CZ235594A3

CZ235594A3 - Vaccine against hepatitis and the use of appropriate antigen for preparing such vaccine

Info

Publication number: CZ235594A3
Application number: CZ942355A
Authority: CZ
Inventors: Nathalie Marie- Garcon-Johnson; Pierre Hauser; Clothilde Thiriart; Pierre Voet
Original assignee: Smithkline Beecham Biolog
Priority date: 1992-03-27
Filing date: 1993-03-24
Publication date: 1995-02-15
Also published as: FI110843B; HUT69931A; ATE146678T1; DE69306940T2; MY111880A; HK1003218A1; IL105161A0; EP0633784A1; DK0633784T3; AP9300502A0; NO943571D0; CA2132833C; UA44688C2; ES2098029T5; IL105161A; NZ249868A; DK0633784T4; DE69306940D1; SI9300149B; CN1085805A

Description

Oblast techniky

Vynález se týká vakcíny proti hepatitidě, obsahující

3-0-deacylovaný monofosforyllipid A. Vynález se rovněž týká způsobu výroby této vakcíny, která je vhodná pro použití k prevenci i k léčebným* účelům.

Dosavadní stav techniky

Virová hepatitida, která je způsobena viry hepatitidy typu A, B, C, D a E je velmi běžným virovým onemocněním. V případě virů typu B a C může také být příčinou vzniku zhoubných nádorů jater. Účinná vakcinace proti tomuto onemocnění je tedy velmi důležitá a přes zřejmé pokroky je stále ještě nedořešeným úkolem, .shrnutí dosavadních poznatků o moderní vakcinaci proti tomuto onemocnění včetně důležitých literárních odkazů je možno najít v publikacích Lancet, 12. května 1990, str. 1142 ff , Prof. A. L. W. F. Eddleston, dále Viral Hepatitis and Liver Disease, Vyas B. N., Dienstag J. L. a Hoofnagle J. H., eds, Grune and Stratton,lne.,

1984 a Viral Hepatitis and Liver Disease, Proceedings of the 1990 International Symposium, eds F. B. Hollinger,

S. M. Lemon a H. Margolis, tisk Williams and Wilkins.

Pod pojmem antigen hepatitidy, tak jak je v průběhu přihlášky užíván se rozumí jakýkoliv antigenní materiál, odvozený od viru hepatitidy, který je možno použít k vyvolání imunity proti viru u člověka. Antigenem hepatitidy může být například polypeptid, získaný rekombinantní technikou DNA nebo atenuovaný kmen viru hepatitidy, případně ještě inakti2 vovaný známými postupy. Vynález se týká všech antigenů hepatitidy kmenů A, B, C, D nebo E, příklady těchto antigenů budou dále uvedeny.

Infekce virem hepatitidy A (HAV) je problémem, rozšířeným po celém světě, avšak jsou použitelné vakcíny, vhodné pro imunisaci velkého množství lidí, jde například o produkt, dodávaný pod názvem Havrix (SmithKline Beecham Blologicals), jde o vakcínu na bázi* usmrceného atenuováného kmene HM-175 ' viru HAV, jak bylo popsáno v publikaci Inactivated Candidate Vaccines for Hepatitis A”, F. E. André, A. Hepburn a E. D'Hondt, Prog. Med. Virol., sv. 37, str. 72-95, 1990 a v monografii Havrix, SmithKline Beecham Blologicals, 1991.

Flehmig a další (loc. cit., str. 56 - 71) shrnuli klinické projevy, virologii, imunologii a epidemiologii hepatitidy A a podrobně popsali možné přístupy k vývoji vakcíny proti této časté virové infekci.

Jak již bylo popsáno, znamená pojem antigen HAV jakýkoliv antigen, schopný vyvolat tvorbu neutralizačních protilátek proti HAV u člověka. Takový antigen může být tvořen živými částicemi atenuovaného viru nebo inaktivovanými částicemi atenuovaného viru nebo může jít o kapsid HAV nebo o virovou bílkovinu HAV, která může být získána také s použitím rekombinantní DNA.

Pokud jde o infekci virem hepatitidy B, HBV, jde rovněž o široce rozšířený problém, avšak k disposici jsou vakcíny, vhodné pro imunizaci v širokém měřítku, jde například o výrobek Engerix-B (SmithKline·Beecham plc), který byl získán pomocí genetického inženýrství.

Příprava povrchového antigenu hepatitidy B, HBsAg, je dobře dokumentována a byla popsána například v publikaci Garford a další, Develop. Biol. Standard 54, str. 125, 1983, Gregg a další, Biotechnology 5, str. 479, 1987 a v evropských patentových spisech c. 226 846 a 299 108.

Tak, jak bude v průběhu přihlášky používán, zahrnuje pojem povrchový antigen hepatitidy B nebo HBsAg jakýkoliv antigen HBsAg nebo jeho fragment s antigenitou, odpovídající povrchovému antigenu HBV. Je zřejmé, že kromě řetězce 226 aminokyselin antigenu H BsAg S (Tiollais a další, Nátuře, 317, 489, 1985 a literární údaje), může popsaný arrtigen HBsAg v případě potřeby obsahovat celý řetězec nebo část předběžného S-řetězce, jak již bylo popsáno ve svrchu uvedených publikacích a mimoto také v evropském patentovém spisu č. 278 940. S výhodou obsahuje uvedený antigen polypeptid s řetězcem aminokyselin 12 až 52, za níž následuje řetězec zbytků 133 - 145 a pak ještě řetězec zbytků 175 400 L-bílkoviny antigenu HBsAg vzhledem k otevřenému čtecímu rámci viru hepatitidy B, serotypu ad, tento peptid se uvádí jako peptid L^K podle EP 414 374. HBsAg ve smyslu vynálezu může zahrnovat také polypeptid preSl-PreS2-S, popsaný v EP 198 474 (Endotronics) nebo jeho analogy, tak jak byly popsány například v EP 304 578 (McCormick a Jones). Popsaný HBsAg se může týkat také mutant, tak jak byly popsány například v mezinárodní patentové přihlášce WO 91/14703 nebo ve zveřejněné evropské patentové přihlášce č. 511 855 Al, zvláště v případě, že aminokyselinou, zaměněnou v poloze 145 je glycin, který je nahrazen argininem.

Obvykle má HBsAg částicovou formu. Částice mohou obsahovat například samotnou bílkovinu S nebo může jít o složené částice, například (L^K, S), kde L^K má svrchu uvedený význam a S znamená bílkovinu S antigenu HBsAg. Částice mají s výhodou formu, schopnou exprese v kvasinkách.

