CZ241698A3

CZ241698A3 - Difenylstilbenové deriváty a farmaceutický prostředek

Info

Publication number: CZ241698A3
Application number: CZ982416A
Authority: CZ
Inventors: Cameron Black; Mario Girard; Daniel Guay; Zhaoyin Wang
Original assignee: Merck Frosst Canada & Co.
Priority date: 1996-02-01
Filing date: 1997-01-29
Publication date: 1998-12-16
Also published as: SK102698A3; HUP9902119A3; EA199800675A1; DE69703791T2; JP2000504332A; CA2244134C; ATE198323T1; AU1434697A; AU707199B2; NO983511D0; NO983511L; CN1214677A; EE9800230A; JP3662936B2; EP0882015B1; PL328225A1; CA2244134A1; DE69703791D1; HUP9902119A2; MX9806213A

Description

Oblast techniky i Vynález se týká nových sloučenin, které jsou prekurzory r ^f sloučenin inhibujících COX-2 selektivně vzhledem k COX-1. s Prekurzory jsou in vivo přeměňovány na selektivní inhibitory. Vynález také zahrnuje některé farmaceutické prostředky pro léčení onemocnění ovlivňovaných COX-2 obsahující sloučeniny vzorce I.

Dosavadní stav techniky

Vynález se týká farmaceutických prostředků obsahujících prekurzory inhibitoru COX-1 pro léčení onemocnění podmíněných cyklooxygenázou.

Nesteroidní protizánětlivé léčiva vykonávají většinu svého protizánětlivého, analgetického a antipyretického účinku a inhibují is hormony indukované kontrakce dělohy a určité typy nádorového růstu inhibicí prostaglandin G/H syntézy, která je také známá jako cyklooxygenáza. Zpočátku byla známa pouze jedna forma cyklooxygenázy, která odpovídá cyklooxygenáze-1 (COX-1) nebo konstitutivnímu enzymu, jak byl původně identifikován v hovězích semenných váčcích. Nedávno byl klonován gen pro druhou inducibiiní formu cyklooxygenázy, cyklooxygenázu-2 (COX-2), který byl sekvenován a charakterizován na počátku z kuřecích, myších a lidských zdrojů. Enzym se odlišuje od COX-1, který byl klonován, sekvenován a charakterizován z různých zdrojů včetně ovce, myši a člověka. Druhá forma cyklooxygenázy, COX-2, je rychle a snadno indukovatelná velkým počtem činidel včetně mitogenů, endotoxinů, hormonů, cytokinú a růstových faktorů. Protože prostaglandiny mají t . ; \ fyziologické i patologické.úlohy,, autoři vynálezu došli ,k« závěru, :že φ « φ · φ · * ® ^{5 β}

- » *. .. «41^ Φ · φ ΦΦΦΦ ΦΦΦΦ ·

Φ · * ♦ · · · ~ · j ·· · ·· *^Φ ” ’’ konstitutivní enzym COX-1 je z větší části odpovědný za endogenní , bazální uvolňování prostaglandinů, a proto je důležitý při své fyziologické funkci jako zachovávání integrity gastrointestinálního traktu a průtoku krve ledvinami. Autoři naopak došli k závěru, že s ' indukovátelná forma COX-2 je odpovědná hlavně ža patologické účinky prostaglandinů, kde dochází k rychlé indukci enzymu jako odpověď na činidla, jako jsou zánětlivá činidla, hormony, růstové faktory a cytokiny. Selektivní inhibitor GOX-2 bude mít podobné protizánětlivé, antipyretické a analgetické vlastnosti jako běžná io nesteroidní protizánětlivé léčiva a navíc budou inhibovat hormony indukované kontrakce dělohy a budou mít potenciální protirakovinné účinky, ale budou mít zmenšenou schopnost indukovat některé

Z vedlejších účinků založených na tomto mechanismu. Tyto sloučeniny by měly mít zvláště sníženou schopnost vyvolávat gastrointestinální toxicitu, sníženou schopnost vyvolávat vedlejší účinky v ledvinách, snížený účinek na dobu krvácení a možná i zmenšenou schopnost indukovat záchvaty astmatu u astmatických pacientů citlivých na aspirin.

Tyto sloučeniny budou také navíc inhibovat prostanoidně indukovanou kontrakci hladkého svalstva zabráněním syntézy kontraktilriích prostanoidů a tím mohou být využitelné při léčení bolestivé menstruace, předčasného porodu, astmatu a poruch spojených s eosinofily. Budou také použitelné při léčení Alzheimerovy choroby, pro snížení kostního úbytku zvláště u žen po menopauze (tj.

léčení osteoporózy) a pro léčení glaukomu.

.Stručný popis potenciální použitelnosti inhibitorů cýklooxygenázy-2 se uvádí v článku John Vane, Nátuře, díl 367, str, 215 - 216, 1994, a v článku Drug News and Perspectives, díl 7, str. 501 - 512, 1994.

V literatuře je známo velké množství derivátů stilbenu. Toda a .další, v, Chem. Commun. 1234 - 5 (1984). popisují dialdehydy A a diol .

% ^₃k 9 » ^Jí

999 9 999 9 1

B je popisován v Tsuji a další, J. Am. Chem. Soc. 88, 1289 - 92 (1966), a diol C byl připraven autory Dhawau a další, J. Org. Chem., 45, 922 - 4 (1980). U těchto sloučenin se neuvádí žádná použitelnost, a nemají ani substituent R¹ podle předkládaného vynálezu.

X = H nebo Cl

B X = H Tsuji C X - Cl Dhawan

Struktura D se popisuje jako použitelná při léčení hyperlipidemie jak se uvádí v Hashimoto a další, evropská patentová přihláška 424,541 (2. května 1991).

H

X, Y jsou halogen R je alkyl n je 0, 1 nebo 2

Tyto sloučeniny (D) nemají druhý uhlíkatý substituent X podle předkládaného vynálezu a nemají příbuznou účinnost.

Podstata vynálezu

Vynález zahrnuje novou sloučeninu vzorce I a způsob léčení 25 onemocnění podmíněných COX-2 podáváním netoxického terapeuticky účinného množství sloučeniny , vzorce í . pacientu v případě potřeby. Tyto sloučeniny jsou prekurzory sloučeniny, které

V4 » ♦ · . « ·« *· inhibují COX-2 selektivně vzhledem k COX-1. Prekurzory se in vivo přeměňují na selektivní inhibitory.

I

Vynález také zahrnuje farmaceutické prostředky pro léčení 10 onemocnění podmíněných COX-2 s obsahem sloučenin vzorce I.

V jednom provedení vynález zahrnuje novou sloučeninu vzorce I stejně jako způsob léčení onemocnění podmíněných COX-2, který zahrnuje podávání netoxického terapeuticky účinného množství sloučeniny vzorce I nebo jejích farmaceuticky přijatelných solí pacientovi v případě potřeby,

kde.

X je (a) CH₂OH, (b) CHO, (c) CO₂R⁴, nebo (d) CÓNR⁴2;

« 4 4? i t * a · - ^ * * ¹ 444 4 444

4 4 4 4 4 · φ * 4* 44 44 ς____ , _ --—,,,. ,,, ,. ,, .,,,,,,..., i ί 44

4*44 4

4 4 a · ·♦

Yje (a) CH₃, nebo (b) CH₂OR^s;

R¹ je zvolena ze skupiny 5...... (a) S(O)₂CH₃, (b) S(O)₂NH₂, (c) S(O)₂NHC(O)CF₃, (d) S(O)(NH)CH₃, (e) S(O)(NH)NH₂, io (f) S(O)(NH)NHC(O)CF_3t (g) P(0)(CH₃)0H, a (h) P(O)(CH₃)NH₂;

R² a R³ jsou nezávisle zvoleny ze skupiny ..

(a) atom vodíku, (b) halogen, (c) Ct-6 alkoxy, (d) C 1-6 alkylthio, (e) CN, (f) CF₃, (g) Ci-s alkyl, a (h) N₃;

R⁴ je zvolena ze skupiny (a) atom vodíku, (b) Ci^ alkyl, a (c) mono- nebo disubstituovaný benzyl, kde substituent je zvolen ze skupiny (1) atom vodíku, (2) halogen, (3) alkyl, (4) Ci-₆ alkoxy, (5) Ci^ alkylthio, (6) OH, ί

. 6 _ (7) CN, a (δ) CF₃, nebo dvě skupiny R⁴ připojené ke stejnému atomu dusíku mohou tvořit nasycený 5, 6 nebo 7-členný kruh popřípadě obsahující atom O nebo S nebo další atom N, přičemž uvedeny atom N může být substituován atomem vodíku nebo skupinou C_V6 alkyl;

R⁵ je zvolena ze skupiny (a) Cm alkyl, io (b) mono- nebo disubstituovaný benzyl, kde substituent je zvolen ze skupiny (1) atom vodíku, (2) halogen, (3) Cm alkyl, (4) Cm alkoxy, (5) Cm alkylthio, (6) OH, (7) CN, (8) CF₃, a (9) CO₂R⁴.

Jednu třídu výhodných sloučenin v rámci předkládaného vynálezu tvoří sloučeniny, kde

R¹ je zvolena ze skupiny (a) S(O)₂CH₃, a j a (b) S(O)₂NH₂;

R² a R³ jsou nezávisle zvoleny ze skupiny (1) atom vodíku, (2) halogen, zvolený ze skupiny fluor, chlor a brom.

Další skupinu výhodných sloučenin v rámci tohoto provedení

3o tvoří sloučeniny, kde

Y je CH₃ nebo CH₂0Cm alkyl.

__ , -1.:. . ..

Uvnitř této skupiny se nacháží třída sloučenin, kde

Y je CH₃ nebo CHzOC^ alkyl;

R¹ je zvolena ze skupiny (a) S(O)₂CH_3l s (b)S(O)₂NH₂;...............-............

(c) S(O)₂NHC(O)CF₃, (d) S(O)NHCH_3l (e) S(O)NHNH₂, a (f) S(O)NHNHC(0)CF₃; a

R² a R³ jsou nezávisle zvoleny ze skupiny (a) atom vodíku, (b) fluor, chlor a brom, (c) Cj.4 alkoxy, (d) Ct.4 aíkylthio, (e) CN, (f) CF₃, a (g) Ci.₄ alkyl.

Uvnitř této třídy existuje podtřída sloučenin, kde R² a R³ jsou nezávisle zvoleny ze skupiny

2o (1) atom vodíku, a (2) halogen;

R⁴ je atom vodíku nebo methyl; a R⁵ je C-i-6 alkyl.

Další skupinu výhodných sloučenin v rámci výše uvedeného 25 provedení tvoří sloučeniny, kde

XjeCO₂R⁴.

