BG62698B1

BG62698B1 - Бензотиофен, бензофуран и индолтиазепинони, оксазепинони и диазепинони като инхибитори на клетъчна адхезия и на нiv

Info

Publication number: BG62698B1
Application number: BG100829A
Authority: BG
Inventors: Diane Boschelli; David Connor; James KRAMER; Paul Unangst
Original assignee: Warner-Lambert Company Llc
Priority date: 1994-03-07
Filing date: 1996-09-05
Publication date: 2000-05-31
Also published as: GR3032861T3; FI963462A; ZA951844B; GEP19991835B; NZ279737A; PH31163A; FI963462A0; UA45967C2; PL316197A1; JPH09509961A; SK114196A3; MD1688G2; CZ259796A3; US5565446A; EP0749434A1; SK282962B6; NO963744L; KR100325881B1; EP0749434B1; AU688466B2

Abstract

Изобретението се отнася до бензотиофен, бензофуран и индолтиазепинони, оксазепинони и диазепинони сформула, в която заместителите са с посочените в описанието значения и до методи затяхното получаване. Съединенията се прилагат като агенти, потискащи прилепването на левкоцитите към васкуларния ендотел, и като ефективни терапевтични агенти за лечение на възпалителни заболявания. Освен това потискат активността на вируса на човешката имунна недостатъчност /HIV/. </P>

Description

Предшестващо състояние на техниката

Изобретението е за нови бензотиофен, бензофуран и индолтиазепинони, оксазепинони и диазепинони и техните фармацевтично приемливи соли, които се използват за предотвратяване адхезията на левкоцити към ендотелиални клетки. Левкоцитното прилепване към васкуларния ендотелиум е неделима част от патогенезата на възпалението. Адхезионният процес предшества трансендотелиална миграция на левкоцитити в околната тъкан и следващата увредена тъкан. Съединения, които могат да блокират това първоначално адхезивно взаимодействие, се очаква да имат активност при лечението на възпалителни заболявания, като ревматоиден артрит, остеоартрит, астма и псориазис. Други индикации могат да бъдат включени, но без да ограничават синдрома на старо респираторно страдание, реперфузионно нараняване, исхемия, улцерозен колит, васкулитид, атеросклероза, възпалителни чревни заболявания и туморни метастази.

Адхезионните рецептори са обединени в три главни класа: селективни, имуноглобулинов супер клас и общи /Nature, 346:426 /1990/. Членовете на три класа са включени в междинната левкоцитна едхезия по време на възпаление (виж лит.източници Thrombosis and Hemostasis, 65 (3); 223 (1991), Clinical and Experimental Allergy, 20: (1990), Transplantation, 48;727 (1989), Biochemical Pharm., 40 (8): 1983 (1990)). Ендотелиалната левкоцитна адхезионна молекула-l /ELAM-I или Е-селективна/ е член на селективната група на гликопротеините, които предизвикват клетъчно-клетъчна адхезия. Докладвана е Еселективна молекула с максимално бързо действие върху повърхността на ендотелиални клетки 4 h след стимулиране на ендотелиалните клетки с цитокини, такива като интерлевтин-1 /IL-I/ туморнекрозисен фактор /TNF-а / или други възпалителни медиатори, такива като липополизахариди (LPS) (Pro. Nat. Acad.Sci., 84:9238 (1987)

Междуклетъчната адхезионна молекула-1 /1САМ-1/ е член на имуноглобулиновата супер група. Тя също не се регулира с максимално пресоване 12-24 h след дразнене. Показано е, че след 4 h ендотелиалните клетки се стимулират с възпалителен медиатор както е Е-селективна молекула, така и с ICAM1, представени върху клетъчната повърхност (J. Clin. In vest., 82:1746 (1988) and J.Immun., 137:1893 (1986), Blood, 78:2721 (1991)).

Показано е, че бензотиафенът, бензофуранът и индолтиазепиноните, оксазепиноните и диазепиноните съгласно изобретението потискат адхезията на неутрофилите към ендотелиалните клетки (HUVECS) на човешка пъпна вена, стимулирани с TNF-a в проба извън организма.

Изобретението се отнася също до нови тиазепинони, оксазепинони и диазепинони за лечение на хора, заразени с вируса на човешката имунна недостатъчност /HIV/, латентен в заразени хора.

Патогенезата на вируса на човешката имунна недостатъчност /HIV/ е сложна и затова не е напълно изучена. Цикълът на съществуване на вируса теоретично се разделя на аферентни и еферентни компоненти. Израстването, сливането, обратната транскрипция и крайното обединяване на вирусите са тези действия, които се включват в аферентния компонент на цикъла на съществуване. Това са аферентните компоненти на цикъла на съществуване на HIV, от които зависи и първичната инфекция с HIV на индивида, обикновено последната от избухване на виремия със или без клинични симптоми.

Много терапевтични стратегии са развити и пригодени за интервенция по време на аферентните действия, описани например в Mitsuya Н., Broder S., “Inhibition of the in vitro Infectivity and cytopathic effect on human T-lymphotropic virus type III/lymphadenopathy virus-associated virus (HTLV-III/LAV) by 2', 3’-Dideoxynucleosides, “Proc.Natl.Acad.Sci. (USA), 83:1911-1915 (1986).

Докато различните етапи на аферентния компонент предлагат възможността за ефективна терапевтична намеса, все повече става очевидно, че само интервенция в тези моменти е недостатъчна. След заразяване с HIV и развитие на заболяването през аферентните фази продължава период на клинична латентност, който може да продължи няколко години и индивидът да остане в добро здраве. При тази съвременна гледна точка са постигнати понижаване или отсъствие на виремия и вирусно възпроизвеждане в периферни кръвни клетки. В по-късен момент обаче заболяването евентуално прогресира до животозастрашаваща имуносупресия (AIDS), в който случай няма лечение. Тези по-късни случаи са клиничната демонстрация на еферентните фази на заразяване с HIV.

Еферентният компонент от цикъла на съществуване на HIV, необходими за успешно разкриване, превеждане, събиране и произвеждане на вириони. Началните действия, необходими за заразените с HIV клетки, за да се развият от асимптоматични в неизразителната фаза на HIV до симптоматични в изразителната фаза на HIV, са отбелязани като активност. Еферентният компонент и клетъчната основа не са напълно изучени. Въпреки това, ако нови терапевтични агенти и стратегии се усъвършенстват и използват по време на клиничната асимптоматична фаза за борба с развитието на AIDS, би могло да се направи някаква надеждна оценка на един милион заразени, но клинично латентни индивиди.

Техническа същност на изобретението

Изобретението се отнася до съединение

с формула	I^s
	γΑγΑ
II 1	Vv““ ^τ
II
^В' 1	0

или	негова фармацевтично приемлива

присъединителна с киселина сол, като всички заместители R_p R₂, R₃ и R₄ са независими и са избрани от водород, хидрокси, халоген, нисш алкил, нисш алкокси, бензилокси, трифлуорометил, нитро, или -NR₈R_g, като R_gи R₉ са независими и са избрани от водород или нисш алкил; R₅ и R₆ са независими и са избрани от водород, нисш алкил или фенил; X е 0, S(0)n или NR₇; Y е 0, S(0)n или NR_g; R₇ е водород, нисш алкил, фенил, бензил, OHjOR₈ или нисш алкил, фенил, бензил, заместен с халоген; R₈ е водород, нисш алкил или фенил; η е цяло число 0, 1 или 2; а при следните условия:

1/ когато Хе ΝΗ, Υ е NH, R, е Н, R₃ е Н и R₄ е Br, R₂ не е метил;

2/ когато X е NH, Y е NH, R,, R₃ и R₄ са Н, R₂ не е метокси или етокси, и

3/ когато X е NH, Y е S, като поне един заместител от R_p R₂, R₃ и R₄ не е Н.

Изобретението включва фармацевтични състави, съдържащи терапевтично ефективно количество от посоченото съединение с формула I и фармацевтично приемлив носител.

