto sloučeniny také inhibují aktivaci viru lidské imunideficience HIV.

Benzothiof en, benzofuran, a indol thiazepinony_,._________ oxazepinony, a diazepinony, jako inhibitory ^1jlť^d_ * ‘ 1 0 ί N i. SVÍ A buněčné adheze a jako inhibitory HIV avy. a δ .XI Ί 0 ' ' oi$oa

Oblast techniky 1 f o I i 9

Γ

Vynález popisuje nový benzothiofén, benzofuran, indolthiazepinony, oxazepinony, a diazepinony, a jejich farmaceuticky přijatelné soli, které jsou použitelné pro zabránění adheze leukocytú do endothelu buněk.

Adherence leukocytú k cévnímu endotelu vede k vývoji chorobného zánětu.

Adheznímu procesu předchází transendoteliální migrace leukocytú do okolí tkáně s jejím následným poškozením.

Sloučeniny podle vynálezu blokují tuto počáteční adhezivní interakci, a jsou účinné pro léčení zánětlivých onemocnění, jako je rheumatoidní artritida, osteoartritida, astma a psoriáza.

Další indikace nejsou omezeny na úzkostlivý dýchací syndrom u dospělých, reperfuzní poranění, ischemii, vředovitý zánět tlustého střeva, atherosklerózu, zánětlivá střevní onemocnění a nádorovou metastázi.

Dosavadní stav techniky

Receptory adheze jsou sloučeny do třech hlavních čeledí : “ selektiny , imunoglobul lnová nadčeled , a “ integriny ( Nátuře, 346 : 426 ( 1990 ) )

Členy všech tří skupin jsou zahrnutý prostřednictvím adheze leukocitú během zánětu do této literatury : Thrombosis and Homostasis 65 ( ) ; 223 ( 1991 ), Clinical and exoerimental

Allercrv, 20 : 619 ( 1990 ) . Transolantation, 48 j_727 ( 1989 ), Biochemical Pharm, . 40 ( 8 ) :

1683 (1990 )).

Endotheliální leukocitová adheze molekula - 1 ( ELÁM - 1 , nebo E - selektin )je členem selectinové Čeledi glykoproteinů, která podporuje adhezi buňka - buňka.

E - selectin je rozšířen s maximálním vyjádřením povrchu endotheliálních buněk, 4 hodiny po stimulaci endotheliálních buněk s cytokynezí, jako je interleukin - 1 ( IL - 1 ) , nebo nádorový nekrózový faktor a ( TNF - a ) , nebo další zánětlivé mediátory, jako je lipopolysacharid ( LPS ) ( Exp,. Na t, Acad, Sci,, M : 9238 ( 1987 )

Intercelulární adhezní molekula - 1 ( ICAM - 1 ) je členem imunoglobulinové nadčeledi.

Je také horní mezí maximálního vyjádřění 12 - 24 hodin po podnětu.

Bylo dokázáno, že 4 hodiny poté jsou endotheliální buňky stimulovány mediátorem zánětu, oba E - selectin a ICAM - 1 jsou přítomny v buněčném povrchu ( J, Clin, Invest., 82 : 17 46 ( 1988 ) a J, Immun., 137 : 1893 ( 1986 ), Blood, : 2721 ( 1991 ) ) .

Benzothiofén, benzofuran, a indolthiazepinony, oxazepinony, a diazepinony, podle tohoto vynálezu se projevily jako inhibitory adheze neutrofilního leukocytu u pupečníkové šňůry endoteliálních buněk ( HUVECS ) stimulované TNFa v postupu in vitro.

Tento vynález také popisuje nové thiazepipnony, oxazepipnony, a diazepinony pro léčení lidí nakažených ztrátou imunity virem ( HIV ) pomocí inhibiční aktivace HIV u latentních nakažených lidí.

Patogeneze imunodeficience u lidí (virus) HIV je komplikovaná a dosud není kompletně prostudována. Životní cyklus viru by měl být teoreticky rozdělen na aferentní a eferentní složky.

Fúze viru, vázání viru, genetická transkripce, a konečná integrace, patří mezi tyto jevy , se zaměřením na aferentní složky životního cyklu. Aferentní složky životního cyklu viru HIV, které jsou odpovědné za primární infekci viru HIV jako samostatné, je obecně následné prasknutí viraemia s , nebo bez klinických příznaků.

Bylo vyvinuto mnoho terapeutických postupů a zkoušek, pro zakročení během aferentních jevů. Příkladem může být , Mitsuia H, Broder S, ¹¹Inhibition of the In Vitro Ifectivity and Cytopathic Effect on Human T - lymphotropič Virus Type III / lymphadenopathy Virus - associated Virus ( HTLV - III / LAV ) by 2,3

Dideoxynucleosides, Proč, Nati, Acad, Sel, (

USA ). 83 : 1911 - 1915 ( 1986 )

Kde odlišné stavy aferentní komponenty jsou čas<to potenciální pro účinný terapeutický zásah , protože při zjevných příznacích jezásah pouze z tohoto hlediska nedostatečný.

Na začátku infekce virem HIV , jsou tyto stavy progresivní skrze aferentní stavy, individuální zkušenosti prodlužují periodu klinické latence, která může trvat po několik let, a může být u každého zdravého jedince jiná.

Z tohoto hlediska je dosažena nízká absence hladin viraemie a replikace viru v peripherálních krevních buňkách .

Nicméně v pozdějším stadiu nemoci je eventuálně progresivní životní léčba imunosupresse ( AIDS ) obtížná.

Eferentní složka životního cyklu HIV zahrnuje tyto nezbytné jevy pro provirus HIV na úspěšný přepis , přenos hromadění, a produkci virionů.

Tyto jevy jsou nezbytné pro HIV - infekci buněk, k progresi z asymptomatického nevýrazného stavu HIV do symptomatického HIV výrazného stavu, kde je ukázána jako aktivace.

Konkrétně efferentní komponenta a buněčná báze pro aktivaci není knkrétně prostudována.

Nová therapeutická činidla a postupy jsou rozvíjeny a implementovány během klinické asymptomatické fáze, v progresivním boji proti AIDS , poskytuje naději milionů infikovaných, ale klinicky latentních individualit.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je sloučenina vzorce I , nebo farmaceuticky přijatelné adiční soli kyselin :

kde:

Rl, R2, R3, a R4 jsou každý nezávisle vodík, hydroxy, halogen, nižší alkyl, nižší alkoxy, benzyloxy, trifluoromethyl, nitro, nebo

- NRgRg, kde Rg a Rg j sou každý nezávisle vodík, nebo nižší alkyl.,

R5 a Rg jsou každý nezávisle vodík, nižší alkyl, nebo f enyl,.,

X je O, S (O ) _n nebo NR7

Y je O, S (O ) _n nebo NRg

R7 je vodík, nižší alkyl, fenyl, benzyl, substituovaný halogenem.,

Rg je vodík, nižší alkyl, nebo fenyl,., n j e 0, 1, nebo 2., s podmínkou že :

1)	jestliže	X je NH,	Y je	NH,	R_X	je	H,	^r3	je H,
a R4	je Br, R2	není methyl
2)	jestliže	X je NH,	Y je	NH,	^R1	je	H,	^r3	je H,
a R4	je H,
	R2 není	methoxy,	nebo	ethoxy,	a
3)	jestliže	X je NH,	Y je	s,	a alespoň	j eden z
^R1 ·	^2 '^R3 ·	a R4, není H.

Přítomný vynález zahrnuje farmaceutické kompozice obsahující therapeuticky účinné množství sloučeniny vzorce I, uvedené výše, společné s farmaceuticky přijatelným nosičem.

Třetím aspektem tohoto vynálezu je způsob léčení nemoci pomocí inhibiční adheze leukocytových endotheliálních buněk, zahrnující podávání hostiteli potřebného množství farmacutické kompozice obsahující sloučeninu vzorce I uvedenou výše v jednotkové dávkové formě.

Výhodným provedením je způsob léčení zánětlivých onemocnění u lidí zahrnující podávání protizánětlivého množství sloučeniny vzorce I.

Čtvrtým aspektem tohoto vynálezu je způsob léčení hostitele infikovaného virem HIV, které zahrnuje podávání výše uvedenám hostitelům farmaceutické kompozice obsahující sloučeninu vzorce I uvedenou výše, v jednotkové dávkové formě.

Termíny používané v definicích u sloučeniny vzorce I podle tohoto vynálezu jsou definovány následovně :

Nižší alkyl a nižší alkoxy znamená přímý, nebo rozvětvený alkyl, nebo alkoxyskupinu mající od 1 do 4 uhlíkových atomů, které zahrnují například methyl, ethyl propyl, i - propyl, nebo další uvedené jako jsou ( methyl ) ethyl, a t - butyl, nebo další jako je 1,1 - ( dimethyl ) - ethyl, a podobné, například methoxy, ethoxy, i - propoxy, nebo 1 - (methyl) ethoxy a podobné.