Y této skupině se nachází třída sloučenin, kde Xje CO₂R⁴;

Y je methyl nebo CH₂OR⁵;

R¹ je S(O)₂CH₃;

R² a R³ jsou nezávisle zvoleny ze skupiny »

- 4 · —¹ · 4 4 '4' ♦··*· 4 4 4 · 4 4 «4 444» (a) atom vodíku, a (b) halogen;

R⁴ je zvolena ze skupiny (a) atom vodíku, a (b) Ci-₆ alkyl,......R⁵ je zvolena ze skupiny (a) Ci^ alkyl, (b) mono- nebo disubstituovaný benzyl, kde substituent je zvolen ze skupiny io (1) atom vodíku, (2) halogen, (3) Ci-6 alkoxy, a _ (4) OH. '..................

Uvnitř této třídy existuje podtřída sloučenin, kde is XjeCO₂R⁴;

Y je methyl nebo CH₂OR⁵;

R¹ je S(O)₂CH₃;

R² a R³ jsou nezávisle zvoleny ze skupiny (a) atom vodíku, a

2o (b) halogen;

R⁴ je zvolena ze skupiny (a) atom vodíku, a (b) alkyl,

R⁵ je zvolena ze skupiny 25 (a) C1.6 alkyl, . (b) mono- nebo disubstituovanýbenzyl, ke substituent je zvolen ze skupiny (1) atom vodíku, (2) halogen, (3) C1-6 alkoxy, a (4) OH.

·—i *r· ·’ > « « β « · ’ * * * _Λ . :·;·|· ' \ · · . « » · » ·♦*-···· · ^„ftl·.·.· «.· ..

···· · * · «# as 4» 4 4 · * ·

Vynález ilustrují sloučeniny z tabulek II a III.

is Ac =

AIBN = Bn = CHO = CMC ~ cox = DBU = DMAP= DMF =

DMS0=

Et3N = HBSS= HEPES=

HWB =

KHMDS=

Pro účely této specifikace zahrnuje definice alkylu přímé, větvené a cyklické struktury s uvedeným počtem atomů uhlíku. Příklady alkylu jsou methyl, ethyl, propyl, 2-propyl, s- a t-butyl, butyl, s pentyl, hexyl, 1,1-dimethyÍethyl, cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl a cyklohexyl. Podobně alkoxy a alkylthio znamená přímo, větvené a cyklické struktury s uvedeným počtem atomů uhlíku.

Pro účely této specifikace, kde se definice objeví dvakrát, jako např. R⁴ v CONR⁴2, každý výskyt je pokládán za nezávislý na io každém dalším výskytu. Ve skupině CQNRV, nemusí být tedy skupiny R⁴ identické.

Pro účely této specifikace znamená halogen F, Cl, Br nebo I.

.. Následující zkratky mají uvedené významy:

kyselina arachidonová acetyl

2,2-azobisizobutyronitril benzyl vaječník čínského křečka

1-cyklohexyl-3-(2-morfolinoethyl)karbodiimidmethop-toluensulfonát cyklooxygenáza diazabicyklo[5,4,0]undec-7-en

4-{dimethylamino)pyridin N,N-dimethylformamid dimethylsulfoxid triethylamin

Hanksův vyvážený solný roztok kyselina N-[2-hydroxyethyl]piperazin-N1-[2ethansulfonová] lidská úplná krev hexamethyldisilazan draselný

-1010 w’ ί * * Z » 9 99 ··» Φ Φ Φ Φ ΦφΦ ♦ ·**· ’ φφφ ΦΦ » *·.*

LDA =	lithiumdiizopropylamid
LPS =	lipopolysacharid
mCPBA=	kyselina metachlorperbenzoová
MMPP=	monoperoxyftalát hořečnatý
-Ms =	methansulfonyl = mesyl
MsO =	methansulfonát = mesylát
NBS =	N-bromsukcinimid
NCS =	N-chlorsukcinimid
NIS =	N-jodsukcinimid
NSAID=	nesteroidní protizánětlivé léčivo
Oxone®=	peroxymonosulfát draselný
PCC =	chlorchromát pyridinia
PDC =	dichromát pyridinia
r.t. =	pokojová teplota
rac. =	racemický
Tf =	trifluormethansulfonyí = triflyl
TFAA=	anhydrid kyseliny trifluoroctové
TfO =	trifluormethansulfonát = triflát
THF =	tetrahydrofuran
TLC =	chromatografie na tenké vrstvě
TMPD=	N,N,N’,N'-tetramethyl-p-fenylendiamin
Ts =	p-toluensulfonyl ~ tosyl
TsO =	p-toluensulfonát = tosylát
Tz =	1Ή (nebo 2H)-tetrazoi-5-yi
S0₂Me=	methylsulfon (také SO₂CH₃)
SO₂NH₂=	sulfonamid

Zkratky alkyíových skupin Me = methyl

Et = ethyl ΐ . u .; n-Pr= normální propyl

Zkratky dávek bíd = bis in die = dvakrát denně qid = quater in die = čtyřikrát denně tid. = teran die = třikrát denně i * · · ύ · ·. > 9 * β “ • · · · ·* · ··· · «·*« · • V « ·· * · · » i-Pr= izopropyl n-Bu=normální butyl i-Bu= izobutyl s-Bu=sekundární butyl t-Bu= terciární butyl c-Pr= cyklopropyl c-Bu=cyklobutyl c-Pen=cyklopentyl c-Hex=cyklohexyl

Některé z popisovaných sloučenin obsahují jedno nebo více center chirality a mohou tak poskytovat diastereomery a optické izomery. Předkládaný vynález má zahrnovat jak možné diastereomery, tak-i jejich racemické formy a rozdělené enantiomerně čisté formy a jejich farmaceuticky přijatelné soli.

Některé z popisovaných sloučenin obsahují olefinické dvojné vazby a pokud není specifikováno jinak, mají zahrnovat geometrické izomery E i Z.

Sloučenina vzorce I je použitelná pro zmírňování bolesti, horečky a zánětu a řady stavů včetně revmatické horečky, příznaků spojených s chřipkou nebo dalšími virovými infekcemi, nachlazením, bolestí v kříži a bolestí zad, bolestivé menstruace, bolesti hlavy, bolesti zubů, podvrtnutí a vykloubení, bolesti svalů, neuralgie, synovitida, artritida, včetně revmatoidní artritidy, degenerativní onemocnění kloubů (osteoartritida), dna a záněty obratlů se ztuhnutím, záněty tíhového váčku, poranění, stavy po chirurgických . a zubařských zákrocích. Navíc může tato sloučenina inhibovat buněčné nádorové transformace a metastatický růst tumorů a tím může být použita při léčbě rakoviny. Sloučenina I může být také použita při léčení a/nebo prevenci cyklooxygenázou podmíněných proliferativních poruch, které se mohou vyskytovat pří diabetické retinopatii a tumorové angiogenezi.

-12Sloučenina I může vykazovat v důsledku přeměny in vivo na inhibitor COX-2 inhibiční účinky na prostanoidy indukovanou kontrakci hladkého svalstva zabráněním syntéze kontraktilních prostanoidů a tím může být použitelná při léčbě bolestivé menstruace, předčasného

5- porodu, astmatu a onemocnění spojených s eosinofily. Může- být také použitelná při léčbě Alzheimerovy choroby, pro snížení kostního úbytku zvláště u žen po menopauze (tj. léčení osteoporózy) a pro léčení glaukomu.

Sloučeniny vzorce I jsou prekurzory selektivních inhibitorů COX10 2 a svou funkci vykonávají konverzí in vivo na tyto aktivní a selektivní inhibitory COX-2. Aktivní sloučeniny vytvořené ze sloučenin podlé předkládaného vynálezu se popisují v následujících dokumentech,

.....které jsou tímto .zařazeny odkazem: WO 95/00501,, publikovaná

5.1.1995, WO 95/18799, publikovaná 13. 7. 1995 a US patent

5,474,995 publikovaný 12. 12. 1995.

V určitých ohledech mají sloučeniny podle předkládaného vynálezu výhody proti sloučeninám popisovaným v uvedených dokumentech v důsledku zlepšených farmakokinetických a/nebo bezpečnostních profilů. Obecný popis výhod a použití prekurzorů jako farmaceuticky použitelných sloučenin se uvádí v článku Waller a George v Br. J. Clin. Pharmac. díl 28, str. 497 - 507, 1989.

Pro ilustraci uvádíme přeměnu následujících sloučenin podle předkládaného vynálezu na uvedené selektivní inhibitory COX-2.

« F 4 •I

Příklad Prekurzor_Aktivní léčivo_Odkaz

Pat. 5,474,995

V důsledku přeměny in vivo na sloučeniny s vysokým inhibičním účinkem proti COX-2 a/nebo specificity pro COX-2 vzhledem k COX-1 budou sloučeniny l použitelné jako alternativa k běžným léčivům NSAIS, zvláště v případech, kde mohou být tyto nesteroidní protizánětlivé léky kontraindikovány, jako je tomu u pacientů s peptickými vředy, gastritidou, místní enteritídou, ulcerativní kolitidou, divertikulitidou nebo s recidivující historií gastrointestináiních poškození; při krvácení do gastrointestinálního traktu, poruchách koagulace včetně anémie jako je hypoprotrombinemie, hemofiiie nebo jiné poruchy krvácení; ledvinových onemocnění; ú pacientu před chirurgickými zákroky nebo u pacientů léčených antikoagulanty.

Farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu obsahují sloučeninu vzorce I jako aktivní složku nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl a mohou také obsahovat farmaceuticky přijatelný nosič a popřípadě další farmaceutické složky. Termín

-14** ti ť • β » ♦ · ?

Φ > · >ϊ ▼ ft* ·. * >>

I „farmaceuticky přijatelné soli“ označuje soli připravené z farmaceuticky přijatelných netoxických bází včetně anorganických bází nebo organických bází. Soli odvozené z anorganických bází zahrnují soli hlinité, amonné, vápenaté, měďnaté, železnaté, žeiezité, lithné, hořečnaté, manganaté, manganičité, draselné, sodné, zinečnaté apod. Zvláště výhodné jsou soli amonné, vápenaté, hořečnaté, draselné a sodné. Soli odvozené z farmaceuticky přijatelných organických netoxických bází zahrnují soli primárních, sekundárních a terciárních aminů, substituované aminy včetně io v přírodě se vyskytujících substituovaných aminů, cyklické aminy jako «

je arginin, betain, kofein, cholin, N,N-dibenzyiethylendiamin, diethylamin, 2-diethylaminoethanol, 2-dimethylaminoethanol, ethanolamin, ethylendiamin, N-ethyimorfolin, N-ethylpiperidin, glukamin, glukosamin, histidin, hydrabamin, izopropylamin, lyzín, methylglukamin, morfolin, piperazin, piperidin, polyaminové pryskyřice, prokain, puriny, theobromin, triethylamin, trimethylamin, tripropylamin, tromethamin apod. a bazické iontoměničové pryskyřice.