Трети аспект на изобретението е метод за лечение на заболявания, който се осъществява чрез потискане адхезията на левкоцити към ендотелиални клетки, включващ прилагане спрямо организъм на необходимия фармацевтичен състав, съдържащ съединението с формула I в единица дозирана форма.

В предпочитан вариант на метода за лечение на възпалително заболяване при хора се включва прилагане на противовъзпалително количество от съединение с формула I.

Четвърти аспект на изобретението е метод за лечение на организъм, заразен с HIV, който включва прилагане на фармацевтичен състав, съдържащ съединението с формула I в единица дозирана форма.

Термините, използвани при дефиниране на съединенията с формула I съгласно изобретението, са определени, както следва:

Нисш алкил и нисш алкокси означават алкилова или алкокси група с права или разклонена верига с 1 до 4 въглеродни атома и включват например метил, етил, пропил, iпропил, или са по друг начин отбелязани като /метил/етил, и t-бутил, или са отбелязани като 1,1-/диметил/-етил, или например, метокси, етокси, i-пропокси, или отбелязан като 1-/метил/етокси и други подобни.

Халоген включва флуор, хлор, бром или йод.

Съединенията с формула I са способни да образуват фармацевтично приемливи присъединителни с киселина соли. Всички тези форми са в обхвата на настоящото изобретение.

Фармацевтично приемливите присъединителни с киселина соли на съединенията с формула I включват соли, производни от неорганични киселини, като солна, азотна, фосфорна, сярна, бромоводородна, йодоводородна, флуороводородна, фосфориста и други подобни, както и соли, производни от нетоксични органични киселини, като алифатни моно- и дикарбонови киселини, фенил заместени алканови киселини, хидрокси алканови киселини, диалканови киселини, ароматни киселини, алифатни и ароматни сулфонови киселини и други. Такива соли включват сулфат, пиросулфат, бисулфат, сулфит, бисулфит, нитрат, фосфат, монохидрогенфосфат, дихидрогенфосфат, метафосфат, пирофосфат, хлорид, бромид, йодид, ацетат, трифлуороацетат, пропионат, каприлат, изобутират, оксалат, малонат, сукцинат, суберат, себацат, фумарат, малеат, манделат, бензоат, хлоробензоат, метилбензоат, динитробензоат, фталат, бензенсулфонат, толуенсулфонат, фенилацетат, цитрат, лактат, малеат, тартарат, метансулфонат и други подобни. Обмислени са също соли на аминокиселини, като аргинат и други подобни, и глюконат, галактуронат, N-метил глюконат /виж, например, Berge S.M., et al., “Pharmaceutical Salte,” Journal of Pfarmaceutical Science, 66:1-19 (1977)/.

Присъединителните c киселина соли на споменатите основни съединения се получават чрез контактуване на свободната основна форма с достатъчно количество от желаната киселина, за да се получи солна по конвенционален начин. Свободната основна форма може да бъде регенерирана чрез контактуване на солта с основа и изолиране на свободната основа по известен начин. Свободните основни форми се различават от техните соли малко, по известни физически качества, като разтворимост в полярни разтворители, но иначе солите са еквивалентни на тяхната съответна свободна основа за целите на изобретението.

Съединенията съгласно изобретението могат да съществуват както в неразтворими форми, така и в разтворими форми, вкл. хидратирани форми. Обикновено разтворимите форми, включващи хидратирани фор ми. са еквивалентни на неразтворимите форми и са предвидени да бъдат включени в обхвата на настоящото изобретение.

Съгласно изобретението е предпочитано съединение с формула I, в която R_pR. и R₄ са водород; R₂ има означението, определено по-горе.

Съгласно изобретението повече се предпочита съединение с формула I, в която R . R₃ и R₄ са водород; R₂ е водород или нисш алкокси; X е 0, S(0)_n или NR,; Y е 0 или S(0)_n; R_? е водород или нисш алкил, и η е 0, 1 или 2.

Особено ценни са следните съединения:

2,3-дихидро-9-метокси-/1 / бензотиено/

2.3- f /1,4-тиазепин-5/4Н/-он, 2,3-дихидро/1 / бензотиено/1,3-f/-l ,4-оксазепин-5/4Н/он. 2,3-дихидро-9-метокси-/1/бензотиено/ 2.3Ф/-1,4-тиазепин-5/4Н/-он-1-оксид, 3,4дихидро-9-метокси-6-метил-2Н-1,4оксазепино/6,7-Ь/-индол-5/6Н/-он, 2,3дихидро-1Н-бензотиено-/3,2-е/-1,4-диазепин-5-он, 2,3-дихидро-9-метокси-1Н-бензотиено-/2,3-Г/-1,4-оксазепин-5-он, 2,3дихидро-9-метокси-6-оксид-1Н-бензотиено/ 2.3-f/оксазепин-5-он, 2,3-дихидро-9-метокси-2-метил-1Н-бензотиено-/2,ЗЧ/-1,4-оксазепин-5-он, 2,3-дихидро-7,8,9,10-тетрахлор-1 Н-бензотиено/2,3-Г / -1,4-оксазепин-5он. 3,4-дихидро-8-нитро-6-терциерен-бутил2Н-1,4-оксазепин/6,7-Ь/индол-5/6Н/-он, 3. 4-дихидро- 9-изoπpoπokcи-6-φeнokcимeτил2H-l,4-okcaзeπин/ 6,7-Ь/индол-5/6Н/-он хидрохлорид, 3,4-дихидро-8,10-дибром-6-/3хлорбензил-2Н-1,4-оксазепино/6,7-Ь/индол5/6Н/-он, 2,3-дихидро-8-хлор-1Н-бензофуpaHo/2,3-f/-l ,4-оксазепин-5-он, метансулфонат, 2,3-дихидро-1,2,3-триметил-1Нбензофурано/3,2-е/-1,4-диазепин-5-он, и 2,3дихидро-3-хексил-1 Н-бензофурано/2,3-Г / -

1.4- тиазепин-5-он.

При определяне кога има инхибитор на клетъчна адхезия или инхибитор на активността на HIV, разбира се, inter alia, специалното състояние и неговата строгост, както и възрастта, пола, теглото и други подобни, на обекта за третиране, трябва да бъдат взети под внимание и това определяне да е по възможностите на асистиращ лекар.

За медицинско приложение, необходимото количество от съединение с формула I или неговата фармацевтично приемлива присъединителна с киселина сол за постигане на терапевтичен ефект ще варира в зависимост от отделното съединение, начина на приложение, бозайника, подложен на лечение, и спецификата на неговото заболяване. В предпочитан вариант съгласно изобретението е създаден метод за лечение на хора, страдащи от възпалително заболяване, като артрит или отичане, състоящ се в прилагане на противъзпалително ефективно количество. Подходяща доза на съединение с формула I или негова фармакологично приемлива присъединителна с киселина сол за бозайници, страдащи от или вероятно страдащи от посочено състояние е от 0,1 g до 500 mg от съединението на килограм телесно тегло. В случай на системно прилагане дозата може да бъде в границата от 0,5 до 500 mg от съединението на килограм телесно тегло, найпредпочитаната доза е 0,5 до 50 mg/kg телесно тегло два до три пъти дневно. В случай на локално приложение, т.е. през кожата или очите, подходящата доза може да бъде в границата 0,1 ng до 100 pg от съединението на килограм, по-специално около 0,1 pg/kg.

В случай на орално дозиране за лечение или профилактика на артрит или възпаление, обикновено дължащи се на някаква причина, подходяща доза на съединение с формула I или негова физиологично приемлива присъединителна с киселина сол може да бъде, както е определена в предходния параграф, но найпредпочитана е от 1 mg до 10 mg от съединението на килограм, най-предпочитана доза може да бъде и от 1 mg до 10 mg от съединението на килограм, най-предпочитана доза може да бъде и от 1 mg до 5 mg/kg телесно тегло на бозайника, например от 1 до 2 mg/kg.

