KR100325881B1 - Ｈｉｖ 억제제로서의 벤조티오펜, 벤조푸란 및 인돌티아제피논, 옥사제피논 및 디아제피논 - Google Patents

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로즈 암스트롱, 크리스틴 에이. 트러트웨인
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Abstract

백혈구의 혈관 내피에 대한 부착을 억제하는 화합물로서 염증성 질병의 효과적인 치료제인 하기 화학식 1의 벤조티오펜, 벤조푸란 및 인돌 티아제피논, 옥사제피논 및 디아제피논 및 이들의 제조 방법이 기술된다. 이들 화합물은 또한 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)의 활성화를 억제한다.

Description

ＨＩＶ 억제제로서의 벤조티오펜, 벤조푸란 및 인돌 티아제피논, 옥사제피논 및 디아제피논 {Benzothiophene, Benzofuran and Indolethiazepinones, Oxazepinones and Diazepinones as Inhibitors of HIV}
본 발명은 백혈구의 내피세포 부착을 억제하기 위하여 사용되는 신규 벤조티오펜, 벤조푸란 및 인돌 티아제피논, 옥사제피논 및 디아제피논 및 제약학상 허용되는 그의 염에 관한 것이다. 혈관 내피세포에 대한 백혈구의 부착은 염증 발병에 필수적이다. 부착에 이어서 백혈구가 내피세포를 통과하여 주위 조직에 이동하고, 그 결과 조직에 손상을 일으킨다. 이러한 초기 부착 작용을 차단할 수 있는 화합물은 염증성 질병, 예를 들면 류마티스성 관절염, 골관절염, 천식 및 건선의 치료에 효능을 가질 것으로 기대된다. 기타 다른 질환, 예를 들면 성인 호흡 장해 증후군, 재관류 손상, 허혈, 궤양성 대장염, 맥관염군, 아테롬성 동맥경화증, 염증성 장 질환 및 종양 전이 (이에 제한되지 않음)에 대해서도 효능을 가질 것이다.
부착 수용체는 3개의 주요 군 - 셀렉틴, 면역 글로불린 수퍼군 및 인테그린으로 구성된다 (Nature, 346:426 (1990)). 이 3군의 모든 구성원은 염증 발병시의 백혈구의 부착을 매개하는데 관련있다 (이에 대해서는 문헌 [Thrombosis andHemostasis, 65(3); 223 (1991), Clinical and Experimental Allergy, 20:619 (1990), Transplantation, 48:727 (1989), Biochemical Pharm., 40(8):1683 (1990)] 참조). 내피세포의 백혈구 부착 분자-1 (ELAM-1 또는 E-셀렉틴)은 세포-세포 부착을 촉진시키는 당단백질의 셀렉틴군의 구성원이다. E-셀렉틴은 시토킨, 예를 들면 인터루킨-1 (IL-1) 또는 종양 괴사 인자 α (TNF-α) 또는 기타 염증 매개체, 예를 들면 리포폴리사카라이드 (LPS)로 내피세포를 자극한 지 4시간 후에 내피세포의 표면 상에서 최대로 발현된다고 보고되었다 (Pro. Nat. Acad. Sci., 84:9238 (1987)).
세포간 부착 분자-1 (ICAM-1)은 면역 글로불린 수퍼군의 구성원이다. 이것도 역시 자극된지 12 내지 24시간 후에 최대로 발현하도록 상향 조절 (upregulation)된다. 내피세포가 염증 매개체로 자극된 지 4시간 후에 E-셀레틴 및 ICAM-1 모두가 세포 표면 상에 존재하는 것이 밝혀졌다 (J. Clin. Invest., 82:1746 (1988) 및 J. Immun., 137:1893 (1986), Blood, 78:2721 (1991) 참조).
본 발명의 벤조티오펜, 벤조푸란 및 인돌 티아제피논, 옥사제피논 및 디아제피논은 시험관내 분석에서 호중구가 TNFα로 자극된 인간 제대 정맥 내피세포 (HUVECS)에 부착하는 것을 억제함이 밝혀졌다.
또한, 본 발명은 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)에 감염된 인체에 잠복하고 있는 HIV의 활성화를 억제함으로써 HIV 감염 인간을 치료하기 위한 신규 티아제피논, 옥사제피논 및 디아제피논에 관한 것이다.
인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)의 병인론은 복잡하여 아직까지 완전하게 이해되지 않고 있다. 바이러스의 라이프 사이클은 이론상으로 구심성 부분 및 원심성 부분으로 나뉘어져 왔다. 바이러스 부착, 융합, 역전사 및 통합은 라이프 사이클의 구심성 부분을 포함하는 사건에 해당한다. 개체에게 HIV를 1차 감염시켜 일반적으로 임상 증상과 함께 또는 임상 증상 없이 바이러스혈증을 발생시키는 원인이 되는 것은 HIV 라이프 사이클의 구심성 부분이다.
구심성 사건 동안에 개입하는 것을 표적으로 하는 많은 치료 방법이 개발되어 왔다. 예를 들면 Mitsuya H, Broder S, 'Inhibition of the In Vitro Infectivity and Cytopathic Effect on Human T-lymphotropic Virus Type III/lymphadenopathy Virus-associated Virus (HTLV-III/LAV) by 2',3'-Dideoxynucleosides,' Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 83:1911-1915 (1986) 참조.
구심성 부분의 여러 단계가 효과적인 치료적 개입 (intervention)의 잠재적인 가능성을 제공하지만, 현 시점에서 개입만으로는 불충분하다는 것이 점점 더 명백해지고 있다. HIV에 감염되어 질병이 구심성 단계를 통하여 진행된 후, 개체는 수년 동안 연장될 수 있는 연장된 임상적 잠복기를 경험하고, 양호한 건강 상태를 유지한다. 이 시점에서는 말초 혈액 세포에서의 바이러스혈증 및 바이러스 복제의 수준이 낮거나 또는 존재하지 않게 된다. 그러나, 시간이 더 흐른 후에는 질병은 결국 치료책이 없는 생명을 위협하는 면역 억제 (AIDS)로 진행한다. 이러한 후기 사건은 HIV 감염의 원심성 단계의 임상적 증거이다.
HIV 라이프 사이클의 원심성 부분은 HIV 프로바이러스가 성공적으로 전사,번역하고 어셈블링하여 바이러스 입자를 생성하는데 필요한 사건을 포함한다. HIV 감염 세포가 무증상의 비HIV 발현 단계에서 증상을 나타내는 HIV 발현 단계로 진행하는데 필요한 사건의 개시를 활성화라 부른다. 현재, 원심성 부분 및 활성화를 위한 세포 수준의 기초는 완전하게 이해되지 않고 있다. 그럼에도 불구하고, AIDS로의 진행에 저항하는 임상적으로 증상을 나타내지 않는 단계 동안의 신규 치료제 및 전략이 개발되고 수행된다면, 감염되었지만 임상적으로 잠복기 상태인 100만명으로 추정되는 사람들에게 어느 정도 희망을 줄 수 있을 것이다.
따라서, 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물 또는 그의 제약학상 허용되는 산 부가염이다:
상기 식 중,
R1, R2, R3및 R4는 각각 독립적으로 수소, 히드록시, 할로겐, 저급 알킬, 저급 알콕시, 벤질옥시, 트리플루오로메틸, 니트로, 또는 -NR8R9(여기서, R8및 R9는 각각 독립적으로 수소 또는 저급 알킬임)이고;
R5및 R6은 각각 독립적으로 수소, 저급 알킬 또는 페닐이고;
X는 O, S(O)n또는 NR7이고;
Y는 O, S(O)n또는 NR8이고;
R7은 수소, 저급 알킬, 페닐, 벤질, CH2OR8또는 할로 치환된 저급 알킬, 페닐, 벤질이고;
R8은 수소, 저급 알킬 또는 페닐이고;
n은 0, 1 또는 2의 정수이되;
다만, 1) X가 NH이고, Y가 NH이고, R1이 H이고, R3이 H이고, R4가 Br이면, R2는 메틸이 아니고; 2) X가 NH이고, Y가 NH이고, R1, R3및 R4가 H이면, R2는 메톡시 또는 에톡시가 아니고; 3) X가 NH이고, Y가 S이면, R1, R2, R3및 R4중 적어도 1개는 H가 아니다.
본 발명은 치료 유효량의 상기 화학식 1의 화합물 및 제약학상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 포함한다.
