CZ236992A3 - Process for preparing solutions of immunoglobulin with inactivated viruses - Google Patents

Description

Oblast techniky inaktivovanými viry

Vynález se týká způsobu výroby roztoků imunoglobulinu s inaktivovanými viry, které se hodí pro výrobu intravenózních injekcí.

Dosavadní stav techniky

Imunoglobuliny jsou humorální glykoproteiny, které při elektc|rforéze plasmového nebo sérového proteinu cestují v tzv. gamma-frakci, a proto byly dříve označovány termínem gammaglobuliny.

Imunoglobulinů se díky jejich vysokému obsahu protilátek, používá při profylaxi a terapii infekcí.

Je známá výroba imunoglobulinů jak pro intramuskulární tak pro subkutánní aplikaci. Často používanou výrobní metodou je tzv. Cohn-Oncleyova frakcionace, která bývá také označována názvem 6/9-metoda. (Cohn a další, J. Am. Chem. Soc.

68, 459 (1946); Oncley a další.; J.Am. Chem. Soc 71, 541 (1949))

Tento výrobní postup má však nevýhodu v tom, že vede ke vzniku vysoce viskózního roztoku, který je aplikovatelný jen intramuskulárně nebo subkutánně a který obsahuje vysokou koncentraci protilátek v relativné nízkém objemu. Získaný produkt je sice při teplotě 4 °C stálý, působením plasminových nečistot však může docházet k proteolýze. Dále v něm mohou být přítomny IgA- a IgG-dimery, které při aplikaci mohou vést u pacientů k anafylaktické reakci (Ullmann, Encyclopedia of Industrial Chemistry, 1989, A14, strana 93, 94).

Z toho důvodu byly vyvinuty intravenózně aplikovatelné imunoglobuliny, jejichž snášenlivost pacienty je zlepšena. Tyto produkty se vyrábějí z tzv. frakce 3 nebo též Cohnovy frakce 2 (viz shora uvedená citace Cohn a další) při pH= 4 za použití polyethylenglykolu, následujícího srážení ethanolem, ultra- nebo diafiltrace a ionexové chromatografie. Tímto způsobem získaný imunoglobulin se stabilizuje mono- a disacha ridy.

Takový zlepšený postup je popsán v evropské patentové přihlášce EP 0 073 371.

Výchozí frakce 3 (viz shora uvedená citace Cohn a další) se po rozpuštění a nastavení hodnoty pH na 4 podrobí ultrafiltrací a diafiltrací. Potom se získaný filtrát zkoncentruje na obsah proteinu 5 % hmotnostních a obsah alkoholu se sníží na 8 % hmotnostních. Po zkoncentrování získaného roztoku imunoglobulinu na obsah proteinu 8 % se získá čirý vodě podobný roztok s iontovou sílou 0,01 a hodnotou pH 4,2. Tonicita roztoku se nastaví 10% roztokem maltózy při obsahu proteinu 5 % hmotnostních. Potom se vzniklý roztok sterilizuje filtrací a lyofilizuje. Lyofilizovaná látka se před injekčním použitím rozpustí ve vhodných médiích.

Velkou nevýhodou takto získaných imunoglobulinů pro intravenózní aplikaci je, že se před použitím musí nejprve rozpustit ve vhodných médiích a jsou skladovatelné pouze v lyofilizované formě.

Další nevýhodou je, že při použití těchto imunoglobulinů je možno na pacienty přenést viry, poněvadž při výrobním postupu nedochází k žádné inaktivaci virů. Existují zprávy, že při intravenozním podání imunoglobulinů došlo k onemocnění hepatitis a HIV (Ullmanns Encycl.. of Ind. Chem., sv. A14, 1989, strana 102, 103).

Úkolem tohoto vynálezu bylo proto vyvinout způsob inaktivace virů v intravenózně vstřikovatelných imunoglobulinech, který by vedl ke vzniku produktu, při jehož použití by nemohlo dojít k žádnému přenosu virů na pacienta a který by byl tak stálý, že by ho bylo možno vyrábět přímo ve formě injekčního roztoku bez lyofilizace a v této formě by byl také skladovatelný .