Halogen zahrnuje chlor, fluor, brom , jód.

Sloučeniny vzorce I jsou schopny dále tvořit farmaceuticky přijatelné adiční soli kyselin. Všechny tyto formy jsou zahrnuty v tomto vynálezu.

Farmaceuticky přijatelné adiční soli kyselin vzorce I zahrnují soli odvozené od anorganických kyselin, jako je : chlorovodíková , dusičná, fosforečná, sírová, bromovodíková, jodovodíková, fluorovodíková, fosforečná, a podobné, tak také solí netoxických anorganických je alifatická jako deriváty kyselin, jako mono - a dikarboxylová kyselina, fenylem substituované alkanové kyseliny, hydroxyalkanové kyseliny, alkandionové kyseliny, aromatické kyseliny, alifatické a aromatické sulfonové kyseliny, , atd.

Těmito solemi jsou sulfáty, pyrosulfáty, bisulfát sulfit, bisulfit, nitrát, fosfát, monohydrogenfosfát, dihydrogenfosfát, metafosfát, pyrofosfát, chlorid, bromid, acetát, jodid, trifluoracetát, propionát, kaprilát, izobutyrát, oxalát, malonát, sukcinát , suberát, sebakát, fumarát, maleát, mandelát, benzoát, chlorbenzoát, methylbenzoát, dinitrobenzoát, ftalát, benzensulfonát, toluensulfonát, fenylacetát, citrát, laktát, maleát, tartrát, methansulfonát, a podobné,.

Také jsou zahrnuty soli aminokyselin, jako jsou arginát, a podobné a glukonát, galakturonát, N methylglutamin ( například Berge S. M., a ostatní., Pharmaceutical Salts, Journal of Pharroaceutical Science, 66 : 1 - 19 ( 1977 )).

Adiční soli kyselin uvedených základních sloučenin jsou připravovány kontaktem volných bází tvořených dostatečným množstvím požadované kyseliny, pro přípravu solí běžným způsobem. Tvorba volné báze může být obnovena kontaktem soli tvořené bází s bází a izolace volné báze konvenčním způsobem.

Tyto volné báze jsou odlišné od jejich tvořených solí ve fyzikálních vlastnostech, jako je rozpustnost v polárních rozpouštědlech, ale ostatní soli jsou ekvivalentní jejich příslušným π

volným bázím pro vlastnosti podle tohoto vynálezu.

Sloučeniny podle vynálezu mohou existovat v nerozpustné formě, tak jako v rozpustné formě, zahrnující hydrátové formy.

Obecně rozpustné formy zahrnují v sobě hydrátové form a jsou ekvivalentní nerozpustným formám, a nevybočují z rozsahu tohoto vynálezu.

Výhodnými sloučeninami je sloučenina vzorce I podle tohoto vynálezu, kde R^, R3, a R4 jsou vodík ; a R2 je definován výše.

Výhodnějšími sloučeninami podle tohoto vynálezu je sloučenina vzorce I kde R^, R3, a R4 jsou vodík ; a R2 je vodík, nebo nižší alkoxy, ;

X je 0, S( 0 )_n nebo RN7;

Y je 0 nebo S( 0 )_n , R7 je vodík, nebo nižší alkyl, a n je 0, 1, nebo 2.

Zvláště výhodnými sloučeninami jsou :

2.3- dihydro-9-methoxy- [1]benzothieno[2,3-f] 1.4- thiazepin-5{4H)-on , 2,3-dihydro[1]benzothieno[2,3-f]-1,4-oxazepin-5(4H)-on ,

2.3- dihydro-9-methoxy-[1]benzothieno[2,3-f] 1.4- thiazepin-5 (4H)-on -1-oxide, 3,4-dihydro-9-methoxy6-methyl-2H-l,4-oxazepino (6,7-b] -indol-5 (5H) -on ,

2.3- dihydro-ΙΗ-benzothieno- [3,2-e] -l,4-diazepine-5-on ,

2.3- dihydro-9-methoxy-lH-benzothieno- [2,3-f] 12

1,4-oxazepin -5-on , 2,3-dihydro-9-methoxy-6-oxid ΙΗ-benzothieno-[2,3-f]oxazepin -5-on , 2,3-dihydro9-methoxy-2-methyl-lH-benzothieno-[2,3-f] 1.4- oxazepin -5-on , 2,3-dihydro-7,8,9,10-tecrachloroΙΗ-benzothieno[2,3-f]-1,4-oxazepin -5-on , 3,4-dihydro8-nitro-6-tert.-butyl-2H-1,4-oxazepin [6,7-b]indol5(6H)-on , 3,4-dihydro-9-isopropoxy-6-phenoxymethyl-2H1.4- oxazepine[6,7-b]indol-5(6H)-on hydrochlorid ,

3.4- dihydro-8,10-dibromo-6-(3 -chlorobenzyl-2H1.4- oxazepin [6,7-b]indol-5(6H)-on , 2,3-dihydro8-chloro-lH-benzofurano[2,3-f]-l,4-oxazepine-5-on , methanesulfonat , 2,3-dihydro-l,2,3-trimethyl-lHbenzofurano[3,2-e]-1,4-diazepin -5-on , and '

2.3- dihydro-3-hexyl-lH-benzofurano[2,3-f] 1.4- thiazepin -5-on .

Jestliže určujeme buněčnou adhezní inhibici · , nebo inhibitor aktivace HIV který je indikován, i

pomocí inter alia ” za zvláštních podmínek j jako je věk, pohlaví, hmotnost, a podobné, léčeného objektu, musí být vzato v úvahu a na tyto odlišnosti si musí dát pozor ošetřující lékař. 1

Pro lékařské použití potřebným množstvím sloučeniny vzorce I , nebo farmaceuticky vhodnými adičními solemi kyselin dosáhneme terapeutického účinku, vzhledem k úpravě obou ze zvláštních sloučenin, cestou podávání savcům pro léčení, a zvláště pro léčení poruch kombinovaných nemocí.

Výhodné provedení vynálezu poskytuje způsob léčení bolesti u lidí, se zánětlivými nemocemi, jako je artritida, nebo nádorové onemocnění zahrnující podávání antizánětlivě účinného množství látky subjektu, který je léčen.

Vhodná dávka sloučeniny vzorce I , nebo farmaceuticky přijatelných adičních solí kyselin, pro podávání proti bolestem u savců, nebo podobným událostem za podmínek zde popsaných je 0,1 mg až 500 mg na kilogram tělesné hmotnosti.

V případě systematického podávání dávka může být v rozmezí od 0,5 do 500 mg sloučeniny na kg tělesné hmotnosti, výhodnější dávka je od 0,5 do 500 mg / kg tělesné hmotnosti savce, kterému se tato podává dvakrát, nebo třikrát denně.

V případě topického podávání, to jest na kůži, nebo do očí, vhodná dávka může být v okolí 0.1 ng až 100 μg sloučeniny na kilogram, typicky kolem 0,1 ítg/kg.

V případě orální dávky pro léčení nebo profilaxi artritidy nebo zánětu, je v tomto případě vhodná dávka sloučeniny vzorce I , nebo fiziologicky přijatelné adiční soli kyselin, podávána podle shora uvedených dávek, nebo výhodněji od 1 mg do 10 mg sloučeniny na kg, výhodnější dávka je od 1 do 5 mg na kg tělesné hmotnosti u savců, například od 1 do 2 mg/kg.

Ze studií vyplývá, že průměrnému odbornému lékaři, nebo veterináři nedělá problémy stanovit a předepsat účinné množství sloučeniny pro podmínky, za kterých se provádí stanovené léčení. Takovýmto způsobem by se mohl zabývat lékař, nebo veterinář, a předepsat první poměrně nízkou dávku a případně dále zvyšovat dávku podle obdržené odezvy pacienta.

Je možné podávat aktivní příměsi samostatně, výhodně v přítomnosti jako farmaceutickou formulaci obsahující sloučeninu vzorce I , nebo její farmaceuticky přijatelné adiční soli

kyselin,	a jejich	farmaceuticky	přijatelné
nosiče.
Takovéto	formulace	tvoří další	rys tohoto
vynálezu.
Formulace	pro veterinární i pro	použiti v
medicíně,	podle tohoto	vynálezu obsahuje aktivní

příměs, ve spojení s farmaceuticky přijatelným nosičem, a optimálními dalšími farmaceutickými ingredienty.

