CZ2003260A3 - Estery kyseliny 5-aminolevulové - Google Patents

Description

Estery kyseliny 5-aminolevulové

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nových derivátů kyseliny 5aminolevulové (ALA) a zvláště esterů ALA a jejich použití jako fotosenzitizačních látek při fotochemoterapii nebo diagnostice.

Dosavadní stav techniky

Fotochemoterapie nebo fotodynamická terapie (PDT) je jak známo způsob léčení různých abnormalit nebo onemocnění kůže nebo jiných epiteliálních orgánů nebo sliznic, zvláště rakoviny nebo předrakovinných poškození, stejně jako některých nemaligních poškození, např. onemocnění kůže jako je lupénka. Fotochemoterapie zahrnuje použití fotosenzitizačních (fotochemoterapeutických) látek na postiženou oblast těla a následné vystavení fotoaktivujícímu světlu pro aktivaci fotosenzitizačních látek a jejich převedení na cytotoxickou formu, přičemž postižené buňky jsou usmrceny nebo dojde ke snížení jejich proliferačního potenciálu.

Je známa řada fotosenzitizačních látek, přičemž do této skupiny patří zejména psoraleny, porfyriny, chloriny a ftalokyaniny. Tyto látky přejdou do toxické formy, jestliže se vystaví působení světla.

Fotosenzitizační léčiva mohou projevit své účinky různými mechanismy, přímo nebo nepřímo. Tak např. některé fotosenzitizátory se při aktivaci světlem stanou přímo toxické, zatímco jiné způsobí vytvoření toxické sloučeniny, například oxidačních činidel jako je singletový kyslík nebo jiné volné radikály odvozené od kyslíku, které jsou extrémně destruktivní pro buněčný materiál a biologické molekuly, jako jsou lipidy, proteiny a nukleové kyseliny. Příkladem přímo působících fotosenzitizátorů jsou psoraleny; po vystavení světlu vytvářejí addukty a zesítění mezi dvěma řetězci molekul DNA, čímž inhibují syntézu DNA. Při této terapii se však vyskytuje nežádoucí riziko mutagenních a karcinogenních vedlejších účinků.

Této nevýhodě se lze vyhnout volbou fotosenzitizátorů s alternativním nepřímým způsobem účinku. Například porfyriny, které působí nepřímo tvorbou toxických kyslíkatých sloučenin, nemají mutagenní vedlejší účinky a jsou tedy vhodnějšími kandidáty pro fotochemoterapii. Porfyriny jsou prekurzory, které se v přírodě vyskytují při syntéze hernu. Hem se zvláště vytváří, jestliže se železo (Fe³⁺) inkorporuje do protoporfyrinu IX (Pp) působením enzymu ferochelatázy. Pp je extrémně účinný fotosenzitizátor, zatímco hem nemá žádné fotosenzitizační účinky.

Jedním takovým lékem na bázi porfyrinu je Photofrin®, který byl nedávno schválen jako fotosenzitizátor pro terapii některých druhů rakovin. Hlavní nevýhodou je to, že musí být podáván parenterálně, obecně intravenózně, což způsobuje fotosenzitizaci kůže, což může trvat několik týdnů po i.v. injekci. Photofrin se skládá z velkých oligomerů porfyrinu a při místní aplikaci obtížně proniká do kůže. Podobné problémy jsou spojeny s dalšími fotosenzitizátory na bázi porfyrinu, jako je tzv. „hematoporfyrinový derivát“ (Hpd), jehož použití také bylo popsáno při fotochemoterapii rakoviny (viz například S. Dougherty, J. Nati. Cancer Ins., 1974, 52; 1333; Kelly a Snell, J. Urol., 1976, 115: 150). Hpd je komplexní směs získaná zpracováním hematoporfyrinu kyselinou octovou a kyselinou sírovou a acetylovaný produkt se potom rozpustí v alkálii.

Aby se předešlo těmto problémům, byla testována fotochemoterapeutická schopnost prekurzorů Pp. Zvláště prekurzor Pp kyselina 5-aminolevulová (ALA) byla testována jako fotochemoterapeutická látka pro některé druhy rakoviny. ALA, která se vytváří ze sukcinyl CoA a glycinu při prvním kroku syntézy hernu, je schopna omezeně pronikat do kůže a způsobit místní tvorbu Pp;

<· · protože omezujícím krokem při syntéze hernu je působení ferochelatázy (metalační enzym), nadbytek ALA vede k akumulaci Pp, což je fotosenzitizační látka. Místní aplikací ALA na kožní tumory a potom několikahodinovým vystavením tumorů světlu je tedy možno získat výhodný fotochemoterapeutický účinek (viz například WO 91/01727). Protože basilomy a karcinomy skvamózních buněk pokrývajícími kůži proniká ALA snadněji než zdravou kůží, a protože koncentrace ferochelatázy je v kožních tumorech nízká, bylo zjištěno, že místní aplikace ALA vede k selektivně zvýšené produkci Pp v tumorech.

Fotochemoterapie s použitím ALA však není vždy zcela uspokojivá. ALA není schopna pronikat do všech tumorů a jiných tkání s dostatečnou účinností pro umožnění léčení širokého spektra tumorů nebo jiných stavů a ALA má také ve farmaceutických prostředcích sklon k nestabilitě. Těmto problémům bylo možno z větší části předejít použitím nesubstituovaných alkylester ALAů s přímým řetězcem, které mají zlepšenou selektivitu pro abnormální tkáň, nesystémovou lokalizaci podaných látek, zlepšený příjem a produkci PpIX a snížené vnímání bolesti při podávání (viz WO 96/28412).

Databáze Xfire, záznamy 3060978, 5347132, 5499790,

5620924, 5633390, 5991317 a 6517740 (Beilstein); Cosmo Sogo Kenkyusho KK, Patent Abstracts of Japan, díl 16; No. 156 (C-0930), 16.4.1992; EP-A-316179 (Tokuyama Soda KK); GB-A-2058077 (Hudson a další) a DE-A-2411382 (Boehringer Sohn Ingelheim) popisují alkylesterové deriváty kyseliny 5-aminolevulové a jejich deriváty a soli a způsoby jejich výroby. Tyto sloučeniny však stále mají některá omezení pro použití jako farmaceutické látky při PDT, například realtivně nízkou účinnost, a je tedy stále zapotřebí získat alternativní fotochemoterapeutické látky, zvláště fotochemoterapeutické látky se zvýšeným účinkem ve srovnání s dosud známými látkami. Předkládaný vynález se zaměřuje na tuto potřebu a jeho cílem je zvláště poskytnutí fotochemoterapeutických

- 4 • · ··· · • · • · · • ···<

• · < >· ·· látek, které jsou lepší léčiva, tj. mají zesílený fotochemoterapeutický účinek proti látkám popisovaným v dosavadním stavu techniky.

Podstata vynálezu

Nyní bylo zjištěno, že pro použití při fotochemoterapii je vhodná skupina derivatizovaných esterů ALA, zahrnující v podstatě rozvětvené alkylestery ALA a substituované benzylestery ALA. Bylo zvláště zjištěno, že některé tyto sloučeniny poskytují překvapivě výhodné vlastnosti pro fotodynamickou terapii ve srovnání se známými sloučeninami.

Jedno provedení předkládaného vynálezu tedy poskytuje sloučeninu pro použití při fotochemoterapii nebo diagnostice, kde tato sloučenina je rozvětvený alkylester nebo substituovaný alkylester kyseliny 5-aminolevulové, nebo jejich derivát nebo farmaceuticky přijatelná sůl.

V dalším provedení poskytuje vynález sloučeninu pro použití při fotochemoterapii nebo diagnostice, kde tato sloučenina má obecný vzorec I:

R²2N-CH₂COCH2-CH₂CO-OR¹ (I) kde

R¹ znamená popřípadě substituovanou alkylovou skupinu jinou než nesubstituovaný přímý alkylový řetězec (s výhodou jestliže skupina R¹ je nesubstituovaná, znamená rozvětvenou alkylovou skupinu); a

R² nezávisle znamená atom vodíku nebo popřípadě substituovanou alkylovou skupinu), nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl.

• · · · • *

Předkládaný vynález popisuje s výhodou sloučeniny vzorce I

R²2N-CH₂COCH₂-CH2CO-OR¹ (I) (kde

R¹ znamená popřípadě substituovanou rozvětvenou alkylovou (např. C5-30 alkylovou) skupinu, nebo substituovanou alkylovou skupinu;

R², které mohou být stejné nebo různé, znamenají atom vodíku nebo popřípadě substituovanou alkylovou skupinu, s výhodou skupinu R¹;

kde uvedené substituenty jsou zvoleny ze skupiny hydroxy, alkoxy, acyloxy, alkoxykarbonyloxy, amino, aryl, nitro, oxo, fluor, -SR³, -NR³2 a -PR³-, a každá alkylová skupina je popřípadě přerušena jednou nebo více skupinami -0-, -NR³-, -S- nebo -PR³-; a

R³ znamená atom vodíku nebo C1-6 alkylovou skupinu) a jejich soli pro použití při fotochemoterapii nebo diagnostice.

Jak se zde používá, termín „alkyl“ zahrnuje jakýkoli dlouhý nebo krátký řetězec, cyklickou, přímou nebo rozvětvenou alifatickou nasycenou nebo nenasycenou uhlovodíkovou skupinu, pokud není uvedeno jinak. Nenasycené alkylové skupiny mohou být mono- nebo polynenasycené a zahrnují jak alkenylové, tak i alkinylové skupiny. Pokud není uvedeno jinak, tyto skupiny mohou obsahovat až do 40 atomů. Výhodné jsou alkylové skupiny obsahující až do 10, s výhodou až do 8, zvláště výhodně až do 6, ještě výhodněji až do 4 atomů uhlíku.

Substituované alkylové skupiny R¹ mohou být mono- nebo polysubstituované. Vhodné skupiny R¹ tedy zahrnují například alkoxyalkyl, hydroxyalkoxyalkyl, polyhydroxyalkyl, hydroxypolyalkylenoxyalkyl, oxaalkyl, polyoxaalkyl apod.