Je zřejmé, že v následující diskusi o způsobech léčení se budou týkat odkazy na sloučeniny vzorce I také farmaceuticky přijatelných solí.

Sloučenina vzorce I je použitelná pro zmírňování bolesti, horečky a zánětu a řady stavů včetně revmatické horečky, příznaků spojených s chřipkou nebo jinými virovými infekcemi, nachlazením, bolesti v kříži a bolesti zad, bolestivé menstruace, bolesti hlavy, bolesti zubů, podvrtnutí a namožení, bolesti svalů, neuralgie, * .. synovitida, artritida, včetně revmatoidní artritidy, degenerativní onemocnění kloubů (osteoartritida), dna a záněty obratlů se . . ztuhnutím, záněty tíhového váčku, poranění, stavy po chirurgických a zubařských zákrocích. Navíc může tato., sloučenina inhibovat

3o buněčné nádorové transformace a metastatický růst tumorů a tím >;·'«· ' >může být použita při léčbě rakoviny. Sloučenina li může být také .

-15použita při léčení a/nebo prevenci cyklooxygenázou podmíněných proliferativních poruch, které se mohou vyskytovat při diabetické retinopatii a tumorové angiogenezi.

- . . Sloučenina I může vykazovat v důsledku přeměny in vivo na inhibitor COX-2 inhibiční účinky na prostanoidy indukovanou kontrakci hladkého svalstva zabráněním syntéze kontraktilních prostanoidů a tím může být použitelná při léčbě bolestivé menstruace, předčasného porodu, astmatu a onemocnění spojených s eosinofily. Může být také použitelná při léčbě Alzheimerovy choroby, pro snížení kostního úbytku (tj. léčení osteoporózy) a pro léčení glaukomu.

V důsledku přeměny in vivo na sloučeniny s vysokým inhibičním účinkem proti COX-2 a/nebo specificity pro COX-2 vzhledem k COX-1 budou sloučeniny I použitelné jako alternativa k běžným léčivům NSAIS, zvláště v případech, kde mohou být tyto nesteroidní protizánětlivé léky kontraindikovány, jako je tomu u pacientů s peptickými vředy, gastritidou, místní enteritidou, ulcerativní kolitidou, d ivertiku litidou nebo s recidivující historií gastrointestinálních poškození; při krvácení do gastrointestinálního traktu, poruchách koagulace včetně anémie jako je

2o hypoprotrombinemie, hemofilie nebo jiné poruchy krvácení; ledvinových onemocnění; u pacientů před chirurgickými zákroky nebo u pacientů léčených antikoagulanty.

Podobně bude sloučenina i použitelná jako částečná nebo úplná náhrada běžných prostředků NSAID tam, kde jsou v současnosti . 25 podávány spolu s jinými prostředky nebo složkami. V dalších hlediscích tedy vynález zahrnuje farmaceutické prostředky pro léčení onemocnění podmíněných COX-2 jak byly definovány výše, které obsahují netoxické terapeuticky účinné množství sloučeniny vzorce I definované výše a jednu nebo více složek jako je další prostředek pro zmírnění bolesti včetně acetaminofenu nebo fenacetinu; látky iir' * - zesilující účinek- včetně kofeinů;; antagonisty H₂', íhydrokidu hlinitého

-16 A · ·· · • »' J »·» »*· - W,^J^· .

• · Ajf A Α··ί .»{·'··» A’ · • ' * 4 A iL A · · • A ·· AA A·

......

nebo horečnatého, simethiconu, látky snižující překrvení včetně fenylefrinu, fenylpropanolaminu, pseudoefedrinu, oxymetazolinu, epinefrinu, naphazolinu, xylometazolinu, propylhexedrihu nebo levodezoxyefedrinu; látek proti kašli včetně kodeinu, hydrokodonu, s caramifenu, carbetapentanu nebo dextramethorfanu; prostaglandin včetně misoprostolu, enprostílu, rioprostilu, ornoprostolu nebo rosaprostolu; diuretika; sedativní nebo nesedativní antihistaminika.

Navíc vynález zahrnuje způsob léčení cyklooxygenázou podmíněných onemocnění, zahrnující podávání netoxického terapeuticky účinného io množství sloučeniny vzorce I, popřípadě podávané spolu s jedním nebo více prostředků uvedených bezprostředně výše, pacientu v případě potřeby.

Pro léčení kterýchkoliv z těchto onemocnění podmíněných cyklooxygenázou může být sloučenina I podávána orálně, místně, is parenterálně, inhalačním sprejem nebo rektálně v jednotkových dávkách obsahujících běžné netoxícké farmaceuticky přijatelné nosiče, adjuvans a vehíkula. Termín parenterální jak se zde používá zahrnuje subkutánní, intravenózní, intramuskulární, intrasternální injekce nebo infuze. Navíc k léčení teplokrevných zvířat jako jsou myši, krysy, koně, hovězí dobytek, ovce, psi, kočky apod. jsou sloučeniny podle vynálezu použitelné při léčení lidí.

Jak je uvedeno výše, farmaceutické prostředky pro léčení onemocnění podmíněných COX-2 definovaných výše mohou popřípadě obsahovat jednu nebo více výše uvedených složek.

-Farmaceutické prostředky obsahující aktivní složku mohou být ve formě vhodné pro orální použití, například jako tablety, pilulky, >·. . · pastilky, vodné nebo olejové suspenze, dispergovatelné prášky nebo * -granulé; emulze, tvrdé nebo měkké kapsle nebo sirupy nebo elixíry.

Prostředky určené pro orální použití mohou být vyrobeny jakoukoliv 3o metodou známou v oboru pro výrobu farmaceutických prostředků a , i vdyto prostředky-mohou obsahovat.jednu·, nebo víceJátek zvolených ze

- 17• ·Ί 11 ·'

4,4. ·| ♦.·,'< 444 * » ·' · · ·» · · · w » · · skupiny' sladidel, očhucovacích prostředků, barviv a ochranných prostředků pro získání farmaceuticky elegantních a chuťově přijatelných prostředků. Tablety obsahují aktivní složku ve směsi s netoxickými farmaceuticky přijatelnými pomocnými látkami, které jsou vhodné pro výrobu tablet. Pomocnými látkami mohou být například inertní řediva, jako je uhličitan vápenatý, uhličitan sodný, laktóza, fosforečnan vápenatý nebo fosforečnan sodný; granulační činidla a rozvolňovadla, například kukuřičný škrob nebo kyselina alginová; pojivá, například škrob, želatina nebo akácie a kluzné látky, io například stearan hořečnatý, kyselina stearová nebo talek. Tablety mohou být nepotahované nebo mohou být známými způsoby potahovány pro zpoždění rozpadávání a absorpce v gastrointestinálním traktu a tím poskytnutí prodlouženého působení po delší dobu. Může být použit například materiál pro zpoždění účinku jako je monostearát nebo distearát glycerolu. Tablety mohou být také potahovány způsoby popsanými v US patentech 4,256,108; 4,166,452; a 4,265,874 za vytvoření osmotických terapeutických tablet pro řízené uvolňování.

Prostředky pro orální použití mohou být také přítomny ve formě tvrdých želatinových kapslí, ve kterých je aktivní složka smísena s inertním pevným ředivem, například uhličitanem vápenatým, fosforečnanem vápenatým nebo kaolinem, nebo ve formě měkkých želatinových kapslí, kde jsou aktivní složky smíseny s vodou nebo mísitelnými rozpouštědly jako je propylenglykol, látky PEG a ethanol, ,25 nebo v olejovém médiu, například podzemnicovém oleji, parafínovém · oleji nebo olivovém oleji.

-Vodné suspenze obsahují aktivní materiál ve směsi s pomocnými látkami vhodnými pro výrobu vodných suspenzí. Těmito pomocnými látkami jsou suspendující prostředky, například sodná sůl karboxymethylcelulózy, methylcelulóza, hydroxypropylmethylcelulóza, . ? _ť 5 , :_: alginát sodný, polyvinylpyrrolidon_{ tragakantová > a·, akáciová guma; ;

.dispérgující nebo smáčející prostředky mohou být v přírodě se vyskytující fosfatidy, například lecitin, nebo kondenzační produkty alkylenoxidu s mastnými kyselinami, například polyoxyethylenstearát, nebo kondenzační produkty ethylenoxidu s alifatickými alkoholy s dlouhým řetězcem, jako je například heptadekaethylenoxycetanol, nebo kondenzační produkty ethylenoxidu s parciálními estery odvozenými z mastných kyselin a anhydridů hexitolu, například polyethylensorbitanmonooleát. Vodné suspenze mohou také obsahovat jednu nebo více ochranných látek, například ethyl nebo n10 propyl nebo p-hydroxybenzoát, jedno nebo více barviv, jeden nebo více ochucovacích prostředků a jedno nebo více sladidel, jako je sacharóza, sacharin nebo aspartam.

Olejové suspenze mohou být formulovány suspendováním aktivní složky v rostlinném oleji, například arašídovém oleji, olivovém oleji, sezamovém oleji nebo kokosovém oleji, nebo v minerálním oleji jako je parafinový olej. Olejové suspenze mohou obsahovat zahušťující prostředek, například včelí vosk, tuhý parafin nebo ΐ cetylalkohol. Pro získání přijatelných orálních prostředků mohou být použita sladidla a ochucující prostředky například jak byly uvedeny výše. Tyto prostředky mohou být chráněny přídavkem antioxidantu, jako například kyseliny askorbové.

Dispergovatelné prášky a granule vhodné pro výrobu vodné suspenze přídavkem vody poskytují aktivní složku ve směsi s dispergujícím prostředkem nebo smáčedtem, suspendujícím .25 prostředkem a jednou nebo více ochrannými látkami. Vhodné dispérgující prostředky nebo smáčedla a suspendující prostředky jsou formou příkladů uvedeny výše. Mohou být také přítomny další . .pomocné látky, například sladidla, ochucující prostředky a barviva.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu mohou být také ve formě emulzí typu olej ve vodě. Olejovou fází může být rostfinný olej, ·.; t i ·;.· například. ..olivový, olej_: nebo arašídový '· olejh. nebo minerální olej,

r

i. · 9 9 «

9\ »» ·· 9 9 *

Ί!» 9 9 9 například parafínový olej nebo jejich směsi. Vhodná emulgační činidla mohou být v přírodě se vyskytující fosfatidy, například sojůvý lecitin, a estery nebo parciální estery odvozené z mastných kyselin a anhydridů hexitolu, například sorbitan monooleát, a kondenzační

5. produkty uvedených parciálních esterů s ethylenoxidem, například polyoxyethylensorbítanmonooleát. Emulze mohou také obsahovat sladidla a ochucovací prostředky.

Sirupy a elixíry mohou být formulovány se sladidly jako například glycerol, propylenglykol, sorbitol nebo sacharóza. Tyto io prostředky mohou také obsahovat tišící látky, ochranné látky a ochucující látky a barviva.