Podstata vynálezu

Tento úkol byl vyřešen způsobem podle vynálezu. Předmětem vynálezu je způsob výroby roztoků imunoglobulinu s inaktivovanými viry, vhodných pro intravenózní aplikaci, jehož podstata spočívá v tom, že se na imunoglobulin působí neiontovými tenzidy, které se potom odstraní extrakcí pevnou fází na hydrofobních materiálech.

Jako neiontových tenzidů se používá zejména TNBP a/nebo Tritonu X 100. Hodnota pH roztoku je přednostně 5,0 až 5,5.

Při přednostní variantě provedení způsobu podle vynálezu se po zpracování neiontovými tenzidy provede extrakce biologicky kompatabilními rostlinnými oleji, načež se tyto oleje oddělí. Jako rostlinných olejů se přednostně používá ricinového oleje nebo sojového oleje.

Navazující extrakce pevnou fází se přednostně provádí za použití oktadecylderivatizovaných látek, kterých se také používá pro chromatografií s obrácenými fázemi. Při obzvláště vý hodném provedení se extrakce pevnou fází provádí chromatografií s obrácenými fázemi na oktadecylované pryskyřici (C-18).

K hotovému produktu se po extrakci pevnou fází přidá disacharid, za účelem stabilizace. Hotový roztok se potom jednou nebo víckrát sterilizuje filtrací.

Před inaktivací viru a/nebo po sterilizaci filtrací se dále může provést ultrafiltrace a diafiltrace imunoglobulinového roztoku.

Následuje podrobný popis provedení způsobu podle vynálezu. Nejprve se, způsobem známým z dosavadního stavu techniky, rozpustí tzv. Cohnova frakce II ve vodě tak, aby vznikl úplně čirý roztok. Hodnota pH tohoto roztoku se potom nastaví na 4,0 až 5,0, přednostně 4,5 a roztok se přefiltruje, aby se odstranily nečistoty.

Potom se roztok podrobí ultrafiltraci a zkoncentruje se. Vylučovací mez molekulové hmotnosti při ultrafiltraci je 30 000 Dalton. V tomto stupni se odstraní zejména nečistoty s nižší molekulovou hmotností. V návaznosti na ultrafiltraci se provede diafiltrace pro odstranění iontů a na tento stupeň navazuje vlastní inaktivace virů.

Inaktivace se provádí tak, že se roztok nejprve ochladí na 4 až 8 °C a hodnota pH se nastaví na 5,0 až 5,5, přednostně 5,3. Potom se k roztoku přidají neiontové tensidy, přednostně TNBP a/nebo Triton X 100 a získaný roztok se několik hodin míchá. V návaznosti na toto zpracování při přednostní variantě provedení následuje extrakce rostlinnými oleji. Při tom se k roztoku přidá 5 % hmotnostních rostlinného oleje, roztok se uvede na teplotu místnosti a promíchá s rostlinným olejem. Po oddělení fází následuje filtrace.

Potom se roztok nanese na sloupec C 18 a provede se chromatografie. Po chromatografií se pH roztoku upraví na 4 a k úpravě tonicity se použije maltózy. Po následující sterilizaci filtrací se získaný roztok zkouší na stabilitu tím, že se uchovává alespoň 22 hodin při 37 °C. Dojde-li k zakalení roztoku, je roztok nepoužitelný. Nedojde-li za tuto dobu ke vzniku žádného zákalu, nastaví se hodnota pH roztoku na 5,0 až 5,5, přednostně 5,3, roztok se podrobí další ultrafiltraci a dia5 filtraci a u takto získaného roztoku se po přídavku maltózy nastaví obsah proteinu 50 g/1. Ještě se provede další sterilizace a získaný roztok se přímo plní do infuzních lahví

Takto získaný produkt se může přímo intravenozně vstřikovat a neobsahuje žádné viry.

Vynález je blíže objasněn v následujícím příkladu provedení. Tento příklad má výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu jím není v žádném ohledu omezen.