• « · · • ·

·· ····

Termín „acyl“, jak se zde používá, zahrnuje karboxylátové i karbonátové skupiny, tedy alkylové skupiny substituované skupinou acyloxy zahrnují například alkylkarbonyloxyalkyl. V těchto skupinách obsahují jakékoli alkylenové části s výhodou počet atomů uhlíku definovaný pro alkylové skupiny.

Mezi výhodné substituované alkylové skupiny R¹ patří skupiny nesoucí jednu nebo více skupin oxo, s výhodou skupiny C4-12 alkyl k ' (např. Ce-ιο alkyl) s přímým řetězcem, substituované jednou, dvěma nebo třemi (s výhodou dvěma nebo třemi) skupinami oxo. Příklady takových skupin zahrnují skupiny 3,6-dioxa-1-oktyl a 3,6,9-trioxa-1decyl. Zvláště výhodné substituované alkylové skupiny R¹, které mohou být přítomné ve sloučeninách vzorce I, zahrnují skupiny C1-6 alkyl, s výhodou C1-4 alkyl, zvláště Ct nebo C₄ alkyl (např. methyl) substituované (s výhodou terminálně substituované) arylovou skupinou. Výhodné arylové skupiny zahrnují fenyl, difenyí a monocyklické 5 až 7-členné, např. 5 nebo 6-členné, heteroaromatické skupiny, zvláště fenyl, a tyto skupiny mohou být samy popřípadě substituované, například jednou nebo více (např. jednou nebo dvěma) C1.6 alkylovými skupinami (s výhodou C1.4 alkyl, např. methyl), alkoxy (např. methoxy), nitro, fluor, chlor nebo trifluormethyl. Vhodné heteroaromatické skupiny zahrnují skupiny obsahující alespoň jeden heteroatom zvolený ze skupiny kyslík, síra a dusík. Výhodná heteroaromátická skupina je pyridin.

Reprezentativní substituované alkylové skupiny R¹ zahrnují skupiny acylalkyl, alkoxymethyl, alkoxyethyl a alkoxypropyl nebo skupiny acyloxymethyl, acyloxyethyl a acyloxypropyl, např. pivaloyloxymethyl.

Rozvětvená alkylová skupina ve vzorci I znamená s výhodou C4-8, s výhodou C5-8 alkylovou skupinu s přímým řetězcem, která je rozvětená substitucí jednou nebo více popřípadě substituovanými C1.6 alkylovými (např. C1.2 alkylovými) skupinami, a s výhodou tedy vytváří • ·

C₆-9 alkylovou skupinu. V těchto případech, kde skupina R¹ znamená rozvětvenou alkylovou skupinu, je tato skupina s výhodou nesubstituovaná. Například R¹ může znamenat nesubstituovanou, rozvětvenou C5-10 alkylovou skupinu, s výhodou C₅.s alkyl, např. C₅ nebo C6 alkyl.

Jestliže R¹ znamená substituovanou alkylovou skupinu, substituenty jsou zvláště výhodně aryl (např. fenyl) nebo alkoxy, které mohou být samy substituované.

Ve zvláště výhodném provedení tedy skupina R¹ znamená:

popřípadě substituovanou rozvětvenou C5.30 alkylovou skupinu, s výhodou C6.9 alkylovou skupinu, obsahující C4-29 alkylovou skupinu s přímým řetězcem, s výhodou C₄.₈, výhodněji C₅._s (např. C5 nebo Οθ) alkylovou skupinu, rozvětvenou substitucí jednou nebo více C1.6 alkylovými skupinami, s výhodou C1 nebo C₂, kde uvedené místo substituce je s výhodou atom C2 nebo vyšší atom uhlíku, nebo arylovou skupinou nebo alkoxylovou skupinou substituovanou alkylovou skupinu, s výhodou C1 nebo C₂ alkylovou skupinu, kde uvedená arylová skupina je s výhodou substituována, zvláště výhodně je substituována jednou nebo více skupinami alkyl (např. C1-2 alkyl), alkoxy (např. methoxy), fluor, chlor, nitro nebo trifluormethyl, a

uvedená alkoxylová skupina je s výhodou substituována jednou nebo více dalšími alkoxylovými skupinami, kde tyto skupiny mohou být dále substituované.

V dalším provedení poskytuje předkládaný vynález nové sloučeniny. Vynález tedy poskytuje sloučeniny vzorce I,

- 8 • ·

R²2N-CH₂COCH₂-CH₂CO-OR¹ (I) (kde

R¹ znamená popřípadě substituovanou rozvětvenou C5.30 alkylovou skupinu, s výhodou C6-9 alkylovou skupinu, obsahující C4-29 alkylovou skupinu s přímým řetězcem, s výhodou C₄.₈, výhodněji C5-8 (např. C5 nebo C₆) alkylovou skupinu, rozvětvenou substitucí jednou nebo více C1-6 alkylovými skupinami, s výhodou C1 nebo C₂, kde uvedené místo substituce je atom uhlíku C2 nebo vyšší atom uhlíku, nebo neheteroaromatickou arylovou skupinou substituovanou alkylovou skupinu, s výhodou nebo C₂ alkylovou skupinu, kde tato arylová skupina je substituována, zvláště výhodně substituována jednou nebo více alkylovými skupinami (např. C^.2 alkyl), alkoxy (např. methoxy), fluor, chlor, nitro nebo trifluormethyl, nebo alkoxy substituovanou alkylovou skupinu, s výhodou C1 nebo C₂ alkylovou skupinu, kde tato alkylová skupina je substituovaná skupinou methoxy, nebo alkoxylovou skupinu substituovanou skupinou alkoxy, která může být dále substituovaná,

R², které mohou být stejné nebo různé, znamenají atom vodíku nebo popřípadě substituovanou alkylovou skupinu (např. skupinu R¹); a kde uvedené substituenty jsou zvoleny ze skupiny hydroxy, alkoxy, acyloxy, alkoxykarbonyloxy, amino, aryl, nitro, oxo, fluor, -SR³, -NR³2 a -PR³2, a uvedená alkylová skupina je popřípadě přerušená jednou nebo více skupinami -0-, -NR³-, -S- nebo -PR³-; a • · · • ····

- 9 ·· »···

R³ znamená atom vodíku nebo C-|.₆ alkylovou skupinu) a jejich farmaceuticky přijatelné soli.

S výhodou jsou obě skupiny R² atomy vodíku, a tedy ve výhodném provedení poskytuje vynález benzylestery ALA a popřípadě substituované rozvětvené C₆-g alkylestery ALA, které mohou být použity při způsobech podle vynálezu.

Výhodné sloučeniny podle vynálezu nebo pro použití při způsobech podle vynálezu zahrnují 2-methylpentylester ALA, 4-methylpentylester ALA, 1-ethylbutylester ALA, 3,3-dimethyl-1-butylester ALA, benzylester ALA, p-methylbenzylester ALA, p-nitrobenzylester ALA, p-[trifluormethyl]benzylester ALA, p-fluorbenzylester ALA, 4-chlorbenzylester ALA, 3-methylbenzylester ALA a 2-methylbenzylester ALA.

Sloučeniny podle vynálezu nebo pro použití podle vynálezu mohou být připraveny standardními způsoby známými v oboru pro tvorbu derivátů vícefunkčních sloučenin, zvláště esterifikací. Jak je v oboru známo, taková exterifikace sloučenin může zahrnovat ochranu a odstraňování ochranných skupin z příslušných skupin, takže aktivní zůstávají pouze požadované skupiny, které se účastní reakce za podmínek esterifikace. Tak například substituenty substituovaných alkanolů používané při přípravu esterů mohou být v průběhu esterifikace chráněné. Podobně skupina NR²2 na sloučenině, která přináší tuto skupinu do sloučenin vzorce I, může být při reakci chráněná a po reakci mohou být ochranné skupiny odstraněny. Tyto postupy navazování/odstraňování ochranných skupin jsou v oboru dobře známé přo přípravu derivátů, zvláště esterů známých aminokyselin, viz například Mcomie v „Protective Groups in Organic Chemistry, Plenům, 1973 a T. W. Green v „Protective Groups in Organic Chemistry“, Wiley-lnterscience, 1981.

V dalším provedení tedy předkládaný vynález poskytuje způsob výroby sloučenin podle vynálezu nebo pro použití v rámci vynálezu, ·· 44·« který zahrnuje vytvoření esteru karboxylové skupiny kyseliny 5aminolevulové.

Vynález tedy také poskytuje například způsob výrob sloučenin podle vynálezu pro použití v rámci vynálezu, který zahrnuje reakci kyseliny 5-aminolevulové nebo jejího esterifikovatelného derivátu s alkanolem, nebo jeho esterotvorným derivátem.

Toto provedení vynálezu zvláště popisuje způsob výroby sloučenin vzorce I, kde tento způsob zahrnuje alespoň jeden z následujících kroků:

(a) provede se reakce sloučenin vzorce II

R²2N-CH₂COCH2-CH₂CO-X (II) (kde X znamená odštěpitelnou skupinu, například hydroxylovou skupinu, atom halogenu nebo skupinu alkoxy, nebo COX znamená skupinu anhydridu kyseliny, a R² je jak definováno výše) se sloučeninou vzorce III

R¹-OH (III) (kde R¹ je jak definováno výše); a (b) sloučenina vzorce I se převede na svou farmaceuticky přijatelnou sůl.

Reakce v kroku (a) se může vhodně provádět v rozpouštědle nebo směsi rozpouštědel jako je voda, aceton, diethylether, methylformamid, tetrahydrofuran atd. při teplotách až do teploty varu směsi, s výhodou při laboratorní teplotě.

Podmínky esterifikační reakce budou záviset na použitém alkoholu a mohou být zvoleny tak, že se získá maximální výtěžek esteru. Protože esterifikační reakce jsou vratné rovnovážné reakce, reakční podmínky se mohou volit tak, aby se získal maximální výtěžek esterového produktu. Tyto podmínky se mohou dosáhnout volbou rozpouštědla, které je schopné odstranit vodu vytvořenou při typické *« ΦΦ·· ·· φφφφ esterifikační reakci vytvořením azeotropní směsi s vodou. Příklady těchto rozpouštědel jsou aromatické uhlovodíky nebo jiná rozpouštědla schopná vytvořit azeotropní směsi s vodou, například některé chlorované uhlovodíky jako je chloroform. Pro vytvoření nižších esterů 5-ALA může být posunuta rovnováha reakce ve směru k esteru použitím velkého nadbytku alkoholu. S jinými estery může být rovnováha posouvána směrem k esterovému produktu použitím velkého nadbytku kyseliny.