Възможно е в началото да се прилагат относително ниски дози, след това да увеличава дозата, докато получи максимален отзвук.

Доколкото е възможно, активният компонент се прилага самостоятелно, но е за предпочитане да представлява фармацевтична формулировка, съдържаща съединение с формула I или неговата фармакологично приемлива присъединителна с киселина сол и съответно фармакологично приемлив носител. Такива формулировки представляват по-нататъшна особеност съгласно изобретението.

Формулировките както за ветеринарната, така и за хуманната медицина съгласно изобретението съдържат активен компонент, свързан с фармацевтично приемлив носител и в даден случай с друг терапевтичен компонент /и/. Носителят /носителите/ трябва да бъде съвместим с другите компоненти на формулировката и да не бъде вреден за получателя.

Формулировките включват компонентите в подходяща форма за орално, белодробно, очно, ректално, парентерално, включително подкожно, мускулно и венозно, интраартикуларно, локално, назално приложение или приложение в устната кухина. Такива формулировки, разбира се, включват продължително действащи формулировки, описани в литературата.

Формулировките могат да бъдат представени в удобна отделна дозирана форма и могат да бъдат получени по всички методи, известни от нивото на техниката. Всички методи могат да включват етап, който води активния компонент към присъединяване с носителя, който се състои от един или повече компоненти. Обикновено формулировките се получават чрез равномерно и интимно довеждане на активния компонент до присъединяване с течен носител или фино разделян твърд носител или и двата процеса, и след това, ако е необходимо, формоване на продукта в желаната формулировка.

Формулировки от изобретението подходящи за орално приложение, могат да бъдат под формата на отделни части като капсули, таблети или хапчета за смучене, съдържащи предварително определено количество от активния компонент под формата на прах или гранули, под формата на разтвор или суспензия във воден разтвор или неводен разтвор, или под формата на емулсия масло във вода или емулсия вода в масло. Активният компонент може също да бъде под формата на голям хап, сироп или паста.

Полезността на съединенията съгласно изобретението като инхибитори на левкоцитна прилепчивост към васкуларния ендотелиум и при лечение на свързан и възпаления, със заболявания или състояния, може да бъде демонстрирана чрез тяхната ефективност в различна стандартни тестуващи процедури.

Примерни изпълнения

Протокол за междуклетъчната адхезия при пресоване на пробата молекула-1/HUVEC (ICAM-I) и при пресоване на пробата Е/селективна/HUVEC (ESEL).

Клетъчна култура

Ендотелиални клетки от човешка пъпна връв от Clonetics (HUVECS) се поставят в колби с тъканна култура Т-25 и се оставят да израснат за 1-3 дни ппи 370 Сив присъствие на 5 % въглероден диоксид. След това HUVECs се разслоява чрез промиване на Т-25 с 10 ml 0,25% трипсин/0,01 % EDTA за 5-10 s, като се излива промитият разтвор. Добавят се други 10 ml от разтвора трипсин/EDTA и клетките се разбъркват 2-4 min при почукване на стената на колбата с молив с гума. След това съдържанието от колбата се излива в 50милилитрова центрофужна тръба, съдържаща 40 ml среда. Средата е ендотелиална основна среда, доставена от Clonetics, съдържаща хидрокортизон (2 mg/1), епидермален растежен фактор (0,05 pg/l), екстракт от волски мозък (12 mg/1) и горещ инактивиран ембрионален серум от прасец /6 % / от Нусюпе. Клетките се центрофугират при 15° С за ΙΟΙ 5 min, супернатантата се изцежда и клетките се ресуспендират със свежа среда. По идентичен начин клетките се промиват втори път и след това се посяват в културална тъкан, намираща се в блюда с 96 гнезда.

Цитокиново стимулиране

В рамките на 5 дни след достигане на сливане клетките се стимулират с тумор некрозисен фактор алфа (TNF a) (Genzyme), за да се получи крайна концентрация на средата 140 U/ml и се допуска да се поставят в инкубатор при 37° С за 4 h. След 4 h престой в инкубатора средата се отделя и съхранява за анализ на хемокинезния продукт. Клетките се промиват 3 пъти с чист буферен физиологичен разтвор на калциев и магнезиев фосфат. След това монокултурите се фиксират чрез добавяне на 10% буфериран формалин върху гнездата за 15 min. След фиксиране клетките се промиват 3 пъти с Dulbecco’s Modified Eagle Media (Gibco), съдържаща 2% волски серумен албумин (DMEM/2%BSA), и се охлаждат цяла нощ.

Elisa

Миша моноклонална античовешка

ICAM-1 (R & D Sysytems, или миша моноктонална античовешка Е-селективна (R & D, Cat No.BBA-2) Car No. BBA-4) /разтворена в DMEM/ 2% BSA се добавя към всяко гнездо при 0,5 pg/ml и се поставя в инкубатор при 370 за 2 h. След това HUVEC монокултурите се промиват 4 пъти с DMEM/2%BSA. Добавя се пероксидазна чифтова овча антимиша IgG (Cappel) /1:3,000 разреждане/ и се поставя в инкубатор 1 h при 37° С. След това клетките се промиват 4 пъти с DMEM; Добавя се цветен реагент (Biorad) към фиксираните клетки, които се поставят в инкубатор 15 min при стайна температура. Реакцията се прекратява с 2% разтвор на оксалова киселина и абсорбцията се регистрира при 414 nm върху плочата за титруване на измервателния уред.

Изпитване на съединение

Съединения се разтварят в DMSO при концентрации 30 mmol и се разреждат със средата до получаване на крайните концентрации за изпитване. HUVECs полученото съединение се разтваря в средата 30 min преди предизвикване на TNFa . Абсорбцията на нестимулираните HUVECs се изважда от абсорбционните стойности на TNFa стимулираните клетки, преди да се определи процентът на инхибиране. Процентът на инхибиране се определя чрез сравняване абсорбцията на ексципиентно третираните клетки с тази на клетките, третирани с лекарство. 1С₅₀се определя, като се използва линеен регресионен анализ.

Метод за определяне инхибирането на неутрофилна адхезия при хора на TNF-a стимулирани ендотелиални клетки на човешка пъпна вена /ЕСА/

Клетъчна култура

Посява се втори пасаж HUVEC (Clonetics Corporation, San Diego, California, CC2617) в Corning (Corning glass works, Corning, New York) блюда c 96 гнезда за клетъчна култура при приблизително 5 х 10³ клетки /гнездо и се оставя да израсне до сливане при добавяне на ендотелиална основна среда /ЕВМ, MCDB - 131, Clonetics, 10 ng/ml EGF, lp.g/ml хидрокортизон, 0,4% екстракт от волски мозък, 5% ембрионален волски серум/. Един ден преди обработване на пробата, обикновено три дни след посяване, към културите се добавя ЕВМ /S-ЕВМ/ в количество 0,2 ml/гнездо.

Получаване на съединения за изпитване

Съединения за изпитване се получават като 10 ml основни разтвори при концентрация 1,0 тМ. Съединенията първоначално се разтварят в 0,1 ml DMSO, последвано от прибавяне на 9,9 ml S-EBM. След това лекарствените препарати се разреждат еднократно до концентрация 66,6 μΜ. Разтварянията и разрежданията се извършват в полистиролови контейнери.

Стимулиране на HUBEC

Рекомбинантен човешки туморнекрозисен фактор-α /TNF, Genzyme, Boston, Massachusetts, code TNF-Н/ се получава при 400 U/ml в S-EBM. Основен TNF се получава при 20,000 U/ml в Delbecco’s фосфатен буферен физиологичен разтвор (PBS, Gibco, Grand Island, New York) плюс 0,1% BSA и се съхранява при -70° С. HUVEC се промива един път с 0,2 ml затоплен ЕВМ и след това се стимулира за 4 h при 37° С с 200 U/ml TNF в присъствието на 33,3 μΜ изследвано съединение. Това се извършва чрез добавяне на 0,1 ml от 400 U/ml TNF и 0,1 ml 66,6 μΜ изследвано съединение. Тези добавки се правят бавно, без да се разрушава HUVEC монослоят. Всяко съединение се изследва в шест гнезда. Нестимулирано /вехикулумна контрола/ и TNF стимулирано третиране, без изпитвано съединение, се извършва във всяко плато.