Virus hepatitidy C, HCV, který je specificky popsán v GB 2 212 511B způsobuje onemocnění, které je možno léčit vakcínou, připravenou z jednoho nebo většího počtu imunogenních polypeptidů, odvozených z cDNA pro HCV.

Virus hepatitidy D byl podrobně popsán v publikaci Viral Hepatidis and Liver Disease, (1990, Symposium, loc. cit. |.

A

Virus hepatitidy E, HEV byl popsán v patentové přihlášce WO 89/12462. Vakcína, podávaná například ve farmakologicky přijatelném pomocném prostředku, obsahuje rekombinantní bílkovinu nebo směs bílkovin, odvozených od HEV.

I když pokusné i komerně vydávané vakcíny proti hepatitdě, jako Havrix a Engeřix-B poskytují velmi dobré výsledky, obecně se uznává, že optimální vakcína by měla nejen vyvolávat tvorbu neutralizačních protilátek, avšak rovněž by měla co nejúčinněji stimulovat buněčnou imunitu, zprostředkovanou T-buftkami. Existuje rovněž potřeba připravit kombinační vakcíny proti hepatitidě ke stimulaci buněčné imunity tímto způsobem. Vynález si klade za úkol takovou vakcínu navrhnout .

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří vakcína, která obsahuje antigen hepatitidy ve spojení s 3-0-deacylovaným monofosforyllipidem A (zkratka MPL) a vhodný nosič.

3-0-deacylovaný monofosforylolipid A (nebo 3 De-0 acylovaný monofosforyllipid A) byl dříve označován 3D-MPL nebo d3-MPl, aby bylo naznačeno, že poloha 3 redukujícího zakončení glukosaminu je de-O-acylována. Příprava této látky byla popsána v GB 2 220 211 A. Chemicky jde o směs 3-deacylovaného monofosforyllipidu A s 4, 5 nebo 6 acylovanými řetězci. Svrchu uvedené označení bylo zkráceno na MPL vzhledem k tomu, že MPL je ochranná známka firmy Ribi Immunochem. Montana pro označení 3-0-deacylovaného monofosforyllipidu A, který tato firma běžně dodává.

V GB 2 220 211 A se uvádí, že endotoxicita dříve pouzí váného enterobakteriá|ního lipopolysacharidu LPS je snížena, kdežto imunogenní vlastnosti jsou zachovány. Avšak uvedený patentový spis spojuje tato zjištění pouze v souvislosti s bakteriálními gram-negativními systémy. Dosud nikdy nebylo, navrhováno možné použití 3-deacylovaného monofosforyllipidu A jako pomocného prostředku pro vakcínu s obsahem antigenu viru hepatitidy.

Neočekávaně však bylo zjištěno, že vákcína podle vynálezu, která obsahuje uvedenou látku spolu s antigeny viru hepatitidy má zvláště výhodné vlastnosti, jak bude dále popsáno .

Velkou výhodou vakcíny podle vynálezu je skutečnost, že vakcína je velmi účinná při vyvolávání imunity, a to i při velmi nízkých dávkách antigenu.

Vakcína poskytuje velmi dobrou ochranu proti primární infekci a vyvolává jak tvorbu specifických neutralizačních protilátek, tak imunologickou odpověď, zprostředkovanou efek tořovými buňkami (DTH).

Další důležitou výhodou .je, že vakcíny podle vynálezu je možno užít nejen k prevenci, nýbrž také k léčení již vzniklého onemocnění.

MPL ve svrchu uvedeném významu je obvykle obsažen v rozmezí 10 až 100, s výhodou 25 až 50 mikrogramů v jedné dávce, kdežto antigen hepatitidy bude typicky obsažen v množství 2 až 50 mikrogramů na jednu dávku.

Nosičem může být emulze typu olej ve vodě, lipidové nosné prostředí nebo alum (sůl hliníku).

Netoxická emulzfe typu olej ve vodě s výhodou obsahuje netoxický olej, například skvalen a emulgátor, například Tween 80 ve vodném nosiči. Vodným nosičem může být například fyziologický roztok chloridu sodného s fosfátovým pufrem. V jednom provedení vynálezu se užije antigen HAV (například Havris) ve směsi se MPL a hydroxidem hlinitým, jak buče dále podrobněji popsáno.

V dalším provedení se použije antigen HBsAg S (například Engerix-B) ve směsi s MPL a hydroxidem hlinitým, jak bude rovněž dále popsáno.

V dalším specifickém provedení se užije antigen HBsAg ve formě částic (L ,S) ve svrchu uvedeném významu ve směsi s MPL a hydroxidem hlinitým.

Ve svrchu uvedených provedeních je možno místo prostředku alum užít emulzi typu olej ve vodě.

Další výhodná provedení budou uvedeny v příkladové části přihlášky.

V dalším provedení se vynález týká vykcíny pro použití v lékařství, zvláště pro léčení nebo profylaxi infekce virem hepatitidy. Ve výhodném provedení jde o léčebnou vakcínu, použitelnou při léčení již vzniklé infekce, zvláště infekce hepatitidou B a/nebo C u lidí.

Vzhledem ke zcela neočekávané účinnosti je v dalším výhodném provedení možno navrhnout vakcínu pro léčení nebo profylaxi hepatitidy A a/nebo B.

Vakcína podle výnálezu s výhodou obsahuje ještě další antigeny, takže je účinná při léčení nebo profylaxi jedné nebo většího počtu dalších bakteriálních, virových nebo houbových infekcí.

Vakcína proti hepatitidě podle vynálezu tedy s výhodou obsahuje alespoň jednu další složku, která se volí|z antigenu odlišných od antigenu hepatitidy, známých pro použití k výrobě vakcín, například proti záškrtu, tetanu, černému kašli, dětské obrně a proti Haemophilus influenzae b (Hib).

Vakcína podle vynálezu s výhodou obsahuje antigen HBsAg ve svrchu uvedeném významu.

Specifickými kombinačními vakcínami v rozsahu vynálezu mohou být například kombinace DTP (difterie-tetanus-pertusse) a hepatitida B, vakcína Hib-hepatitida B, vakcína DTP-Hib-hepatitida B a vykcína IPV (inaktivovaný virus dětské obrny) -DTP-Hib-hepatitida B.

Svrchu uvedené prostředky mohou s výhodou obsahovat složku, chránící proti hepatitidě A, jde zvláště o usmrcení atenuovaný kmen, odvozený od kmene HM-175, tak jak je použit ve vakcíně Hevrix.

Složky, vhodné pro použití v těchto vakcínách se již bažně dodávají, podrobnosti je možno získat od světové organizace WHO. Například jako složka IPV se může použít inaktivovaná vakcína pro dětskou obrnu (Salk). Vakcína proti černému kašli může obsahovat celé buňky nebo bezbuněčný materiál.