본 발명의 제3 특징은 치료할 필요가 있는 숙주에게 상기 화학식 1의 화합물을 포함하는 제약 조성물을 단위 투여 형태로 투여하는 것으로 이루어지는, 백혈구의 내피세포에 대한 부착을 억제함으로써 매개되는 질병의 치료 방법이다.
바람직한 실시 태양은 화학식 1의 화합물의 항염증량을 투여하는 것으로 이루어지는 인간의 염증성 질병의 치료 방법이다.
본 발명의 제4 특징은 HIV에 감염된 숙주에게 상기 화학식 1의 화합물을 포함하는 제약 조성물을 단위 투여 형태로 투여하는 것으로 이루어지는 HIV에 감염된 숙주의 치료 방법이다.
본 발명의 화학식 1의 화합물의 정의에 사용된 용어는 다음과 같이 정의된다:
저급 알킬 및 저급 알콕시는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬 또는 알콕시기를 의미하고, 메틸, 에틸, 프로필, i-프로필 또는 (메틸)에틸, 및 t-부틸 또는 1,1-(디메틸)-에틸, 및 이에 대응하여 예를 들면, 메톡시, 에톡시, i-프로폭시, 또는 1-(메틸)에톡시 등을 예로 들 수 있다.
할로겐은 불소, 염소, 브롬 또는 요오드이다.
화학식 1의 화합물은 또한 제약학상 허용되는 산 부가염을 형성할 수 있다. 이러한 형태는 모두 본 발명의 범위 내에 있다.
화학식 1의 화합물의 제약학상 허용되는 산 부가염은 예를 들면 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 플루오르화수소산, 아인산 등과 같은 무기산에서 유래한 염, 및 지방족 모노- 및 디카르복실산, 페닐 치환 알칸산, 히드록시 알칸산, 알칸디산, 방향족산, 지방족 및 방향족 술폰산 등과 같은 비독성 유기산에서 유래한 염을 포함한다. 따라서, 이러한 염은 술페이트, 피로술페이트, 비술페이트, 술파이트, 비술파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노히드로겐포스페이트, 디히드로겐포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 프로피오네이트, 카프릴레이트, 이소부티레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 숙시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말레에이트, 만델레이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로벤조에이트, 프탈레이트, 벤젠술포네이트, 톨루엔술포네이트, 페닐아세테이트, 시트레이트, 락테이트, 말레에이트, 타르트레이트, 메탄술포네이트 등을 포함한다. 또한, 아미노산염 예를 들면 아르기네이트 등 및 글루코네이트, 갈락투로네이트, N-메틸 글루타민도 생각될 수 있다 (예를 들면, Berge S.M. 등, 'Pharmaceutical Salts,' Journal of Pharmaceutical Science, 66:1-19 (1977) 참조).
상기 염기성 화합물의 산 부가염은 통상적인 방법으로 유리 염기 형태를 충분량의 목적산과 접촉시켜 염을 생성시킴으로써 제조된다. 유리 염기 형태는 통상적인 방법으로 염 형태를 염기와 접촉시키고 유기 염기를 단리시킴으로써 재생성시킬 수 있다. 유리 염기 형태는 이들 각각의 염 형태와 특정 물리적 특성, 예를 들면 극성 용매 중에서의 용해도에서 다소 상이하지만, 이들 염은 본 발명의 목적을 위해서는 이들 각각의 유리 염기와 동등하다.
본 발명 화합물 중 어떤 것은 수화물 형태를 비롯한 용매화물 형태 뿐만 아니라 비용매화물 형태로도 존재할 수 있다. 일반적으로, 수화물 형태를 비롯하여 용매화물 형태는 비용매화물 형태와 동등하고, 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.
본 발명의 바람직한 실시 태양은 R1, R3및 R4가 수소이고, R2가 상기 정의된 바와 같은 화학식 1의 화합물이다.
본 발명의 더욱 바람직한 실시 태양은 R1, R3및 R4가 수소이고, R2가 수소 또는 저급 알콕시이고, X가 O, S(O)n또는 NR7이고, Y가 O 또는 S(O)n이고, R7이 수소 또는 저급 알킬이고, n이 0, 1 또는 2인 화학식 1의 화합물이다.
특히 가치있는 화합물은 다음과 같다:
2,3-디히드로-9-메톡시-[1]벤조티에노[2,3-f]-1,4-티아제핀-5(4H)-온, 2,3-디히드로-[1]벤조티에노[2,3-f]-1,4-옥사제핀-5(4H)-온, 2,3-디히드로-9-메톡시-[1]벤조티에노[2,3-f]-1,4-티아제핀-5(4H)-온-1-옥사이드, 3,4-디히드로-9-메톡시-6-메틸-2H-1,4-옥사제피노[6,7-b]-인돌-5-(6H)-온, 2,3-디히드로-1H-벤조티에노-[3,2-e]-1,4-디아제핀-5-온, 2,3-디히드로-9-메톡시-1H-벤조티에노-[2,3-f]-1,4-옥사제핀-5-온, 2,3-디히드로-9-메톡시-6-옥사이드-1H-벤조티에노-[2,3-f]옥사제핀-5-온, 2,3-디히드로-9-메톡시-2-메틸-1H-벤조티에노-[2,3-f]-1,4-옥사제핀-5-온, 2,3-디히드로-7,8,9,10-테트라클로로-1H-벤조티에노[2,3-f]-1,4-옥사제핀-5-온, 3,4-디히드로-8-니트로-6-t-부틸-2H-1,4-옥사제핀-[6,7-b]인돌-5(6H)-온, 3,4-디히드로-9-이소프로폭시-6-페녹시메틸-2H-1,4-옥사제핀[6,7-b]인돌-5(6H)-온 염산염, 3,4-디히드로-8,10-디브로모-6-(3-클로로벤질-2H-1,4-옥사제피노[6,7-b]인돌-5(6H)-온, 2,3-디히드로-8-클로로-1H-벤조푸라노[2,3-f]-1,4-옥사제핀-5-온, 메탄술포네이트, 2,3-디히드로-1,2,3-트리메틸-1H-벤조푸라노[3,2-e]-1,4-디아제핀-5-온, 및 2,3-디히드로-3-헥실-1H-벤조푸라노[2,3-f]-1,4-티아제핀-5-온.
세포 부착 억제제 또는 HIV 활성화 억제제가 필요할 때를 결정함에 있어서,물론 무엇보다도 치료 대상의 연령, 성별, 체중 등 뿐만 아니라 문제가 되는 특정 질환 및 그의 심도를 고려하여야 하고, 이러한 결정은 담당 의사의 판단에 달려 있다.
의학 용도로서 치료 효과를 달성하기 위한 화학식 1의 화합물 또는 그의 제약학상 허용되는 산 부가염의 필요량은 물론 특정 화합물, 투여 경로, 치료 대상 포유동물, 및 관련 질병의 특정 질환에 따라 상이할 것이다. 바람직한 실시 태양에서, 본 발명은 염증성 질환을 치료할 필요가 있는 환자에게 항염증 유효량을 투여하는 것으로 이루어지는, 염증성 질환 예를 들면 관절염 또는 종창 (腫張)을 앓고 있는 인간의 치료 방법을 제공한다. 본 명세서에서 기술된 바와 같은 임의의 질환으로 고통받고 있거나 또는 고통받을 가능성이 있는 포유동물에 대한 화학식 1의 화합물 또는 그의 제약학상 허용되는 산 부가염의 적합한 투여량은 체중 1 kg 당 화합물 0.1 μg 내지 500 mg이다. 전신 투여의 경우, 투여량은 체중 1 kg 당 화합물 0.5 내지 500 mg일 수 있고, 가장 바람직한 투여량은 포유동물 체중 1 kg 당 0.5 내지 50 mg을 1일 2-3회 투여하는 것이다. 국소 투여의 경우, 예를 들면 피부 또는 눈에 투여하는 경우 적합한 투여량은 1kg 당 화합물 0.1 ng 내지 100 μg, 일반적으로는 약 0.1 μg/kg일 수 있다.
임의의 원인에 의한 관절염 또는 일반적인 염증의 예방 또는 치료를 위한 경구 투여의 경우, 화학식 1의 화합물 또는 그의 생리학상 허용되는 산 부가염의 적합한 투여량은 상기와 동일할 수 있지만, 매우 바람직하게는 체중 1 kg 당 화합물 1 내지 10 mg이고, 가장 바람직한 투여량은 포유동물 체중 1 kg 당 1 내지 5 mg,예를 들면 1 내지 2 mg이다.