Маркиране на неутрофили

Един час преди да се добавят неутрофилите към HUVEC, неутрофилите /5 х 106 /ml/ се маркират за 30 min при 37° С с μΜ калцеин-АМ (Molecular Probes, Eugene, Oregon) в разтвор на балансирана сол на Hanks плюс 0,45% BSA. Приготвя се до 5 тМ калцеинова добавка в безводен DMSO и се 5 съхранява изсушена при -20° С. В края на престоя в инкубатора клетките се промиват два пъти в студен HBSS и се ресуспендират до крайна концентрация 1 х 106 клетки/ml в добавения ЕВМ.

Добавяне на неутрофили към HUVEC

В края на 4-часовото стимулиране, предшестващо незабавно добавянето на неутрофилите към монослоя от HUVEC, платата се промиват с 0,2 ml подгрят ЕВМ, за 15 да се отдели TNF и лекарството. Бавно се добавят неутрофили /1 х 10^J клетки/ към всяко третирано гнездо и се поставя в инкубатор за 30 min при 37° С. В края на престоя в инкубатора платата се промиват 20 два пъти с 0,2 ml затоплен ЕВМ, последвано накрая от добавяне на 0,1 ml за разлагане.

Определяне на относителната флуоресценция

Относителната флуоресценция се опре25 деля, като се използва система Millipore Cytofluor 300 /възбуждане = 480, емисия = 530, чувствителност = 4/.

Изчисления

Анализът се счита валиден, ако от 30 стимулирането с THF та HUVEC произтича 300% увеличение на неутрофилната адхезия спрямо адхезията при нестимулирана HUVEC. Резултатите се изразяват чрез процент и инхибиране на стимулирана с THF адхезия 35 по следната формула:

% Инхибиране = 100 Стимулирана Нестимулирана адхезия /лекарство/ - адхезия

Стимулирана Нестимулирана адхезия /контрола/ адхезия

Някои от тези съединения се изследват при концентрации 33,3 μΜ, 3,3 μΜ, и 1,0 μ М, за да се определят IC_J0 стойностите. За определяне на 1С₃₀ се използва линеен регресивен анализ на средните стойности на инхибирането.

Получените резултати с някои съединения от изобретението са показани в таблица I.

Съединенията от изобретението, поспециално тези с формула III, се прилагат, за да инхибират активността на вируса на човешката имунна недостатъчност /HIV/, латентен при заразени бозайници, и след това се използват за лечение на AIDS.

Опитите да се разбере вирусологията и клетъчна основа за клиничния асимптоматичен период показват, че HIV съществува като латентен или неизразителен провирус в хронично заразените клетки на биомасата. Специфичният тип HIV и HIV-1 е предмет на различни изследвани обекти, които показват, че вирусът съществува като латентен или неизразителен провирус в хронично заразените Т-лимфоцитни клетки на биомасата. Поголяма част, засягаща ядрените и биохимичните механизми, отговорни за поддържането на неизразителното вирусно състояние обаче, е извън обсега на това изложение, но може да бъде открита подробно в литературата, например в Mechanisms of HIV-I Latency, Bednarik, et al., AIDS 6:3-16 (1992).

До неотдавна се предполагаше, че HIV е латентен или неизразителен във всички хронично заразени клетки на хората по време на клиничния асимптоматичен период. Покъсни наблюдения за отсъствие на виремия и вирусен отговор в периферни кръвни клетки водят до впечатлението, че заболяването от HIV не е активно по време на клиничния асимптоматичен период. Установено е обаче, че определено състояние на микробиологична латентност не съществува по време на развитието на заразяването с HIV. Fauci A.S., et al., HIV Infection is Active and Progressive in Lymphoid Tissue During the Clinically Latent State of disease, Nature 362:355-358 (1993).

Съобщава се за разделение между нивата на вирусно натоварване и вирусна репликация в периферна кръв в сравнение с лимфоидни органи по време на клинична латентност. Базирайки се на тези констатации учените откриват, че “периферна кръв неточно отразява актуалното състояние на заболяване от HIV, рано в клиничния ход на инфекцията с HIV. Фактически заболяването от HIV се активизира и прогресира даже когато има малко доказателства за болнична активност чрез незабавно измерване на вирусни параметри в периферна кръв и пациентът преживява клинична латентност”.

Неизбежно състоянието на заболяването от HIV се разширява от клинично латентен асимптоматичен период до изразителен и активен симптоматичен период. Чрез използване на няколко различни модела се схващат клетъчните проводящи пътища, въвличащи в HIV активност от започване до развиване на лабораторна латентност. Според Butera, et al., AIDS, 6:994 (1992) много клетъчни модели на латентност могат да предизвикат потискане на HIV -1 чрез лечение с цитокини. Това означава, че в състояние на микробиологична латентност HIV-1 очаква извънклетъчно стимулиране, преди да започне репликация. Този сигнал не само може да бъде осреднен чрез взаимодействие на разтворим цитокин с неговия рецептор, но също и чрез рецепторрецепторни взаимодействия, които се случват по време на междуклетъчно комуникиране или клетъчен стрес като излагане на UV светлина и топлинен шок. По-нататък извънклетъчният индукционен сигнал може да бъсе генериран по “autocrine” или “paracrine” начин така, че клетка, активирана с HIV-1, може да се размножи, като активира близка латентна клетка.

Допълнителни фактори се обмислят от специалиста в областта, за да бъдат включени при активирането на HIV. Едно изследване показва, че междинни CD4 12-0-тетрадеканоил-форбол-13-ацетати /ТРА/ регулират и потискат вируса в заразени клетки с HIV . Hamamoto, et al., Biochem.Biophys. Res. Commun., 164:339-334 /1989/. Интересно e, че Hamamoto също изпитва ефекта на силните протеиново-киназни С инхибитори стауроспорин, Н-7, и UCN-01 върху ТРА-осъществяващ CD4 регулиране и увеличаване на изражението на HIV. Установено е, че стауроспоринът е ефективен ТРА инхибитор за тези две действия.

Много по-малко ясните клетъчни проводящи пътища включват косвено активния сигнал от плазмената мембрана до интегрираните вируси, водещо до явява на HIV-1. За развитието на сигурна и проста система за оценяване на съединенията, които могат да предотвратят активиране на латентен HIV, е съобщено в The National Cooperative Discovery Grant (NCDDG)/AIDS by P.Feorino, S.T.Butera, T.M.Folks, and R.F. Schinazi, November 3-7, 1991. Аналитичната система използва клетъчна линия ОМ-10.1 на хронично заразен промиелоцитичен клон, чийто остатък CD4+ се активира до HIV-1 с туморнекрозисен фактор-α . Въздействието на CD+4 върху клетъчната повърхност и активността на реверсивната транскриптаза се използва като маркер за количествено вирусно изразяване. Могат да бъдат използвани други маркери на HIV, като протеазна активност, които са известни от литературата. Клетки ОМ-10.1 оставят CD4+ да се активира до вирус и да отговори на индукцията на туморнекрозисния фактор, а по-нататък тези култури се използват за удобни и бързи фармакологични изпитвания относно способността да се предотврати намаляване моду лирането на CD4+ /намаляване въздействието на CD4+ /намаляване въздействието на CD4+ върху клетъчната повърхност/ и развиване на HIV-1.