Přijatelným nosičem je míněno že tento nosič je slučitelný s dalšími příměsemi formulací, a není zhoubný pro příjemce.

Formulace zahrnují také formy pro orální, pulmonární, ofthalmické, rektální, parenterální, ( zahrnující subkutánní , intramuskulární a intravenézní ) , intraartikulární, topické, nasální, nebo bukální podávání. Takovéto formulace jsou prostudovány a zahrnují známé formulace z techniky s dlouhou dobou působení.

Formulace mohou být obyčejně přítomny v jednotkové dávkové formě, a mohou být připraveny pomocí některých dobře známých metod z dosavadního stavu techniky známého ve farmacii. Všechny metody mohou zahrnovat krok obsahující aktivní příměs ve spojení s nosičem, který sestává z jedné nebo více vedlejších příměsí. Formulace jsou jednotně připravovány s rovnoměrně rozvrženými příměsemi, ve spojení s vodným nosičem, nebo s děleným čistým nosičem, nebo oběma, a potom, jestliže je to nezbytné, tvarování produktu do požadovaných formulací.

Formulace podle tohoto vynálezu vhodné pro orální podávání mohou být ve formě diskrétních jednotek, jako jsou kapsle, oplatky, tablety, nebo pastilky, a každá jednotka obsahuje předem určené množství aktivní látky; ve formě prášku, nebo granulí; ve formě roztoku, nebo suspenze, ve vodném, nebo v nevodném roztoku; nebo ve formě emulze olej ve vodě , nebo voda v oleji.

Aktivní příměsi mohou být ve formě velkých pilulek, lektvaru nebo pasty.

Užitečnost sloučeniny podle vynálezu jako inhibitorů cévní adherence cévního endothelia a tedy pro léčení nemocí zánětlivých a jim příbuzných nemocí, nebo podmínky za kterých může být ukázána jejich účinnost v různých standartních testech je uvedena dále. Popis jednotlivých testů a jejich výsledky jsou uvedeny dále.

Protokol intercelulární adheze Molekula - 1 /

HUVEC . Výsledky zkoušek ( ICAM - 1 ) a E Selektin / HUVEC . Výsledky zkoušek ( ESEL )

Buněčná kultura

Endotheliální buňky lidské pupeční šňůry ( HUVECs ) z klonu byly odebrány v T - 25 tkáňové kultury do lahve,ve které je umožno pěstovat buněčnou kulturu po dobu 1 - 3 dní při teplotě 37 °C a přístup 5 % oxidu uhličitého.

HUVECs byl potom rozdělen za pomoci vyplachování T - 25 s 10 ml 0.025 % tripsyn / 0.01 % EDTA po dobu 5 · 10 sekund , vlit do vyplachovacího roztoku.

Dalších lOml tripsyn / EDTA roztoku byl přidán a buňky byly třepány po dobu 2 - 4 minut zatímco bylo třepáno na straně nádoby gumovým čtětečkem. Obsah nádoby byl potom vlit do 50 ml odstředivky, obsahující 40 ml media.

Medium bylo endotheliální bazální médium, dosažené z klonu obsahujícího hydrokortizon ( 2 mg / 1 ) , epidermální růstovou složku ( 0.05 pg / 1 ), extrakt hovězího mozku, ( 12 mg / 1 ) a zahřáté inaktivované mozkové telecí sérum ( 6 % ) z Hyklonu .

Buňky byly odstřeďovány při 15 *C po dobu 10 - 15 minut, pod hladinou sušeny, a buňky byly resuspendovány čerstvým mediem.

Buňky byly stejným způsobem dvakrát promyty a potom rozděleny do 96 zdravých tkáňových destičkových kultur.

Stimulace Cvtokinu

Během pěti dnů došlo ke shlukování buněk , které byly stimulovány nádorovým nekrózovým faktorem alfa ( TNFa ) ( Genzym ) , který byl obdržen konečným zkoncentrováním prostředí 140 U / ml a umožnil inkubovat po dobu 4 hodin při 37*C .

Po 4 hodinách inkubace medium bylo odstraněno a uskladněno pro analýzu chemokinetické produkce. Buňky byly poté třikrát promyty volným vápníkem a hořčíkem a fosfátovým tlumicím solným roztokem. Monokultury byly poté fixovány přídavkem 10 % tlumicí formalínové lázně po dobu 15 minut.

Po tomto fixování byly buňky třikrát promyty Dulbecco s Eagle Media '· ( Gibco ) obsahující 2 % hovězího albůminového séra ( DMEM / 2 % BSA ) a chlazena přesnoc.

Myší monoklonální anti - human ICAM - 1 ( R a D Systems, Cat No. BBA · 4 ), nebo myší monoklonální anti - human E - selektin (R a D Systems, Cat No. BBA - 2 ) rozpuštěný v DMEM / 2 % BSA byl přidán do každé buňky v množství 0.5 μς / ml a dále inkubován po dobu 2 hodin.

HUVEC monokultura byla poté čtyřikrát promyta DMEM / 2 % BSA.

Konjugovaná ovčí peroxidáza anti - mouše IgG ( Cappel ) byla přidána (1:3, 000 rozpouštědla ) a byla dále inkubována 1 hodinu při 37°C .

Buňky byly poté 4 krát promyty DMEM. Poté byl přidán barevný reagent ( Biorad ) do takto fixovaných.buněk, a tyto byly inkubovány 15 minut při pokojové teplotě.

Reakce byla zastavena pomocí 2 % roztoku štavelové kyseliny a absorbance činila 414 nm na titertekovém deskovitém snímači.

Testování sloučeniny

Sloučenina byla rozpuštěna v DMSO o koncentraci 30 mmol a zředěna v nosiči pro konečnou testovací koncentraci.

HUVECs přijal sloučeninu rozpuštěnou v mediu 30 minut před TNFa testováním.

Absorbance nestimulováného HUVECs byla odečítána z absorbanční hodnoty a předem stimulovaných buněk TNFa a bylo určeno % inhibice.

Procento inhibice bylo určeno porovnáním absorbance přidaných zušlechtěných buněk s zušlechtěnými buňkami v léčivu.

IC50 bylo stanoveno pomocí lineární regresní analýzy.

Způsob určení inhibice lidská neutrofilní adheze TNF - a stimulovaných lidckých endotheliálních bunák ( ECA ) v pupeční šňůfe.

Buněčná kultura

Druhý díl HUVEC { Clonetics Corporation , San Diego, California, CC - 26 17 ) byly rozsety do korningových ( Corning glass vorks, Corning New York ) 96 zdravých buněčných kultur v přibližně 5 x 10³ buněk / zdravé a dospělé shluky v doplněném endotheliálním bazálním mediu ( EBM, MCBD - 131, Clonetics, 10 ng / ml EGF, 1 /ig / ml hydrokortizonu, 0.4 % hovězího mozkového extraktu, 5 % plodového hovězího séra,)

Jeden den před zkouškou, typicky tři dny před zkouškou byly rozsévány kultury kde byly přiřazeny 0.2 ml / zdravé doplněné EBM ( S - EBM )

PZ/prava testovaných sloučenin

Testovaná sloučenina byla připravena jako 10 ml zásobní roztok o koncentraci 1.0 mmol.

Sloučeniny byly na počátku rozpuštěny v 0.1 ml DMSO a následně bylo přidána 9.9 ml S - EBM. Připravené léčivo bylo poté zředěno v jednom kroku a koncentrováno na 66.6 μΜ.

Rozpouštění a zředění bylo provedeno v polystyrénových nádobách.

Stimulace HUVEC

Rekombinantní lidský nádorový nekrózový faktor alfa ( TNF, Genzyme Bston, Massachusetts,code TNF - H ) byl připraven v 400 U / ml v S - EBM.

Zásoba TNF byla připravena z 20,000 U / ml v Delbecco s fosfátovém pufru solného roztoku. ( PBS , Gibco, Grand Island, Neww York ) s 0.1 % BSA a uskladněn při - 70 ^eC.

HUVEC byl promyt jedenkrát s 0.2 ml zahřátého bez přídavku EBM a potom stimulován po dobu 4 hodin 200U / ml TNF za přítomnosti 233.3 μΜ testované sloučeniny.

Nakonec stimulace byla dokončena přídavkem 0.1 ml 400U / mk TNF a 0.1 ml 66.6 μΜ. testované sloučeniny.

Tento přídavek byl učiněn pomalu, aby nedošlo k roztrhání HUVEC monovrstvy.

Každá sloučenina byla testována v šesti lázních. Nestimulovaný ( řídící roztok ) a TNF stimulovaný bez testované sloučeniny byl také vložen na každou misku.