S výhodou je vakcína proti hepatitidě nebo kombinační vakcína podle vynálezu určena pro použití v dětském lékařství.

4.

Příprava vakcíny je obecně popsána v publikaci New Trends and Development in Vaccines, ed. Voliér a další, University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978. Zapouzdření do liposomů je popsáno v US patentovém spisu č.

235 877 (Fullerton). Konjugace s bílkovinami a makromolekulami je popsána například v US patentovém spisu č. 4 372 945 (Likhite) a US patent, č. 4 474 757 (Armor a další).

Množství antigenu v každé dávce vakcíny se volí tak, aby toto množství bylo schopné vyvolat imunoprotektivní odpověď bez významnějších nepříznivých vedlejších účinků, typických pro takové vakcíny. Toto množství bude záviset na použité imunogenní látce. Obvykle bude každá dávka obsahovat 1 až 1000, s výhodou 2 až 100 a zvláště 4 až 40 mikrogramů celkového množství imunogenních látek. Optimální množství pro určitou vakcínu je možno zjistit běžným způsobem podle pozorování titru protilátek a dalších odpovědí. Po počátečním očkování je možno ještě přeočkovat po přibližně 4 týdnech.

Podstatu vynálezu tvoří také způsob výroby uvedené vakcíny, při němž se zpracovává antigen hepatitidy ve svrchu uvedeném významu s nosičem a s MPL.

Tímto způsobem je možno zpracovat s HBsAg ještě další složky za vzniku kombinační vakcíny, s výhodou určené pro použití v dětském lékařství.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následují čími příklady.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Vakcína proti hepatitidě B

MPL byl získán od Ribi Immunochem Research lne. Hydroxid hlinitý byl získán od Superfos (Alhydrogel).

MPL se uvede do suspenze ve vodě pro injekční podání v koncentraci 0,2 až 1 mg/ml při použití ultrazvuku ve vodní lázni na tak dlouho, až částice mají rozměr 80 až 500 nm měřeno rozptylem světla.

až 20 mikrogramů HBsAg (S-antigen jako v Engerix B) v roztoku ve fosfátovém pufru v koncentraci 1 mg/ml se adsorbuje na 30 až 100 mikrogramů hydroxidu hlinitého v rozto ku, obsahujícím 10,38 mg Al /ml po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti za míchání. K tomuto roztoku se pak přidá 30 až 50 mikrogramů DMPL ve formě roztoku, obsahujícího 1 mg/ml této látky. Objem a osmotický tlak se upraví doplně ním na 600 mikrolitrů vodou pro injekční podání a 5x koncentrovaným fosfátovým pufrem. Roztok se inkubuje 1 hodinu při teplotě místnosti a pak se až do použití uchovává při teplotě 4 °C. V průběhu skladování dochází ke zrání prostředku. Tímto způsobem je možno získat deset injekčních dávek pro zkoušky na myších.

Podobný prostředek je možno připravit tak, že se jako antigen užije HBsAg (L^x, S), tak jak byl svrchu definován.

Příklad 2

Vakcína proti hepatitidě A

HAV (360 až 22 EU na dávku) se předem adsorbuje na 10% hydroxid hlinitý (0,5₄ mg/ml). K roztoku se přidá MPL v množ-_ ství 12,5 až 100 mikrogramů na jednu dávku.

K roztoku se přidá zbývající hydroxid hlinitý a směs se nechá stát 1 hodinu při teplotě místnosti. Objem se doplní fosfátovým pufrem s obsahem 10 mM fosfátu a 150 mM chloridu sodného a výsledný prostředek se uloží až do použití při teplotě 4 °C.

Příklad 3

Kombinační vakcína proti hepatitidě B a A

HBsAg se adsorbuje na 90 % konečného množství hydroxidu hlinitého (0,5 mg/ml) a směs se inkubuje přes noc při teplotě místnosti. Pak se pH upraví na 6,2 a prostředek se nechá zrát 14 dnů při teplotě místnosti.

Antigen hepatitidy A v množství 360 až 22 EU na jednu dávku se ve formě inaktivovaného derivátu kmene HM-175, který je užit také ve vakcíně Havrix předem adsorbuje na 10 % konečného množství hydroxidu hlinitého (0,5 mg/ml). Zbývající hydroxid hlinitý se pak přidá do roztoku a roztok se nechá stát za míchání 1 hodinu při teplotě místnosti.

HAV, adsorbovaný na hydroxid hlinitý se pak přidá k prostředku s obsahem HBsAg.

K roztoku HAV/HBsAg se pak přidá MPL do konečné koncentrace 12, až 100 mikrogramů na dávku 1 ml, objem se upraví na konečný objem dávky a prostředek se až do použití uloží při teplotě 4 °C.

Příklad 4

Kombinační vakcíny, obsahující přídatné antigeny

Λ

Kombinační vakcíny, obsahující DTP, IPV, Hib nebo bezbuněčné antigeny nebo celé buňky mikroorganismů, vyvolávajícího pertussi se připraví přidáním jednoho nebo většího počtu požadovaných antigenů k prostředkům, které byly popsány v příkladech 1, 2 nebo 3.

Příklad 5

Zvýšení humorální imunoty a indukce buněčně zprostředkované imunity imunizací myší při použití antigenů HBsAg, zpracovaného s hydroxidem hlinitým a MPL

A. Účinek hydroxidu hlinitého a MPL na tvorbu protilátek proti HBs

Myši kmene Balb/c byly imunisovány podkožně nebo nitrokožně rekombinantním HBsAg, adsorbovaným na hydroxid hlinitý s MPL jako pomocným prostředkem. Myši byly dvakrát imunisovány při použití HBsAg/Al/MPL a množství protilátek bylo stanoveno po první a po druhé dávce. Celkové množství lg bylo měřeno zkouškou ELISA nebo při použití zkušebního balíčku AUSAB (Abbott, Lab, 111.), zláště velká pozornost byla věnována vyvolání tvorby protilátek isotypu IgG2a vzhledem k tomu, že tento isotyp se převážně tvoří v důsledku vylučování g-interferonu. To znamená, že indukce tvorby tohoto isotypu nepřímo odráží aktivaci buněčně zprostředkované imunity, zejména aktivaci Thl.

Byl zkoumán poměr HBsAg/MPL stejně jako vliv velikosti částic MPL vzhledem k tomu, že suspenze této látky ve vodě může obsahovat částice menší než 100, avšak i větší než 500 nm.