Известно е, че различни съединения имат антивирусни свойства както срещу акутно, така и срещу хронично заразени клетки, и са оценени по тяхната способност да потискат развитието на HIV в тези ОМ10 10.1 клетки. Изпитани са също няколко съединения, които взаимодействат по биохимичен начин така, че могат да пречат чрез реактивационен процес. Резултатите от оценката са представени на постер на 15 NCDDG/AIDS, San Diego, California, November 3-7 (1991). Между приблизително 48 оценени съединения, 3'-флуоро-3'-дозокситимидин /FLT/, интерферон Y, и дезфериоксамин се считат слаби инхибитори 20 на активността на HIV-1.

Представително съединение с формула I, 2,3-дихидро-9-метокси/ 1/бензотиено/2,3f/-1,4-тиазепин-5/4Н/-он, показва 1С₅₀0,21 μΜ инхибиране в ОМ-10,1 клетки /таб25 лица 1/.

Таблица 1

о

2,3-дихидро-9-метокси-/1 /бензотиено/2,3-f /-1,4-тиазепин-5 /4Н/-он

ECA ICAM/ESEL ОМ-Ю

Пример		X	Y	/1С50/	IC50 или % 30 μΜ	, инхиб. /1С50
1	ОМе	S	S	5,2	3,1/1,3	.21
2	Н	S	0		42%/40%	>30
4	ОМе	NMe	0		14,7/14.2
5	Н	S	NH		64%/47%
6	ОМе	S	0		3,1/7,5
7	ОМе	S-0	0		30%/30%
8	ОМе	S	0 /2-метил/		3,3/5,3

Съединенията от изобретението показват активност in vivo в стандартни проби за измерване на тяхната активност за потискане прилива на неутрофили и съответно тяхната способност да лекуват възпалителни състоя- 5 ния. В един тест, наречен The Reverse Passive Arthus Pleurisy Assay, мъжки плъхове Wistar (220-245 g, Charles River Laboratories) ce оставят да гладуват от 16 до 18 h. Ексципиент /1:1, етанол:физиологичен разтвор/ или съе- 10 динение от изобретението, разтворено в ексципиент, се прилага IV. Животните леко се анестезират с етер и се поставя IV инжекция от 2,5 mg волски серумен албумин (BSA) във физиологичен разтвор. Незабавно след IV 15 инжекцията се прави малък разрез между ребрата и 0,2 ml заешка IgG фракция антиBSA /10 mg/ml в Dulbecc’s фосфатен буферен физиологичен разтвор (PBS)) в PBS се инжектира в плевралната кухина, като се използва 20 дозираща игла за орално третиране, размер

20. След това разрезът се разтваря с 9-mm щипка за рана от неръждаема стомана. Четири часа по-късно животните се умъртвяват с въглероден диоксид и плевралната кухина се промива с 2 ml 0,325% разтвор на phenol red PBS. Ексудатният буфер се отделя от плевралната кухина за анализ. Белите кръвни телца /90% неутрофили/ се преброяват, като се използва Coulter counter. Обемът на плевралния ексудат се измерва чрез оцветяването по метода на разреждане /Carter G.M., et al., J.Pharm.Pharmacol. 34:6667 (1982). Групи, третирани с лекарство, се сравняват с група, третирана с ексципиент, и статистическата значимост се определя, като се използва t-тестът на Student.

Когато съединението от пример 1 се оценява по посочения тест, то проявява следните инхибирания:

Доза /mg/kg/	Процент инхибиране на ексудат	Процент инхибиране на прилив на неутрофили
0,3	40,5	18,6
1,0	28,4	8,9
3,0	28,2	15,9

В друг in vivo анализ, наречен The Thioglycollate - induced neutrophil influx assay, женски Balb/ c мишки от същото потекло се отглеждат в групи по седем със свободен достъп до храна и вода през време на изследването. Животните се третират орално с ексципиент /0,5% хидроксипропил метил целулоза с 0,2% Tween 80/ или съединение от изобретението, разтворено или суспендирано в ексципиент. Един час след оралния прием мишките се анестезират с диетилов етер чрез инхалация и интраперитонеално се инжектират с 1,0 ml 3% тиогликолат във физиологичен разтвор. Два часа след тиогликолатната инжекция, животните се умъртвяват чрез задушаване с въглероден диоксид и се инжектират с 6 ml Dulbecco’s PBS, съдържащ 10 U/ml натриев хепарин и 0,1% BSA. Перитоналната кухина се масажира и се прави разрез в кухината, за да се позволи на течността да се събере в 15 ml центрофужни епруветки.

Аликвотна част се отделя от всяко животно и общият брой клетки във всяка аликвотна част се преоброява, като се използва Coulter Counter (Model Zbi, Coulter Instruments, Hialeah, Florida). Отделя се втора аликвотна част за микроскопия, като се използва Cytospin 2 (Shandon Inc., Pittsburgh, Pennsilvania), и се извършва следващо оцветяване /модифицирано Wright’s оцветяване/. Използват се диференциални хематологични изследвания, за да се определи процентът на неутрофилите, които са проникнали в перитонеалната кухина.

Когато се оценява съединението от пример 1 по този начин, то проявява 26,1% инхибиране на прилив на неутрофили при 10 mg/kg, 31,9% инхибиране при 30 mg/kg, и 34,3% инхибиране при 100 mg/kg.

Съединенията от изобретението могат да бъдат получени по следните методи.

Първият общ подход се нуждае от изходни материали, като 3-хидрокси, тиол, или амино-бензо/Ь/тиофен, бензофуран или индол-2-карбоксилатни естери със структура 1 /схема 1/. З-хидрокси-бензо/Ь/тиофен-2естерите се получават, както е документирано /Connor D.T., et al., J.Med.Chem., 35:958 (1992) /. З-тио-бензо/b/тиофен-2-карбоксилатните естери се получават чрез обработване на аналозите на 3-хлор-производно Connor D.T., et al., J.Med.Chem., 35:958 (1992)/ c тиоацетамид в присъствието на основа като

I, 8-диаза-бицикло /5.4.0/-ундек-7-ен (DBU) и разтворител като N,Ν’-диметилформамид или тетрахидрофуран. З-амино-бензо/Ь/ тиофен-2-карбоксилатните естери се получават по известен общ метод /Beck J.R.,

J. Org.Chem., 37:3224 (1972)/. 3-хидроксииндол-2-карбоксилатните естери се получават по известни методи, като описаните в Unangst

Р.С., etal., J.Heterocyclic Chem., 24:811 (1987) и Moyer M.P., et al., J.Ord.Chem., 51:5106 (1986). З-тиоиндол-2-карбоксилатните естери се получават по известни методи като Unangst

Р.С., etal., J.Heterocyclic Chem., 24:811 (1987); ATKINSON J.G., et al., Synthesis, 480 (1980); u Nagarajan K., et al. Indian J.Chem., 20B:672 (1981). З-амино-индол-2-карбоксилатни естери се получават по известни методи като Simakov S.V., et al., Khim.-Farm., Zu., 17:1183 /1983/.

Конверсията на съединения тип 1 до тези от изобретението е показана на схема 1. Естерите се обработват с производно на ахалоген заместен ацетонитрил, като бромоацетонитрил в присъствието на основа, като калиев t-бутоксид в тетрахидрофуран, ацетонитрил, или диметилсулфоксид при 0-80°С, за да се осигурят естери от тип 2. Нитрилната група се редуцира до съответния първичен амин и полученото междинно съединение 3 се циклизира до лактама 4. Предпочитана конверсия е хидрогениране на 2 с рений кобалтов катализатор в разтворител като тетрахидрофуран в присъствието на основа, такава като триетиламин при повишена температура и налягане. При тези условия 4 се получава директно от 2. Ако междинно съединение 3 е изолирано, то циклизира до 4 под въздействие на алкално съединение, за предпочитане NaOMe в метанол, или при кисели условия, за предпочитане полифосфорна киселина, при повишена температура.