Esterifikační reakce jsou v oboru dobře známé, například jak popisuje Saul Patai v „The chemistry of the karboxylic acids and esters“, (kapitola 11, str. 505, Interscience 1969) a Houben Weyl, (Methoden der Organische Chemie, Band E5, „Karbonsauren und karbonsauren-derivate“, str. 504, Georg Thieme Verlag, 1985). Tvorba derivátů aminokyselin se popisuje v dílu XI/2 stejné řady (Houben Weyl, Methoden der Organische Chemie, Band XI/2, „Stickstoffverbindungen, str. 269, Georg Thieme Verlag, 1958).

Reakce v kroku (a) se bude vhodně provádět v přítomnosti katalyzátoru, např. anorganické nebo organické kyseliny nebo prostředku vázajícího kyselinu jako je báze.

Sloučeniny používané jako výchozí látky jsou známé z literatury a v mnoha případech jsou komerčně dostupné, nebo se mohou získat známými metodami. Například ALA je dostupná od firmy Sigma nebo Photocure ASA, Oslo, Norsko.

Jak je uvedeno výše, sloučeniny podle vynálezu nebo pro použití podle vynálezu mohou být ve formě farmaceuticky přijatelných solí. Tyto soli jsou s výhodou adiční soli s kyselinami s fyziologicky přijatelnými organickými nebo anorganickými kyselinami. Vhodné kyseliny zahrnují např. kyseliny chlorovodíkovou, bromovodíkovou, sírovou, fosforečnou, octovou, mléčnou, citrónovou, vinnou, jantarovou, maleinovou, fumarovou a askorbovou. Hydrofobní soli se také mohou pohodlně vyrábět například srážením. Vhodné soli

- 12 ·· ···« ·· ···· zahrnují například acetát, bromid, chlorid, citrát, hydrochlorid, maleát, mesylát, nitrát, fosfát, sulfát, tartrát, oleát, stearát, tosylát, soli s vápníkem, megluminem, draselné a sodné soli. Způsoby vytváření solí jsou v oboru běžné.

Jak je uvedeno výše, sloučeniny podle vynálezu a pro použití podle vynálezu a jejich soli mají cenné farmakologické vlastnosti, zvláště fotosenzitizační vlastnosti, které umožňují jejich využití jako fotochemoterapeutických látek.

Další provedení předkládaného vynálezu tedy poskytuje farmaceutický prostředek obsahující výše popsanou sloučeninu nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl spolu s alespoň jedním farmaceutickým nosičem nebo pomocnou látkou.

V dalším provedení se poskytuje farmaceutický prostředek popisovaný výše pro použití jako lék, například při fotochemoterapii nebo diagnostice.

V ještě dalším provedení se poskytuje také použití sloučeniny popisované výše nebo její farmaceuticky přijatelné soli pro výrobu terapeutické látky pro použití při fotochemoterapii, a zvláště pro léčení onemocnění nebo abnormalit vnějších nebo vnitřních tělesných povrchů, které reagují na fotochemoterapii.

Abnormality a onemocnění, která je možno léčit podle předkládaného vynálezu, zahrnují jakékoli maligní, premaligní a nemaligní abnormality nebo onemocnění, regující na fotochemoterapii, např. tumory nebo jiné růsty, onemocnění kůže jako je lupénka nebo aktinické keratózy a akné, kožní abraze a jiná onemocnění nebo infekce, např. bakteriální, virové nebo houbové infekce, např. infekce herpetickým virem. Vynález je zvláště vhodný pro léčení onemocnění, poruch nebo abnormalit, u kterých jsou vytvořena diskrétní poškození, na která mohou být prostředky přímo naneseny (výraz poškození se zde používá v širokém smyslu zahrnujícím tumory apod.).

*·*· • ·

4 • 4

4

- 13 Vnější a vnitřní tělesné povrchy, které je možné léčit podle vynálezu, zahrnují kůži a jiné epiteliální a serózní povrchy včetně např. sliznice, tkání vystýlajících orgány, např. dýchací, gastrointestinální a urogenitální trakty, a žlázy s vývody, které se na tyto povrchy vyprazdňují (např. játra, vlasové folikuly s mazovými žlázami, mléčné žlázy, slinné žlázy a semenné váčky). Kromě kůže zahrnují tyto povrchy také např. výstélku vagíny, endometrium a urothelium. Tyto povrchy mohou také zahrnovat dutiny vytvořené v těle po vyříznutí nemocné nebo rakovinné tkáně, např. mozkové dutiny po odstranění tumorů, jako jsou gliomy.

Příklady povrchů tedy zahrnují: (i) kůži a spojivky; (ii) výstelku úst, hltanu, jícnu, žaludku, střev a přívěsků střev, rekta a análního kanálu; (iii) výstelku nosních průchodů, nosních dutin, nosohltanu, průdušnice, průdušek a průdušinek; (iv) výstelku močovodů, močového měchýře a močové trubice; (v) výstelku vagíny, děložního čípku a dělohy; (vi) parietální a viscerální pohrudnice; (vii) výstelku pobřišnice a pánevních dutin a povrch orgánů uvnitř těchto dutin; (viii) tvrdé a měkké mozkové pleny; (ix) jakékoli tumory a pevné tkáně, které mohou být zpřístupněny fotoaktivačnímu světlu, např. přímo v době chirurgického zákroku nebo optickým vláknem vloženým pomocí jehly.

Prostředky podle vynálezu mohou být formulovány běžným způsobem s jedním nebo více fyziologicky přijatelnými nosiči nebo pomocnými látkami způsoby dobře známými v oboru. Kde je to vhodné, se prostředky podle vynálezu sterilizují, např. zářením gama, autoklávováním nebo sterilizací teplem před nebo po přidání nosiče nebo pomocné látky, jestliže jsou přítomny, pro poskytnutí sterilních prostředků.

Prostředky mohou být podávány místně, orálně nebo systémově. Místní prostředky jsou výhodné a zahrnují gely, krémy, masti, spreje, mléka, tinktury, tyčinky, mýdla, prášky, pesary, aerosoly, kapky, roztoky a jakékoli jiné v oboru běžné farmaceutické formy.

• φ φφφφ «φ φφφφ

Masti, gely a krémy mohou být například formulovány s vodnou nebo olejovou bází s přídavkem vhodných zahušťujících a/nebo gelujících látek. Mléka mohou být formulována s vodným nebo olejovým základem a budou také obecně obsahovat jeden nebo více emulgačních, dispergačních, suspendujících, zahušťovacích nebo barvicích prostředků. Prášky mohou být formovány za pomoci jakéhokoli běžného práškového základu. Kapky a roztoky mohou být formulovány s vodným nebo nevodným základem, který také obsahuje jeden nebo více dispergujících, solubilizujících nebo suspendujících prostředků. Aerosolové spreje se běžně dodávají z tlakových balení použitím vhodného hnacího prostředku.

Prostředky mohou být alternativně poskytnuty ve formě upravené pro orální nebo parenterální podávání, například intradermální, subkutánní, intraperitoneální nebo intravenózní injekcí. Alternativní farmaceutické formy tedy zahrnují prosté nebo potahované tablety, kapsle, suspenze a roztoky obsahující účinnou složku popř. spolu s jedním nebo více inertními běžnými nosiči a/nebo ředivy, např. s kukuřičným škrobem, laktózou, sacharózou, mikrokrystalickou celulózou, stearanem hořečnatým, polyvinylpyrrolidonem, kyselinou citrónovou, kyselinou vinnou, vodou, směsmi voda/ethanol, voda/glycerol, voda/sorbitol, voda/polyethylenglykol, propylenglykolem, stearylalkoholem, karboxymethylcelulózou nebo mastnými látkami jako je pevný tuk nebo jejich vhodné směsi.

Prostředky mohou dále obsahovat kluzné látky, smáčedla, emulgační prostředky, suspendující prostředky, ochranné prostředky, sladidla, příchuti, látky zlepšující adsorpci, například látky usnadňující penetraci do povrchu jak bude uvedeno dále, apod. Prostředky podle vynálezu mohou být formulovány tak, aby poskytly okamžité, opožděné nebo prodloužené uvolňování účinné složky po podání pacientovi použitím způsobů dobře známých v oboru.

*· ©♦·» *· ··*·

Mohou být také použity solubilizující a/nebo stabilizující látky, např. cyklodextriny (CD) α, β, γ a cyklodextrin ΗΡ-β. Prostředky mohou být v jakékoli vhodné dávkové formě, např. jako emulze nebo v liposomech, niosomech, mikrokuličkách, nanočásticích apod. Sloučenina podle vynálezu může být potom absorbována do těchto forem, může být do nich inkorporována nebo může být na ně navázána.

Koncentrace sloučenin popisovaných výše v prostředcích závisí na povaze sloučeniny, prostředku, způsobu podávání, léčeném stavu a pacientovi, a může se lišit nebo může být upravena podle potřeby. Obecně jsou však vhodná rozmezí koncentrací 0,01 až 50 %, např. 0,05 až 20 %, např. 1 až 10 % (hmotn./hmotn.). Pro terapeutická použití byly zjištěny jako vhodné koncentrace v rozmezí 0,1 až 50 %, např. 0,2 až 30 % (hmotn./hmotn.). Mohou být použity i nižší dávky, jestliže se připravují vysoce lipofilní deriváty, přičemž koncentrace budou v rozmezí 0,01 až 10 %, např. 0,02 až 1 % (hmotn./hmotn.).

Místní podávání do nepřístupných míst se může provádět způsoby známými v oboru, např. použitím katétrů nebo jiných vhodných systémů pro dodávání léčiv.