Q?n9Čgfíí..Neu,tlQ.n,lŮ

Jednu hodinu před přidáním neutrofilů do HUVEC , neutrofil ( 5x 10⁶ ml ) byl označen po 30 minut při teolotě 37 °C s 5 μΜ kalcein - AM ( Molecular Probes, Eugene, Oregon ) v Hanksově pufrovacím solném roztoku s 0.45 % BSA.

Zásoba kalceinu byla připravena s 5 mM anhydridu DMSO a usušený byl skladován při - 20 °C. Nakonec byly inkubované buňky promyty dvakrát chladným HBSS a resuspendovány na konečnou koncentraci 1 X 10⁶ buněk / ml v doplněném EBM.

Přídavek neutrofilů do HUVEC

A nakonec po 4 hodinách stimulace byly okamžitě přidány neutrofily do HUVEC monovrstvy, plátky byly promyty 0.2 ml teplého EBM bez doplnění , a byl odstraněn TNF a léčivo.

Neutrofily ( 1 x 10 ⁵ buněk ) byly pomalu přidávány do každé ze zušlechtěných zdravých a inkubovaných plátků po dobu 30 minut při 37 °C. Nakonec byly inkubované plátky promyty dvakrát 0.2 ml horkého EBM přídavku a následovalo konečné přidání 0.1 ml na snímaný plátek.

Určení relativní fluorescence

Relativní fluorescence byla určena za použití Millipore Cytofluoi 300 systém ( excitace = 480, emise = 530, citlivost = 4 )

Výpočet

Zkoušky byly uvažovány jako platné, jestliže TNF - stimulace HUVEC je výsledkem v 300 % vzrůstu neutrofní adherence o proti adherenci nestimulované HUVEC.

Výsledky byly vyjádřeny jako procenta inhibice TNF - stimulované adherence.

stimulovaná adherence * nestimulovaná adherence (léčivo) % inhib ice =* 100 ------------------------------------------stimulovaná adherence - nestimulovaná adherence (kontrolní)

Některé z těchto sloučenin byly testovány pro koncentraci 33.3 μΜ, 10.0 μΜ, 3.3 μΜ a 0.1 μΜ pro určení hodnoty IC50 ·

Lineární regresní analýzou byla určena inhibiční hodnota , kde bylo použito určení IC5Q .

Výsledky, které byly dosaženy pro sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou uvedeny v tabulce I,.

Sloučeniny podle vynálezu, zvláště sloučeniny vzorce III, měly nalezenou inhibiční aktivitu lidské imunodeficience virus ( HIV ) latentní u savců, a jsou používány pro léčení AIDS.

Pokusy a studie virologických buněčných bází pro klinické asymptomatické periody odhalily, že virus HIV existuje jako latentní, nebo nevyjadřující se provirus, v množství populace chronicky infikovaných buňkách.

Specifické, typy HIV a HIV - 1 byly subjektem a počtem různých výzkumných projektů, které ukázaly , že virus existuje jako latentní, nebo se neprojevující provirus, v množství populace chronicky infikovaných T - lymfocytických buněk. Přesnější detaily spojené s nukleárním a biochemickým mechanizmem odpovědným za údržbu viru, který se neprojevuje, nicméně na druhé

straně rozsah	článků	nemůže najít	detaily někde
j inde.
Mechanisms of	HIV	1 Latenc,	Bednařík, a
ostatní.. AIDS	6 : 3	- 16 ( 1992 )

V nedávné době se věřilo, že HIV byl latentní , nebo se neprojevoval ve všech zásobnících populace, nebo chronicky infikovaných buněk během klinické asymptomatické periody.

Sledováním nízké hladiny viraemia a replikace viru v peripherálních krevních buňkách vede k dojmu, že HIV onemocnění nebylo aktivní během klinické asymptomatické periody.

Tým vědců nicméně měl odhalit že, opravdový stav mikrobiologické latentní dávky neexistuje během HIV infekce.

Fauci A. S. , a ostatní., HIV Infection is Active and Progressive in Lymphoid Tissue During the Clinically Latent Stage of disease, Nátuře 362 : 355 - 358 ( 1993 )

Vědci určili dichotomii mezi hgladinou virového zatížení a replikace viru v peripherální krvi o proti lymphoidním orgánům během klinické latence.

Základem těchto zjištění proto bylo to, že vědci měli sledovat že :

peripherální krev není obsažena a neodráží se na aktuálním stavu nemoci HIV, zvláště v časném klinickém stadiu infekce HIV.

Skutečnost, že nemoc HIV je aktivní a progresivní dokonce když je malá evidence aktivity nemoci a přesně odměřené parametry viru v peripherální krvi, a pacient se cítí klinicky latentní.

Stav nemoci HIV nevyhnutelně postoupí z klinické latentní asymptomatické periody na expresivní a aktivní asymptotickou periodu.

Skrze užití několika různých modelů, studiem celulární cesty poškozené HIV aktivací z laboratorně latentní se virus začne odhalovat. Podle Butera, a ostatních., AIDS 6 : 994 ( 1992 ), mohou být celulární modely latentně indukovány a vyjádřeny HIV - 1 pod léčením cytokineze.

Bylo zjištěno, že stav mikrobiologické' latence, HIV - 1 očekává extracelulární stimulaci před iniciací replikace.

Tento signál nemůže být pouze zprostředkující ačkoli rozpustná cytokinetická interakce s tímto receptorem je také skrze receptor - receptorové interakce které se uskuteční během komunikace mezi buňkami, nebo buněčným stresem jako je UV záření, a tepelný šok.

Dále může být generován extrabuněčný signál v autokrinovém, nebo parakrinovém stavu tak, že aktivované buňky mohou rozšiřovat vlastní aktivací latentní vedlejší buňky.

Další faktory by měly být uváženy z dosavadních zkušeností z dosavadního stavu techniky, jestliže dojde k aktivaci viru HIV.

Jedna studie ukazuje, že 12 - 0 - tetradekanoyl phorbol - 13 - acetát ( TPA ) zprostředkuje snižování CD 4 regulace a výskyt viru v HIV infikovaných buňkách.

Hammato, a ostatní., Biochem, Biophvs. Res. Commun., 164 : 339 -344 ( 1989 ).

Zajímavé je, že Hamamoto také zkoušel účinnost potenciální protein kinázy C inhibitorů st aur o spor inu, H - 7, a UCN - 01 TPA zprostředkuje CD4 snižování regulace a rozšíření výskytu viru HIV.

U staurosporinu bylo objeveno, že je účinný TPA inhibitor pro oba tyto postupy.

Poškozená buněčná cesta zprostředkuje aktivační signál, z plazmové membrány, do integrovaného viru, výsledkem je vznik HIV - 1 , který je víceméně jasný.

Nedávno byly nalezeny sloučeniny, které mohou předcházet aktivaci latentního HIV , které byly uvedeny v National Cooperative Discovery Grant ( NCDDG ) / AIDS by Feorino, S.T. Butera, T.M. Folks, and R.F. Schinazi, November 3 -7 , 1991.

Zkoušky vyvinutého systému OM - 10.1 buněčné řady, jedinečného, chronicky · infikovaného promyleocytického klonu, se zbytkem CD4 + až do HIV - 1 aktivace s nádorovým nekrózovým faktorem

- a.

Výraz CD4+ v buněčném povrchu a účinnost reverzní transkriptázy byly použity k označení pro kvantitativní vyjádření viru.

Alternativně další HIV virové označení , jako je účinnost proteázy, která je známá odborníkům z dosavadního stavu techniky, může být také použita.

OM - 10.1 buňky zbytek CD41 až do aktivace viru, a odpovídá indukci nádorového nekrózového faktoru, a proto tyto kultury jsou používány jako konvenčně a rychle určitelné farmakologika pro schopnost prevence CD4+ snižování modulace ( snižování ve vyjádření CD4+ buněčního povrchu ) a HIV - 1 vyjádření.

Různé známé sloučeniny které mají antivirální vlastnosti, jejich akutně, nebo chronicky infikované buňky byly určeny pro jejich schopnost inhibovat HIV vyjádřením v těchto OM - 10.1 buňkách.

Několik sloučenin interaguje s chemickou cestou a může interferovat s reaktivačním procesem , který je také podroben zkoušce.

Výsledky vyhodnocení byly uvedeny v NCDDG / AIDS, San Diego, California, November 3 - 7 ( 1991 ). Mezi některými 48 sloučeninami byly vyhodnoceny 3 - fluoro - 3 - deoxythymidin ( FLT ) , interferon Y, a desferrioxamin ,byly uvedeny jako dobré inhibitory aktivace HIV - 1.