통상 수준의 의사 또는 수의사는 치료되는 질병의 진행을 예방하거나 제지하기 위한 화합물의 유효량을 용이하게 정하여 처방할 수 있을 것이라고 이해된다. 이러한 과정에서, 의사 또는 수의사는 먼저 비교적 낮은 투여량을 사용한 후, 최대 반응이 얻어질 때까지 투여량을 증가시킬 수 있다.
활성 성분 단독으로 투여할 수도 있지만, 화학식 1의 화합물 또는 그의 제약학상 허용되는 산 부가염 및 이를 위한 제약학상 허용되는 담체를 포함하는 제약 제제로서 활성 성분을 투여하는 것이 바람직하다. 이러한 제제는 본 발명의 또다른 특징을 구성한다.
수의용 및 인체용 의약 용도를 위한 본 발명의 제제는 활성 성분을 위한 제약학상 허용되는 담체 및 임의의 다른 치료 성분(들)과 함께 활성 성분을 포함한다. 담체(들)은 제제의 다른 성분과 상용성이 있고 그의 투여 대상에게 해롭지 않다는 의미에서 '허용되는' 것이어야 한다.
상기 제제는 경구, 폐내, 안내, 직장내, 비경구 (피하, 근육내 및 정맥내 포함), 관절내, 국소, 비내, 또는 구강 투여에 적합한 형태의 제제를 포함한다. 이러한 제제는 당업계에 알려진 장기간 작용하는 제제를 포함하는 것으로 이해된다.
제제는 단위 투여 형태로 편리하게 제공될 수 있고, 제약업계에 공지된 임의의 방법에 의하여 제조될 수 있다. 모든 방법은 활성 성분을 1종 이상의 보조 성분을 구성하는 담체와 결합시키는 단계를 포함할 수 있다. 일반적으로, 제제는 활성 성분을 액상 담체 또는 미세 분할 고상 담체 또는 둘 모두에 일정하고 긴밀하게결합시키고, 이어서, 필요한 경우, 생성물을 목적 제제로 성형함으로써 제조된다.
경구 투여에 적합한 본 발명의 제제는 각각 소정량의 활성 성분을 포함하는 분리 단위 형태, 예를 들면 캡슐제, 카세제, 정제 또는 로젠지제; 분말제 또는 과립제 형태; 수성 액체 또는 비수성 액체 중의 액제 또는 현탁액제 형태; 또는 수중유 (oil-in-water) 또는 유중수 (water-in-oil)의 에멀젼제 형태일 수 있다. 활성 성분은 또한 거환제, 지제 또는 페이스트제 형태일 수도 있다.
백혈구의 혈관 내피세포에 대한 부착의 억제제로서 염증 관련 질병 또는 질환의 치료에 있어서 본 발명 화합물의 유용성은 다양한 표준 시험 과정에서 그의 효용성에 의해 증명될 것이다. 각각의 시험 과정 및 예시적인 시험 결과는 하기에 설명한다.
세포간 부착 분자-1/HUVEC 발현 분석 (ICAM-1) 및 E-셀렉틴/HUVEC 발현 분석 (ESEL)에 대한 프로토콜
세포 배양
Clonetics사의 인체 제대 내피세포 (HUVEC)를 T-25 조직 배양 플라스크 중에 구입하여 37℃ 및 5％ 이산화탄소에 도달한 후 1 내지 3일 동안 성장시켰다. 이어서, T-25를 0.025％ 트립신/0.01％ EDTA 10 ml을 사용하여 5 내지 10초 동안 세척하여 HUVEC를 분리시키고 세척 용액을 제거하였다. 트립신/EDTA 용액 10 ml을 추가로 첨가하고 연필 지우개로 플라스크 측면을 똑똑 두드리면서 2 내지 4분 동안 세포를 진탕시켰다. 이어서, 플라스크 내용물을 배지 40 ml을 포함하는 50 ml 원심 분리 튜브에 부었다. 배지는 히드로코르티손 2 mg/l, 표피 성장 인자 0.05ug/l, 소 뇌 추출물 12 mg/l 및 Hyclone사의 열처리 불활성화된 6％ 태아 송아지 혈청을 포함하는 Clonetics사의 내피세포 기초 배지였다. 세포를 15℃에서 10 내지 15분 동안 원심분리하고, 상징액을 버린 후, 세포를 새로운 배지에 재현탁시켰다. 세포를 동일한 방법으로 다시 세척한 후 96웰 조직 배양 플레이트에 씨딩하였다.
시토킨 자극
융합에 도달한 후 5일 내에 세포를 종양 괴사 인자 알파 (TNFα) (Genzyme사 제품)로 자극하여 최종 배지 농도 140 U/ml를 얻은 후, 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 4시간 동안 배양한 후, 배지를 제거하고 케모킨 생성 분석을 위하여 보관하였다. 세포를 칼슘 및 마그네슘이 없는 인산염 완충 염수로 3회 세척하였다. 이어서, 웰에 완충된 10％ 포르말린을 15분 동안 첨가하여 단배양을 고정시켰다. 고정시킨 후, 세포를 2％ 소 혈청 알부민 (DMEM/2％BSA)를 포함하는 Dulbecco의 Modified Eagle Media (Gibco사)을 사용하여 3회 세척하고 철야 냉장 보관하였다.
ELISA
DMEM/2％BSA 중에 용해시킨 쥐 모노클로날 항-인간 ICAM-1 (R ＆ D Systems, Cat No. BBA-4) 또는 쥐 모노클로날 항-인간 E-셀렉틴 (R ＆ D, Cat No. BBA-2)을 각각의 웰에 0.5 μg/ml로 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 이어서, HUVEC 단배양을 DMEM/2％BSA로 4회 세척하였다. 양의 퍼옥시다제 접합 항-마우스 IgG (Cappel사)를 첨가하고 (1:3,000 희석) 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 DMEM으로 4회 세척하였다. 착색 시약 (Biorad사)을 고정된 세포에첨가하고 실온에서 15분 동안 배양하였다. 2％ 옥살산 용액을 사용하여 반응을 중단시키고, 타이터테크 플레이트 판독기 상에서 414 nm에서 흡수도를 판독하였다.
화합물 시험
화합물을 30 밀리몰의 농도로 DMSO 중에 용해시키고, 최종 시험 농도를 얻기 위하여 배지로 희석하였다. TNFα 첨가 30분 전에 배지 중에 용해시킨 화합물을 HUVEC에 첨가하였다. 억제율을 측정하기 전에 비자극 HUVEC의 흡수도를 TNFα 자극 세포의 흡수치에서 공제하였다. 흡수율은 부형제 처리 세포의 흡수도를 약물 처리 세포의 흡수도와 비교함으로써 정하였다. IC50은 선형 회귀 분석을 사용하여 정하였다.
TNF-α 자극 인체 제대 동맥 내피세포 (ECA)에 대한 인체 호중구의 부착 억제도를 정하는 방법
세포 배양
2차 계대접종 HUVEC (미국 캘리포니아주 산디에고 소재 Clonetics Corporation사 제품, CC-2617)을 Corning (미국 뉴욕주 코닝 소재 Corning glass works사 제품) 96웰 세포 배양 플레이트에 약 5 x 103세포/웰로 씨딩하고, 보충 내피세포 기초 배지 (EBM) (Clonetics사의 MCDB-131, EGF 10 ng/ml, 히드로코르티손 1 μg/ml, 0.4％ 소 뇌 추출물, 5％ 소 태아 혈청) 중에서 융합할 때까지 성장시켰다. 분석 실시 1일 전에, 일반적으로 씨딩 3일 후에 배양물에 웰 당 보충 EBM (S-EBM) 0.2 ml을 재공급하였다.
시험 화합물의 제조
시험 화합물을 1.0 mM 농도의 스탁 용액 10 ml로서 제조하였다. 화합물을 초기에 DMSO 0.1 ml 중에 용해시킨 후, S-EBM 9.9 ml을 첨가하였다. 이어서, 이 약물 제제를 1단계로 66.6 μM의 농도까지 희석시켰다. 용해 및 희석은 폴리스티렌 용기 중에서 수행하였다.