Farmaceutické , prostředky mohou být ve formě sterilních injikovatelných vodných nebo olejových suspenzí. Táto suspenze může být vytvořena v oboru známým způsobem použitím takových .1. . » .. · vhodných dispergujících látek nebo smáčedel, a suspendujících prostředků, které byly uvedeny výše.

Sterilní injikovatelné prostředky mohou být také ve formě sterilního injikovatelného roztoku nebo suspenze v netoxickém parenterálně přijatelném diluentu nebo rozpouštědle, například ve formě roztoku v 1,3-butandiolu. Mezi přijatelná vehikula a rozpouštědla, která mohou být použita patří voda, Ringerův roztok a izotonický roztok chloridu sodného. Mohou být také použita pomocná rozpouštědla jako je ethanol, propylenglykol nebo polyethylenglykoly. Navíc se jako rozpouštědla nebo suspendujícího prostředí používá běžně sterilních fixovaných olejů. Pro tento účel . , - může.být použit jakýkoliv nedráždivý fixovaný olej včetně syntetických mono- nebo diglyceridů., Navíc mohou být použity při výrobě prostředků ve formě injekcí mastné kyseliny jako je kyselina olejová.

Sloučenina I může být také podávána ve formě čípků pro

30; rektální podávání léčiva. Tyto prostředky mohou být vyrobeny míšením léčiva s vhodným nedráždivým nosičem, který je za normálních teplot

-20 ·^ι,»Ί • ý ···( ·· * · « e e » « ·« ·· a proto v rektu po ·*. v tuhém stavu, ale zkapalní při rektální teplotě, roztavení léčivo uvolní. Takovými materiálý jsou kakaové-máslo a polyethylenglykoly.

Pro místní použití se používají krémy, masti, gely, roztoky nebo suspenze apod., obsahující sloučeninu vzorce I (pro účely této přihlášky bude místní podání zahrnovat také ústní vody a kloktadla). Místní prostředky mohou obecně obsahovat farmaceutický nosič, pomocné rozpouštědlo, emulgátor, látku zvyšující pronikání do tkáně, ochranný systém a změkčovadlo.

Při léčení výše uvedených stavů jsou použitelné dávky řádově od přibližně 0,01 mg do přibližně 140 mg/kg tělesné hmotnosti za den nebo alternativně přibližně 0,5 mg až přibližně 7 g na pacienta za den. Zánět může být například účinně léčen podáním od přibližně 0,01. do 50 mg sloučeniny na kg tělesné hmotnosti za den, nebo alternativně přibližně 0,5 mg až přibližně 3,5 g na pacienta a den.

Množství aktivní složky, která může být kombinována pro vytvoření jednotlivé dávky s různými nosnými materiály, bude záviset na léčeném pacientovi a zvláště způsobu podání. Například prostředek určený pro orální podávání lidem může obsahovat od

0,5 mg do 5 g aktivní složky spojené s vhodným množstvím nosného materiálu, které může kolísat od přibližně 5 do přibližně 95 % celkového prostředku. Formy jednotlivých dávek budou obvykle obsahovat mezi přibližně 1 mg až přibližně 500 mg aktivní složky, typicky 25 mg, 50 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg,

600 mg, 800 mg nebo 1000 mg.

Je však- třeba rozumět, že specifická míra - dávkování pro ; - > jakéhokoliv, konkrétního pacienta bude záviset na řadě faktorů včetně věku, tělesné hmotnosti, ‘ celkového zdraví, pohlaví, dietě, době podávání, cestě podávání, rychlosti vylučování, kombinaci léčiv a , 30 vážnosti konkrétní choroby, která je léčena. .

- 21 Sloučeniny podle předkládaného vynálezu je možno vyrobit následujícími způsoby.

Způsob A

Působením bistrimethyiketenového acetalu 2 na ketal 1 za 5 přítomnosti vhodné Lewisovy kyseliny jako je TiCI₄ nebo Et₂O.BF₃ ve vhodném rozpouštědle jako je CH2CI2 poskytne addukt 3 jako diastereomerní směs. Ěsterifikací 3 CH₂N₂ následovanou působením báze jako je DBU se získá směs 5 a 6, která se separuje chromatografii na silikagelu. Oxidací 5 pomocí MMPP nebo mCPBA poskytne požadovaný produkt 7.

Z

-22s Způsob B:

Hydrolýza esteru 7 bází jako je LiOH nebo NaOH ve vodné směsi rozpouštědel jako THF/H₂O nebo MeOH/H₂O poskytne požadovanou karboxylovou kyselinu 8.

Způsob C:

Působením oxalylchloridu na karboxylovou kyselinu 8 a reakcí s vhodným aminem se získá požadovaný amid 9.

··.···! »fe··· «'Λ··· · f irw<^;' ·

-23'

Způsob D:

Difenyllakton 10 se redukuje na diol 11 vodným redukčním Činidlem jako je diizobutylalumíniumhydrid nebo lithiumaluminiumhydrid ve vhodném rozpouštědle jako je toluen, hexan, tetrahydrofuran nebo ether. Diol 11 se alkyluje alkylhalogenidem nebo benzylhalogenidem v přítomnosti báze jako je NaH nebo KOBut. Tato alkylace poskytne požadovaný izomer 12 a nežádoucí izomer 13, které se dělí chromatograficky nebo krystalizací. Sloučenina 12 se oxiduje na aldehyd 14 činidlem jako je oxid io manganičitý. Další oxidace látky 14 pomocí NaCIO₂ poskytne kyselinu

15. Alternativně může být látka 12 oxidována pomocí Cr^s+ přímo na kyselinu 15. Působením báze na 15 se vytvoří sůl 16. Estery 17 mohou být připraveny reakcí kyseliny 15 s alkylačním činidlem v přítomnosti báze. Methylester kyseliny 15 se pohodlně připraví v malém měřítku reakcí 15 s diazomethanem v etheru.

Ji

MnOj

M=Li> Na, K, Mg/2

R⁴ = C1-5 alkyl nebo substituovaný benzyl

Způsob E:

Anhydrid kyseliny difenylmaleinové 18 může být redukován na 2s„ dipL 11 vhodným ;_; hydridovým; i redukčním činidlem jako ;je

ouštedla jako toluen, tétrahydrofuran nebo ether.

diizobuty laluminíumhydrid nebo lithiumaluminiumhydriď: Pro redukci jsou vhodná

is

Dibal nebo LiAIH₄

CH₂OH ch₂oh

Způsob F;

Anhydrid kyseliny 2,3-difenylmaleínové 18 je možno připravit 15 metodou podle Fíeidse [J. Org. Chem., díl 55, str. 5165 - 70 (1990); US 4,596,867], při které se kyselina fenyloctová 19 přivede do reakce s kyselinou a-oxofenyloctovou 20 (s výhodou ve formě její draselné soli) v acetanhydridu za varu pod zpětným chladičem.

Vícestupňový postup pro získání 18 z fenylacetonitrilů jako 21 20 a 22 se popisuje v Smith a další, J. Org. Chem., díl 55, str. 3351 - 62 (1990).

Florac a spolupracovníci v Tetrahedron, díl 46, str. 445 - 52 (1990) popisují další syntézu 18 v několika krocích z abromfenylacetohydrazidů 23 a 24.

CH₂CN + .

ch₂cn

?·* t

Í8 několik kroků (Smith)

V tabulce I jsou uvedeny některé laktony .10, ze kterých je možno připravit sloučeniny podle předkládaného vynálezu způsobem

D.

V tabulce II a III jsou uvedeny sloučeniny reprezentující 25 předkládaný vynález (struktury la a Ib).

Tabulka I

Lakton

-π -

Vi««.

J

-28Tabulka I (pokračování)

Lakton • 4 * ♦· ·(· ' · » I«st 4 ' • · · t ·

S(O)₂Me

-29tabulka I (pokračování)

Lakton □ '3 i a s * • « ··· • · · » S · · ”7.

-j i

<

S(O)₂Me

-30 Tabulka I (pokračování) ·

’ * I » · « • 4 44

4 4 * ρΒττΡ'’’ ' • · --š .^4#·*.·«·^-* >}

Lakton

S<O),Me

- 31 Tabulka I (pokračování)

Lakton • β ± 9 *»« ♦ ·

9

O.

S(O)₂Me

-32.i i* « 9

-- - * » » · • · 9 · flfl · fl 3 3 9 • · * · · • · «a »s ·· »·

9 • ·

.4í

Tabuika I (pokračování)

Lakton

S(O)₂Me .*· .....

- 33 Tabulka I (pokračování)

Lakton

-34Tabulka I (pokračování)

Lakton

S{O)₂Me » a * «· « a * φ φ φ • φ φ φ

φφφ a « φ· ·

Tabulka I (pokračování)

Lakton β’ β' é’ • ··· · • 4 « • « 4a· • · · a¹ * « a a a · · · , r ·· ·♦♦ « « « • a a a

^0>v

S(O)₂Me

-36 Tabulka I (pokračování)

Lakton

4 4 4 9 3' 9 «* * α 4 · ··· f,3 Μ » 4 »

4> 1

S(O)₂NH₂

-37Tabulka I (pokračování)

9_r . 9 9 a · 9 .

· · 9 * ·*·

9 9 9 · * • 99 9 a 9 9

»9 «·

Lakton

O

Cl

-38Tabulka I (pokračování)

Lakton β, β' ΪΤ:

#· ··

Br v

Tabulka 11

V VW v • i, ·' · • « · • 9 9 ·

99 • k 9 9

9 999

9 Τ' 9 * '9 9

9« * 9

Ia

	Sloučenina	R²	R³	X	Y
10	1	H	H	CH₂0H	ch₃
	2	H	H	CH₂0H	CH₂0Me
	3	H	H	CHO	ch₃
	4	H	H	C0₂H	ch₃
	5	H	H	C0₂Me	ch₃
15	6	H	H	CO₂Na	ch₃
	7	H	H	CHO	CH₂OMe
	8	H	H	C0₂H	CH₂OMe
	9	H	H	C0₂Me	CH₂OMe
	10	H	H	CO₂Na	CH₂OMe
20	11	H	F	CH₂OH	ch₃
	12	H	F	CHO	CH₂0Me
	13	H	F	CO₂Me	CH₃
,	14	H	. F	CO₂H	ch₃
	15	H	F	C0₂Na	ch₃
25	16	F	F	C0₂H	ch₃
	17	F	F	C0₂Me	ch₃
	18	F	F	C0₂Me	CH₂OMe
	19	F	F	CO₂Na	CH₂0Me
' 'j	^? 20	F	: > F	CH₂OH	. CH₃ ^:

-40 Tabulka III

Vf Φ v φ' φ · • « * · • · · · ·· ·* φ ' 9 9¾ β • φ·' »·♦ φ 9 ’% · • 9 ·· ? 9l·

99* Φ 9 ·

Sloučenina	R²	R³	X	Y
²¹	H	H	CH₂OH	ch₃
. ₂₂	H	H	ch₂oh	CH₂0Me '
23	H	H	CHO	ch₃
24	H	H	co₂h	ch₃
25	H	H	C0₂Me	ch₃
26	H	H	C0₂Na	ch₃
27	H	H	CHO	CH₂0Me
28	H	H	C0₂H	CH₂OMe
29	H	H	C0₂Me	CH₂0Me
30	H	H	CO₂Na	CH₂OMe
31	H	F	ch₂oh.	ch₃
32	H	F	CHO	CH₂OMe
33	H	F	C0₂Me	ch₃
34	H	F	C0₂H	ch₃
35	Ή	F	C0₂Na	ch₃
Testy pro stanovení biologické účinnosti
Sloučenina	vzorce I	I múze být pro	stanovení	aktivity inhibuj

cyklooxygenázu-2 testována následujícími testy.