Reprezentativní sloučeninou vzorce I je 2,3 dihydro - 9 - methoxy - / 1 / benzothieno (2,3 f ) - 1,4 - thiazepin - 5 ( 4H ) - on, u kterého je uvedeno IC5Q na 0,21 μΜ inhibice v OM - 10.1 buňkách ( Tabulka I ) .

Tabulka 1

2.3 - Dihvdro - 9 - methoxv ( 1 ) benzothieno /

2.3	- f	/ -	1.4 thiazeoin	- 5 í	4H ) - on
				ECA	ICAM/ESEL OM-IO
X	*2	X	Y	dCso)	(ΙΟ_Λ or Irlnhib _{{ C( }} ® 30 μΜ) ⁵⁰
1	OMe	s	s	5.2	3.1/1.3 .21
2	H	s	0		42%/40% >30
4	OMe	NMe	0		14.7/14.2
5	H	S	NH		64%/47*
6	OMe	S	0		3.1/7.5
7	OMe	S-0	0		30%/30%
8	OMe	s	0 (2-methyl)		3.8/5.3

Sloučeniny . podle vynálezu také vykazují účinnost ve standartní zkoušce in vivo v míře jejich schopnosti inhibovat neutrofní přísun, a podle jejich využití pro léčení zánětlivých stavů.

První test se nazývá ¹¹ Reverse Passive Arthus Pleurisy Assay , male outbret Wistar rats ( 220

- 245 g Charles River Laboratories ) a probíhal po dobu od 16 do 18 hodin.

Rozpouštědlo (1:1, ethanol : solný roztok ) , nebo sloučenina podle vynálezu rozpuštěná v rozpouštědle byla podávána IV.

Zvířata byla lehce anesteziována etherem a bylo jim podáno IV injekce 2.5 mg volského albuminového séra ( BSA ) v solném roztoku. Betprostředně následovala IV injekce a byl vytvořen malý zářez mezi žebry, a 0.2 ml králičí IgG frakce anti - BSA ( 10 mg / ml v Dulbecco s solného fosfátového pufru ( PBS)) v PBS bylo injektováno do pohrudnicové dutiny za použití 20

- měrky orální dávkovou jehlou.

Zářez byl potom uzavřen 9 - mm svorkou z nerezavějící oceli, která se používá pro uzavření rány.

Po pěti hodinách byla zvířata usmrcena oxidem uhličitým, a dutina pohrudnice byla vypláchnuta 2 ml 0.325 % fenolového červeného roztoku v PBS. Výměškový tlumič byl odstraněn z pohrudnicové dutiny, pro analýzu.

Světlé krevní buňky ( > 90 % neutrofilu ) byly spočítány pomocí Kulterova počítače.

Objem pleurálního výměšku byl dělen pomocí barevné diluční metody, ( Carter G.V., et al., J. Pharm, Pharmacol, 34 : 66-67( 1982 )).

Skupiny léků byly vybrány podle léčebného rozpouštědla a statistického významu určené pomocí Studentského t - testu.

Poté, co sloučeniny z příkladu 1 byly vyhodnoceny pomocí výše uvedeného testu , byly nalezeny následující inhibice :

Dávka (mg/kg)

Proč. inh. Procento neutrofního influxu výměšku inhibice

0.3 40.5 18.6

1.0 28.4 8.9

3.3 282 15.9

V další zkoušce in vivo nazývané Thiogiykolátová indukce neutrofní influxní zkoušky u samic Balb/c plememe myší jsou vloženy po skupinách po sedmi s diethyletheru 1.0 ml 3 volným přístupem k jídlu a vodě za účelem sledování.

Zvířata jsou orálně dávkovány roztokem ( 0.5 % hydroxypropylmethylcelulózy s 0.2 % Twen 80 ), nebo sloučeninou podle vynálezu ,rozpuštěnou, nebo suspendovanou v rozpouštědle.

Jednu hodinu po orálním podání jsou myši anesteziovány, inhalací intraperitoneální injekcí thioglykolátového nosiče v solném roztoku.

Dvě hodiny po thioglykolátové injekci jsou zvířata utracena udušením oxidem uhličitým a injektována 6 ml Dulbecco s PBS obsahující 10 U / ml heparinu sodného a 0.1 % BSA.

Pohrudnicová dutina je masírována a zářez je utvořen do dutiny a tekutina je plněna do 15 ml trubiček.

Část je odstraněna z každého zvířete, a celkový počet buněk v každé části je počítán pomocí Coulter Counter ( Model ZBi, Coulter

Instruments, Hialeah, Florida ) .

je odstraněna pro mikroskopické Cytospin 2 ( Shandon INC.,

Pennsylvania ) a dále napouštěna

Druhá část použití, Pittsburgh, barvou ( modifikované Wright s barvivo )

Hematologický diferenciál je proveden určením procent neutrofilů, které mají extravazanci z peritoneální dutiny.

Poté sloučeniny z příkladu 1 byly vyhodnoceny v této zkoušce, a bylo dosaženo 26.1 % inhibice neutrofního influxu v 10 mg / kg, 31.9 % inhibice pro 30 mg / kg, a 34.3 % inhybice na 100 mg / kg.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být připraveny následujícími postupy .

Prvním obecným požadavkem jsou výchozí látky, které jsou použity pro výrobu, a kterými jsou 3 hydroxy, thiol, nebo amino - benzo ( b ) thiofen, benzofuran, nebo indol - 2 - karboxylátový ester vzorce 1 ( schéma 1).

- Hydroxy - benzo ( b ) thifen - 2 - estery jsou připraveny, jak vyplývá z dokumentu / Connor D.T. , et., al J, Med, Chem, 35 : 958 ( 1992 ) /

- Thio - benzo ( b ) thiofen - 2 karboxylátové estery jsou připravené pomocí analogů 3 - chloro derivátů.

/ Connor D.T. , et., al J, Med, Chem, 35 : 958 ( 1992 ) / s thioacetamidem v přítomnosti zásady jako je 1,8 - diaza - bicyklo / 5,4,0 / - undek - 7 - en ( DBU ) a roztokem, jako je N,N - dimethylformamid, nebo tetrahydrofuran.

- Amino - benzo ( b ) thiofen - 2 karboxylátové estery jsou připravené pomocí známé obecné metody / Beck J.R., J, Pro, Chem, 37 : 3224 ( 1972 ) /.

- Hydroxy - indol - 2 - karboxylátové estery jsou připraveny, jak vyplývá ze známé metody kterou je Unangst P.C., et., al., J. Heterocvclic Chem., 24 : 811 ( 1987 ) a Moyer M.P., et., al. , J.Orcr, Chem., 51: 5106 ( 1986 ) .

- Thioindol - 2 - karboxylát estery jsou připraveny známými metodami, kterými jsou Unangst P.C., et., al., J, Heterocvclic Chem., 24 : 811 ( 1987 ) a Aktinson J-.G., et., al, . Svnthesis 480 ( 1988 ) , a Nagarajan K., et al., Indián J. Chem.. 20 B : 672 ( 1981 ).

- Amino - indol - 2 - karboxylové estery jsou připravovány známými metodami jako je, Simakov S.V ., et al., Khim. -Farm. Zu. 17 : 1138 ( 1983 ) .

Konverze sloučeniny typu 1 na sloučeniny podle vynálezu je uvedeno ve schématu 1.

Estery jsou převedeny z a - halo substituovaného acetonitrilového derivátu jako je bromacetonitril, za přítomnosti zásady jako je draselný t - butoxid v tetrahydrofuranu, acetonitril, nebo dimethylsulfoxid, při 0- 80 ^eC a poskytuje estery typu Zj_

Nitrilová skupina je redukována na odpovídající primární amin, a následný meziprodukt Z je cyklizován laktamem £ ·

Výhodnou konverzí je hydrogenace Z katalyzátorem Raney kobaltem v roztoku jako je tetrahydrofuran, v přítomnosti zásady jako je triethylamin při zvýšené teplotě a tlaku.

Za těchto podmínek dostáváme 4. přímo z 2.·

Jestliže meziprodukt Z je izolován cyklizací 4 za přítomnosti zásady výhodně NaOMe v methanolu, nebo za kyselých podmínek, výhodně s polyfosforečnou kyselinou za zvýšené teploty.

Během syntézy některé sloučeniny podle vynálezu mohou být je li to potřebné, nebo požadované přeměněny reaktivní skupiny, jako je hydroxy, amino, nebo karboxy, na deriváty, které je budou chránit, od nechtěných uvedených reakcí, jestliže požadovaná reakce je nahrazena některou další molekulou.