По време на синтеза на някои съединения от изобретението може да бъде необходимо или желателно да се преобразуват реактивни групи, като хидроксилна, амино и карбоксилна до производни, които ще ги защитят от нежелани странични реакции, когато желаната реакция протича някъде другаде в молекулата. Такива защитени хидроксилна, амино и карбоксилна групи са готови да станат незащитени по конвенционални методи. Обикновено използвани химически неопределени части, чрез които се защитават реактивни групи, като хидроксилна, амино и карбоксилна, и методи за тяхното присъединяване и след отстраняване, са описани от Greens и Wuts в Protective Goups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1991.

Например, 3-амино, 3-хидрокси, или 3тио индол, бензотиофен, или бензофуран /съединение 1 от схема 1 / могат да реагират с β-халоген-етиленамин, където аминогрупата е защитена с подходяща защитна група /PG/, като t-бутоксикарбонил /Вос/ или бензилоксикарбонил /Cbz/. Реакция при същите условия, както е описано по-горе, осигурява съединение от тип 5. Отнемане защитата /т.е. отделяне на PG/ на 5 при стандартни условия, т.е., трифлуороцетна киселина или воден разтвор на киселината за отделянето на ВОС или хидрогенолиза за отделяне на Cbz осигурява съединения от типа 3, които циклизират, както е отбелязано по-рано. Друг подход е взаимодействието на съединения от тип 1 с етиленамин в алкохолен разтворител до директно получаване на 3 /виж: Nagarajan К„ et al. Indian J.Chem., 20B: 672 (1981)/.

Втори общ подход /схема 2/ за съединение от типа 4 е от съответните 3-халоген производни 6. Взаимодействие на 6 с етилендиамин и меден оксид в разтворител, като, пиридин в присъствието на основа, като калиев карбонат, осигурява съединения от типа 3, където Y е NH /виж: Hiremath S.P., et al., Proc.Nat.Acad.Sci., India, 60:367 (1990)/. Взаимодействие на 6 c цистамин в разтворител като диметилформамид в присъствието на основа като DBU осигурява съединения от тип 3, където Y е S. Взаимодействие на 6 с нитроетанол в разтворител като тетрахидрофуран в присъствието на основа като калиев t-бутоксид или калиев хидрид осигурява съединения от тип 7, След това редукция на нитрогрупата до амин води до съединение от тип 3, където Y е 0. В някои от посочените случаи 3 може да не бъде изолирано, но 4 може да бъде получено директно.

При трети общ подход /схема 3/ също се използват 3-халоген производни 6. 3-халоген производното се обработва с първичен амин, който съдържа подходящо защитена амино, хидроксилна или тиолова група на β позиция, за да се образува амидна група, осигуряваща междинно съединение от типа 7. Следващо отнемане на защитата чрез циклизиране води до съединения от типа 4. Сходна последователност започва с 3-хидрокси, тиолово или аминово съединение, като се добавя амин с подходяща отцепваща се група на β позиция. Получените междинни съединения от тип 8 след това се циклизират до получаване на 4.

Тези съединения от тип 4, където X е S 5 и Υ е 0 или NR могат да бъдат превърнати в съответния сулфоксид и/или сулфон, 9, с окисляващ агент като т-хлорпербензоена киселина /т - СРВА/ или оксазиридин при реакционни условия, определящи степента 10 на окисление /схема 4/. За тези съединения от типа 4, където Υ е S, подобно окисляване би могло да осигури както сулфоксида, така и сулфона от тип 10.

Условията в описаните схеми от 1 до 4 15 и вариантите в описанието са известни или веднага могат да бъдат определени от известни аналогични реакции.

Схема 1

основе у.~и киселина | /ако се изисква/ *

Схема 1 /продължение/Схема 1

NaOMe/MeOH or PPA

Схема 2

COOMe

редукция |

Схема 3

R' = OH, ОМе,Cl основа

H₂N-CH(R₆) CH(R₅)LG

Схема 4

Следните примери са илюстрация на получаването на съединенията от изобретението.

Пример 1. 2,3-дихидро-9-метокси/1/ бензотиено/2,3-Г/-1,4-тиазепин-5/4Н/-он

При стайна температура към разтвор на метил З-хлор-5-метокси-бензо/Ь/тиофен2-карбоксилат /500 mg, 1,95 mmols/ /получен чрез взаимодействие на известния З-хлор-5метокси-бензо/Ь/тиофен-2-карбонил хлорид с метанол-/.!.Med.Chem., 35:958 /1992/// в 20 ml DMF се добавя цистамин-НС1 /885 mg, 7,79 mmol/ последвано от DBU /2,33 ml, 15,58 mmol/. Реакционната смес се разбърква при стайна температура в продължение на 1,5 h, след това се затопля до 70°С. Сместа се разрежда с етилов ацетат и се промива с воден разтвор на НС1, вода и солна луга. Органичният слой се изсушава над MgSO₄, филтрува се и се концентрира под вакуум. Суровият продукт рекристализира от хексан и етилов ацетат, за да се получи 2,3-дихидро-9-метокси/1 /бензотиено/2,З-f/-1,4-тиазепин-5/4Н/ -он, с добив 74%; т.т. 209-209,5°С.

Пример 2. 2,3-дихидро-/1/бензотиено/

2.3- f/-1,4-оксазепин-5/4Н/-он

Смес от метиловия естер на 3-/цианометокси/-бензо/Ь/тиофен-2-карбоксилна киселина/405 mg, 1,64 mmols/ /J.Hetero.Chem., 12:1037 /1975//, 0,5 ml Et₃N и 0,50 g RaCo в 50 ml THF се загрява при 100°C в атмосфера от водород при 1200 psi. Реакционната смес се концентрира под вакуум. Колонно хроматографско елюиране със смес хексан:етилов ацетат /1:1/ спрямо цялото количество етилов ацетат осигурява 2,3-дихидро-/1/бензотиено/

2.3- Г/1,4-оксазепин-5/4Н/-он с добив 55%; т.т. 244-245°С.

Пример 3. 2,3-дихидро-9-метокси-/1/ бензотиено/2,3-f/ -1,4-тиазепин-5/4Н/-оноксид

Смес от 2,3-дихидро-9-метокси-/1/ бензотиено/2,3-Г/-1,4-тиазепин-5/4Н/-он / 200 mg, 0,75 mmol/ и NaBO₃-4H₂0 /116 mg, 0,75 mmol/ в 18 ml AcOH се разбърква цяла нощ. Реакционната смес се филтрува и към филтрата се добавя 60 ml вода. След филтруване се получава 2,3-дихидро-9-метокси-/1/ бензотиено/2,3-f-1,4-тиазепин-5/4Н/ -он-1 оксид с добив 69%; т.т. 215-216°С /намаление/.

Пример 4. 3,4-дихидро-9-метокси-6 метил-2Н-1,4-оксазепино/6,7-Ь/-индол-5/ 6Н/-он

A. Метил 3-/цианометокси/-5-метокси-

-метил-1 Н-индол-2-карбоксилат

Суспензия от калиев терциерен бутоксид /3,2 g, 29 mmol/ в 60 ml диметилсулфоксид се обработва на части с метил З-хидрокси-5метокси-1 -метил- 1Н-индол-2-карбоксилат /5,6 g, 24 mmol; Unangst Р.С., et al., J.Heterocyclic Chem., 24:811 1987//. Сместа се разбърква 15 min и се добавя на капки хлорацетонитрил /4,8 ml, 5.7 mmol/. Сместа се загрява при 80°С в продължение на 90 min, охлажда се, и добавя 800 g лед и вода. Утаеното твърдо вещество се филтрува, промива се с 10% метанол-вода, и рекристализира от воден разтвор на ацетонитрил, за да се получат 3,9 g /60%/ от продукта; т.т. 136-137°С.