Pokus I

Účinek MPL s velikostí částic větších než 500 nm na imunogenitu rekombinantního HBsAg, adsorbovaného na hydroxid hlinitý

Skupinám po deseti myších samicích kmene Balb/c bylo podkožně podáno 2,5 mikrogramů rekombinantního HBsAg, adsorbovaného na 50 mikrogramů Al⁺⁺⁺ ve formě hydroxidu hlinitého při zvyšujícím se množství MPL v rozmezí 3,1 až 50 mikrogramů při velikosti částic větším než 500 nm. Myším byly podány dvě injekce v objemu 100 mikrolitrů v intervalech 2 týdny. Myším byla odebrána krev dva týdny po prní injekci a týden po druhém očkování. Celkové množství IgG proti HBs a celkové množství specifického IgG2a bylo měřeno metodou ELISA při použití rekombinantního HBsAg. Titry byly vyjádřeny jako převrácená hodnota ředění, které odpovídá 50 % maximální hodnoty (ředění do středního bodu). Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1. Výsledky prokazují zvýšení množství specifického IgG i IgG2a při zvyšující se dávce MPL, zvláště v rozmezí dávek 12,5 až 50 mikrogramů. Účinek je možno pozorovat pro primární i sekundární odpověď a je zvláště zřejmý v případě IgG2a, kde dochází až ke 20násobného vzestupu, což nepřímo ukazuje na to, že při imunizaci s použitím MPL dochází k vylučování g-interferonu.

Pokus II

Srovnání prostředků s adsorbovaným rekombinantním HBsAg v přítomnosti nebo nepřítomnosti MPL s částicemi většími než 500 nm, určených pro klinické zkoušky

Byly připraveny tři prostředky, určené pro klinické zkoušky a obsahující rekombinantní HBsAg, adsorbovaný na hydroxid hlinitý. Prostředek BSAH15 neobsahoval MPL a byl kontrolní. Prostředky DSAR501 a 502 obsahovaly 20 mikrogramů rekombinantního HBsAg, adsorbovaného na 0,5 mg Α1⁺⁺⁺νβ formě hydroxidu hlinitého a mimoto 50 mikrogramů MPLs velikostí částic vyšší než 500 nm.

Uvedené tři prostředky byly podkožně podány skupinám po deseti myších, celkem dvakrát v intervalu dva týdny, podáno bylo 200 mikrolitrů s obsahem 2,5 mikrogramů HBsAg,

100 mikrogramů Al⁺⁺⁺ a 6,25 mikrogramů MPL. Myším byla odebrána krev po dvou týdnech a pak jeden týden po přeočkování. Množství protilátek proti HBS bylo měřeno při použití zkuseb ního balíčku AUSAB nebo metodou ELISA pro IgG nebo IgG2a. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2 a je z nich zřejmé, že dva týdny po první injekci vyvolávají oba prostředky s obsahem MPL velmi významnou tvorbu protilátek proti HBs, a to 12,4 a 41,9 mlU/ml, kdežto prostředek bez obsahu MPL vyvolal pouze hraniční odpověď 0,75 mlU/ml. Množství jedinců s prokazatelnou odpovědí byla rovněž vyšší v případě MPL, a to 9/10 a 9/10 oproti 1/10 v nepřítomnosti MPL. Účinek MPL byl potvrzen také po přeočkování, protože titry pro prostředky DSAR 501 a 502 jsou přibližně 6x vyšší než pro prostředek bez MPL.

To prokazuje, že alespoň u myší může MPL s velikostí částic vyšší než 500 nm zlepšit kinetiku vzniku odpovědi na HBs i úroveň této odpovědi.

Uvedené výsledky byly potvrzeny také při měření množství specifického IgG a IgG2a po imunizaci prostředkem DSAH16 bez MPL a DSAR502 s obsahem MPL. Titr IgG proti HBS je 5x větší pro primární odpověď a 3x vyšší pro sekundární odpověď v přítomnosti MPL.

Pro odpověď, spočívající v tvorbě IgG2a je účinek MPL ještě nápadnější, alespoň po druhé dávce a ukazuje na přednostní tvorbu IgG2a. To nepřímo ukazuje na aktivaci buněčně zprostředkované imunity (sekrece g-interferonu) při podání prostředku s obsahem MPL.

Pokus III

Účinek MPL s velikostí částic menší než 100 nm na imunogenitu rekombinantního HBsAg, adsorbovaného na hydroxid hlinitý

Vzhledem k tomu, že MPL je mnohem snáze dosažitelný reprodukovatelným způsobem v částicích menších než 100 nm než v částicích větších než 500 nm, byl sledován také účinek MPL s velikostí částic menších než 100 nm na imunogenitu rekombinantního HBsAg, adsorbovaného na hydroxid hlinitý.

Skupinám deseti myších samic kmene Balb/c ve stáří 7 týdnů byl podkožně podán 1 mikrogram rekombinantního HBsAg, adsorbovaného na 50 mikrogramů Al⁺⁺⁺ ve formě hydroxidu hlinitého v přítomnosti zvyšujícího se množství 3,1 až 25 mikrogramů MPL s velikostí částic menší než 100 nm. Myším byly podány dvě injekce v intervalu dvou týdnů v objemu 200 mikrolitrů. Myším byla odebrána krev dva týdny po první injekci a týden po přeočkování. Odpověď proti HBs byla vyhodnocena zkouškou ELISA na směsi sér, hodnoceno bylo množství Ig, IgG a IgG2á. Titry byly vyjádřeny jako reciproční hodnota ředění, poskytujícího 50 % nejvyšší hodnoty. Výsledky ukazují, že již pouze 3,1 mikrogramů MPL vyvolá silné zvýšení tvorby protilátek při primární i sekundární odpovědi. Zvýšení vyvrcholí při použití 6,25 mikrogramů této látky a pak pomalu klesá, až při použití vysokých dávek MPL až 25 mikrogramů je odpověď podobná jako v případě, že se MPL vůbec nepoužiji Tento typ tvorby protilátek je podobný pro IgG, IgG2a i pro celkové množství Ig. Na rozdíl od výsledků, získaných při použití MPL s většími částicemi nad 500 nm v pokusu I je patrné, že částice s mepším rozměrem do 100 nm jsou pravděpodobně účinnější, alespoň v případě humorální imunity vzhledem k tomu, že je zapotřebí menšího množství MPL k dosažení maximálního účinku. Vyšší účinnost MPL s menšími částicemi byla potvrzena v průběhu několika pokusů.

Jak bylo prokázáno, pro MPL s částicemi vyššími než 500 nm, je účinek MPL vyšší v případě IgG2a než v případě celkového I.gG nebo Ig. Při maximálním účinku pro sekundární odpověď při použití 6,25 mikrogramů MPL dochází ke 25násobnému zvýšení množství IgG2a, kdežto odpovídající zvýšení je 7,6x pro IgG a 4,3x pro celkový Ig.