-41 φ e 0 β • 0 0 0 0

0 0 · · • 0 0· *» • 9

00· • 0

0 ί β;

0*0 0 0 0

00

Ε :ί

Inhibice cvklooxygenázové aktivity

Sloučeniny se testují jako inhibitory cyklooxygenázové aktivity v testech na cyklooxygenázu v celých buňkách. Oba tyto testy měří syntézu prostaglandinů E₂ jako odpověď na kyselinu arachidonovou 5 s použitím radiolmunologického stanovení. V těchto testech je stoprocentní účinnost definována jako rozdíl mezi syntézou prostaglandinů E₂ v nepřítomnosti a v přítomnosti arachidonátu.

Testy v celých buňkách io Pro testy na cyklooxygenázu se kultivují buňky osteosarkomu v 1 ml média ve 24-jamkových miskách (Nunclon) až do konfluentního stavu (1 · 2 x 10⁵ buněk/jamku). Buňky U-937 rostou v rotujících lahvích a resuspendují se na konečnou hustotu 1,5 x 10⁶ buněk/ml ve 24-jamkových miskách (Nunclon). Po promytí a resuspendování buněk osteosarkomu a U-937 v 1 ml HBSS se přidá 1 μΙ roztoku testované sloučeniny v DMSO a samotný DMSO a vzorky se opatrně zamíchají. Všechny testy se provádějí v triplikátech. Vzorky se potom inkubují 5 nebo 15 min při 37 °C před přídavkem kyseliny arachidonové. Kyselina arachidonová (bez peroxidu, Cayman Chemical) se připraví

2o jako 10 mM zásobní roztok v ethanolu a dále se 10 x zředí v HBSS. Alikvot 10 μΙ tohoto zředěného roztoku se přidá k buňkám za získání konečné koncentrace kyseliny arachidonové 10 μΜ. Kontrolní vzorky se inkubují namísto s kyselinou arachidonovou s ethanoiovým vehikulem. Vzorky se opět opatrně zamíchají a inkubují se dalších

10 min při 37 °C. Pro buňky osteosarkomu se reakce potom zástaví přídavkem 100 μΙ 1N HCI s míšením a rychlým odstraněním roztoku z buněčných monovrstěv. Pro buňky U-937 se reakce zastaví přídavkem 100 μΙ 1N HCI za míchání. Vzorky se potom neutralizují přídavkem 100 μΙ 1N NaOH a hladiny PGE₂ se měří radioimunologickým testem.

• 4 • 4

-42*T ΐ Tfts · β ·> ⁵ s^t·· · i

I « *»· » »»··*'·!

• · ·* ·.!

* > Ο» 4 4 4 4

Testy na celých buňkách látek COX-2 a COX-1 s použitím transfekovanych buněčných linií CHO

Pro tento test byly použity buněčné linie vaječníků čínského křečka (CHO), které byly stabilně transfekovány eukaryotickým expresním vektorem pCDNAIII obsahujícím cDNA buď lidského COX-1 nebo COX-2. Tyto buněčné linie se označují jako CHO [hCOX-1] a CHO [hCOX-2]. Pro testy na cyklooxygenázu se sklidí buňky ze suspenzních kultur CHO [hCOX-1] a buňky CHO [hCOX-2j připravené io trypsinizací přichycených kultur centrifugací (300 x g, 10 min) a promyjí se jednou v HBSS obsahujícím 15 mM HEPES, pH 7,4, a resuspendují se v HBSS, 15 mM HEPES, pH 7,4 při koncentraci buněk 1,5 x 10⁶ buněk/ml. Testovaná léčiva se rozpustí v DMSO na

66,7 krát nejvyšší testovaná koncentrace léčiva. Sloučeniny se typicky testují v osmi koncentracích v duplikátech s použitím sériového trojnásobného zředění v DMSO nejvyšší koncentrace látky. Buňky (0,3 . x 10⁶ buněk v 200 μΙ) se předinkubují s 3 μΙ testovaného léčiva nebo vehikula DMSO 15 min při 37 °C. Pracovní roztoky bezperoxidové AA (5,5 μΜ a 110 μΜ AA pro CHO [hCOX-1], popř. CHO [hCOX-2]) se připraví desetinásobným zředěním koncentrovaného roztoku AA v ethanolu do HBSS obsahujícího 15 mM HEPES, pH 7,4. Buňky se potom testují v přítomnosti nebo nepřítomnosti léčiva s roztokem AA/HBSS za získání konečné koncentrace 0,5 μΜ AA v testu CHO [hCOX-1] a konečné koncentrace 10 μΜ AA v testu CHO [hCOX-2].

Reakce se ukončí přídavkem 10 μΙ 1N HCI následovaným neutralizací 20 μΙ 0.5N NaOH. Vzorky se centrifugují při 300 x g při 4 °C 10 min a , alikvot vyčeřeného supernatantu se příslušně zředí pro stanovení hladin PGE₂ s použitím enzymatického imunologického testu na PGE₂(Correlate PGE₂ enzyme Ímmunoassay kit, Assay Designe, lne.);

Cyklooxygenázová aktivita v nepřítomnosti testovaných sloučenin se i : _: ?<sťanoví i jako rozdíl hladin PGE₂ v buňkách v přítomnosti kyseliny

-43arachidonové proti hladinám PGE₂ v buňkách v přítomnosti ethanolového vehikula. Inhibice syntézy PGE₂ testovanými sloučeninami se vypočte jako procento aktivity v přítomnosti léčiva proti aktivitě v pozitivních kontrolních vzorcích.

Test aktivity COX-1 z mikrozomů buněk U937

Buňky U937 se odděií centrifugací při 500 x g 5 min a jednou se promyjí fyziologickým roztokem s fosfátovým pufrem a znovu se zcentrifugují. Buňky se resuspendují v homogenizačním pufru io obsahujícím 0,1 M tris-HCI, pH 7,4, 10 mM EDTA, 2 pg/ml leupeptin, 1 pg/ml sojový trypsinový inhibitor, 2 pg/ml aprotinin a 1 mM fenylmethylsulfonylfluorid. Buněčná suspenze se sonikuje 4 x 10 s a centrifuguje při 10 000 x g 10 min při 4 °C. Supernatant se centrifuguje při 100 000 x g 1 hod při 4 °C. Usazené mikrozomy při

100 000 x g se resuspendují v 0,1 M tris-HCI, pH 7,4, 10 mM EDTA na přibližně 7 mg proteinu/ml a uchovávají se při - 80 °C.

Mikrozomální preparáty se rozmrazí bezprostředně před použitím, krátce se sonikují a potom se zředí na koncentraci proteinu 125 pg/ml v pufru 0,1M tris-HCI, pH 7,4 obsahujícím 10 mM EDTA,

2o 0,5 mM fenol, 1 mM redukovaný glutathion a 1 μΜ hematin. Testy se provádějí v duplikátech v konečném objemu 250 μΙ. Na počátku se přidá 5 μΙ vehikula DMSO nebo léčiva v DMSO k 20 μΙ 0,1M tris-HCI pufru, pH 7,4, s obsahem 10 mM EDTA do jamek 96-jamkové polypropylenové titrační destičky s hlubokými jamkami. Potom se

2S přidá 200 μΙ mikrozomálního preparátu a předinkubuje se 15 min při pokojové teplotě před přídavkem 25 μΙ 1M kyseliny arachidonové v 0,1M tris-HCI a 10 mM EDTA, pH 7,4. Vzorky se inkubují 40 min při pokojové teplotě a reakce se zastaví přídavkem 25 μΙ 1N HCl. Vzorky se neutralizují 25 μι 1N NaOH před kvantifikací obsahu PGE₂

3o radioímunologickým testem (kity Dupont-NEN nebo. Amersham). Aktivita cyklooxygenázy se definuje jako rozdíl mezi hladinami PGE₂

- 44 ve vzorcích inkubovaných v přítomnosti kyseliny arachidonové a ethanolového vehikula.

Test aktivity čištěné lidské CQX-2

Enzymová aktivita se měří chromogenním testem založeným na oxidaci N,N,N’,N’-tetramethyl-p-fenylendiaminu (TMPD) při redukci PGG₂ na PGH₂ enzymem COX-2 (Copeland a další (1994) Proč. Nati. Acad. Sci. 91, 11202- 11206).

Rekombinantní lidská COX-2 se čistí z buněk Sf9 jak bylo io popsáno dříve (Percival a další (1994) Arch. Biochem. Biophys. 15, 111 - 118). Testovací směs (180 μί obsahuje 100 mM fosforečnan Sodný, pH 6.5, 2 mM genapol X-100, 1 μΜ hematin, 1 mg/ml želatiny, 80 - 100 jednotek čištěného enzymu (jedna jednotka enzymu je definována jako množství enzymu nutné pro vytvoření změny O. D. is 0,001/min při 610 nm) a 4 μΙ testované sloučeniny v DMSO. Směs se předinkubuje při pokojové teplotě (22 °C) 15 min před počátkem enzymatické reakce přídavkem 20 μΙ sonikovaného roztoku 1mM ; kyseliny arachidonové (AA) a 1 mM TMPD v testovacím pufru (bez enzymu nebo hematinu). Enzymatická aktivita se měří odhadem počáteční rychlosti oxidace TMPD v průběhu prvních 36 s reakce. Nespecifická rychlost oxidace se pozoruje v nepřítomnosti enzymu (0,007 - 0,010 O. D./min) a odečte se před výpočtem procenta inhibice. Hodnoty ICso se odvodí regresní analýzou metodou nejmenších čtverců se čtyřmi parametry z grafu log dávky proti procentu inhibice.