B. Смес от метил 3-/цианометокси-5метокси-1 -метил-1 Н-индол-2-карбоксилат /0,60 g, 2,2 mmol/ и триетиламин /0,40 ml, 0.29 g, 2,9 mmol/ в 35 ml тетрахидрофуран се обработва с рений кобалтов катализатор /0,40 g/ в реакционен съд под налягане. Реакторът е под налягане с водород /590 psi/ и се загрява при 80°С за 10 h. Охладената реакционна смес се филтрува и филтратът се изпарява. Маслообразният остатък се разтваря в 50 ml метанол и към разтвора се добавя натриев метоксид /0,80 g, 15 mmol/. Сместа се загрява на обратен хладник в продължение на 3 Ь,след това се охлажда и изпарява. Остатъкът се разпределя между 75 ml етилов ацетат и 150 ml солна луга. Водният слой се екстрахира няколко пъти със свеж етилов ацетат. Събраните органични слоеве се промиват със солна луга, изсушават се /безводен натриев сулфат/ и се изпаряват. Утайката от суров продукт се пречиства чрез флаш хроматография /силикагел, 5% метанол и дихлорметан - елюиране/, за да се получат 0,18 g /33 %/ от продукта. Проба, рекристализирана от етилов ацетат-хексан, има т.т. 184-186°С.

Пример 5. 2,3-дихидро-1Н-бензотиено/3,2-е/-1,4-диазепин-5-он

3-/2-аминоетиламино/бензо/Ь/тиофен-2-карбоксилно кисел метилов естер хидрохлорид

Разтвор на 2-/4,5-дихидро-1Н-имидазол-2-ил/бензентиол /1,00 g, 5,62 mmol/ /Hegen, H.,Fleig, H.Justus Liebigs Ann.Chem.

11:1994 /1915/ / и хлорметилов ацетат /1610 mg, 5,62 mmol/ в 15 ml метанол се загрява на обратен хладник в продължение на 90 min. Охлажда се до стайна температура и се филтрува. Филтратът се концентрира до сухо и утайката се разтваря в топъл хлороформ. След няколко часа получената утайка се събира и изсушава. Матерният разтвор може да образува кристали на хидрохлорид на метилов естер на 3-/2-аминоетиламино/ бензо/Ь/тиофен-2-карбоксилна киселина с практичен добив 61%, т.т. 219-220°С.

2,3-дихидро-1Н-бензотиено-/3,2-е/-1,4диазепин-5-он

Разтвор на хидрохлорид на метилов естер на 3-/2-аминоетиламино/бензо/Ь/тиофен-2-карбоксилна киселина /339 mg, 1,18 mmol/ и току-що приготвен натриев метоксид /от 134 mg, 2,48 mmol натрий/ в 5 ml метанол се загрява на обратен хладник в продължение на 18 h. При охлаждане се неутрализира с 25 ml 1 N НС1 и се охлажда до 0°С за 1 h. Полученият жълт кристален продукт се филтрува и се изсушава под вакуум при 60°С в продължение на няколко часа, за да се получи 2,3-дихидро1Н-бензотиено-/3,2-е/-1,4-диазепин-5-он с добив 64%. Хроматографски се елюира с 2% метанол в етилов ацетат и 5% метанол в етилов ацетат, за да се получи аналитично чист 2,3-дихидро-1 Н-бензотиено-/3,2-е/-1,4диазепин-5-он, т.т. 210-212°С.

Пример 6. 2,3-дихидро-9-метокси-1Нбензотиено-/2,3-1/-1р4-оксазепин-5-он

З-цианометокси-5-метокси-бензо/Ь/ тиофен-2-карбоксилно кисел метилов естер

При стайна температура към разтвор на метил-З-хидрокси-5-метоксибензо/Ь/тиофен-2-карбоксилат /1,00 g, 4,2 mmol/ /Connor, et al., J.Med.Chem. 35:959 /1992// в 20 ml DMSO се добавя калиев t-бутоксид /494 mg, 4,41 mmol/, последван от бромацетонитрил /878 1, 12,58 mmol/. Сместа се разбърква при стайна температура за 1,5 h, след това се излива в етилов ацетат и IN НС1. Органичният слой се промива с IN НС1, последвана от няколко порции солна луга и се изсушава върху MgSO₄. Следва филтруване за отстраняване на разтворителя под вакуум и рекристализация на утайката от етилов ацетат:хексан, за да се получат 413 mg. Допълнително образуваните 112 mg кристали могат да бъдат получени от матерния разтвор, т.т. 159,5-160°С.

2,3-дихидро-9-метокси-1Н-бензотиено/2,3-1/-1,4-оксазепин-5-он

Разтвор на метилов естер на 3-цианометокси-5-метокси-бензо/Ь/-тиофен-2-карбоксилна киселина /2,5 g, 9,0 mmol/1 50 ml THF се загрява интензивно на обратен хладник. Бързо се добавя боранов биметил сулфид /9,0 ml, 90,2 mmol/ и се загрява в продължение на 25 min, като добавеният THF се изпарява. Добавя се допълнително количество боранов диметил сулфид /4,0 ml/ и се загрява в продължение на 10 min. Реакционната смес се охлажда до 0°С и внимателно се добавя 50 ml 6N НС1. Отделя се водород и температурата на реакционната смес се повишава. Получената утайка се събира чрез филтруване, промива се с вода и се изсушава под вакуум цяла нощ.

Твърдото вещество /2,3 g, 8,2 mmol/ се добавя към току-що приготвен разтвор на натриев метоксид / от 1,9 g, 82,0 mmol натрий/ в 40 ml метанол. Реакционната смес се подгрява до 50°С в продължение на 2 h, след това се загрява на обратен хладник в продължение на 2 h. След охлаждане до стайна температура утайката се събира и промива със стеден метанол, последван от студен диетилов етер. Твърдото вещество се изсушава под вакуум цяла нощ, за да се получи 1,18 g /52%,/· Аналитична проба от 2,3дихидро-9-метокси-1Н-бензотиено-/2,3-1/-

1,4-оксазепин-5-он се получава чрез рекристализация от етилов ацетат:хексан, т.т. 264-265°С.

Пример 7. 2,3-дихидро-9-метокси-6оксид-1 Н-бензотиено-/2,3-f/-1,4-оксазепин-

5-он

Към суспензия от 2,3-дихидро-9-метокси-1Н-бензотиено-/2,3-1/-1,4-оксазеин-5-он /1,00 g, 4,0 mmol/ в 100 ml затоплен метанол се добавя 30% водороден прекис /8,0 ml, 80 mmol/, последван от селенов диоксид /445 mg, 4,01 mmol/. Реакционната смес се разбърква при стайна температура в продължение на 3 h, след това се загрява при 30°С за 2 h. Реакционната смес се охлажда до 40°С и получената утайка се събира чрез филтруване. Утайката се елуира хроматографски с 5% метанол в етилов ацетат постепенно, като се увеличава полярният разтворител, до 1:1 метанол:етилов ацетат, за да се получат 338 mg от продукта. Аналитична проба от 2,3-дихидро-9-метокси-6-оксид-1Нбензотиено-/2,3-f/ -1,4-оксазепин-5-он се получава чрез рекристализация от метанол:етилов ацетат, т.т. 273-2730С.

Пример 8. 2,3-дихидро-9-метокси-2метил-1 Н-бензотиено-/2,3-Г/ -1,4-оксазепин-

5-он

Метилов естер на 3-/1-цианоетокси/5-метокси-бензо/Ь/тиофен-2-карбоксилна киселина 10

При стайна температура към разтвор на метил З-хидрокси-5-метоксибензо/Ь/тиофен-2-карбоксилат /1,00 g, 4,2 mmol/ /Connor, et al., J.Med Chem. 35:958 /1992// в 20 ml DMSO се добавя калиев t-бутоксид /494 mh, 4,41 mmol/, последван от 2-хлоропропионитрил /1,1 ml, 12,6 mmol/. Сместа се разбърква при стайна температура в продължение на 1,5 h, след което се затопля до 82°С за 3 h.

Реакционната смес се излива в етилов ацетат 20 и 1 N НС1. Органичният слой се промива с IN НС1, последвана от няколко порции солна луга, и се изсушава над MgSO₄ филтруване, след което се отделя разтворителят под вакуум, и рекристализация на утайката от етилов ацетат: хексан дават 853 mg, т.т. 127129°С.