Příklad provedení vynálezu

Příklad

Cohnova frakce II se rozpustí v 6 ti násobném množství vody a směs se míchá tak dlouho, dokud nevznikne čirý roztok. Potom se hodnota pH roztoku nastaví 0,5N kyselinou chlorovodíkovou na 4,5. Následuje nejprve ultrafiltrace, při níž se roztok zkoncentruje na 90 g/1. Použije se typu membrány Novasette 30 K. Potom se roztok zředí pětinásobným množstvím vody a podrobí se diafiltraci za tlaku 0,03 až 0,05 MPa. Po této diafiltraci je obsah proteinu v diafiltrovaném roztoku nastaven na 70 g/1. Roztok se ochladí na 4 až 8 °C a jeho hodnota pH se 0,IN roztokem hydroxidu sodného nastaví na 5,3. Potom se k roztoku přidá 0,3 % hmotnostního TNBP a 1 % hmotnostní Tritonu X 100 a směs se podrobí intenzivnímu míchání. Po asi 4 hodinách při 4 až 8 °C se přidá 5 % hmotnostních ricinového oleje. Extrakce olejem se provádí při 15 °C. Vzniklé fáze se oddělí a roztok se přefiltruje přes filtr s vrstvami Cuno. Potom se roztok nanese na sloupec C 18, na němž jsou zakotveny oktadecylderivatizované látky. Dále se hodnota pH roztoku nastaví na 4 a přidá se 100 g/1 maltózy. Potom následuje ste6 rilizace filtrací a filtrací sterilizovaný roztok se uchovává 22 až 24 hodin při teplotě 37 °C. Získaný čirý roztok se uvede na hodnotu pH 5,3 přídavkem 0,IN roztoku hydroxidu sodného. Znovu se provede ultrafiltrace a diafiltrace, přidá se maltóza (100 g/1) a obsah proteinu v roztoku se nastaví na 50 g/1. Po následující filtrační sterilizaci se roztok naplní do 50ml infusních lahví, které jsou sterilizovány a silikonizovány, lahve se opatří uzávěry a uzávěry se obroubí.

Claims (11)

1. PATENTOVĚ NÁROKY

   6 '3 v«‘

   1. Způsob výroby roztoku imunoglobulinu s inaktivovanými viry, vhodného pro intravenozní aplikaci, v y z n á č u jící se t í m, že se na imunoglobulin působí neiontovými tensidy, které se potom odstraní extrakcí pevnou fází na hydrofobních materiálech.
2. 2. Způsob podle nároku 1,vyznačuj ící se tím, že hodnota pH roztoku je 5,0 až 5,5.
3. 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačuj ící se t í m, že se jako neiontového tenzidu použije TNBP a/nebo Tritonu X 100.
4. 4. Způsob podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že se roztok po zpracování neiontovými tenzidy extrahuje biologicky kompatibilními rostlinnými oleji a potom se tyto oleje oddělí.
5. 5. Způsob podle nároku 4,vyznačující se tím, že se jako rostlinného oleje použije ricinového oleje a/nebo sojového oleje.
6. 6. Způsob podle některého z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že se extrakce pevnou fázi provádí oktadecylderivatizovanými látkami, kterých se také používá pro chromatografii s obrácenými fázemi.
7. 7. Způsob podle některého z nároků 1 až 6, vyznačující se t í m, že se extrakce pevnou fází provádí chromatografii s obrácenými fázemi na sloupci C 18.
8. 8. Způsob podle některého z nároku 1 až 7, vyznačující se tím, že se k roztoku po extrakci pevnou fází přidá disacharid.
9. 9. Způsob podle některého z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že se hotový roztok jednou nebo několikrát sterilizuje filtrací.
10. 10. Způsob podle některého z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že se roztok imunoglobulinu před inaktivací virů a/nebo po sterilizaci filtrací podrobí ultrafiltrací a diafiltrací.
11. 11. Způsob podle některého z nároků laž 10, vyznačující se t í m, že se po extrakci pevnou fází nebo po přidání disacharidu vyrobený roztok zkouší na stabilitu.