HUVEC의 자극
재조합 인체 종양 괴사 인자-α (TNF) (미국 매사추세츠주 보스톤 소재 Genzyme사의 코드명 TNF-H)를 S-EBM 중에 400 U/ml로 제조하였다. 스탁 TNF를 Delbecco의 인산염 완충 염수 (PBS) (미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재 Gibco사) 및 0.1％ BSA 중에 20,000 U/ml로 제조하여 -70℃에서 보관하였다. HUVEC를 따뜻한 비보충 EBM 0.2 ml로 1회 세척한 후 시험 화합물 33.3 μM의 존재 하에 TNF 200 U/ml을 사용하여 37℃에서 4시간 동안 자극하였다. 이것은 400 U/ml TNF 0.1 ml 및 66.6 μM 시험 화합물 0.1 ml을 첨가함으로써 달성되었다. 이 첨가는 HUVEC 단층을 붕괴시키지 않도록 하기 위하여 서서히 실시되었다. 각 화합물을 6개의 웰에서 시험하였다. 또한, 비자극 시험 (부형제 대조군) 및 시험 화합물 비처리 TNF 자극 시험도 각 플레이트에서 실시되었다.
호중구의 표지
HUVEC에 호중구를 첨가하기 1시간 전에 호중구 (5 x 106/ml)를 Hanks사의 평형염 용액 및 0.45％ BSA 중에서 5 μM 칼세인-AM (미국 오레곤주 유겐 소재Molecular Probe사)을 사용하여 37℃에서 30분 동안 표지하였다. 스탁 칼세인을 무수 DMSO 중에서 5 mM로 제조하여 -20℃에서 건조 보관하였다. 배양이 끝난 후 세포를 차가운 HBSS로 2회 세척하고, 보충 EBM 중에 최종 농도 1 x 106세포/ml로 재현탁시켰다.
HUVEC에 호중구의 첨가
4시간의 자극이 끝나고 HUVEC 단층에 호중구를 첨가하기 직전에 TNF 및 약물을 제거하기 위하여 플레이트를 따뜻한 비보충 EBM 0.2 ml로 세척하였다. 호중구 (1 x 105세포)를 각각의 처리된 웰에 서서히 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후, 플레이트를 따뜻한 비보충 EBM 0.2 ml로 2회 세척한 후 플레이트 스캐닝을 위하여 0.1 ml을 최종 첨가하였다.
상대 형광도 측정
Millipore Cytofluor 300 시스템 (여기 = 480, 방출 = 530, 감도 = 4)을 사용하여 상대 형광도를 측정하였다.
계산
HUVEC에 대한 TNF 자극을 통하여 호중구의 부착이 비자극 HUVEC에 대한 부착보다 300％ 증가하면, 분석은 유효한 것으로 간주하였다. 결과는 TNF 자극 부착의억제율의 평균으로서 표현되었다.
이들 화합물 중 일부는 IC50치를 측정하기 위하여 33.3 μM, 10.0 μM, 3.3 μM, 및 1.0 μM의 농도에서 시험하였다. 억제치의 평균에 대한 선형 회귀 분석을 사용하여 IC50을 정하였다.
본 발명의 특정 화합물을 사용하여 얻어진 결과는 표 I에 나타내었다.
본 발명에 따른 시험 화합물, 특히 화학식 3의 화합물은 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)에 감염된 포유동물에 잠복하고 있는 HIV의 활성화를 억제하고, 따라서 AIDS 치료에 유용하다는 사실이 밝혀졌다.
임상적 비증상 기간 동안의 바이러스학 및 세포적 기초를 이해하기 위한 시도는 HIV가 만성적으로 감염된 세포의 저장 군집에서 휴면성 또는 비발현 프로바이러스로 존재한다는 것을 보여준다. 특정 종류의 HIV, 즉 HIV-1은 이 바이러스가 만성적으로 감염된 T-임파구 세포의 저장 군집에서 휴면성 또는 비발현 프로바이러스로 존재한다는 것을 보여주는 많은 상이한 연구 프로젝트의 대상이었다. 그러나, 비발현 바이러스 상태를 유지하는 작용을 하는 핵 및 생화학적 메카니즘에 관한 보다 상세한 내용은 본 고찰의 범위를 벗어나는 것이지만, 다른 문헌 [Mechanisms of HIV-1 Latency, Bednarik 등, AIDS 6:3-16 (1992)]에서 상세하게찾아볼 수 있다.
현재까지, HIV는 임상적 비증상 기간 동안 만성적으로 감염된 세포의 모든 저장 군집에서 휴면성 또는 비발현 상태라고 생각되어 왔다. 말초 혈액 세포에서 바이러스혈증 및 바이러스 복제 수준이 낮거나 또는 존재하지 않는다는 관찰을 통하여 HIV 질병이 임상적 비증상 기간 동안 비활성이라는 생각을 하게 되었다. 그러나, 일단의 과학자들은 진정한 미생물학적 잠복 상태가 HIV 감염 과정 동안 존재하지 않는다는 것을 발견하였다 (Fauci A.S. 등, HIV Infection is Active and Progressive in Lymphoid Tissue During the Clinically Latent Stage of disease, Nature 362:355-358 (1993) 참조).
이들 과학자들은 임상적 잠복기 동안 말초 혈액 대 임파 기관에서 바이러스 적하 수준 및 바이러스 복제 사이의 이분법을 보고하였다. 따라서, 이러한 발견을 기초로하여 과학자들은 '말초 혈액은 특히 HIV 감염의 임상 과정 초기에 HIV 질병의 실제 상태를 정확하게 반영하지 않는다. 사실상, 말초 혈액에서 바이러스 변수를 용이하게 측정한 결과 질병 활성에 대한 증거가 거의 없을 때 조차도 HIV 질병은 활성이고 진행성이며, 환자는 임상적 잠복기를 경험하고 있다'는 것을 발견하였다.
필연적으로, HIV의 질병 상태는 임상적 비증상 잠복기로부터 발현 및 활성 증상기로 진행한다. 몇개의 상이한 모델을 통하여 실험실 차원에서 잠복기로부터의 HIV 활성화에 관련된 세포내 경로에 대해 이해되기 시작하고 있다. Butera 등의 문헌 [AIDS, 6:994 (1992)]에 따라서, 잠복기에 관한 많은 세포 모델을 시토킨으로 처리하여 HIV-1을 발현시키도록 유도할 수 있다. 이것은 미생물학적 잠복기 상태에서 HIV-1이 복제를 개시하기 전에 세포외 자극을 기다린다는 것을 의미한다. 이러한 시그날은 가용성 시토킨과 그의 수용체와의 상호 작용 뿐만 아니라 세포 대 세포의 커뮤니케이션 동안에 발생하는 수용체와 수용체와의 상호 작용 또는 세포 스트레스, 예를 들면 UV광 노출 및 열 충격을 통하여 매개될 수 있다. 또한, 세포외 유도 시그날이 자가분비(autocrine) 또는 파라분비(paracrine) 방식으로 발생하여 HIV-1 활성화 세포가 그 자신의 발현을 증강시키고 인접 잠복기 세포를 활성화시킬 수 있다.
당업계의 숙련가는 또다른 요인이 HIV의 활성화에 관련된다고 생각하였다. 한 연구는 12-0-테트라데칸오일-포르볼-13-아세테이트 (TPA)가 CD4 하향 조절 및 HIV 감염 세포에서 바이러스 발현을 매개하는 것을 밝혀내었다 (Hamamoto 등, Biochem. Biophys. Res. Commun., 164:339-344 (1989) 참조). 또한, Hamamoto는 흥미있게도 효능있는 단백질 키나제 C 억제제인 스타우로스포린, H-7, 및 UCN-01의 TPA-매개 CD4 하향 조절 및 HIV 발현의 증가에 대한 효과를 조사하였다. 스타우로스포린은 이러한 작용 둘 모두에 대해 효과적인 TPA 억제제임이 밝혀졌다.