B. Vyvolání buněčně zprostředkované imunity při použití rekombinantního HBsAg, adsorbovaného na hydroxid hlinitý, vliv MPL

I když je humorální imunita dostatečná k ochraně prot hepatitidě B, mohlo by mít vyvolání buněčně zprostředkované imunity (CTL, Thl) zvláštní význam při léčení této choroby.

Pro léčebné vakcíny je však zapotřebí navrhnout nové typy prostředků vzhledem k tomu, že hydroxid hlinitý může zvýšit humorální imunitu, avšak nikoliv buněčně zprostředkovanou imunitu.

Z uvedeného důvodu byl sledován vliv MPL na indukci tvorby Thl-buněk, schopných sekrece IL-2 a gamma-interferonu u myší Balb/c, imunizovaných rekombinantním HBsAg, adsorbovaným na hydroxid hlinitý.

Pokus I

Vliv MPL s velikostí částic vyšší než 500 nm na indukci tvorby buněk Thl po imunizaci myší Balb/c HBsAg, adsorbovaným na hydroxid hlinitý

Skupiny po 10 myších samicích kmene Balb/c ve stáří 5 týdnů byly imunizovány do každé tlapky injekcí 30 mikrolitrů, obsahující 10 nrtkrogramů HBsAg, 15 mikrogramů Al⁺⁺⁺ve formě hydroxidu hlinitého a 15 mikrogramů MPL.Kontrolním myším bylo vstřiknuto totéž množství rekombinantního HBsAg ve směsi s FCA (positivní kontrola) nebo adsorbovaného na hydroxid hliníku bez MPL (negativní kontrola).

Šest dnů po imunisaci byly myši usmrceny a byly odstraněny popliteální lymfatické uzliny. Buňky lymfatických uzlin LNC v množství 2105/M1 byly pěstovány po různá časová období v rozmezí 24 až 74 hodin v prostředí RPMI, doplněném 1 % negativního myšího séra a obsahujícím 5 mikrogramů/ml rekombinantního ABsAg. Po ukončení pěstování bylo měřeno množství IL-2, INF-g a IL-4 v živném prostředí. IL-2 byl stanoven na základě své schopnosti stimulovat proliferaci buněčné linie, závislé na IL-2, buněk VDA-2, proliferace byla vyhodnocena příjmem 3H-thymidinu, titr byl vyjádřen jako stimulační index SI, který je roven poměru 3H-thymidinu, přijatého stimulovanými buňkami a téže látky, přijaté nestimulovanými buňkami. Množství IL-4 a INF-g bylo měřeno při použití komerčních balíčků ELISA (Holland Biotechnology pro IFN-g a endogen pro IL-4). Titry byly vyjádřeny v pg pro IFN-g/ml.

Výsledky ukazují, že LNC myší, imunisovaných HBsAg, adsorbovaným na hydroxid hlinitý neprodukují podstatnější množství IL-2, IL-4 ani INF-g. Na druhé straně u LNC myší, imunizovaných HBsAg, adsorbovaným na hydroxid hlinitý s přidáním MPL dochází k sekreci vysokého množství IL-2 (I.S. = po 48 hodinách) a podstatného množství INF-g. Tato sekrece je v případě IN-g podobná a v případě IL-2 vyšší než sekrece u myší, imunizovaných HBsAg + FCA a k sekreci in vitro také dochází o něco dříve Λ

Žádný IL-4 nebylo možno pozorovat po imunizaci HBsAg, adsorbovaným na Al(OH)g ani v přítomnosti MPL.

Tento profil sekrece prokazuje, že při imunizaci adsorbovaným HBsAg v přítomnosti MPL, avšak nikoliv v nepřítomnosti MPL došlo ke tvorbě specifických buněk Thl (IL-2, INF-g).

Avšak za těchto podmínek imunizace nebylo možno prokázat tvorbu buněk Th2 (IL-4).

Pokus II

Účinek MPL s velikostí částic menší než 100 nm na indukci tvorby buněk Thl po imunizaci myší Balb/c rekombinantním HBsAg, adsorbovaným na hydroxid hlinitý

Skupiny po pěti myších Balb/c byly imunizovány do každé ze dvou tlapek podáním 30 mikrolitrů prostředku s obsahem 10 mikrogramů rekombinantního HBsAg, adsorbovaného na 15 mikro gramů Al⁺⁺⁺ ve formě hydroxidu hlinitého s přidáním zvyšujícího množství MPL s velikostí částic 100 nm, dávka 0 až 15 mikrogramů.

Šest dnů po injekci byly myši usmrceny a buňky popliteálních lymfatických uzlin, LNC, byly pěstovány při hustotě 2106 buněk(ml v prostředí RPMI, doplněném 1 % negativního myšího séra po různou dobu 24 až 96 hodin v přítomnosti 5 mikrogramů/ml rekombinantního HBsAg.

Sekrece IL-2 byla měřena stimulací proliferce buněk VDA2 a koncentrace IL-2 byla vyjádřena jako stimulační index SI. Sekrece INF-g byla měřena pomocí běžně dodávaného zkušebního balíčku a vyjádřena v pg/ml.

Bylo prokázáno, že sekrece IL-2 se dramaticky zvyšuje již při nízké dávce 7,5 mikrogramů MPL, k maximálnímu účinku dochází při dávce 15 mikrogramů MPL.

Sekrece IL-2 je obvykle vyšší po 24 než po 4β nebo 72 hodinách.

K sekreci INF-g nedochází v případě, Že se užije HBsAg, adsorbovaný na hydroxid hlinitý bez přidání MPL. Malá dávka 7,5 mikrogramů MPL vyvolá sekreci INF-g a maximálního účinku je dosaženo při 15 mikrogramech MPL. Na rozdíl od pozorování pro IL-2 je sekrece INF-g poněkud opožděna a zvyšuje se v průběhu času až do 96 hodin.

Závěrem je možno shrnout, že MPL s velikostí částic 100 nm může vyvolat tvorbu buněk Thl v případě, že tato látka je přidána k HBsAg, adsorbovanému na hydroxid hlinitý.

C. Závěr

Byl sledován účinek prostředku, obsahujícího HBsAg, adsorbovaný na hydroxid hlinitý a MPL na vyvolání humorální a buněčně zprostředkované imunity u myší kmene Balb/c. Vý19 sledky ukazují, že MPL zcela zřejmě zlepšuje kinetiku odpovědi proti HBs vzhledem k tomu, že po primární i sekundární imunizaci je možno pozorovat daleko větší množství protlátek proti tomuto antigenu. Kvalita těchto protilátek je rovněž pozměněna, bylo možno pozorovat přednostní tvorbu IgG2a, což nepřímo prokazuje sekreci INF-g a tím také indukci buněčně zprostředkované imunity.