Test v úplné lidské krvi

Princip metody í ·. ?b·.. / 'Tr ; Lidská úplná krev poskytuje prostředí bohaté proteiny a buňkami vhodné pro studium biochemické účinnosti protizánětlivých

-45*94 • * · • 4 4 · ♦ · »4 β 9 * · 4*9 * r · <B 94

9 9 9c • «·

9Π :sr sioučenin, jako jsou selektivní inhibitory ČOX-2. Studie ukázaly, že normální lidská krev enzym COX-2 neobsahuje. To je v souladu s pozorováním, že inhibitory COX-2 nemají žádný vliv na produkci PGE₂ v normální krvi. Tyto inhibitory jsou aktivní pouze po inkubaci s úplné lidské krve s LPS, které indukují COX-2. Tento test může být použit pro vyhodnocení inhibičního účinku selektivních inhibitorů

COX-2 na produkci PGE₂. Rovněž destičky v úplné krvi obsahují velké množství enzymu COX-1. Bezprostředně po srážení krve se destičky aktivují mechanismem podmíněným trombinem. Tato reakce vede k io vytváření tromboxanu B₂ (TxB₂) aktivací COX-1. Vliv testovaných sloučenin na hladiny TxB₂ po srážení krve může být zjištěn a použit jako index pro aktivitu COX-1. Proto stupeň selektivity poskytované testovanou sloučeninou může'být stanoven měřením hladin PGE₂ po indukci LPS (COX-2) a TxB₂ po srážení krve (COX-1) ve stejném testu.

Metoda

A. COX-2 (produkce PGE₂ indukovaná LPS)

Čerstvá krev je odebrána z žíly do heparinizovaných zkumavek

2o od mužských i ženských dobrovolníků. U dobrovolníků se nevyskytuje žádný zřejmý zánětlivý stav a alespoň sedm dnů před odběrem krve nebrali žádné NSAID. Z 2 ml aíikvotu krve se ihned získá plazma pro použití jako blank (bazální hladiny PGE₂). Zbylá krev se inkubuje s LPS (100 pg/ml konečná koncentrace, Sigma Chem, #L-2630 z E.

coli; zředěné v 0,1 % BSA (fyziologický roztok s fosfátovým pufrem) 5 min při pokojové teplotě. Alikvoty krve 500 μΙ se inkubují vždy s 2 μΙ vehikula (DMSO) nebo 2 μΙ testované sloučeniny, přičemž konečné koncentrace se pohybují od 10 nM do 30 μΜ, 24 hod při 37 ”C. Na konci inkubace se krev centrifuguje 5 min při 12 000 x g pro získání

30: ·. .plazmyη.ΐΟΟ μΙ alikvot plazmy se smísí- s. 400 μΙ methanqlupro vysrážení proteinů. Získá se supernatant, který se testuje > ,·ί’ » » » '-«’Ά • ··&$ 4 · 'J * 4 4 · 4 HÉŠj» « » »X » ··» · ··· 4 ,i ·Ή 4 · . · · 4 4 v · ·

- 46 radioimunologickým krtem (Amersham, RPA#530) na PGE₂ po přeměně PGE₂ na jeho methyloximátový derivát podle doporučení výrobce.

B. COX-1 (Produkce TxB₂ indukovaná srážením)

Čerstvá krev še odebere do zkumavek typu vacutainer bez antikoagulantů. Alikvoty 500 pl se ihned převedou do silikonizovaných mikrocentrifugačních zkumavek, do kterých bylo předem přidáno 2 μΙ buď DMSO nebo testované sloučeniny za získání konečných io koncentrací od 10 nM do 30 μΜ. Zkumavky se roztřepou a inkubují 1 hod při 37 °C, aby se mohla krev srazit. Na konci inkubace se oddělí sérum centrifugací (5 min 12 000 x g). 100 μΙ alikvot séra se smísí pro vysrážení proteinů s 400 μΙ methanolu. Oddělí se supernatant, který se testuje na TxB₂ s použitím enzymového imunologického kitu (Cayman, #519031) podle doporučení výrobce.

Test otoku krysí tlapky

Protokol

Samci krys Sprague-Dawfey (150 - 200 g) hladoví přes noc a je jim podáno po buď vehikulum (1 % methocei nebo 5 % Tween 80) nebo testovaná sloučenina. O 1 hod později se nakreslí čára s použitím permanentního fixu na úrovni nad kotníkem jedné zadní tlapky pro definování oblasti tlapky, která se bude sledovat. Použitím plethysmometru (Ugo-Basile, Itálie) se změří objem tlapky (V_o) na základě vytlačování vody. Zvířatům se potom vstříkne do chodidla 50 μΙ 1 % roztoku karagenanu ve fyziologickém roztoku (FMC Corp, Maine) s použitím inzulínové stříkačky s jehlou 0,45 mm (tj. 500 pg karagenanu na tlapku). O 3 hod později se měří objem tlapky (V₃) ;< ·; =/ ! r. a vypočte se vzrůst objemu (V₃ - V_o). <Zvířata se usmrtí vdechováním-- > ^;

3o CO₂ a zjistí se přítomnost nebo nepřítomnost poškození žaludku.

-47» 1 v ·· ► ft «9«

Získaná data se porovnají š hodnotami pro kontrolu s vehikulem a vypočte se procento inhibice. Všechny ošetřené skupiny jsou kódovány pro odstranění systematické chyby způsobené pozorovatelem.

Gastropatie u krys indukovaná NSAID

Princip metody

Hlavním vedlejším účinkem běžných NSAID je jejich schopnost vyvolávat u člověka poškození žaludku. Předpokládá se, že tento io účinek je způsoben inhibicí Cox-1 v gastrointestinálním traktu. Krysy jsou na působení NSAID zvláště citlivé. Ve skutečnosti byly dříve běžně používány krysí modely pro vyhodnocování gastrointestinálních vedlejších účinků běžných NSAID. V prováděném testu se pozoruje poškození gastrointestinálního traktu indukované NSAID měřením fekálního vylučování ⁵¹Cr po systémové injekci červených krvinek značených ⁵¹Cr. Fekální vylučování ⁵¹Cr je zavedená a citlivá metoda pro detekci gastrointestinální integrity u zvířat a lidí.

Metody

Samcům krys Sprague Dawley (150 až 200 g) se podává orálně testovaná sloučenina buď jednou (akutní dávkování) nebo dvakrát denně 5 dnů (chronické dávkování). Ihned po podání poslední dávky se krysám vstříkne ocasní žílou 0,5 ml červených krvinek značených ⁵¹Cr od krysy-dárce. Zvířata jsou umístěna individuálně do

m.etabolických klecí se stravou a vodou podle libosti. Výkaly se shromažďují 48 hodin a fekální exkrece ⁵¹Cr se vypočte jako procento celkové injikované dávky. Červené krvinky značené ⁵¹Cr se připraví s použitím následujících způsobů. Odebere se 10 ml krve do . : .heparinizovaných zkumavek z duté žíly krysy-dárce .Plazma<se oddělí ^ř30 centrifugací a nahradí stejným objemem HBSS. Červené krvinky se

-489 9 9 9 Ts 9 · ' 9 9 • 9 to 9 · * 9 ·*9 · *·· · · 9 * 9 9 9 9 9 999 • 9. «9 9· «· inkubují s 400 Ci (14,8 x 10¹² Bq) ⁵¹chromanu sodného 30 min při 37 °C. Na konci inkubace se červené krvinky promyjí dvakrát 20 ml HBSS pro odstranění volného ⁵¹chromanu sodného. Červené krvinky se nakonec rekonstituují v 10 ml HBSS a každé kryse se vstříkne s 0,5 ml roztoku (přibližně 20 Ci, 74 x 10¹⁰ Bq).

Gastropatie se ztrátou proteinů u kotulů veverkovitých

Princip metody

Gastropatie se ztrátou proteinů (která se projevuje jako io přítomnost buněk z krevního oběhu a plazmatických proteinů v Gl ΐ

traktu) je významná a dávku omezující nepříznivá odezva na standardní nesteroidní protizánětíivá léčiva (NSAID). Může být kvantitativně určena intravenózním podáním roztoku ⁵¹CrCl3. Tento iont izotopu se může vázat na globiny buněk a séra a buněčné , 15 endoplazmatické retikulum. Měření radioaktivity, která se objeví ve výkalech shromažďovaných 24 hod po podání izotopu tedy poskytuje citlivý a kvantitativní index gastropatie se ztrátou proteinů.

Metody

Skupinám samců kotulů veverkovitých (0,8 až 1,4 kg) se podává žaludeční sondou buď 1 % methocel! nebo 5 % Tween 80 ve vehikulu H₂O (3 ml/kg b.i.d.) nebo testované sloučeniny v dávkách od 1 do 100mg/kg b.i.d. po dobu 5 dnů. Jednu hodinu po poslední dávce : j ¹ : < léčiva/vehikula se intravenózně podá ⁵¹Cr (5 Ci/kg, 18,5 x 10¹° Bq/kg ,,, 25.v. v.T ml/kg;fyziologického roztoku s fosfátovým pufrem (PBS) a fekálie se, 24 hod shromažďují v metabolické kleci a gama čítáním se stanovuje vyloučený ⁵¹ Cr. Vzorky žitní krve se odebírají 1 hod a 8 hod po poslední dávce léčiva a koncentrace léčiva v plazmě se měří HPLC s reverzní fází. . .

-49i-. XT »;

'> 4 4 3 9 ·♦· » <·· · · ' • · · · g g ¢6 6 A

Hladiny v plazmě u krys

Farmakokinetika při podání per os u krys

Postup:

Péče o zvířata, jejich umístění a krmení se provádí podle doporučení organizace Canadian Council on Animal Care.

Samci krys Sprague Dawley (325 - 375 g) hladoví přes noc před každou studií hladiny v krvi po podání p.o.

Krysy se umístí po jedné do omezovači klece, která se pevně io zajistí. Počáteční vzorky krve se získají odříznutím malého kousku (1 mm nebo méně) špičky ocasu. Z ocasu se potom mírným pohybem od kořene směrem ke konci vytlačí krev. Dó heparinizovaných zkumavek typu vacutainer se odebere přibližně 1 ml krve.

Sloučeniny se připraví podle potřeby ve standardním 15 dávkovacím objemu 10 ml/kg a podají se ústy žaludeční sodnou o průměru 1,3 mm a délce 76 mm do žaludku.

Další odběry krve se provádějí stejným způsobem jako počáteční odběr s tím rozdílem, že není zapotřebí znovu odřezávat ocas. Ocas se očistí kouskem gázy a krev se vytlačí jak bylo popsáno výše do příslušně označených zkumavek.

Ihned po odebrání vzorku se krev centrifuguje, rozdělí, vloží do zřetelně označených zkumavek a skladuje se v mrazicím boxu až do analýzy.

Typická časová rozmezí pro stanovení hladiny v krvi krysy po 25 podání p.o. jsou:

0, 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h.