활성화 시그날을 원형질막으로부터 통합 바이러스에 매개하여 HIV-1 발현을 야기하는데 관련되는 세포내 경로는 더욱 분명하지 않다. 최근에, 잠복기 HIV의 활성화를 억제할 수 있는 화합물을 평가하기 위한 신뢰할 수 있고 간단한 시스템이 1991년 11월 3일 - 7일 National Cooperative Discovery Grant (NCDDG)/AIDS에서 P. Feorino, S.T. Butera, T.M. Folks, 및 R.F. Schinazi에 의하여 보고되었다.이 분석 시스템은 OM-10.1 세포주, 즉 종양 괴사 인자-α에 의해 HIV-1가 활성화될 때까지 CD4+ 상태인 만성적으로 감염된 특이 전(前)골수구 클론을 사용하였다. 세포 표면에서의 CD4+의 발현 및 역전사 활성을 바이러스 발현의 정량을 위한 마커로서 사용한다. 별법으로, 당업계의 숙련가에게 공지된 다른 HIV 마커, 예를 들면 프로테아제 활성을 사용할 수도 있다. OM-10.1 세포는 바이러스가 활성화될 때까지 CD4+ 상태이고 종양 괴사 인자 유도에 반응하고, 따라서 이들 배양물은 CD4+ 하향 조절 (세포 표면 상에서 CD4+의 발현 감소) 및 HIV-1 발현을 억제하는 능력에 대한 약리학을 편리하고 신속하게 조사하는데 사용된다.
급성 또는 만성적으로 감염된 세포에 대한 항바이러스 특성을 가진 것으로 알려진 다양한 화합물을 이들의 상기 OM-10.1 세포에서 HIV 발현 억제능을 평가하기 위하여 사용하였다. 재활성화 과정을 방해할 수 있는 생화학적 경로와 상호 작용하는 몇종의 화합물도 역시 조사하였다. 평가 결과는 1991년 11월 3일 - 7일 미국 캘리포니아주 산디에고 소재 NCDDG/AIDS의 포스터에 제공되었다. 평가된 48종의 화합물 가운데, 3'-플루오로-3'-데옥시티미딘 (FLT), 인터페론 Y, 및 데스페리옥사민이 HIV-1 활성화의 적절한 억제제로 생각되었다.
화학식 1의 대표적인 화합물인 2,3-디히드로-9-메톡시-[1]벤조티에노[2,3-f]-1,4-티아제핀-5(4H)-온은 OM-10.1 세포에서 0.21 μM의 IC50을 보였다 (표 1).
2,3-디히드로-9-메톡시-[1]벤조티에노[2,3-f]-1,4-티아제핀-5-(4H)-온
실시예 R2 X Y ECA (IC50) ICAM/ESEL (IC50또는30μM에서의 억제％) OM-10(IC50μM)
1 OMe S S 5.2 3.1/1.3 0.21
2 H S O 42％/40％ 30
4 OMe NMe O 14.7/14.2
5 H S NH 64％/47％
6 OMe S O 3.1/7.5
7 OMe S-O O 30％/30％
8 OMe S O (2-메틸) 3.8/5.3
또한, 본 발명 화합물은 그들의 호중구 유입 억제능 및 이에 따른 그들의 염증 증상 치료를 위한 유용성을 측정하기 위하여 사용된 체내 표준 분석에서 활성을 나타냈다. Reverse Passive Arthus Pleurisy Assay로 불리는 한 시험에서, 이계교배된 위스타르 (Wistar) 쥐 수컷 (220-245 g, Charles River Laboratories)을 16 내지 18시간 동안 단식시켰다. 부형제 (1:1의 에탄올:염수) 또는 부형제에 용해시킨 본 발명 화합물을 정맥내 투여하였다. 상기 쥐를 에테르를 사용하여 가볍게 마취시키고, 염수 중의 소 혈청 알부민 (BSA) 2.5 mg을 정맥내 주사하였다. 정맥내 주사 직후에 늑골 사이를 조금 절개하고, Dulbecco의 인산염 완충 염수 (PBS) 중의 토끼 IgG 부분 항-BSA 0.2 ml (PBS 중의 10 mg/ml)을 20-게이지 경구 투여 바늘을 사용하여 흉강 내에 주사하였다. 이어서, 절개 부위를 9 mm 스테인레스 스틸 상처 클립으로 막았다. 4시간 후에 쥐를 이산화탄소를 사용하여 안락사시키고 흉강을 PBS 중의 0.325％ 페놀 적색 용액 2 ml로 세척하였다. 분석을 위하여 삼출 완충액을 흉강으로부터 제거하였다. Coulter 계수기를 사용하여 백혈구 (호중구 90％ 이상)의 갯수를 세었다. 흉강 삼출 용량은 염료 희석 방법에 의하여 측정하였다 (Carter G.W. 등, J. Pharm. Pharmacol. 34:66-67 (1982) 참조). 약물 처리군을 부형제 처리군과 비교하고, Student의 t-시험을 사용하여 통계적 의미를 결정하였다.
실시예 1의 화합물을 상기 시험으로 평가한 결과, 다음과 같은 억제를 보였다:
투여량 (㎎/㎏) 삼출물의 억제율 호중구 유입의 억제율
0.3 40.5 18.6
1.0 28.4 8.9
3.0 28.2 15.9
티오글리콜레이트-유도 호중구 유입 분석으로 불리는 또다른 체내 분석에서, Balb/c 동계교배 마우스 암컷을 7개의 군으로 수용하여 연구 내내 먹이 및 물에 자유롭게 접근할 수 있도록 하였다. 마우스에게 부형제 (0.5％ 히드록시프로필 메틸 셀룰로스 및 0.2％ Tween 80) 또는 부형제 중에 용해시키거나 현탁시킨 본 발명 화합물을 경구 투여하였다. 경구 투여 1시간 후에 마우스를 디에틸 에테르 흡입에 의하여 마취시키고 염수 중의 3％ 티오글리콜레이트 배지 1.0 ml을 복막내 주사하였다. 티오글리콜레이트 주사 2시간 후에 마우스를 이산화탄소 질식에 의해 안락사시키고, 10 U/ml 소듐 헤파린 및 0.1％ BSA를 포함하는 Dulbecco의 PBS 6 ml을 주사하였다. 복강을 마사지하고 복강 내를 절개하여 액체를 15-ml 원심분리 튜브에 모았다. 각 마우스로부터 부분표본을 취하여 각 부분표본 내의 세포 총수를 Coulter Counter (미국 플로리다주 하이얼리 소재 Coulter Instruments사의 모델명ZBi)를 사용하여 측정하였다. Cytospin 2 (미국 펜실바니아주 피츠버그 소재 Shandon Inc.사 제품)을 사용하는 현미경 관찰을 위하여 2차 부분표본을 취한 후, 염색 (변형된 Wright사의 착색제)을 실시하였다. 복강에 삼출된 호중구의 비율을 정하기 위하여 혈액 감별을 실시하였다.
이 분석에서 실시예 1의 화합물을 평가한 결과, 호중구의 유입을 10 mg/kg에서는 26.1％, 30 mg/kg에서는 31.9％, 100 mg/kg에서는 34.3％ 억제하는 것으로 나타났다.
본 발명의 화합물은 다음과 같은 방법으로 제조될 수 있다.
일반적으로, 먼저 반응 출발 물질로서 반응식 1에서 구조식 1의 3-히드록시, 티올, 또는 아미노-벤조[b]티오펜, 벤조푸란 또는 인돌-2-카르복실레이트 에스테르가 필요하다. 3-히드록시-벤조[b]티오펜-2-에스테르는 문헌 [Connor D.T. 등, J. Med. Chem., 35:958 (1992)]에 기재된 바와 같이 제조된다. 3-티오-벤조[b]티오펜 -2-카르복실레이트 에스테르는 유사한 3-클로로 유도체 (Connor D.T. 등, J. Med. Chem., 35:958 (1992))를 염기, 예를 들면 1,8-디아자-비시클로[5.4.0]-운데크-7-엔 (DBU) 및 용매, 예를 들면 N,N'-디메틸포름아미드 또는 테트라히드로푸란의 존재 하에 티오아세트아미드로 처리하여 제조된다. 3-아미노-벤조[b]티오펜-2-카르복실레이트 에스테르는 공지의 일반적 방법 (Beck J.R., J. Org. Chem., 37:3224 (1972))에 의하여 제조된다. 3-히드록시-인돌-2-카르복실레이트 에스테르는 공지 방법, 예를 들면 문헌 [Unangst P.C. 등, J. Heterocyclic Chem., 24:811 (1987) 및 Moyer M.P. 등, J. Org. Chem., 51:5106 (1986)]의 방법에 의하여 제조된다.3-티오-인돌-2-카르복실레이트 에스테르는 공지 방법, 예를 들면 문헌 [Unangst P.C. 등, J. Heterocyclic Chem., 24:811 (1987); Atkinson J.G. 등, Synthesis, 480 (1988); 및 Nagarajan K. 등, Indian J. Chem., 20B:672 (1981)]의 방법에 의하여 제조된다. 3-아미노-인돌-2-카르복실레이트 에스테르는 공지 방법, 예를 들면 Simakov S.V. 등, Khim.-Farm. Zu., 17:1183 (1983)에 의하여 제조된다.