Přímé vyhodnocehí indukce tvorby buněk Thl pomocí prostředků, obsahujících HBsAg, hydroxid hlinitý a MPL jasně prokazuje, že MPL může vyvolat silnou indukci tvorby buněk Thl, u nichž dochází k sekreci IL-2 a INF-g. Tento typ pro-středku je tedy velmi důležitý pro vývoj vakcíny, užívané k léčebným účelům.

Výsledky svrchu uvedených pokusů budou shrnuty v tabulkách 1 až 6.

Příklad 6

Klinické použití MPL jako pomocného prostředku pro HBsAg předběžné výsledky

Studie s použitím MPL-HBV-002 (stále ještě pokračuje)

Při této studii byl srovnáván prostředek HBsAg-MPL s vakcínou Engerix-B u mladých zdravých dospělých dobrovolníků bez jakéhokoliv předběžného ošetření. Pokusy byly prováděny do následujících konečných bodů:

imunogenita: velikost odpovědi ve formě množství protilátek proti HBs kinetika tvorby protilátek proti HBs, buněčně zprostředkovaná imunita, vyvolaná oběma vakcínami in vivo i in vitro, vznik reakce, toxikologie a bezpečnost.

Materiály a metody

a) Vakcína

HBsAg *Alum MPL jako v Engerix B

I 20/Ug 500/Ug 50/Ug

II 20/Ug 500/Ug 0

b) Pokusné osoby

Šlo o zdravé dospělé dobrovolníky ve stáří 18 až 30 let, negativní na HBV a nikdy dříve očkované proti viru hepatitidy B.

c) Provedení pokusu

Dvojitá slepá zkouška s náhodným vybráním subjektů. Schéma vakcinace: 0, 1 a 6 měsíců.

Sledování až do 12 měsíce.

Odběry krve:

protilátky proti HBs byly stanoveny před vakcinací a 7, 15 a 30 dnů po každém očkování, biochemické a hematologické parametry byly vyhodnoceny před a dva dny po každé dávce, krev pro vyhodnocení buněčně zprostředkované imunity byla odebrána před a po primární vakcinaci a před a po přeočkování.

Výskyt reakcí:

Pokusné osoby zaznamenávaly výskyt místních i celkových příznaků do deníku v den očkování a v průběhu sedmi následujících dnů.

Výsledky

Výsledky sledování do dvou měsíců po druhé dávce budou dále uvedeny.

Pokusné osoby:

Celkem 29 osob souhlasilo s provedením pokusu, avšak pouze 27 osob, 15 mužů a 12 žen splnilo kriteria. 15 osob bylo zařazeno do skupiny I a 12 osob do skupiny II. Průměrný věk osob byl 22 let.

Bezpečnost:

Nebyly pozorovány žádné nežádoucí vedlejší účinky a žádnou osobu nebylo nutno vyřadit ze studie. Nebyly pozorovány žádné významné klinické změny, pokud jde o hematologické nebo biochemické parametry. Výskyt a závažnost místních a celkových příznaků byly podobné u obou očkovaných skupin.

Imunogenita:

Titr protilátek proti HBs byl měřen až do dne 90, to znamená dva měsíce po přeočkování. Rychlost tvorby protilátek

SC v procentech je definována okamžikem, v němž je již možno prokázat protilátky u osob, které na počátku tohoto pokusu měly negativní krevní sérum.

Dosažená ochrana je definována procentem osob, u nichž bylo dosaženo dostatečně vysokého titru protilátek proti HBS. V případě, že není možno prokázat jasný rozdíl v množství vytvořených protilátek mezi oběma skupinami, je kinětiká odpovědi odlišná a je ^zřejmě výhodné použít vakcínu, obsahujfcí MPL. Sedm dnů po druhé dávce skutečně došlo v 93 a v 80 % osob, jimž byla podávána vakcína MPL-HBV a osoby z těchto skupin byly tedy chráněny, pro srovnání je možno uvést, že hodnota SC pro skupinu, jíž byla podávána vakcína Engerix-B byla 95 % a dosažená ochrana 58 %. Tento rozdíl se udržuje až 2 měsíce po podání druhé dávky a je zvláště patrný pro dosaženou ochranu. V uvedeném časovém období byly všechny osoby, jimž byla podávána vakcína MPL-HBV dostatečně chráněna, kdežto ve skupině osob, jimž byla podána vakcína s hlinitou solí jako pomocným prostředkem bylo chráněno pouze 58 % očkovaných osdb.

Studie s podáním MPL-HBV-003 (ještě pokračuje)

Materiály a metody jsou obdobné jako při předchozí studii s podáním MPL-HBV-002, tak jak bylo svrchu uvedeno. Způsob vakcinace však byl odlišný.

skupina počet osob vakcína časové rozmezí

I	25	MPL-HBsAg/alum	0-2	měsíce
II	25	Engerix-B	0-2	měsíce
III	25	MP L-HB sAg/alum	0-6	měsíců
IV	25	Engerix-B	0-6	měsíců

Výsledky

Přestože kinetika tvorby protilátek proti HBs nebyla tak přesně sledována jako v předchozích studiích, je zřejmé, že z výsledků je možno vyvodit stejný závěr. Osoby, jimž byla podávána vakcína s obsahem MPL byly lépe chráněny po podání druhé dávky než osoby, jimž byla podána vakcína bez obsahu MPL. Všechny osoby až na jednu, to znamená

95,8 % osob mělo dostatečný ochranný titr jeden měsíc po podání druhé dávky vakcíny MPL-HBV ve srovnání se 72,7 % osob ve skupině, jíž byla podávána vakcína Engerix-B. Mimoto na rozdíl od předchozího pokusu vyvolávala vakcína MPL-HBV tvorbu vyššího titru protilátek než vakcína Engerix-B a to 214 a 72 mIU/'ml, což může znamenat, že delší interval mezi dávkami je důležitý.

Závěr

Ve svrchu uvedených studiích byl vyhodnocen účinek vakcíny proti hepatididě B s obsahem antigenu HBsAg, který obsahuje také vakcína Engerix-B a účinek doplnění této vakcíny MPL, studie byly prováděny na zdravých dospělých dobrovolnících a srovnávány s účinkem vakcíny Engerix B, obsahující antigen HBsAg S a alum. Po podání první dávky se zdá, že mezi oběma vakcínami není podstatný rozdíl v imunogenitě, kdežto po druhé dávce je zřejmé, že vakcína MPL-HBV je daleko výhodnější vzhledem k tomu, že po jejím podání je možno u většího procenta osob prokázat ochranný titr protilátek. GMT je rovněž v této skupině vyšší v případě, že se obě dávky podají v intervalu 2 měsíců místo v intervalu 1 měsíc.