Takovéto hydroxy, amino, a karboxyskupiny jsou ochotně odstranitelné konvenčními metodami. Společné použití chemických částic, které slouží k ochraně reaktivních skupin, jako je hydroxy, amino, a karboxy, a způsob pro jejich navázání a dalšího odstranění, jsou popsány v Greene a Wuts v Protective orouos in oroanics Svnthesis, , John Wiley and Sons, lne., New York, 1991.

Například 3 - amino, 3 - hydroxy, nebo 3 thioindol, benzothiofen, ( Sloučenina 1 ve schématu 1 ) mohou reagovat s β- halo ethylenaminem, kde aminoskupina je chráněna s vhodnou ochrannou skupinou ( PG ) jako je t buthoxykarbonyl, ( Boc ), nebo benzyloxykarbonyl, ( Cbz ) .

Reakce za stejných podmínek, které jsou popsány výše, poskytuje sloučeniny typu 5.

Deprotekce ( to jest odstranění PG ) z 5. za standartních podmínek, to jest trifluoroctová kyselina, nebo vodná kyselina pro odstranění BOC , nebo hydrogenolýza pro odstranění Cbz, poskytuje sloučeninu typu 2. , která dále bude cyklizována jak bude uvedeno později.

Dalším přístupem je reakce sloučeniny typu 1 s ethyleniminem, v alkoholickém rozpouštědle, přímo poskytuje 3. ( Nagarajan K., et al., Indián J,

Chem., 20 B : 672 ( 1981 ) .

Druhým obecným přístupem ( schéma 2 ) sloučenin typu 4 je z odpovídajícího 3 - halo derivátu 6. Reakce 6 s ethylendiaminem a oxidem mědnatým, v rozpouštědle jako je pyridin, za přítomnosti zásady jako je uhličitan draselný, poskytuje sloučeninu typu 1 , kde Y je NH ( Hiremath S.P., et al. , Proč. Nat, Acad. Sel., India , 60 : 367 (

1990 ).

Reakce 6 s krystalickým aminem v rozpouštědle jako je dimethylformamid za přítomnosti zásady jako je DBU , poskytuje sloučeninu typu 2., kde Y je S.

Reakce 6 s nitroethanolem v rozpouštědle jako je tetrahydrofuran, za- přítomnosti zásady jako je t butoxid draselný, nebo hydrid draselný, poskytuje sloučeninu typu 7.

Další redukcí nitroskupiny na amin vede ke sloučenině typu i , kde Y je 0.

V některých výše uvedených případech 2 nemůže být izolována , ale 1 může být obdržena přímo.

Třetím obecným přístupem ( schéma 3 ) je také použití 1 - halo derivátů

- Halo derivát je převeden s primárním aminem, který obsahuje vhodnou chráněnou amino, hydroxy, nebo thiolovou skupinu v β - pozici, tvořící amidovou skupinu, a poskytuje meziprodukt typu 1. Deprotekce a následná cyklizace vede ke sloučenině typu 4.

Tyto sloučeniny typu 4 , kde XjeSaYjeO nebo NR mohou být převedeny na odpovídající sulfoxid, a/nebo sulfon, 9. pomocí oxidačního činidla jako je m - chlorperbenzová kyselina ( m - CPBA ) , nebo oxaziridin při reakčních podmínkách určených rozsahem oxidace ( schéma 4 )

Pro tyto sloučeniny typu 4. , kde Y je S podobnou oxidací by mělo být dosaženo sulfoxidu, nebo sulfonu typu 10.

Podmínky, které jsou popsané ve schématu 1 skrze

4. jsou popsány rozdílně jsou známé, nebo mohou být snadno určeny z analogických reakcí známých odborníkovi z dosavadního stavu techniky.

t . ' *

-Μ -

COOMe

X = O, S, nr₇Y = O, S, NR_a

SCHÉMAT

Base or acid ⁺ (if required)

R.

SCHEtlR 4

NHPC

R_g

COOMe

H

N

ΖΔ

Deprotect

NaOMe/MeOH ior PPA

NaOMe/MeOH ” or PPA

Z = Br, Cl

COOMe

Rx

Y?G = Br, Cl R’ = OH, OMe,Cl

YH

Base

Následující příklady jsou pouze ilustrativní příklady přípravy sloučenin podle tohoto vynálezu.

Přiklad 1

2.3 - Dihvdro - 9 - methoxv ( 1 ) benzothleno /

2.3 - f / - 1.4 thiazeoln - 5 ( 4H ) - on

Do roztoku, který má pokojovou teplotu 3 - chloro - 5 - methoxy - benzo ( b ) thiofen - 2 karboxylát ( 500 mg , 1.95 mmol ) / připraveného pomocí reakce známého 3 - chloro - 5 - methoxy benzo ( b ) thiofen - 2 - karbonylchlor idu s methanolem - / J, Med, Chem, , 3 5 : 958 ( 1992 ) // ve 20 ml DMF je přidán cysteamin - HCL ( 885 mg , 7,79 mmol ) , a následně DBU ( 2,33 ml , 15,58 mmol ).

Reakční směs je míchána při pokojové teplotě po dobu 1,5 hodiny, potom je zahřáta na 70 °C.

Směs je rozpuštěna v ethylacetátu, a promyta vodným HCl, vodou a solanlou.

Organická vrstva je sušena nad MgSO4 , filtována, a koncentrována ve vakuu.

ΑΊ

Hrubý produkt je rekrystalizován z hexanu , a ethylacetátu, a poskytuje

2,3 - Dihydro - 9 - methoxy ( 1 ) benzothieno /

2.3 - f / - 1,4 thiazepin - 5 ( 4H ) - on 74 % výtěžek., teplota tání 209 - 209,5 °C.

pfíklad.,,,2.

2.3 - Dihydro - ( 1 ) benzothieno / 2,3 - f / 1.4 oxazeoin - 5 ( 4H ) - on

Směs methylesteru 3 - ( kyanomethoxy ) - benzo ( b ) thiofen - 2 - karboxylové kyseliny ( 405 mg , 1.64 mmol ) - / J, Hetero. Chem., 12 : 1037 ( 1975) / 0,5ml Et₃N a 0,50 g RaCo v 50 ml THF je zahříváno na 100 °C , pod 12 00 psi vodíkem. Reakční směs je končentována ve vakuu.

Eluční kolonová chromatografie s gradientem 1:1 hexan : ethylacetát k celkovému ethylacetátu poskytuje

2.3 - Dihydro - ( 1 ) benzothieno /'2,3 - f / 1.4 oxazepin - 5 ( 4H ) - on v % výtěžku., teplota tání 244 - 245 °C.

PiíkiacLJI

2.3 - Dihvdro - 9 - methoxv ( 1 ) benzothieno Z

2.3 - f / - 1.4 thiazepin - 5 ( 4H ) - on - 1 oxid

Směs 2,3 - Dihydro - 9 - methoxy ( 1 ) benzothieno /2,3 - f / - 1,4 thiazepin - 5 ( 4H ) - on ( 200 mg ,. 0,75 mmol ) a NaBC>3 - 4 H2O ( 116 mg, 0,75 mmol ) v 18 ml Ac OH je mícháno při pokojové teplotě přesnoc.

Reakční směs je zfiltrována, a 6 0 ml vody je přidáno do filtrátu.

Filtrát poskytuje 2,3 - Dihydro - 9 - methoxy ( 1 ) benzothieno /2,3 - f / - 1,4 thiazepin - 5 (

4H ) - on - 1 - oxidu o výtěžku 69 % a teplota tání je

244 - 245 °C.

Příklad 4

3,4- Dihvdro - 9 - methoxv - 6 - methyl - 2H 1^.4 - oxazepino /6,7 - b / - indol - 5 ( 6H ) on

Aj_Methyl 3 - (kvanomethoxv) - 5 - methoxv 1 - methvl - 1H - indol - 2 - karboxvlát

Suspenze draselného terč - hutoxidu ( 3.2 g ,29 mmol ) v 60 ml dimethylsulfoxydu je zpracováno po částech s methyl 3 - hydroxy - 5 - methoxy - 1 methyl - 1H - indol - 2 - karboxylátem ( 5.6 g , 24 mmol., Unangst P.C., et al. , - / GL.

Heterocvclic. Chem., 24 : 811( 1987) / /.

Směs je míchána po dobu 15 minut, a potom je přidán chloracetonitril ( 4.8 ml , 5.7 g , 76 mmol ) po kapkách.

Směs je zahřáta na 80 °C po dobu 9 0 minut, chlazena , a je přidáno 800 g ledu a vody.

Pevný precipitát je zfiltrován, promyt 10 % methanolem ve vodě,· a rekrystalizován z vodného acetonitrilu a dává 3.9 g ( 60 % ) produktu., teplota tání je 136 - 137 °G.