타입 1의 화합물의 본 발명의 화합물로의 전환은 반응식 1에 도시하였다. 에스테르를 0 내지 80℃에서 테트라히드로푸란, 아세토니트릴 또는 디메틸술폭사이드 중에서 염기, 예를 들면 포타슘 t-부톡사이드의 존재 하에 α-할로 치환 아세토니트릴 유도체, 예를 들면 브로모아세토니트릴로 처리하여 타입 2의 에스테르를 제공한다. 니트릴기는 대응하는 1차 아민으로 환원되고, 생성되는 중간체 3은 락탐 4로 고리화된다. 바람직한 전환은 승온 및 승압에서 염기, 예를 들면 트리에틸아민의 존재 하에 용매, 예를 들면 테트라히드로푸란 중에서 라니 코발트 촉매를 사용하여 타입 2를 수소첨가시키는 것이다. 이러한 조건 하에서 4가 2로부터 직접 얻어진다. 단리된 중간체 3은 승온에서 염기 조건, 바람직하게는 메탄올 중의 NaOMe, 또는 산성 조건, 바람직하게는 폴리인산 하에 4로 고리화된다.
본 발명 화합물 중 일부의 합성 동안에 반응기, 예를 들면 히드록시기, 아미노기 및 카르복시기를, 목적 반응이 분자 내의 다른 곳에서 발생할 때 이들 반응기를 원치 않는 부반응으로부터 보호하는 유도체로 전환시키는 것이 필요하거나 바람직할 수 있다. 이와같이 보호된 히드록시기, 아미노기 및 카르복시기는 통상적인 방법으로 쉽게 탈보호시킬 수 있다. 반응기, 예를 들면 히드록시기, 아미노기 및카르복시기를 보호하는 작용을 하는, 통상적으로 사용되는 화학 잔기 및 이들의 부착 및 추후 제거 방법은 Greene 및 Wuts의 문헌 [Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley ＆ Sons, Inc., New York, 1991]에 기재되어 있다.
예를 들면, 3-아미노, 3-히드록시, 또는 3-티오 인돌, 벤조티오펜, 또는 벤조푸란 (반응식 1의 화합물 1)을 아미노기가 적합한 보호기 (PG), 예를 들면 t-부톡시카르보닐 (Boc) 또는 벤질옥시카르보닐 (Cbz)로 보호된 β-할로-에틸렌아민과 반응시킬 수 있다. 상기와 동일한 조건 하에서의 반응은 타입 5의 화합물을 제공한다. 표준 조건, 즉 BOC 제거를 위한 트리플루오로아세트산 또는 수성산, 또는 Cbz 제거를 위한 가수소분해를 통한 5의 탈보호 (즉, 보호기의 제거)는 상기한 바와 같이 고리화되는 타입 3의 화합물을 제공한다. 또다른 방법은 타입 1의 화합물을 알콜계 용매 중에서 에틸렌이민과 반응시켜 직접 3을 제공하는 것이다 (문헌 [Nagarajan K. 등, Indian J. Chem., 20B:672 (1981)] 참조).
타입 4의 화합물에 대한 제2의 일반적인 방법 (반응식 2)은 대응하는 3-할로 유도체 6을 통한 것이다. 염기, 예를 들면 탄산칼륨의 존재 하에 용매, 예를 들면 피리딘 중에서 6을 에틸렌디아민 및 쿠프릭 옥사이드와 반응시키는 것은 Y가 NH인 타입 3의 화합물을 제공한다 (문헌 [Hiremath S.P. 등, Proc. Nat. Acad. Sci., India, 60:367 (1990)] 참조). 염기, 예를 들면 DBU의 존재 하에 용매, 예를 들면 디메틸포름아미드 중에서 6을 시스테아민과 반응시키는 것은 Y가 S인 타입 3의 화합물을 제공한다. 염기, 예를 들면 포타슘 t-부톡사이드 또는 수소화칼륨의 존재 하에 용매, 예를 들면 테트라히드로푸란 중에서 6을 니트로에탄올과 반응시키는 것은 타입 7의 화합물을 제공한다. 이어서, 니트로기를 아민으로 환원시켜 Y가 O인 타입 3의 화합물을 얻는다. 상기 경우들 중 어떤 경우에는 3은 분리되지 못하지만, 4는 직접 얻을 수 있다.
제3의 일반적인 방법 (반응식 3)도 역시 3-할로 유도체 6을 이용한다. 3-할로 유도체는 아미드기를 형성하기 위하여, β위치에 적절하게 보호된 아미노기, 히드록시기 또는 티올기를 포함하는 1차 아민으로 처리되어 타입 7의 중간체를 생성시킨다. 탈보호 후에 고리화되어 타입 4의 화합물이 생성된다. 유사한 순서의 반응이 β위치에 적합한 이탈기 (LG)를 갖는 아민을 첨가한 3-히드록시, 티올 또는 아미노 화합물로 시작한다. 이어서, 생성되는 타입 8의 중간체를 고리화하여 4를 얻는다.
X가 S이고 Y가 O 또는 NR인 타입 4의 화합물은 산화도를 결정하는 반응 조건으로 산화제, 예를 들면 m-클로로퍼벤조산 (m-CPBA) 또는 옥사지리딘을 사용하여 대응하는 술폭사이드 및(또는)술폰 9로 전환될 수 있다 (반응식 4). Y가 S인 타입 4의 화합물의 경우에는 유사한 산화 반응을 통하여 타입 10의 술폭사이드 또는 술폰을 생성시킬 수 있다.
반응식 1 내지 4에서 기술된 조건 및 이의 변형은 당업계의 숙련가에게 공지되어 있거나, 또는 공지된 반응과 유사한 반응으로부터 용이하게 정해질 수 있다.
하기 실시예는 본 발명의 화합물의 제조를 예시한 것이다.
실시예 1
2,3-디히드로-9-메톡시[1]벤조티에노[2,3-f]-1,4-티아제핀-5(4H)-온
DMF 20 ml 중의 메틸 3-클로로-5-메톡시-벤조[b]티오펜-2-카르복실레이트 (공지 3-클로로-5-메톡시-벤조[b]티오펜-2-카르보닐 클로라이드를 메탄올과 반응시켜 제조함 [J. Med. Chem., 35:958 (1992)]) 500 mg (1.95 밀리몰)의 실온 용액에 시스테아민-HCl 885 mg (7.79 밀리몰), DBU 2.33 ml (15.58 밀리몰) 순으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1.5시간 동안 교반한 후, 70℃로 가온하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고 HCl 수용액, 물 및 염수로 세척하였다. 유기층을 MgSO4상에서 건조시키고 여과하여 진공 농축하였다. 조 생성물을 헥산 및 에틸 아세테이트에서 재결정화시켜 2,3-디히드로-9-메톡시[1]벤조티에노[2,3-f]-1,4-티아제핀-5-(4H)-온을 74％의 수율로 얻었다; 융점 209 - 209.5℃.
실시예 2
2,3-디히드로-[1]벤조티에노[2,3-f]-1,4-옥사제핀-5(4H)-온
THF 50 ml 중의 3-(시아노메톡시)-벤조[b]티오펜-2-카르복실산의 메틸 에스테르 (J. Hetero. Chem., 12:1037 (1975)) 405 mg (1.64 밀리몰), Et3N 0.5 ml 및 RaCo 0.50 g의 혼합물을 수소 1200 psi 하에 100℃에서 가열하였다. 반응 혼합물을 진공 중에서 농축하였다. 모든 에틸 아세테이트에 대해서 1:1의 헥산:에틸 아세테이트 구배로 용출시키는 컬럼 크로마토그래피에 의해 2,3-디히드로-[1]벤조티에노[2,3-f]-1,4-옥사제핀-5(4H)-온을 55％의 수율로 얻었다; 융점 244 - 245℃.