Po podání do povrchu se ošetřená plocha vystaví světlu pro dosažení fotochemoterapeutického účinku. Čas po podání, ve kterém bude probíhat vystavení světlu, bude záviset na povaze prostředku, léčeném stavu a formě podávání. Tato doba může být obecně řádově 0,5 až 48 hod, např. 1 až 10 hod.

Ozáření se bude obecně aplikovat v dávce 40 až 200 J/cm², například při 100 J/cm².

Vlnová délka světla použitého pro ozáření může být zvolena pro dosažení účinnějšího fotochemoterapeutického efektu. Jestliže se při fotochemoterapii používají porfyriny, běžně se budou ozařovat světlem v okolí absorpčního maxima porfyrinu. Tak např. při použití ALA podle dosavadního stavu techniky při fotochemoterapii rakoviny kůže byly ·· ··»· •Φ *··· používány vlnové délky v oblasti 350 až 640 nm, s výhodou 610 až 635 nm. Může však být zvoleno široké rozmezí vlnových délek přesahující absorpční maximum porfyrinu, což může zesílit fotosenzitizační účinek. Aniž by si autoři přáli být vázáni teorií, předpokládá se, že jestliže se vystaví Pp a jiné porfyriny světlu s vlnovými délkami uvnitř absorpčního spektra, dochází k degradaci na různé fotoprodukty, včetně zvláště fotoprotoporfyrinu (PPp). PPp má významný fotosenzitizační účinek; jeho absorpční spektrum zasahuje k delším vlnovým délkám za vlnové délky, při kterých absorbuje Pp, tj. až do přibližně 700 nm (Pp neabsorbuje téměř žádné světlo s vlnovou délkou vyšší než 650 nm). Při běžné fotochemoterapii tedy použité vlnové délky neexcitují PPp a nezíská se tedy prospěšný účinek jeho další fotosenzitizace. Ozáření vlnovými délkami světla v rozmezí 500 až 700 nm se ukázalo jako zvláště účinné. Zvláště důležité je, aby byly obsaženy vlnové délky 630 a 690 nm.

Další předmět vynálezu tedy poskytuje způsob fotochemoterapeutického léčení onemocnění nebo abnormalit vnějších nebo vnitřních tělesných povrchů, který zahrnuje podávání do postižených povrchů prostředku definovaného výše a vystavení těchto povrchů působení světla, zvláště světlu v oblasti vlnových délek 300 až 800 nm, například 500 až 700 nm.

Způsoby ozáření různých oblastí těla, např. lampami nebo laserem, jsou dobře známé v oboru (viz například Van den Bergh, Chemistry in Britain, květen 1986, str. 430 - 439). Osvětlení nepřístupných oblastí se může snadno provést pomocí optických vláken.

Sloučeniny podle vynálezu pro použití v rámci vynálezu mohou být formulovány a/nebo podávány s jinými fotosenzitizačními prostředky, například ALA nebo Photofrinem®, nebo s jinými účinnými složkami, které mohou zesilovat fotochemoterapeutický účinek. Například pro zesílení akumulace Pp mohou být vhodně přidány • · · · • · · ·

- 17 chelatační prostředky; chelatace železa chelatačními prostředky zabrání jeho inkorporaci do Pp za vytvoření hernu působením enzymu ferochelatázy, což vede k vytvoření Pp. Tak dojde k zesílení fotosenzitizačního účinku.

Z tohoto hlediska jsou zvláště vhodné chelatační prostředky na bázi aminopolykarboxylové kyseliny, včetně jakýchkoli chelatačních prostředků popisovaných v literatuře pro detoxikaci kovů nebo pro chelataci paramagnetických kovových iontů při zobrazování magnetickou rezonancí s kontrastními prostředky. Je možno zvláště uvést EDTA, CDTA (cyklohexandiamintetraoctová kyselina), DTPA a DOTA a jejich dobře známé deriváty/analogy. Výhodná je EDTA. Pro dosažení chelatačního účinku na železo mohou být použity desferioxamin a jiné siderofory, např. spolu s chelatačními prostředky na bázi aminopolykarboxylové kyseliny jako je EDTA.

Chelatační prostředek se může vhodně používat v koncentraci 0,05 až 20 %, např. 0,1 až 10 % hmotnostních.

Navíc bylo zjištěno, že látky napomáhající penetraci do povrchu a zvláště dialkylsufoxidy jako je dimethylsulfoxid (DMSO), mohou mít prospěšný účinek ve smyslu zesílení fotochemoterapeutického účinku. To se podrobně popisuje ve WO 95/07077.

Prostředek napomáhající penetraci do povrchu může být jakýkoli z prostředků napomáhajících penetraci do kůže popisovaných ve farmaceutické literatuře, např. chelatační látky (např. EDTA), povrchově aktivní látky (např. dodecylsulfát sodný), jiné než povrchově aktivní látky, soli žlučových kyselin (např. deoxycholát sodný) a mastné kyseliny (např. kyselina olejová). Mezi příklady vhodných látek napomáhajících penetraci do povrchu patří HPE-101 (dostupný od firmy Hisamitsu), DMSO a další dialkylsulfoxidy, zvláště ndecylmethylsulfoxid (NDMS), dimethylsulfacetamid, dimethylformamid (DMFA), dimethylacetamid, glykoly, různé deriváty pyrrolidonu (Woodford a další, J. Toxicol. Cut. & Ocular Toxicology, 1986, 5: 167 • · • · · · · · · · · ··· ···· ··· • · · · · ······· · ·

A O · · · ··♦ ····

- lo - ·· · ·· · ·· ··

177) a Azone® (Stoughton a další, Drug Dpv. Ind. Pharm. 1983, 9: 725 - 744), nebo jejich směsi.

DMSO je však výhodný z důvodů svých antihistaminových a protizánětlivých účinků a stimulačního účinku na aktivitu enzymů ALAsyntázy a ALA-dehydrogenázy (enzym, který vytváří a kondenzuje ALA na porfobilinogen), čímž zvyšuje tvorbu aktivní formy, Pp.

Prostředek napomáhající penetraci do povrchu může být vhodně přítomen v rozmezí koncentrací 0,2 až 50 % (hmotn./hmotn.), např. přibližně 10 % (hmotn./hmotn.).

Prostředky podle vynálezu nebo prostředky používané podle vynálezu mohou být dále formulovány a/nebo podávány s jinými prostředky pro zlepšení účinnosti PDT. Při léčbě tumorů mohou být dále například společně s prostředky podle vynálezu při PDT používány inhibitory angiogeneze (antiangiogenní léky), které se ukázaly jako užitečné pro léčení tumorů (O’Reilly a další, Nátuře Medicine, 2, str. 689 - 692, 1996; Yamamoto a další, Anticancer Research, 14, str. 1 - 4, 1994; a Brooks a další, J. Clin. Invest., 96, str. 1815 - 1822, 1995), aby se dosáhlo dalšího poškození cévního systému tumoru. Mezi použitelné inhibitory angiogeneze patří TNP-470 (AGM-1470, syntetický analog houbového sekrečního produktu nazývaného fumagilin; Takeda Chemical Industries Ltd., Osaka, Japonsko), angiostatin (Surgical Research Lab. at Childreďs Hospital Medical Center of Harvard Medical School) a antagonisté integrinu α_νβ₃ (např. monoklonální protilátka proti integrinu α_νβ3, The Scripps Research Institute, LaJolla, CA).

Alternativně nebo navíc mohou být pro zlepšení PDT podle vynálezu použity imunoterapeutické látky (například protilátky nebo efektory jako je faktor aktivující makrofágy) nebo chemoterapeutika; Podávání těchto dodatečných prostředků by se mělo provádět způsobem, v koncentraci a ve formulaci známými způsoby použití těchto látek. Tyto další prostředky mohou být podávány před, po nebo • · · · • · * · · · · A······ · « . « · A * ·· · · · · · _ ί 9 - ·· * ·· · ·· ·· v průběhu PDT v závislosti na jejich funkci. Například inhibitory angiogeneze se mohou přidávat 5 až 10 dnů po PDT, aby se zabránilo novému růstu tumorů. Podobně mohou být v kombinaci s prostředkem podle vynálezu použity jiné protirakovinné látky, buď jako součást prostředku nebo jako oddělené léčení pro současné, oddělené nebo postupné podávání.

Bylo také zjištěno, že při místním nebo systémovém podávání napomáhá PDT glukóza. Aniž by si autoři přáli být vázání teorií, zdá se, že podání glukózy vede ke snížení pH, které zesílí hydrofobní vlastnosti protoporfyrinů, např. ALA, takže mohou snadněji pronikat do buněk. Jestliže se uvažuje místní podání, může obsahovat formulace, například krém, 0,01 % až 10 % glulózy (hmotn./hmotn.).

V závislosti na léčeném stavu a povaze prostředku mohou být sloučeniny pro použití v rámci vynálezu podávány společně s těmito dalšími případnými prostředky, například v jednom prostředku, nebo mohou být podávány postupně nebo odděleně. V mnoha případech je ovšem možné získat zvláště výhodný fotochemoterapeutický účinek předběžným ošetřením látkou napomáhající penetraci do povrchu v odděleném kroku před podáním sloučenin pro použití v rámci vynálezu.

Například v některých situacích může být prospěšné předběžné ošetření látkou napomáhající pronikání do povrchu a následné podání fotochemoterapeutické látky spolu s látkou napomáhající pronikání do povrchu. Jestliže se použije látka napomáhající penetraci do povrchu při předběžném ošetření, může být použita ve vysokých koncentracích, např. až do 100% (hmotn./hmotn.). Jestliže se použije takového kroku předběžného ošetření, fotochemoterapeutické látka se může následně podat až několik hodin po předběžném ošetření, např. v intervalu 5 až 60 min po předběžném ošetření.

Z hlediska dalšího provedení tedy předkládaný vynález poskytuje produkt obsahující sloučeninu popsanou výše nebo její • · · ·

farmaceuticky přijatelnou sůl, spolu s alespoň jednou látkou napomáhající pronikání do povrchu a popřípadě jedním nebo více chelatačními prostředky jako kombinovaný preparát pro současné, oddělené nebo postupné použití při léčení onemocnění nebo abnormalit vnějších nebo vnitřních tělesných povrchů, které reagují na fotochemoterapii.