B. Směs methyl 3 - kyanomethoxy - 5 - methoxy - 1 - methyl - 1H - indol - 2 - karboxylát ( 0.60 g , 2.2 mmol ) a triethylaminu ( 0.40 ml, 0.29 g, 2.9 mmol ) ve 35 ml v tetrahydrofuranu v tlakové reakční nádobě je zpracována s Raney kobaltovým katalyzátorem, ( 0.40 g ).

Reaktor je natlakován s vodíkem ( 590 psi ) a zahříván na 80 °C po dobu 10 hodin.

Zchlazená reakční směs je filtrována a filtrát odpařen.

Olejový zbytek je rozpuštěn v 50 ml methanolu, a methoxyd sodný ( 0.8 g, 15 mmol ) je přidán do roztoku .

Směs je zahřívána při refluxu po dobu tří hodin, potom je ochlazena a odpařena. Zbytek je rozdělen mezi 75 ml ethylacetátu a 150 ml solanky.

Vodná vrstva je několikrát extrahována s čerstvým ethylacetátem.

Sloučené organické vrstvy jsou promyty solankou, sušeny, ( bezvodý sulfát sodný ) a odpařeny.

Zbytek hrubého produktu je čištěn mžikovou chromatografií ( silikagel, 5 % methanol, v elučním dichlormethanu a poskytuje výtěžek 0.18 g ( 33 % ) produktu.

Vzorek rekystalizuje z ethylacetát hexanu a má teplotu tání 184 - 186 °C.

Příklad 5
2.3 - Dihvdro - 1H	-benzothieno	/3.2 - e / - 1,4
diazeoin - 5 - on
Methvlesterhvdrochlorid 3 - ( 2	- Aminoethvlamino
) - benzo ( b	) thiofen -	2 - karboxvlové
kvselinv
Roztok 2 - ( 4,5 -	dihydro - 1H	- imidazol- 2 -
yl ) benzenthiol (	1.00 g, 5.62	mmol ) / Justus
Liebics Ann. Chem	. 11 : 1994	( 1975 ) / a

chlormethylacetát( 610 mg, 5.62 mmol, ) v 15 ml methanolu je zahříváno pod. zpětným chladičem po dobu 90 minut.

Reakční směs je ochlazena na pokopjovou teplotu a zfiltrována.

Filtrát je koncentrován a sušen a zbytek je rozpuštěn v horkém chloroformu.

Po několika hodinách je výsledný precipitát ochlazen a. sušen.

Matečný louh poskytuje následující výtěžek krystalů methylesterhydrochloridu 3 - ( 2 Aminoethylamino ) - benzo ( b ) thiofen - 2 karboxylové kyseliny o celkovém výtěžku 61 % , teplota tání 219 - 220 °C.

2,3 - Dihvdro · 1H -benzothieno /3,2 - e / - 1,4 diazepin - 5 - on

Roztok methylester hydrochloridu 3 - ( 2 Aminoethylamino ) - benzo ( b ) thiofen - 2 karboxylové kyseliny ( 339 mg, 1.18 mmol ) a čerstvě připravený methoxyd sodný, ( od 134 mg,

2.4 8 mmol, sodíku ) v 5 ml methanolu je zahříván pod zpětným chladičem po dobu 18 hodin.

Po zchlazení je reakčni směs neutralizována cs 25 ml IN HCl a chlazena na 0 °C po dobu lhodiny . Výsledný žlutý krystalický materiál je filtrován a sušen ve vakuu při teplotě 6 0 °C po několik hodin a poskytl 2,3 - dihydro - 1H -benzothieno /3,2 - e / - 1,4 diazepin - 5 - on v 64 % výtěžku.

Eluční chromatografií s gradientem 2% methanolu v ethylacetátu poskytuje anyliticky čistý 2,3 dihydro - 1H - benzothieno /3,2 - e / - 1,4 diazepin -.5 - on , s teplotou tání 210 - 212 °C.

Příklad 6

2.-3, - Dihvdro - 9 - methoxv - 1H - benzothieno /

2,-3 - f / - 1.4 oxazepin - 5 - on

Methvlester hvdrochlorid 3 - kvanomethoxv - 5 methoxv - benzo ( b ) thiofen - 2 - karboxylové kvselinv

Do roztoku, který má pokojovou teplotu 3 hydroxy - 5 - methoxy - benzo ( b ) thiofen - 2 karboxylát ( 1.00 g , 4.2 mmol ) / Connor , et al J, Med, Chem., 35 : 959 ( 1992 ) // ve 20 ml DMSO je přidán t - butoxyd draselný ( 494 mg , 4,41 mmol ) , a následně bromacetonitril ( 87 8 μΐ,

12.58 mmol ).

Směs je míchána při pokojové teplotě po dobu 1.5 hodiny a čištěna v ethylacetátu a IN HCl. Organická vrstva je promyta s IN HCl a následně s několika částmi solanky a sušena na MgSO4. Následnou filtrací zbytku roztoku ve vakuu a rekrystalizací zbytku z ethylacetátu : hexanu dostaneme 4123 mg.

Adiční výtěžek 112 mg může být obdržen z matečného louhu , s teplotou tání 159.5 - 160 °C.

2.3 - Dihvdro · 9 - methoxv - 1H - benzothieno /

2.3 - f / - 1.4 oxazepin. - 5 ...on

Roztok methylester kyseliny 3 - kyanomethoxy - .5 methoxy - benzo ( b ) thiofen - 2 karboxylové ( 2.5 g, 9.0 mmol) v 50 ml THF je zahříván pod silným refluxem.

Boran - dimethyl sulfid ( 9.0 ml, 90.2 mmol ) je rychle přidán a nepřetržitě zahříván po dobu 25 minut s THF a dále byl přidán po odpaření.

Množství přidaného boran - dimethylsulfidu bylo ( 4.0 ml ) bylo přidáno a průběžně mícháno po dobu 10 minut.

Reakční směs byla ochlazena na 0 °C a 50 ml 6N HCl bylo opatrně přidáno.

Vodíkový plyn je uvolněn a teplota reakční směsi roste. Výsledný precipitát je zchlazen filrací, promyt vodou, a sušen ve vakuu přes noc.

Pevná látka ( 2.3 g, 8.2 mmol ) je přidána do čerstvě přidaného roztoku methoxydu sodného, ( od 1.9 g , 82.0 mmol sodíku ve 40 ml methanolu. Reakční směs je zahřáta na 50 °C po dobu 2 hodin a potom zahřívána pod zpětným cladičem po dobu 2 hodin. Po ochlazení na pokojovou teplotu je precipitát zachycen a promyt v chladném methnolu, a následně v chladném diethyletheru.

Pevný vzorek je sušen ve vakuu přes noc a výtěžek je 1.18 g ( 52 % )

Analytický vzorek 2,3 - Dihydro - 9 - methoxy 1H - benzothieno /2,3 - f / - 1,4 oxazepin - 5

- onu, je obdržen rekrystalizací z ethylacetátu : hexanu , teplota tání 264 - 265 °C.

Příklad 7

2,3 - Dihvdro - 9 - methoxv - 6 - oxid - 1H benzothieno /2,3 - f / - 1,4 oxazepin - 5 -on

K suspenzi 2,3 - dihydro - 9 - methoxy - 1H benzothieno /2,3 - f / - 1,4 oxazepin - 5 - onu ( 1.00 g, 4 mmol ) ve 100 ml vařícího methanolu je přidáno 3 0 % peroxidu vodíku, ( 8.0 ml, 80 mmol ) následně dioxid selenu ( 445 mg, 4.01 mmol ) ·

Reakční směs je míchána při pokojové teplotě po dobu 3 hodin, a potom zahřáta na 30 °C po dobu

1.5 hodiny, a s následným zahříváním na 40 °C po dobu 2 hodin.

Reakční směs je ochlazena na - 40 °C a výsledný precipitát je oddělen filtrací.

Zbytek je chromatografován pomocí eluční chromatografie původně s 5 % methanolu, v ethylacetátu, s postuzpným zvyšováním polarity roztoku, až k 1 : 1 methanol : ethylacetát a dává 338 mg produktu.

Analytický vzorek 2,3 - Dihydro - 9 - methoxy - 6 - oxid - 1H - benzothieno /2,3 - f / - 1,4 oxazepin - 5 - onu je obdržen rekrystalizací z methanolu : ethylacetátu, teplota tání 273 - 274 °C.