실시예 3
2,3-디히드로-9-메톡시-[1]벤조티에노[2,3-f]-1,4-티아제핀-5(4H)-온-1-옥사이드
AcOH 18 ml 중의 2,3-디히드로-9-메톡시-[1]벤조티에노[2,3-f]-1,4-티아제핀 -5(4H)-온 200 mg (0.75 밀리몰) 및 NaBO3-4H2O 116 mg (0.75 밀리몰)의 혼합물을 실온에서 철야 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하여 물 60 ml을 여액에 첨가하였다. 여과하여 2,3-디히드로-9-메톡시-[1]벤조티에노[2,3-f]-1,4-티아제핀-5(4H)-온-1-옥사이드를 69％의 수율로 얻었다; 융점 215-216℃ (분해).
실시예 4
3,4-디히드로-9-메톡시-6-메틸-2H-1,4-옥사제피노[6,7-b]-인돌-5(6H)-온
A.메틸 3-(시아노메톡시)-5-메톡시-1-메틸-1H-인돌-2-카르복실레이트
디메틸 술폭사이드 60 ml 중의 포타슘 t-부톡사이드 3.2 g (29 밀리몰)의 현탁액을 메틸 3-히드록시-5-메톡시-1-메틸-1H-인돌-2-카르복실레이트 (Unangst P.C. 등, J. Heterocyclic Chem., 24:811 (1987)) 5.6 g (24 밀리몰)로 수회 처리하였다. 혼합물을 15분 동안 교반하고, 클로로아세토니트릴 4.8 ml (5.7 g, 76 밀리몰)을 적가하였다. 혼합물을 80℃에서 90분 동안 가열한 후 냉각시키고, 얼음 및 물 800 g을 첨가하였다. 침전된 고상물을 여과하여 10％ 메탄올-물로 세척한 후, 아세토니트릴 수용액에서 재결정화시켜 생성물 3.9 g (60％)을 얻었다; 융점 136-137℃.
B. 압력 반응기 중에서 테트라히드로푸란 35 ml 중의 메틸 3-(시아노메톡시)-5-메톡시-1-메틸-1H-인돌-2-카르복실레이트 0.60 g (2.2 밀리몰) 및 트리에틸아민 0.40 ml (0.29 g, 2.9 밀리몰)의 혼합물을 라니 코발트 촉매 0.40 g으로 처리하였다. 수소를 사용하여 반응기에 압력 (590 psi)을 가하고 80℃에서 10시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 냉각시켜 여과하고 여액을 증발시켰다. 오일 잔사를 메탄올 50 ml 중에 용해시키고 소듐 메톡사이드 0.80 g (15 밀리몰)을 용액에 첨가하였다. 혼합물을 환류에서 3시간 동안 가열한 후 냉각시켜 증발시켰다. 잔사를 에틸 아세테이트 75 ml와 염수 150 ml 사이에 분배하였다. 수성층을 새로운 에틸 아세테이트로 수회 추출하였다. 유기층을 합하여 염수로 세척하여 건조시키고 (무수 황산나트륨), 증발시켰다. 조 생성물 잔사를 플래시 크로마토그래피 (실리카겔, 디클로로메탄 중의 5％ 메탄올 용출)에 의해 정제하여 생성물을 0.18 g (33％) 얻었다. 에틸 아세테이트-헥산에서 재결정화시킨 시료의 융점은 184-186℃였다.
실시예 5
2,3-디히드로-1H-벤조티에노-[3,2-e]-1,4-디아제핀-5-온
3-(2-아미노에틸아미노)벤조[b]티오펜-2-카르복실산 메틸 에스테르 히드로클로라이드
메탄올 15 ml 중의 2-(4,5-디히드로-1H-이미다졸-2-일)벤젠티올 (Hegen, H., Fleig, H. Justus Liebigs Ann. Chem. 11:1994 (1975)) 1.00 g (5.62 밀리몰) 및 클로로메틸 아세테이트 610 mg (5.62 밀리몰)의 용액을 환류에서 90분 동안 가열하였다. 반응물을 실온으로 냉각시키고 여과하였다. 여액을 농축하여 건조시키고 잔사를 뜨거운 클로로포름 중에 용해시켰다. 수시간 후에 생성되는 침전물을 수거하여 건조시켰다. 모액을 2차 결정화시켜 3-(2-아미노에틸아미노)벤조[b]티오펜-2-카르복실산 메틸 에스테르 히드로클로라이드를 총 61％의 수율로 얻었다; 융점 219-220℃.
2,3-디히드로-1H-벤조티에노-[3,2-e]-1,4-디아제핀-5-온
메탄올 5 ml 중의 3-(2-아미노에틸아미노)벤조[b]티오펜-2-카르복실산 메틸 에스테르 히드로클로라이드 339 mg (1.18 밀리몰) 및 새로 제조된 소듐 메톡사이드 134 mg (이중 나트륨은 2.48 밀리몰임)의 용액을 환류에서 18시간 동안 가열하였다. 냉각시킨 후, 반응물을 1 N HCl 25 ml로 중화시키고 0℃에서 1시간 동안 냉각시켰다. 생성 황색 결정물을 여과하여 진공 하에 60℃에서 수시간 동안 건조시켜 2,3-디히드로-1H-벤조티에노-[3,2-e]-1,4-디아제핀-5-온을 64％의 수율로 얻었다. 에틸아세테이트 중의 2％ 메탄올에서 에틸 아세테이트 중의 5％ 메탄올의 구배로 용출시키는 크로마토그래피에 의해 분석적으로 순수한 2,3-디히드로-1H-벤조티에노 -[3,2-e]-1,4-디아제핀-5-온 (융점: 210-212℃)을 얻었다.
실시예 6
2,3-디히드로-9-메톡시-1H-벤조티에노-[2,3-f]-1,4-옥사제핀-5-온
3-시아노메톡시-5-메톡시-벤조[b]티오펜-2-카르복실산 메틸 에스테르
DMSO 20 ml 중의 메틸 3-히드록시-5-메톡시벤조[b]티오펜-2-카르복실레이트 (Connor 등, J. Med. Chem. 35:959 (1992)) 1.00 g (4.2 밀리몰)의 실온 용액에 포타슘 t-부톡사이드 494 mg (4.41 밀리몰), 브로모아세토니트릴 878 μl (12.58 밀리몰) 순으로 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 1.5시간 동안 교반한 후, 에틸 아세테이트 및 1 N HCl에 부었다. 유기층을 1 N HCl로 세척한 후, 염수로 수회 세척하고 MgSO4상에서 건조시켰다. 여과 후 용매를 진공 중에서 제거하고 잔사를 에틸 아세테이트:헥산에서 재결정화시켜 413 mg을 얻었다. 추가로 모액으로부터 112 mg을 얻을 수 있었다; 융점 159.5-160℃.
2,3-디히드로-9-메톡시-1H-벤조티에노-[2,3-f]-1,4-옥사제핀-5-온
THF 50 ml 중의 3-시아노메톡시-5-메톡시-벤조[b]티오펜-2-카르복실산 메틸 에스테르 2.5 g (9.0 밀리몰)의 용액을 격렬한 환류로 가열하였다. 보란-디메틸술파이드 9.0 ml (90.2 밀리몰)을 신속하게 첨가하고, THF가 증발하기 때문에 THF를 첨가하면서 25분 동안 계속 가열하였다. 보란-디메틸 술파이드 4.0 ml을 추가로 첨가하고 10분 동안 계속 가열하였다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 6 N HCl 50 ml을 조심스럽게 첨가하였다. 수소 기체를 방출시키고 반응 혼합물의 온도를 상승시켰다. 생성 침전물을 여과에 의해 수거하고 물로 세척한 후 진공 중에서 철야 건조시켰다.
고상물 2.3 g (8.2 밀리몰)을 메탄올 40 ml 중의 소듐 메톡사이드 1.9 g (이중, 나트륨은 82.0 밀리몰임)의 새로 제조한 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 2시간 동안 50℃로 가온한 후, 환류에서 2시간 동안 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 침전물을 수거하여 차가운 메탄올, 차가운 디에틸 에테르 순으로 세척하였다. 고상물을 진공 중에서 철야 건조시켜 1.18 g (52％)을 얻었다. 에틸 아세테이트:헥산에서 재결정화시켜 2,3-디히드로-9-메톡시-1H-벤조티에노-[2,3-f]-1,4-옥사제핀-5-온의 분석 시료를 얻었다; 융점 264-265℃.