V alternativním provedení se také poskytuje kit pro použití při fotochemoterapii onemocnění nebo abnormalit vnějších nebo vnitřních povrchů těla, který obsahuje:

a) první nádobku obsahující sloučeninu popisovanou výše nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl,

b) druhou nádobku obsahující alespoň jednu látku napomáhající pronikání do povrchu, a popřípadě

c) jeden nebo více chelatačních prostředků obsažených buď v první nádobce nebo ve třetí nádobce.

Jestliže se prostředek napomáhající pronikání do povrchu použije v odděleném kroku předběžného ošetření, může se použít ve vyšší koncentraci, například až do 100 % (hmotn./hmotn.).

Bude zřejmé, že způsob léčení použitím sloučenin popisovaných výše nevyhnutelně zahrnuje fluorescenci místa onemocnění nebo abnormality, které se mají léčit. Zatímco intenzita této fluorescence může být použita pro odstranění abnormálních buněk, lokalizace této fluorescence se může použít pro zviditelnění místa, rozsahu a stavu abnormality nebo onemocnění.

Abnormalita nebo onemocnění identifikované nebo potvrzené tímto způsobem na testovaném místě mohou být potom léčeny alternativními léčebnými postupy, např. chirurgickým nebo chemickým, nebo léčením podle vynálezu pokračující tvorbou fluorescence nebo další aplikací sloučenin podle vynálezu ve vhodném místě. Bude zřejmé, že způsoby diagnózy mohou vyžadovat nižší hladiny fluorescence pro zviditelnění, než jaká se používá při léčebném zákroku. Rozmezí koncentrací budou tedy obecně 0,2 až 30 % např. 1 až 5 % (hmotn./hmotn.). Místa, způsoby a postupy podávání byly již diskutovány výše ve vztahu k léčebným použitím, a jsou použitelné také na diagnostická použití popisovaná v tomto odstavci.

Sloučeniny podle vynálezu nebo pro použití v rámci vynálezu mohou být také použity pro diagnostické techniky in vitro, např. pro vyšetřování buněk obsažených v tělesných tekutinách. Vyšší fluorescence spojená s normální tkání může být vhodným indikátorem abnormality nebo onemocnění. Tato metoda je vysoce citlivá a může být použita pro časnou detekci abnormalit nebo onemocnění, např. močového měchýře nebo karcinomu plic vyšetřením epiteliálních buněk přítomných v moči nebo ve sputu. Mezi jiné použité tělesné tekutiny, které mohou být použity pro diagnózu navíc k moči a sputu, zahrnují krev, semennou tekutinu, slzy, spinální tekutinu atd. Mohou být také vyhodnocovány vzorky tkáně nebo preparáty, např. tkáň odebraná při biopsii nebo vzorky kostní dřeně. Předkládaný vynález tedy zahrnuje také použití sloučenin podle vynálezu nebo jejich solí pro diagnózu výše uvedenými způsoby fotochemoterapie a produkty a kity pro provádění této diagnózy.

Další provedení vynálezu se týká způsobu diagnózy in vitro abnormalit nebo onemocnění testováním vzorku nebo tělesné tekutiny nebo tkáně pacienta, přičemž uvedený způsob zahrnuje alespoň jeden z následujících kroků:

i) tělesná tekutina nebo tkáň se smísí se sloučeninou popisovanou výše, ii) směs se vystaví působení světla, iii) určí se intenzita fluorescence, a iv) intenzita fluorescence se porovná s kontrolními intenzitami.

• ·

Vynález bude nyní podrobněji popsán na následujících neomezujících příkladech s pomocí odkazů na výkresy.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 ukazuje buněčnou tvorbu porfyfinu indukovanou ALA (plné kroužky), 1-methylpentylester ALAem (prázdné kroužky), p-isopropylbenzylester ALAem (plné převrácené trojúhelníky) a p-methylbenzylester ALAem (prázdné převrácené trojúhelníky).

Obr. 2 ukazuje buněčnou tvorbu porfyrinu indukovanou ALA (plné kroužky), benzylester ALAem (plné trojúhelníky) a 2fenylethylester ALAem (prázdné trojúhelníky), úsečky označují standardní odchylku.

Obr. 3 ukazuje buněčnou tvorbu porfyrinu indukovanou ALA (plné kroužky), hexylester ALAem (prázdné kroužky), cyklohexylester ALAem (plné převrácené trojúhelníky) a 4-methylpentylester ALAem (prázdné převrácené trojúhelníky), úsečky označují standardní chybu.

Obr. 4 ukazuje buněčnou tvorbu porfyrinu indukovanou ALA (plné kroužky), p-[trifluormethyl]benzy!ester ALAem (prázdné kroužky), p-[t-butyl]benzylester ALAem (plné převrácené trojúhelníky) a p-nitrobenzylester ALAem (prázdné převrácené trojúhelníky).

Obr. 5 ukazuje fluorescenci kůže po místní aplikaci hexylester ALAu (plné čtverečky), 1-methylpentylester ALAu (plné trojúhelníky), 1-ethylbutylester ALAu (plné převrácené trojúhelníky) a 2methylpentylester ALAu (plné kroužky), úsečky označují standardní chybu.

Obr. 6 ukazuje fluorescenci kůže po místní aplikaci hexylester ALAu (prázdné čtverečky), cyklohexylester ALAu (plné trojúhelníky), 2fenylethylester ALAu (kosočtverce) a 4-methylpentylester ALAu (plné kroužky), úsečky označují standardní chybu.

I • · · tt «

Obr. 7 ukazuje fluorescenci kůže po místní aplikaci hexylester ALAu (prázdné čtverečky) a p-methylbenzylester ALAu (trojúhelníky), úsečky znamenají standardní chybu.

Obr. 8 ukazuje fluorescenci kůže po místní aplikaci hexylester ALAu (plné čtverečky), p-(isopropyl)benzylester ALAu (plné trojúhelníky) a 4-fenylbutylester ALAu (převrácené trojúhelníky), úsečky označují standardní chybu.

Obr. 9 ukazuje fluorescenci kůže po místní aplikaci hexylester ALAu (plné čtverečky), p-fluorbenzylester ALAu (plné trojúhelníky) a pnitrobenzylester ALAu (plné kroužky), úsečky označují standardní chybu.

Obr. 10 ukazuje fluorescenci kůže po místní aplikaci hexylester ALAu (plné čtverce), p-(t-butyl)benzylester ALAu (trojúhelníky) a p-[trifluormethyljbenzylester ALAu (plné kroužky), úsečky označují standardní chybu.

Obr. 11 ukazuje fluorescenci kůže po místní aplikaci hexylester ALAu (plné čtverce) a benzylester ALAu (plné kroužky), úsečky označují standardní chybu.

Obr. 12 ukazuje fluorescenci kůže po místní aplikaci 1% hexylester ALAu (plné čtverce) a 3% 3,3-dimethyl-1-butylester ALAu (plné trojúhelníky), úsečky označují standardní chybu.

Obr. 13 ukazuje fluorescenci kůže po místní aplikaci 1% hexylester ALAu (prázdné čtverečky), 10% 2-fluorbenzylester ALAu (trojúhelníky), 10% 2,3,4,5,6-pentafluorbenzylester ALAu (kosočtverce) a 10% 4-chlorbenzylester ALAu (plné kroužky), úsečky označují standardní chybu.

Obr. 14 ukazuje fluorescenci kůže po místní aplikaci hexylester ALAu (prázdné trojúhelníky), 2-methoxyethylester ALAu (plné čtverce),

3-nitrobenzylester ALAu (kosočtverce) a 3,4-[dichlor]benzylester ALAu (prázdné kroužky), úsečky označují standardní chybu.

• fc

Obr. 15 ukazuje fluorescenci kůže po místní aplikaci hexylester ALAu (plné čtverce), 3,6-dioxa-1-oktylester ALAu (plné trojúhelníky),

3- fluorbenzylester ALAu (kosočtverce) a 3,6,9-trioxa-1-decylester ALAu (kroužky), úsečky označují standardní chybu.

Obr. 16 ukazuje fluorescenci kůže po místní aplikaci hexylester ALAu (plné čtverce), 3-pyridinylmethylester ALAu (plné trojúhelníky),

4- difenylmethylester ALAu (kosočtverce) a 4-methoxybenzylester ALAu (plné kroužky), úsečky označují standardní chybu.

Obr. 17 ukazuje fluorescenci kůže po místní aplikaci 1% hexylester ALAu (prázdné čtverce), 3% 2-methylbenzylester ALAu (plné trojúhelníky), 3% benzyl-5-[(1-acetyloxyethoxy)-karbonyl] ester ALAu (kosočtverce) a 3% 3-methylbenzylester ALAu (prázdné kroužky), úsečky označují standardní chybu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava esterů hydrochloridu 5-amino-4-oxopentanoátu

Obecný postup I

Thionylchlorid (1,0 ml) byl po kapkách přidán k míchanému alkoholu (6,0 ml nebo 5 až 6 g) ochlazenému na 0 °C (teplota vsádky), a potom byl najednou přidán hydrochlorid kyseliny 5-amino-4oxopentanové (1,0 g; 6,0 mmol). Směs byla míchána při 70 až 90 °C 1 až 4 hod, dokud nebyl získán čirý roztok. Reakční směs byla zkontrolována na TLC [silikagel 60 na hliníkové fólii, eluce směsí aceton-MeOH (3 : 2)]. Směs byla ochlazena na laboratorní teplotu a byla přidána k diethyletheru (50 ml) za míchání. Filtrace poskytla surový ester; přebytek alkoholu bylo možno od filtrátu oddělit.

Surový ester byl čištěn bleskovou chromatografii na koloně 150 - 200 x 25 mm silikagel 60 s elucí acetonitrilem (250 ml) a 5 až 10%

MeOH v acetonitrilu (500 až 1000 ml). Frakce obsahující produkt byly odpařeny a zbytek byl promyt etherem a sušen při 30 až 40 °C a tlaku 0,2 mm Hg (27 Pa).