Příklad 8

2,3 - Dihvdro methoxy methyl - 1H

benzothieno	/ 2.3 -	f /	- 1.4 oxazeoin - 5 - on
Methvlester	3 -	( 1	kvanoethoxv ) - 5 -
methoxv -	bengo , (	b )	thiofen - 2 - karboxvlové

kvselinv

Do roztoku, který má pokojovou teplotu 3 hydroxy - 5 - methoxybenzo ( b ) thiofen - 2 karboxylát ( 1.00 g , 4.2 mmol ) / Connor , et al J, Med, Chem., 35 : 958 ( 1992 ) // ve 20 ml DMSO je přidán t - butoxyd draselný ( 494 mg , 4,41 mmol ) , a následně 2 ( 1.lml, 12.6 mmol ), chlorpropionnitrylnitril

Směs je míchána při pokojové teplotě po dobu 1.5 hodiny a potom ohřátá na 82 °C po dobu 3 hodin. Reakční směs je čištěna v ethylacetátu a IN HCl.

Organická vrstva je promyta s IN HCl a následně s několika částmi solanky a sušena na MgS04. Následnou filtrací zbytku roztoku ve vakuu a rekrystalizací zbytku z ethylacetátu : hexanu dostaneme 853 mg. s teplotou tání 127 - 129 °C.

2,3 - Dihvdro - 9 - methoxy - 2 - methyl - 1H benzothieno /2.3 - £ / - 1.4 oxazepin - 5 - on

Roztok methylester kyseliny 3 - ( 1 kyanoethoxy - 5 - methoxybenzo ( b ) thiofen - 2 - karboxylové ( 400 mg , 1.37 mmol) v lOml THF je zahříván pod silným refluxem.

Boran - dimethyl sulfid ( 1.4 ml, 13.7 mmol ) je přidán po kapkách a nepřetržitě zahříván po dobu 20 minut s THF a dále byl přidán po odpaření. Reakční směs byla ochlazena na pokojovou teplotu a 7.5 ml 6N HCl bylo opatrně přidáno.

Po 5 minutách byla reakční směs ochlazena na 0 °C a 65.8 ml IN NaOH bylo přidáno s následným přidáním ethylacetátu.

Vrstvy jsou odděleny a organická fáze je promyta s 1:1 solanka : voda.

Organická fáze je sušena nad MgSC>4, filtrována, a koncentrována ve vakuu.

Zbytek je chromatografován pomocí eluční chromatografie s gradientem 5 : 25 : 70 methanol : hexan : chloroform až do 10 : 90 methanol : chloroform až do 30 : 70 methanol : chloroform a poskytuje 135 mg produktu.

Analytický vzorek 2,3 - Dihydro - 9 - methoxy 2 - methyl - 1H - benzothieno / 2,3 - f / - 1,4 oxazepin - 5 - onu je obdržen rekrystalizací z ethylacetát : hexan , teplota tání 185 - 186 °C.

Sloučeniny podle vynálezu jsou ochtně formulovány s běžnými rozpouštědly, a nosiči proběžné orální , nebo parenterální podávání, člověku a živočichům pro léčení nemocí, jako jsou záněty, zvláště artritida a podobné.

Následující příklady ilustrují přípravu tapických farmaceutických formulací.

Příprava 250 mg kapsle

2,3 - Dihydro - 9 - isopropoxy - 7 - chloro - 1H benzothieno /2,3 - f / - 1,4 oxazepin - 5 on ( 250. mg ) je jednotně mícháno se 150 mg laktózy, a 150 mg kukuřičného škrobu.

Směs byla plněna do želatinových kapslí.

Takovéto kapsle jsou orálně podávány v poměru jedna až tři denně pro léčení artritidy.

Příklad IQ.

Formulace pro orální suspenzi

PHsady	Množství
2,3-Dihydro-8-ethyl- 10-trifIuoro	500 mg
methyl-6-oxid- lH-benzothieno-
/2,3-f/-1,4-oxazepin-5-on
Roztok sorbitolu ( 70 % NP)	40mI
Benzoát sodný	150 mg
Sacharin	10 mg
Višňové aroma	50 mg
Destilovaná voda	100 ml

Roztok sorbitolu je přidán do 40 ml destilované vody, a oxazepinon je v něm suspenzován.

Sacharin, benzoát sodný, a aromatické látky jsou přidány a rozpuštěny.

Roztok je doplněn do 100 ml destilované vody. Každý ml syrupu obsahuje 5 mg oxazepinonu.

Orální formulace ideálně vyhovuje pro léčení zánětů při pediatrickém ošetřování.

Příklad 11

Příprava parentenálního roztoku

V roztoku 700 ml propylenglykolu a 200 ml destilované vody, pro injekci je rozpuštěno 20.0 g 2,3 - dihydro - 7 - dimethylamino - IH benzothieno / 3,2- e/ - 1,4 diazepin - 5 - onu ., pHroztoku je upraveno do 5.5 chlorovodíkovou kyselinou a objem je doplněn do 1000 ml destilovanou vodou.

Formulace je sterilizována , plněna do 5 ml ampulí , každá obsahuje 2.0 ml ( 40 mg aktivního diazepinonu )

Formulace je podávána intravenózně pacientům, kteří trpí zánětlivými nemocemi, nebo AIDS.

Příklad 12

Příprava topického krému

Pět tisíc mg 2,3 - dihydro - 7 - ethoxy benzofurano - /2,3 f / - 1,4 oxazepin - 5 onu je smíseno s 15 g acetylalkoholu, 1 g laurylsulfátu sodného, 40 g vodného silikonu D.C. 200 ( sold by Dow Corning Co. , Midland, Michigan ), 43 g sterilované vody, 0.25 g methylparabenu, a 0,15 g propylparabenu.

Směs je zahřáta na asi 7 5 °C za konstantního míchání, a potom ochlazena na pokojovou teplotu při které tuhne.

Přípravek je aplikován na povrch kůže osobám trpícím záněty.

Claims

Patentové nároky nebo její farmaceuticky přijatelné adiční soli kyselin, kde: R]_, R2, R3, a R4 jsou každý nezávisle vodík, hydroxy, halogen, nižší alkyl, nižší alkoxy, benzyloxy, trifluoromethyl, nitro, nebo - NRgRg, kde Rg a R9 j sou každý nezávisle vodík, nebo nižší alkyl., R5 a Rg jsou každý nezávisle vodík, nižší alkyl, nebo fenyl,., X je O, S ( 0 ) n nebo NR7 Y je O, S ( 0 ) n nebo NRg í?7 j© vodík, nižší alkyl, fenyl, benzyl, substituovaný halogenem., Rg je vodík, nižší alkyl, nebo fenyl,., n je 0, 1, nebo 2., s podmínkou že :

1) jestliže X je NH, Y je NH, R_x je H,. R₃ je H, «

a R4 je Br, R₃ není methyl

2) jestliže X je NH, Y je NH, Ri je H, R₃ je H, a R4 je H, R₃ není methoxy, nebo ethoxy, a

3) jestliže X je NH, Y je S, a alespoň jeden z

Rl , R₃ ,R₃ , a R4, není H.

2. Sloučenina podle nároku 1, kde R]_ , R₃ , a

R4 jsou vodík.

3. Sloučenina podle nároku 2, kde R₃ je vodík, nebo nižší alkoxy, X je O, S ( O ) _n nebo NR7

YjeO, S (O) _n, R7 je vodík, nebo nižší alkyl, a n je 0, 1, nebo 2

4. Sloučenina podle nároku 3, kterou je

2,3 - Dihydro - 9 - methoxy ( 1 ) benzothieno / <

2,3 - f / - 1,4 thiazepin - 5 ( 4H ) - on

5. Sloučenina podle nároku 3, kterou je

2.3 - Dihydro - ( 1 ) benzothieno / 2,3 - f / 1.4 oxazepin - 5 ( 4H ) - on

6. Sloučenina podle nároku 3, kterou je

2,3 - Dihydro - 9 - methoxy ( 1 ) benzothieno /

2.3 - f / - 1,4 thiazepin - 5 ( 4H ) - on - 1 oxid

7. Sloučenina podle nároku 3, kterou je

3,4- Dihydro - 9 - methoxy - 6 - methyl - 2H 1.4 - oxazepino /6,7 - b / - indol - 5 ( 6H ) on

8. Sloučenina podle nároku 3, kterou je

2,3 - Dihydro - 1H -benzothieno /3,2 - e / - 1,4 diazepin - 5 - on

9. Sloučenina podle nároku 3, kterou je

2,3 - Dihydro - 9 - methoxy - 1H - benzothieno /

2,3 - f / - 1,4 oxazepin - 5 - on

10. Sloučenina podle nároku 3, kterou je

2,3 - Dihydro - 9 - methoxy - 6 - oxid - 1H benzothieno /2,3 - f / - 1,4 oxazepin - 5 - on