실시예 7
2,3-디히드로-9-메톡시-6-옥사이드-1H-벤조티에노-[2,3-f]-1,4-옥사제핀-5-온
따뜻한 메탄올 100 ml 중의 2,3-디히드로-9-메톡시-1H-벤조티에노-[2,3-f]-1,4-옥사제핀-5-온 1.00 g (4.0 밀리몰)의 현탁액에 30％ 과산화수소 8.0 ml (80 밀리몰), 이산화셀레늄 445 mg (4.01 밀리몰) 순으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반한 후 30℃에서 1.5시간, 40℃에서 2시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 -40℃로 냉각시키고 생성 침전물을 여과에 의해 수거하였다.처음에는 에틸 아세테이트 중의 5％ 메탄올을 사용하고 점차 용매 극성을 1:1의 메탄올:에틸 아세테이트로 증가시키면서 용출시키는 크로마토그래피에 의해 잔사로부터 생성물 338 mg을 얻었다. 메탄올:에틸 아세테이트에서 재결정화시켜 2,3-디히드로-9-메톡시-6-옥사이드-1H-벤조티에노-[2,3-f]-1,4-옥사제핀-5-온의 분석 시료를 얻었다; 융점 273-274℃.
실시예 8
2,3-디히드로-9-메톡시-2-메틸-1H-벤조티에노-[2,3-f]-1,4-옥사제핀-5-온
3-(1-시아노에톡시)-5-메톡시-벤조[b]티오펜-2-카르복실산 메틸 에스테르
DMSO 20 ml 중의 메틸 3-히드록시-5-메톡시벤조[b]티오펜-2-카르복실레이트 (Connor 등, J. Med. Chem. 35:958 (1992)) 1.00 g (4.2 밀리몰)의 실온 용액에 포타슘 t-부톡사이드 494 mg (4.41 밀리몰), 2-클로로프로피오니트릴 1.1 ml (12.6 밀리몰) 순으로 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 1.5시간 동안 교반한 후, 3시간 동안 82℃로 가온하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 및 1 N HCl에 부었다. 유기층을 1 N HCl로 세척한 후, 염수로 수회 세척하고 MgSO4상에서 건조시켰다. 여과 후 용매를 진공 중에서 제거하고 잔사를 에틸 아세테이트:헥산에서 재결정화시켜 853 mg을 얻었다; 융점 127-129℃.
2,3-디히드로-9-메톡시-2-메틸-1H-벤조티에노-[2,3-f]-1,4-옥사제핀-5-온
THF 10 ml 중의 3-(1-시아노에톡시)-5-메톡시벤조[b]티오펜-2-카르복실산 메틸 에스테르 400 mg (1.37 밀리몰)의 용액을 격렬한 환류로 가열하였다. 보란-디메틸 술파이드 1.4 ml (13.7 밀리몰)을 적가하고, THF가 증발하기 때문에 THF를 첨가하면서 20분 동안 계속 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 6 N HCl 7.5 ml을 조심스럽게 첨가하였다. 5분 후에 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고 1 N NaOH 68.5 ml, 에틸 아세테이트 순으로 첨가하였다. 층을 분리하여 유기상을 1:1의 염수:물로 세척한 후 염수로 추가 세척하였다. 유기상을 MgSO4상에서 건조시키고 여과하여 진공 중에서 농축하였다. 잔사를 5:25:70의 메탄올:헥산:클로로포름, 10:90의 메탄올:클로로포름, 30:70의 메탄올:클로로포름 순으로 용출시키는 크로마토그래피하여 생성물 135 mg을 얻었다. 에틸 아세테이트:헥산에서 재결정화시켜 2,3-디히드로-9-메톡시-2-메틸-1H-벤조티에노-[2,3-f]-1,4-옥사제핀-5-온의 분석 시료를 얻었다; 융점 185-186℃.
본 발명 화합물은 통상의 희석제 및 담체와 함께 염증, 특히 관절염 등의 질병 치료를 위해 인간 및 동물에게 경구 또는 비경구 투여하기 위해 제제화될 수 있다. 하기 실시예는 대표적인 제약 제제의 제조를 예시한다.
실시예 9
250-mg 캡슐제의 제조
2,3-디히드로-9-이소프로폭시-7-클로로-1H-벤조티에노-[2,3-f]-1,4-옥사제핀-5-온 250 mg을 락토스 150 mg 및 옥수수 전분 150 mg과 균질하게 혼합하였다. 혼합물을 젤라틴 캡슐에 봉입하였다. 이 캡슐은 관절염 치료를 위해 1일 당 1 내지 3개의 비율로 경구 투여된다.
실시예 10
경구 현탁액제의 제조
성분 양
2,3-디히드로-8-에틸-10-트리플루오로-메틸-6-옥사이드-1H-벤조티에노[2,3-f]-1,4-옥사제핀-5-온 500 ㎎
소르비톨 용액 (70％ N.F.) 40 ㎖
소듐 벤조에이트 150 ㎎
사카린 10 ㎎
체리 향미제 50 ㎎
증류수 총 부피가 100 ㎖이 되도록 하는 충분량
소르비톨 용액을 증류수 40 ml에 첨가하고, 여기에 옥사제피논을 현탁시켰다. 사카린, 소듐 벤조에이트 및 향미제를 첨가하고 용해시켰다. 물을 사용하여 부피를 100 ml로 조절하였다. 시럽 1 ml는 옥사제피논 5 mg을 포함하였다. 이 경구 제제는 소아의 염증 치료에 이상적으로 적합하다.
실시예 11
비경구 액제의 제조
프로필렌 글리콜 700 ml 및 주사용 증류수 200 ml의 용액 중에 2,3-디히드로-7-디메틸아미노-1H-벤조티에노[3,2-e]-1,4-디아제핀-5-온 20.0 g을 용해시켰다. 용액의 pH는 염산을 사용하여 5.5로 조절하고, 부피는 증류수를 사용하여 1000 ml로 만들었다. 제제를 멸균 처리하여 5.0 ml 앰퓰에 2.0 ml (활성 디아제피논 40 mg 포함)를 충전하고 질소 하에 밀봉하였다. 제제는 염증 또는 AIDS 환자에게 정맥내 투여된다.
실시예 12
국소 크림제의 제조
2,3-디히드로-7-에톡시-벤조푸라노-[2,3-f]-1,4-옥사제핀-5-온 500 mg을 세틸 알콜 15 g, 소듐 라우릴 술페이트 1 g, 액상 실리콘 D.C. 200 (미국 미시건주 미들랜드 소재 Dow Corning Co.사 제품) 40 g, 멸균수 43 g, 메틸파라벤 0.25 g, 및 프로필파라벤 0.15 g과 혼합하였다. 혼합물을 일정하게 교반하면서 약 75℃로 가온한 후, 반응물이 응고하는 실온으로 냉각시켰다. 이 제제는 염증 환자의 피부 표면에 도포된다.
본 발명에 의한 벤조티오펜, 벤조푸란 및 인돌 티아제피논, 옥사제피논 및 디아제피논은 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)의 활성화를 억제한다.

Claims (1)

  1. 치료 유효량의 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약학상 허용되는 산 부가염, 및 제약학상 허용되는 담체를 포함하는, HIV에 감염된 포유동물 치료용 제약 조성물.
    상기 식 중,
    R1, R2, R3및 R4는 각각 독립적으로 수소, 히드록시, 할로겐, 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알콕시, 벤질옥시, 트리플루오로메틸, 니트로, 또는 -NR8R9(여기서, R8및 R9는 각각 독립적으로 수소 또는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬임)이고;
    R5및 R6은 각각 독립적으로 수소, 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬 또는 페닐이고;
    X는 O, S(O)n또는 NR7이고;
    Y는 O, S(O)n또는 NR8이고;
    R7은 수소, 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 페닐, 벤질, CH2OR8또는 할로 치환된 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 페닐, 벤질이고;
    R8은 수소, 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬 또는 페닐이고;
    n은 0, 1 또는 2의 정수이되;
    다만, 1) X가 NH이고, Y가 NH이고, R1이 H이고, R3이 H이고, R4가 Br이면, R2는 메틸이 아니고; 2) X가 NH이고, Y가 NH이고, R1, R3및 R4가 H이면, R2는 메톡시 또는 에톡시가 아니고; 3) X가 NH이고, Y가 S이면, R1, R2, R3및 R4중 적어도 1개는 H가 아니다.
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