Tímto způsobem byly připraveny následující estery:

Hydrochlorid ethyl 5-amino-4-oxopentanoátu

Z ethanolu (6,0 ml) a hydrochloridu kyseliny 5-amino-4-oxopentanové (1,0 g; 6,0 mmol) při 70 °C. Reakce byla u konce po 2 hod. Výtěžek byl 1,0 g (85 %). ¹H NMR (200 MHz; DMSO-d6): δ 1,19 (3H, t, J = 7,2 Hz), 2,54 (2H, t, J = 6,3 Hz), 2,83 (2H, t, J = 6,6 Hz), 3,96 (2H, br s), 4,05 (2H, q, J = 7,0 Hz), 8,52 (3H, br s). ¹³C NMR (50 MHz; DMSO-d6): δ 14,0, 27,1, 34,2, 46,4, 60,0, 171,9, 202,4.

Hydrochlorid 1-methvlpentyl-5-amino-4-oxopentanoátu [sloučenina Π

Z 2-hexanolu (6,0 ml) a hdrochloridu kyseliny 5-amino-4-oxopentanové (1,0 g; 6,0 mmol) při 70 °C. Reakce byla u konce po přibližně 4 hod. Výtěžek byl 1,0 g (66 %). ¹H NMR (200 MHz; DMSOd6): δ 0,87 (3H, t, J = 6,5 Hz), 1,15 (3H, d, J = 6,2 Hz), 1,25 (4H, m), 1,51 (2H, m) 2,51 (2H, t, J = 6,5 Hz), 2,81 (2H, t, J = 6,6 Hz), 3,95 (2H, s), 4,78 (1H, m, J = 6,5 Hz), 8,47 (3H, br s). ¹³C NMR (50 MHz; DMSO-d6): δ 13,6, 19,4, 21,6, 26,6, 27,0, 33,8, 34,4, 44,9, 69,6,

169,5, 200,1.

Hydrochlorid 3-hexyl-5-amino-4-oxopentanoátu [sloučenina 121

Z 3-hexanolu (6,0 ml) a hydrochloridu kyseliny 5-amino-4-oxopentanové (1,0 g; 6,0 mmol) při 100 °C. Reakce byla u konce po 2 dnech. Výtěžek byl 0,87 g (58 %) světle hnědého oleje. ¹H NMR (200 MHz; DMSO-d6): δ 0,83 (3H, t, J = 7,4 Hz), 0,86 (3H, t, J = 7,2 Hz), 1,27 (2H, m, J = 7,7 Hz), 1,48 (4H, m, J = 7,5 Hz), 2,54 (2H, t, J = 6,3

- 26 Ηζ), 2,83 (2Η, t, J = 6,0 Hz), 3,95 (2Η, s), 4,73 (1Η, m, J = 5,9 Hz), 8,55 (3H, br s). ¹³C NMR (50 MHz; DMSO-d6): δ 9,3, 13,6, 17,8, 26,2,

26,8, 33,9, 34,8, 45,9, 73,7, 169,8, 200,1.

Hydrochlorid 2-methyl-1 -pentyl-5-amino-4-oxopentanoátu [sloučenina 131

Z 2-methyl-1-pentanolu (6,0 ml) a hydrochloridu kyseliny 5-amino-4-oxopentanové (1,0 g; 6,0 mmol) při 70 °C. Reakce byla u konce po 3,5 hod. Výtěžek byl 1,43 g (95 %). ¹H NMR (200 MHz; DMSO-d6): δ 0,85 - 0,90 (6H, m), 1,1 - 1,4 (4H, m), 1,74 (1H, m), 2,56 (2H, t, J = 6,7 Hz), 2,84 (2H, t, J = 6,6 Hz), 3,75 - 3,9 (2H, m), 3,95 (2H, br s), 8,52 (3H, br s). ¹³C NMR (50 MHz; DMSO-d6): δ 13,9, 16,4,

19,1, 26,7, 31,3, 33,9, 34,5, 45,9, 67,9, 170,0, 200,1.

Hydrochlorid 4-methyl-1 -pentyl-5-amino-4-oxopentanoátu [sloučenina 81

Z 4-methyl-1-pentanolu (6,0 ml) a hdrochloridu kyseliny 5-amino-4-oxopentanové (1,0 g; 6,0 mmol) při 70 °C. Reakce byla u konce po 2 hod. Výtěžek byl 1,32 g (87 %). ¹H NMR (200 MHz; DMSO-d6): δ 0,87 (6H, d, J = 6,6 Hz), 1,15 - 1,25 (2H, m), 1,45 - 1,65 (3H, m), 2,55 (2H, t, J = 6,5 Hz), 2,83 (2H, t, J = 6,4 Hz), 3,96 (2H, br s), 3,99 (2H, t, J = 6,8 Hz), 8,53 (3H, br s). ¹³C NMR (50 MHz; DMSOd6): δ 22,0, 22,2, 25,6, 26,7, 26,8, 34,0, 45,9, 63,5, 169,9, 200,1.

Hydrochlorid 3,3-dimethvl-1-butyl-5-amino-4-oxopentanoátu [sloučenina 161

Z 3,3-dimethyl-1-butanolu (5,0 g; 49 mmol) a hydrochloridu kyseliny 5-amino-4-oxopentanové (1,0 g; 6,0 mmol) při 70 °C. Reakce byla u konce po 4 hod. Výtěžek byl 0,91 g (60 %), teplota tání 146 - 27 ·· 1 • · 4 • · · · • · · · · • · · ·· ·

148 °C. ¹H NMR (200 MHz; DMSO-d6): δ 0,91 (9H, s), 1,51 (2H, t, J = 7,6 Hz), 2,53 (2H, t, J = 6,2 Hz), 2,83 (2H, t, J = 6,2 Hz), 3,96 (2H, br s), 4,07 (2H, t, J = 7,0 Hz), 8,54 (3H, br s). ¹³C NMR (50 MHz; DMSOd6): δ 27,0, 29,3, 29,34, 34,3, 46,4, 61,5, 171,9, 202,4.

Hydrochlorid cyklohexyl-5-amino-4-oxopentanoátu [sloučenina 71

Z cyklohexanolu (6,0 ml) a hydrochloridu kyseliny 5-amino-4-oxopentanové (1,0 g; 6,0 mmol) při 80 °C. Byl přidán thionylchlorid při teplotě laboratoře. Reakce byla u konce po 3 hod. Výtěžek byl 1,48 g (99 %). ¹H NMR (200 MHz; DMSO-d6): δ 1,1 - 1,5 (6H, m), 1,5 - 1,9 (4H, m), 2,52 (2H, t, J = 6,3 Hz), 2,82 (2H, t, J = 6,3 Hz), 3,95 (2H, br s), 4,64 (1H, m), 8,52 (3H, br s). ¹³C NMR (50 MHz; DMSO-d6); δ 22,8,

24,5, 27,1, 30,6, 33,9, 45,9, 71,2, 169,3, 200,1.

Hydrochlorid 2-fenvlethyl-5-amino-4-oxopentanoátu fsloučenina 5|

Z 2-fenylethanolu (5,0 g; 41 mmol) a hydrochloridu kyseliny 5-amino-4-oxopentanové (1,0 g; 6,0 mmol) při 70 °C. Reakce byla u konce po 3 hod. Výtěžek byl 1,43 g (88 %). ¹H NMR (200 MHz; DMSO-d6): δ 2,50 (2H, t, J = 6,4 Hz), 2,82 (2H, t, J = 6,4 Hz), 2,89 (2H, t, J = 7,0 Hz), 3,95 (2H, br s), 4,23 (2H, t, J = 7,0 Hz), 7,1 - 7,4 (5H, m), 8,54 (3H, br s). ¹³C NMR (50 MHz; DMSO-d6): δ 24,6, 28,0,

35,2, 47,4, 65,5, 127,2, 129,2, 129,7, 172,8, 203,3.

Hydrochlorid 4-fenyl-1-butvl-5-amino-4-oxopentanoátu fsloučenina 141

Z 4-fenyl-1-butanolu (5,0 g; 33 mmol) a hydrochloridu kyseliny 5-amino-4-oxopentanové (1,0 g; 6,0 mmol) při 70 °C. Reakce byla u konce po 29 hod. Výtěžek byl 1,22 g (68 %). ¹H NMR (200 MHz; DMSO-d6): δ 1,60 (4H, br s), 2,5 - 2,6 (4H, m), 2,84 (2H, t, J = 6,4 Hz), 3,97 (2H, br s), 4,0 (2H, m), 7,15 - 7,35 (5H, m), 8,56 (3H, br s).

¹³C NMR (50 MHz; DMSO-d6): δ 27,0, 27,2, 27,6, 34,3, 34,6, 46,4,

63,8, 125,6, 128,2, 141,8, 171,9, 202,4.

Hydrochlorid 2-methoxvethyl-5-amino-4-oxopentanoátu (sloučenina 201

Z 2-methoxyethanolu (5,0 g; 66 mmol) a hydrochloridu kyseliny

5-amino-4-oxopentanové (1,0 g; 6,0 mmol) při 70 °C. Reakce byla u konce po 1 hod. Výtěžek byl 1,25 g (93 %) žlutavého oleje. ¹H NMR (200 MHz; DMSO-d6): δ 2,57 (2H, t, J = 6,2 Hz), 2,83 (2H, t, J = 6,2 Hz), 3,27 (3H, s), 3,54 (5H, br s), 3,95 (2H, br s), 4,12 (2H, br s), 8,52 (3H, br s). ¹³C NMR (50 MHz; DMSO-d6): δ 27,1, 34,3, 46,5, 58,0,

63,2, 69,6, 172,0, 202,5.