Po 4 hod se po odebrání vzorku poskytne krysám potrava podle < í libosti. <Voda je dostupná po celou dobu studie;···<·,:;·? h :- ' u ·

-50·« * 9 0 9 ó * 999 •990» 9 ··· 9 9099 9

9999 9 9 9 9

9 99 9« 99 9 · 9·

Vehikula:

Při stanovení hladin v použita následující vehikula:

PEG 200/300/400 Methocel 0,5 % - 1,0 %

Tween 80 5 % krvi krys při podání p.o. mohou být omezeno na 2 ml/kg 10 ml/kg 10 ml/kg

Sloučeniny při stanovení hladin v krvi po podání p. o. mohou být ve formě suspenze. Pro lepší rozpuštění je možno vložit roztok do io sonikátoru na přibližně 5 minut.

Intravenózní farmakokinetika u krys

Postup:

Samci krys Sprague Dawley (325 - 375 g) se umístí do plastických boxů s vodou a potravou.

Sloučenina se připraví podle potřeby při standardním dávkovacím objemu 1 ml/kg.

Počáteční vzorek krve a dávkování testované sloučeniny se provede pod sedativním účinkem CO₂. Krysy se po jedné umístí do komory s CO₂ a vyjmou se, jakmile ztratily napřimovací reflex. Krysa se potom umístí na poutači desku, na čenich se jí vloží maska s přívodem CO₂ a krysa se připoutá elastickými popruhy. Pomocí pinzety a nůžek se obnaží krční žíla, odebere se počáteční nulový vzorek a do krční žíly se pak vstříkne odměřená dávka léčiva. V místě vpichu se provede mírný tlak prstem a maska se odstraní z čenichu. Zaznamená se čas, který je nulovým časem.

-51 fl β 3 · flfl fl fl Í 9 9 •fl fl * fl · «·« · flflflfl fl flflflfl flfl * flfl* fl« fl flfl flfl flfl fl*

Vzorky krve po 5 min se odebírají odříznutím kousku (1 až 2 mm) špičky ocasu. Z ocasu se potom od kořene ke konci vytlačuje krev. Přibližně 1 ml krve se odebírá do heparinizované odběrové zkumavky. Stejným způsobem se odebírají další vzorky krve s tím rozdílem, že není třeba opět odřezávat ocas. Ocas se očistí kouskem gázy a provede se odběr stejným způsobem jak bylo popsáno výše do vhodně označených zkumavek.

Typické doby pro určení krevní hladiny u krysy po dávkování i.v. jsou buď:

io 0,5 min, 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 6 h, nebo

0,5 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 hod.

Vehikula:

Při stanovení hladiny v krvi u krys při podání i.v. mohou být použita následující vehikula:

Dextróza; 1 ml/kg

Molecusol 25 %: 1 ml/kg

DMSO: (dimethylsulfoxid) objem dávky omezen na 0,1 ml na zvíře

PEG 200: ne více než 60 % ve směsi s 40 % sterilní vody -1 ml/kg

Pokud je roztok s dextrózou zakalený, je možno přidat buď hydrogenuhličitan nebo uhličitan sodný.

Pro analýzu se zředí alikvoty stejným objemem acetonitrilu a provede se centrifugace pro odstranění sražených proteinů. Supernatant se nastříkne přímo na HPLC kolonu C-18 s detekcí UV.

Kvantifikace se provede vzhledem k čistému vzorku krve s přidaným známým množstvím léčiva. Biologická dostupnost (F) se stanoví porovnáním oblasti pod křivkou (AUC) i.v. proti p.o.

AUC_po dávka_iv :

F = ---------x----------x 100 %

AUCiv dávka_po

-529 9 * · • · · · 4 4

34 4 ® • 9 A» · · · · · • · · · » · · 9 · *4

Poměry ciearance se vypočtou z následující rovnice:

MM* Q | I dávka_iv (mg/kg) AUC_iv

Hodnoty Cl jsou ml/h.kg io Reprezentativní biologická dataSloučeniny podle předkládaného vynálezu jsou prekurzory inhibitorů COX-2 a jsou proto použitelné při léčení onemocnění podmíněných COX-2 uvedených výše. Míra přeměny těchto sloučenin — na aktivní inhibitory COX-2 může být sledována na dále uvedených 15 reprezentativních výsledcích. Uvedené hladiny v plazmě jsou maximální koncentrace v plazmě krys aktivního inhibitoru COX-2, které jsou pozorovány při podání orální dávky 20 mg/kg uvedeného prekurzoru krysám.

Tabulka IV

Příklad Hladiny v plazmě (μΜ)’

1,0 * Maximální koncentrace odpovídajícího laktonu v plazmě pozorované při dávkování 20 mg/kg uvedeného prekurzoru orálně krysám.

,· Vynález bude nyní ilustrován následujícími neomezujícími příklady, ve kterých, pokud nebylo uvedeno jinak, platí:

(i) všechny operace byly prováděny při pokojové teplotě nebo teplotě okolí, tzn. při teplotě v rozmezí 18-25 ®C;

-53φ . φ φ φ ΦΦ Φ V ΦΦΦ ' φ φ φφφ φ φφφ φ φφφ φ φ

ΦΦΦΦ φφ φ Φ Φ 4

ΦΦ Φ» ΦΦ ·Φ *· ·· , (ii), odpaření rozpouštědla bylo prováděno s použitím rotační odparky za sníženého tlaku (600 - 4000 Pa: 4,5 - 30 mm Hg) s.tep lotou. lázně do 60-°C; .................... ....................

(iii) průběh reakcí byl sledován chromatografii na tenké vrstvě (TLC) a doby reakce se udávají pouze pro ilustraci;

(iv) teploty tání jsou nekorigované a „d“ označuje rozklad; uvedené teploty tání jsou teploty získané pro materiály vyrobené podle popisu; polymorfismus může vést u některých materiálů k izolaci látek s rozdílnými teplotami tání;

(v) struktura a čistota všech konečných produktů byla ověřována alespoň jedním Z následujících způsobů: TLC, hmotnostní spektrometrie, nukleární magnetická rezonanční spektroskopie (NMR) nebo mikroanalytická data;

(vi) výtěžky jsou uvedeny pouze pro ilustraci;

(vii) pokud jsou uvedena data NMR, jsou ve formě hodnot δ pro hlavní diagnostické protony, uvedené v ppm relativně k tetramethylsilanu (TMS) jako vnitřnímu standardu při stanovení při 300 MHz nebo 400 MHz s použitím uvedeného rozpouštědla; běžné zkratky používané pro tvar signálu jsou: s. singlet; d. dublet; t. triplet; m. multiplet; br. široký; apod. Navíc „Ar“ označuje aromatický signál;

(viii) chemické symboly mají své obvyklé významy; eq znamená ekvivalent.

-544 9 · » 4 4 • · 9*4 94

4 4 4 4 β α »4 · 4

4 4

Příklad 1

Methylester kyseliny (E)-3-(4-methvlsulfonv0fenvl-2-fenylbut-2-enové ............................... Krokvi; --Methylester—· kyseliny *^r2-methoxv-3-(4-methýltfíÍo)fěhyí-2fenylbutanové

K roztoku 1-(1,1-dimethoxyethyl)-4-methylthiobenženu (2,9 g,

13,7 mmol) v 100 ml CH₂CI₂ ochlazeného na -78 °C byl po kapkách přidán roztok TiCI₄ (13,7 ml, 1M v CH₂CI₂), a potom (2,2 bistrimethylsilyloxyvinyl)benzen (4,6 g, 16,4 mmot) vyrobený podle postupu Ainsworth, J. Organomet. Chem., 1972, 46, 73). Reakční io směs byla míchána 2 hod při - 78 °C a byla ukončena roztokem pufru pH 7 (60 ml, NaH₂P0₄/Na₂HP0₄). Směs byla extrahována 3 x 50 ml CH₂CI₂. Extrakty byly spojeny, sušeny nad MgSO₄ a koncentrovány. Zbytek byl rozpuštěn v 50 ml etheru a byl přidán nadbytek roztoku CH₂N₂ v etheru. Odpařením etheru byla získána surová v názvu uvedená sloučenina jako diastereomerní směs.

Krok 2: Methylester kyseliny (E) a (Z)-3-(4-methylsulfonvl)fenyl-2fenvlbut-2-enové

Surový produkt z kroku 1 (0,6 g) byl rozpuštěn v 10 ml MeOH a ochlazen na 0 °C. Po kapkách byl přidán roztok Oxonu (4,0 ml, 0,75 M ve vodě) a směs byla míchána při 0 °C 10 min a při pokojové teplotě 2 h. Směs byia potom zředěna vodou (10 ml) a extrahována 3 x 20 ml CH₂CI₂. Extrakty byly spojeny, sušeny nad MgSO₄ a koncentrovány. Zbytek byl rozpuštěn v CH₃CN (10 mt) a byl přidán DBU (0,51 ml).

Směs byla potom zahřívána 22 h pod zpětným chladičem a ochlazena na pokojovou teplotu. Rozpouštědlo bylo odpařeno, a zbytek byl Čištěn chromatografii na silikagelu. Elucí směsí 9:1 hexan/EtOAc byl nejprve získán požadovaný E-izomer (0,25 g) jako bílá pevná látka.

¹H NMR(400 MHz, CDCI₄) δ 7,69 (2H, d), 7,20 (2H, d), 7,11 (3H, ^?'· - -.30 m), 6,96 (2H,m), 3,78 (3H, s), 2,97 (3H,s), 2,34 (3H,-s).^?

-55a · « * *·· « á « · • a a a · • a a a · a aa aa ·♦ ·· & ® 4 a • a a a a a a * a» »*

Pokračováním etuce směsí 4:1 hexan/EtOAc byl získán Z-izomer (0,35 g) jako bílá pevná látka.

¹H NMR(400 MHz, CDCI₃) δ 7,92 (2H, d), 7,48 (2H, d), 7,41 (2H, m), 7,33 (3H, m), 3,44 (3H, s), 3,07 (3H, s), 2,01 (3H, s).

Příklad 2

Kyselina (E)3-(4-methvísulfonvl)fenvl-2-fenylbut-2-enová

Směs methylesteru kyseliny (E)-3-(4-methylsulfonyl)fenyl-2fenylbut-2-enové (258 mg) a LiOH.H₂O (98 mg) v 5 ml dioxanu a 5 ml vody byla zahřívána pod zpětným chladičem 2 h. Reakční směs byla potom ochlazena na pokojovou teplotu, okyselena 1 N HCI na pH~1, a extrahována 50 ml EtOAc. Vrstva EtOAc byla sušena nad Na₂SO₄ a zakoncentrována. Krystalizaci ze směsi 1:1 hexan/EtOAc byla získána v názvu uvedená kyselina (200 mg) jako bílá pevná látka.

¹H NMR(400 MHz, CDCb) δ 7,69 (2H, d), 7,19 (2H, d), 7,13 (3H, m), 6,98 (2H, m), 2,97 (3H, s), 2,47 (3H, s).