Přidání MPL k antigenu tedy vyvolává výhodnější imunologickou odpověď a vakcína tohoto typu by měla být zvláš tě vhodná pro použití u osob, u nichž dochází k tvorbě ě protilátek pomalu nebo u osob, které vytváří jen malé I i

množství protilátek po očkování proti viru hepatitidy B, j i

tak jako tomu je u starších lidí nebo u lidí s poruše- I ným imunitním systémem.

f

Výsledky svrchu uvedených pokusů jsou shrnuty v dále uvedených tabulkách 7 až 9. 1

I i

i \ 'I

Příklad 7

Hepatitida A - studie s vakcínou s obsahem MPL u myší

V následujícím pukusu je prokázáno, že přidání MPL !

k vakcíně proti hepatitidě A má příznivý účinek. Tento j účinek se odráží v nižší hodnotě ED5O, jde o dávku, vyjá- c dřenou v jednotkách ELISA, EU, která poskytuje sérologie- i kou odpověď u 50 % očkovaných zvířat.

Metoda j

Myši kmene NMRI byly očkovány jednou injekční dávkou J' pokusné vakcíny HAV, obsahující 360, 120, 40 nebo 13,3 EU/ J /dávka, současně byla vakcína doplněna různými koncentrace- - j mi MPL, a to 0, 1,5, 6 nebo 12,5 mikrogramů(dávka. Vzorky ) krve byly odebrány 28 dnů po očkování a sérum bylo podrobe- * j no zkoušce při použití testu HAVAB. Byla vypočítána hodnota [

ED50, vyjádřena v EU, odpovídající dávce, schopné vyvolat jí serologickou odpověď u 50 % pokusných zvířat.

Výslédky [

I i

I

Získané výsledky jsou shrnuty v následující tabulce.

Hodnoty ED5O pro vakcínu bez obsahu MPL hyly 123,7 EU, !

kdežto hodnota ED50 pro vakcínu, obsahující 1,5 mikrogramů MPL/dávka byla tato hodnota 154. Vyšší dávky MPL mely příznivý účinek, ED5O bylo možmo dosáhnout při nižších hodnotách EU. Při použití 12,5 mikrogramů MPL/dávka byla hodnota ED5O rovna 47,1 EU.

Závěr

Kombinace příslušného množství MPL a vakcíny HAV může zlepšit účinek vakcíny při pokusech na myších.

Tabulka

Vliv přidání MPL k vakcíně proti hepatitidě A

Přidaná dávka MPL (/Ug/dávka)

ED5O (vEU/dávka)

123,7

1,5

154

101,1

12,5

47,1

Tabulka 1

Vliv zvyšujících se dávek MPL ( >500 nm) na imunogenitu

rekombinantního antigenu, adsorbovaného na hydroxid hlinitý	i I ' I
Množství MPL	Odpověď proti HBs			í
(/Ug/dávka)	celkový IgG	IgG2a
den 14 den 21	den 14 den 21	-	1

0* 69	743	3,2	11
3,13 122	541	3,8	20
6,25 296	882	6,4	24
12,5 371	1359	10	48
25 456	1493	18	138
50 403	1776	33	242
T a b	u 1 k a 2
Srovnání tří klinických	prostředků, bez	obsahu	nebo s

obsahem MPL při měření pomocí AUSAB prostředek dávka HBsAg dávka MPL GMT proti HBs ňa Al(0H)g (/Ug) (mlU/ml) (/Ug)

DSAH16	2,5	. 0	0,75	15,1
DSAR501	2,5	6,25	12,4	96,7
DSAR502	2,5	6,25	41,9	89,2

Tabulka 3

Srovnání dvou klinických prostředků s obsahem nebo bez obsahu MPL s částicemi většími než 500nm

Odpověd. ve formě IgG a IgG2a proti HBS prostředek dávka HBsAg na Al'() (/Ug) dávka MPL (/Ug) odpověd proti HBs

IgG d 15 d 21

IgG2a d 15 d.21

DSAH16	2,5		0	20	178	✓	5 5
DSAR5O2	2,5		6,25	113	641	/	5 28
	T a b i	u 1	k a 4
Vliv MPL	s částicemi	pod	ί 100 nm na	imunogenitu rekombinantního
HBsAg, adsorbovaného	na	hydroxid hlinitý
dávka	dávka		odpověď	proti HBs
HBsAg na ai(oh)₃ ( /Ug)	MPL ( -4 lOOnm) ( /Ug)		celkový lg dl5 d 21	IgG d 15	d 21	IgG2a d 15 d 21
1	0		30 637	67	516	15	99
1	3,12		312 2302	335	3532	167	1752
1	6,25		538 2719	856	3932	261	2521
1	12,5		396 '2104	485	3625	125	1393
1	25,0		38 446	141	638	28	233

P	3	13
2	O	0
’Π	X*
OP	O	p·
03	3	3
3	σ	C
3	Ρ·	3
53	3	P-
>«	53	N
	3	53
53	ct	O
	3	P·
H	P'	M
f	3*
1	O	Ό
A		0
	E	tJ
Ό	OD	ta
3<	01	53
P·	>	3
	OP	ro*
U	•'x.
O	3	<
c	p
N<		ct
P·	•3	ro
ct	0	X
P'		ct
	c	3
σ	<
c	ro	&
3	Cc	<<
<T3<	ro	P
X	3	<<
	0
<	c	σ
o		s
>	Q.	3<
r\j	0	x
	σ	<<
<-3	s
		P
53	53	<<
		3
CX	σ	Hj
<	<<	53
O	p	ct
c	53	P·
		o
N	3	X
x	ro<	‘C'
c	3<	o
w<	ro	3
o	3
σ	53	3
3		N
H>	oi	P
O	ro	P·
3“	X	3
	3
σ	ro	Ό
53	o	ro<
P	ro	01
P'		ct
o<	H	O
X	tm	<
c·	1	S?'
	ro	3
w	M	«<
t-·
H		03
CZ3
>		01
•

c

OP

UJ

O 2 3 o r*

NJ NJ

NJ

X 3 03 OP 03

OP «<

03« tt

53' <

X* £0 ž >

~ o n ÍS

M ř* > G4 +

cx	Ό
ro	3
X	O
	01
	ct
	3«

ro

I t-3 σ

P

X cn

NJ

A o j cj

U)		MM	NJ	00
00	A	00
				~J
	1.2	0.7	8.0	NJ
A	A	A	A	N> i>r
•M	MM	M	MMt
nj	NJ	NJ	NJ	MJ
v>	V»	t-Λ	Cn
NJ oe ř->	<1	<1	<1	48
NJ	NJ	NJ	ST
»	ui	Ví
280	A NJ Cn	<125	CJ 90 cn	~4 NJ

I

NJ

I—»

C/3 oi (D x

ro o

(Λ

P·

Vliv MPL s částicemi nad 500 nm na indukci tvorby buněk TH1, specifických pro HBsAg u myší Balb/c i

I

Účinek různých dávek MPL s částicemi pod 100 nm : indukci tvorby buněk TH1, specifických pro HBsAg

0) ω

χ*

C

Ό

Η· ¢3

W Ο 3 •C Wi

W ξ.