Hydrochlorid 3,6-dioxa-1-oktyl-5-amino-4-oxopentanoátu fsloučenina 231

Z diethylenglykolmonoethyletheru (5,0 g; 37 mmol) a hydrochloridu kyseliny 5-amino-4-oxopentanové (1,0 g; 6,0 mmol) při 70 °C. Reakce byla u konce po 4 hod. Výtěžek byl 0,90 g (53 %) světle hnědé pevné látky. ¹H NMR (200 MHz; DMSO-d6): δ 1,10 (3H, t, J = 7,0 Hz), 2,58 (2H, t, J = 6,0 Hz), 3,35 - 3,65 (8H, m), 3,96 (2, br s), 4,13 (2H, t, J = 4,2 Hz), 8,52 (3H, br s). ¹³C NMR (50 MHz; DMSO-d6): δ 15,0, 27,1, 34,3, 46,5, 63,4, 65,5, 68,1, 69,1,69,8, 172,0, 202,5.

Hydrochlorid 3,6,9-trioxa-1-decyl-5-amino-4-oxopentanoátu [sloučenina 251

Z triethylenglykolmonomethyletheru (5,0 g; 30 mmol) a hydrochloridu kyseliny 5-amino-4-oxopentanové (1,0 g; 6,0 mmol) při 70 °C. Reakce byla u konce po 20 hod. Výtěžek byl 1,19 g (63 %) hnědavého oleje. ¹H NMR (200 MHz; DMSO-d6): δ 2,58 (2H, t, J = 6,2 Hz), 2,84 (2H, t, J = 6,4 Hz), 3,25 (3H, s), 3,4 - 3,65 (10H, m), 3,96 • ·Φ· (2Η, br s), 4,13 (2H, m), 8,49 (3H, br s). ¹³C NMR (50 MHz; DMSOd6): δ 27,1, 34,3, 46,5, 58,0, 63,4, 68,1, 69,5, 69,6, 69,7, 71,2, 171,9,

202,5.

Obecný postup II

Směs alkoholu (5,0 g) a hydrochloridu kyseliny 5-amino-4-oxopentanové (1,0 g; 6,0 mmol) byla zahřívána na 90 až 100 °C (až na 135 °C, v případě potřeby pro roztavení alkoholu), a byla přidána 12M kyselina chlorovodíková (0,1 ml). Zahřívání pokračovalo dokud nebyl získán čirý roztok (až 5 až 6 dnů). Další zpracování bylo prováděno jako v předchozím postupu.

Tímto způsobem byly připraveny následující estery:

Hydrochlorid benzyl-5-amino-4-oxopentanoátu [sloučenina 41

Z benzylalkoholu (50 ml) a hydrochloridu kyseliny 5-amino-4-oxopentanové (10,0 g; 60 mmol). Po 23 hod při 90 °C byl oddestilován přebytek benzylalkoholu při 90 °C (teplota lázně) a tlaku 0,33 mm Hg (44 kPa). Výtěžek byl 8,1 g (53 %) svě hnědého prášku. ¹H NMR (200 MHz; DMSO-d6): δ 2,63 (2H, t, J = 6,5 Hz), 2,87 (2H, t, J = 6,5 Hz), 3,98 (2H, br s), 5,11 (2H, s), 7,3 - 7,4 (5H, br s), 8,52 (3H, br s). ¹³C NMR (50 MHz; DMSO-d6): δ 26,7, 33,8, 45,9, 64,8, 126,3,

126,4,126,8,134,4,169,8,200,1.

Hydrochlorid 4-nitrobenzvl-5-amino-4-oxopentanoátu [sloučenina 111

Z 4-nitrobenzylalkoholu (5,0 g; 33 mmol) a hydrochloridu kyseliny 5-amino-4-oxopentanové (1,0 g; 6,0 mmol). Reakce byla u konce po 15 min při 135 °C. Výtěžek byl 0,95 g (52 %). ¹H NMR (200 MHz; DMSO-d6): δ 2,72 (2H, t, J = 5,8 Hz), 2,91 (2H, t, J = 6,2 Hz), 4,02 (2H, br s), 5,28 (2H, s), 7,67 (2H, d, J = 8,0 Hz), 8,25 (2H, d,

- 30 ·· ···· ♦ · · »

9 9 9

9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 • · · ♦· « 9 9 9 9

J = 9,1 Hz), 8,58 (3H, br s). ¹³C NMR (50 MHz; DMSO-d6): δ 27,1,

34,3, 46,5, 64,4, 123,5, 128,3, 143,9, 146,9, 171,8, 202,5.

Hydrochlorid 4-fluorbenzyl-5-amino-4-oxopentanoátu [sloučenina 151

Z 4-fluorbenzylalkoholu (5,0 g; 40 mmol) a hydrochloridu kyseliny 5-amino-4-oxopentanové (1,0 g; 6,0 mmol). Reakce byla u konce po 3 hod při 90 °C. Výtěžek byl 1,02 g (62 %). ¹H NMR (200 MHz; DMSO-d6): δ 2,63 (2H, t, J = 6,4 Hz), 2,88 (2H, t, J = 6,6 Hz), 3,99 (2H, br s), 5,10 (2H, s), 7,22 (2H, t, J = 8,8 Hz), 7,45 (2H, d, J = 8,0 Hz), 8,57 (3H, br s). ¹³C NMR (50 MHz; DMSO-d6): δ

27,1, 34,3, 46,5, 64,9, 115,0, 115,4, 130,1, 130,2, 132,2, 132,3, 159,3, 164,2, 171,8, 202,4.

Hydrochlorid 4-methvlbenzyl-5-amino-4-oxopentanoátu [sloučenina 31

Z 4-methylbenzylalkoholu (5,0 g; 41 mmol) a hydrochloridu kyseliny 5-amino-4-oxopentanové (1,0 g; 6,0 mmol). Reakce byla u konce po 2 dnech. Výtěžek byl 0,84 g (52 %). ¹H NMR (200 MHz; DMSO-d6): δ 2,30 (3H, s), 2,60 (2H, t, J = 6,4 Hz), 2,86 (2H, t, J = 6,2 Hz), 3,96 (2H, br s), 5,05 (2H, s), 7,1 - 7,3 (4H, m), 8,55 (3H, br s). ¹³C NMR (50 MHz; DMSO-d6): δ 21,7, 28,1, 35,2, 47,4, 66,4, 128,9,

129,8, 133,9, 138,2, 172,8, 203,4.

Hydrochlorid 4-isopropvlbenzyl-5-amino-4-oxopentanoátu [sloučenina 21

Z 4-isopropylbenzylalkoholu (5,0 ml) a hydrochloridu kyseliny 5-amino-4-oxopentanové (1,0 g; 6,0 mmol). Reakce byla u konce po 2 dnech. Výtěžek byl 1,0 g (56 %). ¹H NMR (200 MHz; DMSO-d6): δ 1,19 (6H, d, J = 6,6 Hz), 2,61 (2H, t, J = 6,4 Hz), 2,84 (1H, m), 2,88 (2H, t, J = 6,8 Hz), 3,98 (2H, br s), 5,06 (2H, s), 7,2 - 7,4 (4H, m), 8,56 ·♦ »* · ♦ ♦ (3H, br s). ¹³C NMR (50 MHz; DMSO-d6): δ 23,7, 27,1, 33,1, 34,3,

46,4, 65,5, 126,2, 128,0, 133,3, 148,2, 171,8, 202,6.

Hydrochlorid 4-t-butvlbenzyl-5-amino-4-oxopentanoátu [sloučenina 101

Z 4-t-butylbenzylalkoholu (5,0 g; 30 mmol) a hydrochloridu kyseliny 5-amino-4-oxopentanové (1,0 g; 6,0 mmol). Reakce byla u konce po 2 dnech. Výtěžek byl 0,84 g (52 %). ¹H NMR (200 MHz; DMSO-d6): δ 1,27 (9H, s), 2,61 (2H, t, J = 6,4 Hz), 2,87 (2H, t, J = 6,6 Hz), 3,98 (2H, br s), 5,06 (2H, s), 7,29 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,39 (2H, d, J = 8,4 Hz), 8,55 (3H, br s). ¹³C NMR (50 MHz; DMSO-d6): δ 27,1, 31,0, 34,16, 34,26, 46,4, 65,4, 125,0, 127,7, 133,0, 150,4, 171,8,

202,4.

Hydrochlorid 4-(trifluormethvl)benzvl-5-amino-4-oxopentanoátu fsloučenina 91

Z 4-(trifluormethyl)benzylalkoholu (4,9 g; 28 mmol) a hydrochloridu kyseliny 5-amino-4-oxopentanové (1,0 g; 6,0 mmol). Reakce byla u konce po 2 hod. Výtěžek byl 1,24 g (64 %). ¹H NMR (200 MHz; DMSO-d6): δ 2,69 (2H, t, J = 6,2 Hz), 2,92 (2H, t, J = 6,4 Hz), 4,00 (2H, br s), 5,23 (2H, s), 7,62 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,75 (2H, d, J = 8,2 Hz), 8,58 (3H, br s). ¹³C NMR (50 MHz; DMSO-d6): δ 27,1,

34,4, 46,5, 64,7, 121,4, 125,2, 125,3, 125,4, 126,9, 128,2, 140,9,

171,8, 202,5.

Hydrochlorid 2-fluorbenzvl-5-amino-4-oxopentanoátu fsloučenina 171

Z 2-fluorbenzylalkoholu (5,7 g; 45 mmol) a hydrochloridu kyseliny 5-amino-4-oxopentanové (1,0 g; 6,0 mmol). Reakce byla u konce po 27 hod při 100 °C. Výtěžek byl 0,64 g (44 %). Teplota tání 91 - 94 °C (rozkl.). ¹H NMR (200 MHz; DMSO-d6): δ 2,63 (2H, t, J =

6,0 Hz), 2,88 (2H, t, J = 6,0 Hz), 3,98 (2H, br s), 5,16 (2H, s), 7,2 - 7,6 (4H, m), 8,56 (3H, br s). ¹³C NMR (50 MHz; DMSO-d6): δ 27,0, 34,3,

46,4, 59,7, 59,8, 115,1, 115,5, 122,7, 123,0, 124,5, 130,4, 130,6, 130,7, 130,8, 157,8, 162,7, 171,8, 202,4.