Příklad 3

Methylester kyseliny (E)-2-(4-fluorfenvl)-3-(4-methvlsulforiyl)fenvÍbut2-enové

Ή NMR (400 MHz, aceton-d₆) δ 7,76 (2H, d), 7,36 (2H, d), 7,06 (2H, m), 6,90 (2H, m), 3,76 (3H, s), 3,05 (3H, s), 2,36 (3H, s).

Příklad 4 (E)-3-(4-methylsulfonvl)fenYl-1-morfolin-4-vl-2-fenylbut-2-en-1-on

Podle postupu popsaného ve způsobu C byla připravena v názvu uvedená sloučenina.

-56A A Á • A A • · · A ·» A·

A A A A

A A *·*

A A A • A AÁ

Φ o A i

AAAA A

Ή NMR (400 MHz. CDCJ₃) δ 7.73 (2H, d). 7,28 (2H, d), 7,13 (3H, m), 7,01 (2H, m), 3,72 (2H, m), 3,64 (2H, m), 3,42 <4H, bs), 3,00 (3H, s), 2,21 (3H,s).

Příklad 5

Kyselina (E)-4-methoxv-3-(4-methylsulfonvlfenv0-2-fenylbutenová

V názvu uvedená sloučenina byla připravena postupem popsaným ve způsobu D.

¹H NMR (400 MHz, aceton-d₅) δ 7,75 (2H, m), 7,42 (2H, d), 7,15 ίο (5H, m), 4,55 (2H, s), 3,30 (3H, s), 3,05 (3H, s).

Zastupuje:

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

Sloučenina vzorce I

R³ nebo její farmaceuticky přijatelné soli, kde X je (a) CH₂OH, (b) CHO, (c) CO₂R⁴, nebo (d) CONR⁴2;

Yje (a) CH₃, nebo (b) CH₂OR^s;

R⁵ je zvolena ze skupiny (a) S(O)₂CH₃, (b) S(O)₂NH₂, .

(c) S(O)₂NHC(O)CF₃, (d) S{O)(NH)CH₃, (e) S(O)(NH)NH₂, (f) S{O)(NH)NHC(O)CF_3t

9 9 9'

9 99

-58s ».

···’ »· v ·· ♦ 1 fl 9· (g) P(O)(CH₃)OH, a (h) P(O)(CH₃)NH₂;

R² a R³ jsou nezávisle zvoleny ze skupiny (a) atom vodíku,

5 (b) halogen,.

(c) Ci-e alkoxy, (d) Cm alkylthio, (e) CN, (f) CF₃, io (g) Ci-₅ alkyl, a (h) N₃;

R⁴ je zvolena ze skupiny (a) atom vodíku, (b) Ci-_S alkyl, a

15 (c) mono- nebo disubstituovaný benzyf, kde substituent je zvolen ze skupiny (1) atom vodíku, (2) halogen, (3) Cm alkyl,

20 (4) Cm alkoxy, (5) Cm alkylthio, (6) OH, (7) CN, a (8) CF₃,

25 nebo dvě skupiny R⁴ připojené ke stejnému atomu dusíku mohou tvořit nasycený 5, 6 nebo 7-členný kruh popřípadě obsahující atom O nebo S nebo ' další atom N, přičemž uvedený atom N může být substituován atomem vodíku nebo skupinou Cm alkyl;

-59 ·υ

R^s je zvolena ze skupiny (a) alkyl, (b) mono- nebo disubstituovaný benzyl, kde substituent je zvolen ze skupiny s (1) atom vodíku, (2) halogen, (3) Cm alkyl, (4) C^ alkoxy, (5) Ci-₆ alkylthio, io (6) OH, (7) CN, (8) CF₃, a (9) CO₂R⁴.

15 2. Sloučenina podle nároku 1, kde Y je CH₃ nebo CH2OC1-5 alkyl.

3. Sloučenina podle nároku 1, kde

Y je CH₃ nebo CH-OC^ alkyl;

R¹ je zvolena ze skupiny

20 (a) S(O)₂CH₃, (b) S(O)₂NH₂, (c) S(O)₂NHC(O)CF₃, (d) S(O)NHCH_3l (e) S(0)NHNH_2l a

25 (f) S(O)NHNHC(O)CF₃; a

R² a R³ jsou nezávisle zvoleny ze skupiny (a) atom vodíku, (b) fluor, chlor a brom, (c) Cva alkoxy,

30 (d) Ci-4 alkylthio, » r

-60 (e) CN, (f) CF₃, a (g) Ci-4 alkyl.

s 4. Sloučenina podle nároku 3, kde

R² a R³ jsou nezávisle zvoleny ze skupiny (1) atom vodíku, a (2) halogen;

R⁴ je atom vodíku nebo methyl; a io R⁵ je Cm alkyl.

5. Sloučenina podle nároku 4, kde

R¹ je zvolena ze skupiny (a) S(O)₂CH₃, a

15 (b) S(O)₂NH₂;

R₂ a R3 jsou nezávisle zvoleny ze skupiny (1) atom vodíku, (2) halogen, zvolený ze skupiny fluor, chlor a brom.
2o 6. Sloučenina podle nároku 1. kde Xje CO₂R⁴.

7. Sloučenina podle nároku 6, kde X je CO₂R⁴;

3 Y je methyl nebo CH₂0R⁵;

R¹ je S(O)₂CH₃;

R² a R³ jsou nezávisle zvoleny ze skupiny (a) atom vodíku, a w » — - T - Τ 7 7 ’ 3 . «« · ·:·» · ·, · * • ·. · · * » ·♦· · ··· · · ·· ·· ·» »» « »»

-61(b) halogen;

R⁴ je zvolena ze skupiny (a) atom vodíku, a (b) C_M alkyl,

5 R⁵ je zvolena ze skupiny (a) Cm alkyl, (b) mono- nebo dísubstituovaný benzyl, kde substituent je zvolen ze skupiny (1) atom vodíku, io (2) halogen, (3) Ci-_S alkoxy, a (4) OH.

8. Sloučenina vzorce ta

20 kde

R² R³ X Y 1 H H CH₂OH ch₃ 2 H H ch₂oh CH₂0Me 3 H H CHO ch₃ 4 H H CO₂H ch₃ 5 H H CO₂Me ch₃ 6 H H CO₂Na ch₃ 7 H H CHO CH₂0Me 8 H H CO₂H CH₂OMe

-62v VI τ. »»_ », yi

I i l · « ;· ®4 · • · ' · · i. * 9*9 » 9 9 9 ·? ·' ♦

9 9 9« 4· 9*

TV « »»

449 9 9

4: 9 4 3 Φ4

9 H H CO₂Me CH₂0Me 10 H H CO₂Na CH₂0Me 11 H F CH₂0H ch₃ 12 H F CHO CH₂OMe 13 H F CO₂Me ch₃ 14 H F C0₂H ch₃ 15 H F CO₂Na ch₃ 16 F F CO₂H ch₃ 17 F F CO₂Me ch₃ 18 F F C0₂Me CH₂0Me 19 F F CO₂Na CH₂0Me 20 F F ch₂oh ch₃

9. Sloučenina vzorce Ib

R² R³ X Y 1 H H ch₂oh ch₃ 2 H H ch₂oh CH₂OMe 3 H H CHO ch₃ 4 H H co₂h ch₃ 5 H H C0₂Me ch₃ 6 H H CO₂Na ch₃ 7 H H CHO CH₂0Me

V »' • 9 * * ·;··.? ·. *· . · ·· · * • *9 9 9 · · · · *

99 99 9* 99 ·· ··

- 63 - 8 H H CO₂H CH₂QMe 9 H H C0₂Me CH₂OMe 10 H H C0₂Na CH₂0Me 11 H F CH₂OH ch₃ 12 H F CHO CH₂0Me 13 H F C0₂Me ch₃ 14 H F CO₂H ch₃ 15 H F CO₂Na ch₃

ίο 10. Sloučenina podle nároku 1, zvolená ze skupiny (a) imethylester kyseliny (E)-3-(4-methylsulfonyl)fenyl-2fenylbut-2-enové, .........., (b) kyselina (E)3-(4-methylsulfonyl)fenyl-2-fenylbut-2-enová (c) methylester kyseliny (E)-2-(4-fiuorfenyl)-3-(415 methylsulfonyl)fenylbut-2-enové (d) (E)-3-(4-methylsulfonyl)fenyl-1 -morfolin-4-yl-2-fenylbut-2en-1-on (e) kyselina (E)-4-methoxy-3-(4-methylsulfonylfenyl)-2fenylbutenová

11. Farmaceutický prostředek pro léčení zánětiivého onemocnění citlivého na léčení nesteroidními protizánětlivými prostředky, vyznačující se tím, že obsahuje netoxické terapeuticky účinné množství sloučeniny podle některého

25 z nároků 1 až 10 a farmaceuticky přijatelný nosič.

12. Farmaceutický prostředek pro léčení onemocnění podmíněných cyklooxygenázou, která se s výhodou léčí aktivním prostředkem selektivně inhibujícím COX-2 oproti COX-1,

Β Β

~ - 64 - V * » » » T ” 7 * * ft ~ Β Β Β · B · B · «' ·' ·· • a, B a ·., · B.B · · BB· · · ·. • Β B · · · · · ·· · · BB ·· ♦:· ·· ·· ·· vyznačující se tím , ž e zahrnuje netoxické

terapeuticky účinné množství sloučeniny podle některého ť z nároků 1 až 10 a farmaceuticky přijatelný nosič.

5 13. Způsob léčení zánětlivého onemocnění citlivého na léčeni nesteroidním protizánětlivým prostředkem^Jcterý^zahrnuje podávání netoxického terapeuticky účinného množství sloučeniny podje-náT&líul a farmaceuticky přijatelného nosiče ^pacientovi v případě potřeby.

14. Způsob léčení onemocnění podmíněných cyklooxygenázgur

........... které se $ výhodou léčí aktivním prostředkem^selektivně inhibujícím COX-2 oproti COX>U--kíery zahrnuje podávání netoxického terapeu-tiekýTícinného množství sloučeniny podle

15 nárokyj-pácíentovi v případě potřeby.

15. Farmaceutický prostředek s protizánětlivými účinky, vyznačující se tím, že obsahuje protizánětlivě účinné množství sloučeniny vzorce (I) podle některého

20 z nároků 1 až 10 nebo její farmaceuticky přijatelné soli spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem.

16. Sloučenina vzorce (I) podle některého z nároků 1 až 10 nebo její farmaceuticky přijatelná sůl pro použití při léčení

25 onemocnění podmíněných cyklooxygenázou, která se s výhodou léčí prostředkem selektivně inhibujícím COX-2 oproti COX-1.

i!'· 4' • 4 »*, Τ· * . . ” • R · · » ·* t ·

4 4 >

44 4»

-65 17. Použití sloučeniny vzorce (I) podle některého z nároků 1 až 10 nebo její farmaceuticky přijatelné soli pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení zánětlivého onemocnění citlivého na léčení nesteroidním protizánětlivým prostředkem.