5*

ΚΙ

Τ= «Μ « w

ί* η

<

V χ· ο

Η'

Η

Ρ σ

c ι—¹

X* ·Ξ ^2 2 2 2 2 α S $ S g· S §

Ο ΙΛ Μ Cí

ΟΧ

NJ»4NJN»NJN»N»N» !Λ (Λ ’J1 'JI 71 f. '71 ‘71

©	©	©	'J	tn	UJ
UJ	©	UJ	ΙΛ	9	UJ
UJ	Μ	UJ	Ο	©	UJ

3¹

Ο &

Ο

C+

0)

Ω

Ξ

W r

W <

» ©

©

SJ «7

Η

tn	cn	U	ιη	Μ	Μ
Μ	©	ΜΑ	©	©	©
U>	ο	U)	UJ	©	©

© β

X- © © © ® © 9

-4 ©

UJ Ο

SJ «4 © ' ©

•σ ο

<τ+ <

Ο

rť	σ'
Η·	03
Μ
03'	0
ct	ο
ÍD	3*
X*	3
	03
χ—'	3
	3
<✓	«<'
	Ο
	3*

) o

M

O σ

d15~ d30 d37 d45 d60 d90

§

□	a
ČI)	σ m
X*	CO X*
c	> c
•Ό	Χ-Ό
•	Ui ·
ha	o
• ·	K3 ..
m	3> ca
3	ha σ
CQ	•
(B	2
	o
X	r-
03	X
··	03
σ	<ft
co	2>
>	ta
X et >

x* ί»

Studie MPL-002: titr ochranných protilátek proti HHs je vyšší nebo roven 10 mIU/ml

Studie MPL-HBV-003	Tabulka 9
čas	N	SC(%)	GMT	SP(%)
skupina	vakcína
I	MPL-	Pre	25	0,0	0	0,0
	HBsAg	Pl(ml)	23	56,5	10	26,1
	(20/Ug)	P*í(m2)	24	66,7	6	16,7
	P2(m3)	24	100,0	214	95,8
II	Engerix-B	Pre	25	0,0	0	0,0
	(20_zug)	Pl(ml)	24	41,7	12	29,2
		Pl(m2)	19	52,6	4	5,3
		P2(m3)	22	90,9	72	72,7

Zastupuje :

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

!) n T 8 f o

1. Vakcína proti hepatitidě, vyznačuj íjc í se t í m , že obsahuje antigen hepatitidy A spolu s p 3-0-deacylovaným monofosforyllipidem A a příslušný nosič.
2. Vakcína podle nároku 1,vyznačující se t í m , že jakc^ nosič obsahuje alum.
3. Vakcína podle nároku 1, vyznačující se t í m , že jako nosič obsahuje emulzi typu olej ve vodě nebo jiný nosič na bázi lipidu.
4. Vakcína podle nároků 1 až 3, vyznačuj ící se t í m , že jako antigen hepatitidy obsahuje antigen hepatitidy A.
5. Vakcína podle nároku 4, vyznačuj íc I se t í m , že jako antigen hepatitidy A obsahuje inaktivované celé buňky, připravené z kmene HM-175.
6. Vakcína podle nároků 1 až 3, vyznačuj í c í s e t í m , že jako antigen obsahuje antigen hepatitidy B.
7. Vakcína podle nároku 6, vyznačuj íc í se t í m , že jako antigen obsahuje povrchový antigen hepatitidy B HBsAg nebo jeho variantu.
8. Vakcína podle nároku 7, vyznačuj íc í se t í m , že obsahuje S-antigen HBsAg s obsahem 226 aminokyselin.

; 1 a
9. Vakcína podle nároku 8, vyznačuj ící se t í m , že jako antigen obsahuje HBsAg, navíc obsahující pre-S-řetězec.

a fj
10. Vakcína podle nároků 8 nebo 9,vyznaču- S

I jící se tím, že antigen HBsAg je tvořen složenými částicemi (L^X,S), kde L* znamená modifikovanou bílkovinu L viru hepatitidy B, s řetězcem aminokyselin, obsahujícím ' zbytky 12 až 52, za⁴nimiž následují zbytky 133 až 145 a pak j zbytky 175 až 400 bílkoviny L a S znamená bílkovinu S anti- j genu HBsAg. jj
11. Vakcína podle nároků 6 až 10, v y z n a č u j í- | cí se tím, že dále obsahuje antigen hepatitidy A. [
12. Vakcína podle kteréhokoliv z nároků 1 až 11, i * 3 vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden antigen hepatitidy a alespoň jednu další složku, volenou ř z antigenu» odlišných od antigenu hepatitidy a vyvolávají- i cích ochranu proti záškrtu, tetanu, pertussi, Haemophilus influenzae b (Hib) a/nebo dětské obrně. I ' i
13. Vakcína podle nároku 12,vyznačující j se t í m , že jde o kombinaci DTP (difterie-tetanus- *

-pertusse) a HBsAg, kombinaci Hib-HBsAg, kombinaci DTP-Hib-HBsAg nebo kombinaci IPV (inaktivovaná vakcína proti ‘ dětské obrně) -DTP-Hib-HBsAg.
14. Vakcína podle nároku 12,vyznačující se tím, že navíc obsahuje antigen hepatitidy A.
15. Vakcína podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že jako antigen hepatitidy obsahuje antigen hepatitidy C, D nebo E.
16. Vakcína podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že obsahuje 3-0-deacylovaný monofosforyllipid A v množství 10 až 100 mikrogramů na jednu dávku.
17. Vakcína podle nároků 1 až 16 pro použití v lékařství .
18. Použití antigenu hepatitidy spolu s 3-0-deacylova ným monofosforyllipidem A pro výrobu prostředků pro profylaxi nebo léčení hep^atitidy.