2,3-дихидро-9-метокси-2метил-1Н-бензотиено-/2,3-17-1,4-оксазепин-5-он

Ратвор на метилов естер на 3-/1-цианоетокси/-5-метоксибензо/Ь/-тиофен-2-карбоксилна киселина /400 mg, 1,37 mmol/ в 10 ml THF се загрява интензивно на обратен хладник. Добавя се на капки боран-диметилов сулфид /1,4 ml, 13,7 mmol/ и се загрява в продължение на 20 min с добавения THF, който се изпарява. Реакционната смес се охлажда до стайна температура и внимателно се добавя 7,5 ml 6N НС1. След 5 min реакционната смес се охлажда до 0°С и се добавят 68,5 ml IN NaOH, последвана от етилов 5 ацетат. Слоевете се разделят и органичната фаза се промива със солна луга:вода /1:1/ и след това допълнително - със солна луга. Органичната фаза се изсушава над MgSO₄, филтрува се и се концентрира под вакуум. Утайката се елюира хроматографски с метанол:хексан:хлороформ в съотношение 5:25:70 до 10:90 метанол:хлороформ или до 30:70 метанол:хлороформ, за да се получат 135 mg от продукта. Аналитична проба от 15 2,3-дихидро-9-метокси-2-метил-1Н-бензотиено-/2,3-1/-1,4-оксазепин-5-он се получава чрез рекристализация от етилов ацетат: хексан, т.т. 185-186°С.

Съединенията от изобретението лесно се комбинират с обикновени разредители и носители за удобно орално или парентерално приложение от хора и животни за лечение на заболявания като възпаление, по-специално артрит и други подобни.

Следните примери поясняват получаването на типични фармацевтични препарати.

Пример 9. Получаване на капсула от 250 mg

2,3-дихидро-9-изопропокси-7-хлор-1Н30 бензотиено-/2,3-1/-1,4-оксазепин-5-он /250 mg/ се смесва равномерно с 150 mg лактоза и 150 mg царевично нишесте. Сместа се затваря в желатинови капсули. Такива капсули са орално приложими от 1 до 3 пъти на ден за 35 лечение на артрит.

Пример 10. Формулировка за орална суспензия.

Компонент	Количество
2,3-дихидро-8-етил-10-трифлуорометил-6-оксид-
1 Н-бензотиено-/2,3-1/-1,4-оксазепин-5-он	500 mg
Разтвор на сорбитол /70% N.F./	40 ml
Натриев бензоат	150 mg
Захарин	10 mg
Добавка с вкус на вишна	50 mg
Дестилирана вода q.s.ad.	100 ml

Сорбитолният разтвор се прибавя към 40 ml дестилирана вода и оксазепинонът се суспендира в него. Добавят се захаринът, натриевият бензоат и вкусовата добавка и се разтварят. Обемът се довежда до 100 ml с дестилирана вода. Всеки милилитър сироп съдържа 5 mg от оксизепинона. Тази орална формулировка идеално подхожда за лечение на възпаление при деца.

Пример 11. Получаване на парентерални разтвори

В разтвор на 700 ml пропилея гликол и 200 ml дестилирана вода за инжектиране се разтваря 20,0 g 2,3-дихидро-7-диметиламино1Н-бензотиено-/3,2-е/-1,4-диазепин-5-он.рН на разтвора се довежда до 5,5 със солна киселина и обемът се долива до 1000 ml с дестилирана вода. Формулировката се стерилизира, напълва в 5,0-милилитрови ампули, всяка от които съдържа 2,0 ml /представляващи 40 mg активен диазепинон/, и се херметизира под азотна атмосфера. Формулировката се прилага интравенозно при пациенти, страдащи от възпаление или AIDS.

Пример 12. Получаване на локален крем 500 mg от 2,3-дихидро-7-етокси-бензофурано-/2,3-1/-1,4-оксазепин-5-он се смесват с 15 g цетилов алкохол, 1 g натриев лаурил сулфат, 40 g течен силикон D.C. 200 /продаван от Dow Corning Co., Midland Michigan/, 43 g стерилна вода, 0,25 g метилпарабен и 0,15 g пропилпарабен. Сместа се загрява приблизително до 75°С при постоянно разбъркване и след това се охлажда до стайна температура, при която се сгъстява. Препаратът се употребява върху повърхността на кожата от лица, страдащи от възпаление.

Claims

1. Съединение с формула или негова фармацевтично приемлива кисела присъединителна сол, в която R,, R₂, R₃ и R₄ са независими и са избрани от водород, хидроксилна група, халоген, нисш алкил, нисш алкокси, бензилокси, трифлуорометил, нитро група, или -NR₈R₉, в която R, и R₉ са независими и са избрани от водород или нисш алкил; R, и R₆ са независими и са избрани от водород, нисш алкил или фенил; X е 0, S(0)_nили NR_?; Y е 0, S (0)_п или NR_g; R₇ е водород, нисш алкил, фенил, бензил, OH₂OR_g или нисш алкил, фенил, бензил, заместен с халоген; R_g е водород, нисш алкил или фенил; η е цяло число 0, 1 или 2; а при следните условия:

1/ когато X е NH, Υ е NH, R₍ е Н, R₃ е Н и R₄ е Br, R₂ не е метилова група;

2/ когато X е NH, Y е NH, R_p R₃ и R₄са Н, R₂ не е метокси или етокси група, и

3/ когато X е NH, Y е S, поне една от групите R_p R₂, R₃ и R₄ не е водород.

2. Съединение съгласно претенция 1, в което R_p R₃ и R₄ са водород.

3. Съединение съгласно претенция 2, в което R₂ е водород или нисш алкокси, X е 0, S (0)_п или NR₇, Y е 0 или S(0)_n; R, е водород или нисш алкил, и η има стойност 0, 1 или 2.

4. Съединение съгласно претенция 3, което е 2,3-дихидро-9-метокси-/1/бензотиеHo/2,3-f/-l ,4-тиазепин-5/4Н/-он.

5. Съединение съгласно претенция 3, което е 2,3-дихидро-/1/бензотиено-/2,3-1/-

1.4- оксазепин-5/4Н/-он.

6. Съединение съгласно претенция 3, което е 2,3-дихидро-9-метокси-/1/-бензотиено/2,3-f / -1,4-тиазепин-5/4Н/-он- 1-оксид.

7. Съединение съгласно претенция 3, което е 3,4-дихидро-9-метокси-6-метил-2Н-

1.4- оксазепино/6,7-Ь/-индол-5/6Н/-он.

8. Съединение съгласно претенция 3, което е 2,3-дихидро-1Н-бензотиено-/3,2-е/-

1.4- диазепин-5-он.

9. Съединение съгласно претенция 3, което е 2,3-дихидро-9-метокси-1Н-бензотиено-/2,3-f/-1,4-оксазепин-5-он.

10. Съединение съгласно претенция 3, което е 2,3-дихидро-9-метокси-6-оксид-1Нбензотиено-/2,3-f/-1,4-оксазепин-5-он.

11. Съединение съгласно претенция 3, което е 2,3-дихидро-9-метокси-метил-1Нбензотиено-/2,3-Ц-1,4-оксазепин-5-он.

12. Фармацевтичен състав, характеризиращ се с това, че съдържа терапевтично ефективно количество от съединение съгласно претенция 1 заедно с фармацевтично приемлив носител.

13. Метод за лечение на заболявания чрез задържане адхезията на левкоцити към ендотелиални клетки, характеризиращ се с това, че се състои в прилагане на терапевтично ефективно количество в единица доза 5 от фармацевтичния състав съгласно претенция 12.

14. Метод съгласно претенция 13, характеризиращ се с това, че заболяването, което се лекува, е възпалително заболяване.

15. Метод за лечение на бозайници, заразени с HIV, характеризиращ се с това, че се състои в прилагане на терапевтично ефективно количество единична доза от фармацевтичен състав съгласно претенция 12.