Hydrochlorid 3-fluorbenzyl-5-amino-4-oxopentanoátu [sloučenina 241

Z 3-fluorbenzylalkoholu (5,1 g; 40 mmol) a hydrochloridu kyseliny 5-amino-4-oxopentanové (1,0 g; 6,0 mmol). Reakce byla u konce po 20 hod při 100 °C. Výtěžek byl 1,04 g (72 %). Teplota tání 115 - 119 °C. ¹H NMR (200 MHz; DMSO-d6): δ 2,67 (2H, t, J = 6,2 Hz), 2,90 (2H, t, J = 6,2 Hz), 4,00 (2H, d, J = 5,0 Hz), 5,14 (2H, s), 7,1 - 7,3 (3H, m), 7,4 - 7,5 (1H, m), 8,54 (3H, br s). ¹³C NMR (50 MHz; DMSOd6): δ 27,1, 34,3, 46,5, 64,7, 114,1, 114,5, 114,9, 123,1, 123,6, 130,4, 130,5,138,8,139,0,159,6,164,5,171,8,202,5.

Hydrochlorid 2,3,4,5,6-pentafluorbenzyl-5-amino-4-oxopentanoátu [sloučenina 181

Z 2,3,4,5,6-pentafluorbenzylalkoholu (5,1 g; 26 mmol) a hydrochloridu kyseliny 5-amino-4-oxopentanové (1,0 g; 6,0 mmol). Reakce byla u konce po 6 dnech při 100 °C. Výtěžek byl 0,25 g (13 %). Teplota tání 146 - 148 °C. ¹H NMR (200 MHz; DMSO-d6): δ 2,59 (2H, t, J = 6,4 Hz), 2,85 (2H, t, J = 6,4 Hz), 3,95 (2H, br s), 5,22 (2H, s), 8,51 (3H, br s). ¹³C NMR (50 MHz; DMSO-d6): δ 26,8, 34,2,

46,5, 53,2, 109,9, 123,2, 134,5, 139,5, 142,7, 147,7, 171,6, 202,4.

Hydrochlorid 4-chlorbenzyl-5-amino-4-oxopentanoátu [sloučenina 191

Z 4-chlorbenzylalkoholu (5,0 g; 35 mmol) a hydrochloridu kyseliny 5-amino-4-oxopentanové (1,0 g; 6,0 mmol). Reakce byla u konce po 24 hod při 100 °C. Výtěžek byl 0,56 g (32 %). Teplota tání ·· ····

127 - 129 °C. ¹H NMR (200 MHz; DMSO-d6): δ 2,65 (2H, t, J = 5,8 Hz), 2,89 (2H, t, J = 6,0 Hz), 3,99 (2H, br s), 5,11 (2H, s), 7,44 (4H, s), 8,56 (3H, br s). ¹³C NMR (50 MHz; DMSO-d6): δ 27,1, 34,3, 46,5, 64,7,

128,4, 129,7, 132,6, 135,1, 171,8, 202,5.

Hydrochlorid 3₁4-dichlorbenzyl-5-amino-4-oxopentanoátu fsloučenina 221

Z 3,4-dichlorbenzylalkoholu (5,0 g; 28 mmol) a hydrochloridu kyseliny 5-amino-4-oxopentanové (1,0 g; 6,0 mmol). Reakce byla u konce po 45 hod při 100 °C. Výtěžek byl 1,12 g (57 %). ¹H NMR (200 MHz; DMSO-d₆): δ 2,67 (2H, t, J = 6,4 Hz), 2,90 (2H, t, J =

6,4 Hz), 4,00 (2H, br s), 5,12 (2H, s), 7,2 - 7,5 (1H, m), 7,5 - 7,6 2H, m), 8,50 (3H, br s). ¹³C NMR (50 MHz; DMSO-d₆): δ 27,1, 34,3, 46,7,

64,1, 129,8, 130,7, 137,3, 173,7, 202,8.

Hydrochlorid 3-nitrobenzyl-5-amino-4-oxopentanoátu fsloučenina 211

Z 3-nitrobenzylalkoholu (5,0 g; 33 mmol) a hydrochloridu kyseliny 5-amino-4-oxopentanové (1,0 g; 6,0 mmol). Reakce byla u konce po 20 hod při 100 °C. Výtěžek byl 1,00 g (55 %). ¹H NMR (200 MHz; DMSO-d6): δ 2,68 (2H, br s), 2,90 (2H, br s), 3,98 (2H, br s), 5,26 (2H, s), 7,6 - 7,9 (2H, m), 8,1 - 8,3 (2H, m), 8,47 (3H, br s). ¹³C NMR (50 MHz; DMSO-d6): δ 27,1, 34,3, 46,5, 64,4, 122,3, 122,8,

130,1, 134,3, 138,4, 147,7, 171,8, 202,5.

Hydrochlorid 2-methvlbenzyl-5-amino-4-oxopentanoátu Fsloučenina 291

Z 2-methylbenzylalkoholu (5,0 g; 41 mmol) a hydrochloridu kyseliny 5-amino-4-oxopentanové (1,0 g; 6,0 mmol). Reakce byla u konce po 4 dnech při 100 °C. Výtěžek byl 0,72 g (44 %). Teplota tání 107 - 109 °C. ¹H NMR (200 MHz; DMSO-d₆): 2,29 (3H, s), 2,62 (2H, t, « 4

- 34 *···

4

4 4 « « • 4 4 4 4 4

4«·· 444 · • · · 4 4 4 ·

4 4 ·· · _a

J = 6,4 Hz), 2,86 (2H, t, J = 6,4 Hz), 3,96 (2H, br s), 5,10 (2H, s), 7,2 7,4 (4H, m), 8,54 (3H, br s). ¹³C NMR (50 MHz; DMSO-d₆): δ 18,4, 27,0, 34,3, 46,4, 64,1, 123,1, 125,8, 128,2, 128,8, 130,0, 133,8, 136,5,

171,8, 202,5.

Hydrochlorid 3-methylbenzvl-5-amino-4-oxopentanoátu (sloučenina 311

Z 3-methylbenzylalkoholu (5,0 g; 40 mmol) a hydrochloridu kyseliny 5-amino-4-oxopentanové (1,0 g; 6,0 mmol). Reakce byla u konce po 2 dnech při 80 °C. Výtěžek byl 1,11 g (68 %). Teplota tání 96 - 98 °C. ¹H NMR (200 MHz; DMSO-d_e): δ 2,31 (3H, s), 2,62 (2H, t, J = 6,2 Hz), 2,87 (2H, t, J = 6,4 Hz), 3,97 (2H, br s), 5,06 (2H, s), 7,1 7,4 (4H, m), 8,55 (3H, br s). ¹³C NMR (50 MHz; DMSO-de): δ 20,9,

27,1, 34,3, 46,4, 65,6, 124,9, 128,3, 128,4, 128,5, 135,9, 137,5, 171,9,

202,5.

Obecný postup III

Benzylalkohol (5,0 mmol) byl po kapkách přidán ke směsi N,N’-diisopropylkarbodiimidu (0,63 g; 5,0 mmol) a chloridu měďného (1 mg) ochlazené na 0 °C (teplota vsádky). Po 1 hod při 0 °C byla směs míchána přibližně 24 hod při teplotě laboratoře. Tmavě zelená směs byla zředěna pentanem (3 ml) a zfiltrována přes celitové lože. Zbytek byl promyt malým množstvím pentanu a spojené filtráty byly odpařeny. Zbytek byl rozpuštěn v suchém tetrahydrofuranu a byla přidána N-t-BOC-5-amino-4-oxopentanová kyselina (0,43 mmol) v suchém dichiormethanu (10 ml). Po stání 5 dnů při teplotě laboratoře byla směs zfiltrována a zbytek byl promyt malým množstvím diethyletheru. Zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu (20 ml) a smísen s roztokem chlorovodíku v ethylacetátu (2 ml). Sraženina hydrochloridu se objevila po 4 hod až 3 dnech a byla čištěna jak je ukázáno níže.

• «•9

- 35 *9 999» « 9

9 9

9 9 9

9 9 9

9 9

Kyselina N-t-BOC-5-amino-4-oxopentanová

Triethylamin (13,9 ml; 10,1 g; 0,10 mol) byl po kapkách přidán k míchané směsi hydrochloridu kyseliny 5-amino-4-oxopentanové (10,0 g; 59,7 mmol) a di-t-butyldikarbonátu (21,8 g; 0,10 mol) v suchém Ν,Ν-dimethylformamidu (25 ml). Reakční směs byla míchána 6 hod při 50 °C a přes noc při teplotě laboratoře. Rozpouštědlo bylo odpařeno při 35 až 40 °C (teplota vsádky) a tlaku 7 až 1 mm Hg (933 až 133 Pa). Zbytek byl okyselen ledově chladnou 10% kyselinou citrónovou (50 ml) a ihned extrahován ethylacetátem (6 x 15 ml). Spojené extrakty byly promyty vodou (2x5 ml) a nasyceným roztokem NaCl (1x5 ml). Po sušení (Na2SO) přes noc v chladicím boxu byla směs zfiltrována a odpařena. Červený olej byl čištěn bleskovou chromatografíi na koloně 50 x 60 mm silikagelu s elucí směsí ethylacetát-hexan (2 : 1), a byly jímány 50 ml frakce, za získání 12,2 g (88 %) viskózního žlutého oleje, který částečně ztuhnul při uchování v chladicím boxu. ¹H NMR (200 MHz; DMSO-de): δ 1,39 (9H, s), 2,42 (2H, t, J = 6,4 Hz), 2,63 (2H, t, J = 6,4 Hz), 3,78 (2H, d, J = 5,8 Hz), 7,04 (1H, t, J = 5,6 Hz), 12,1 (1H, br s). ¹³C NMR (50 MHz; DMSO-d₆): δ 27,4, 28,1, 38,6, 49,5, 78,1, 155,7, 173,6, 206,1.

Hydrochlorid 4-methoxvbenzyl-5-amino-4-oxopentanoátu [sloučenina 281

Připraven z 4-methoxybenzylalkoholu (1,0 g; 7,2 mmol), N,N’-diisopropylkarbodiimidu (0,91 g; 7,2 mmol), CuCI (9 mg) a kyseliny N-t-BOC-5-amino-4-oxopentanové (1,7 g; 7,2 mmol). Blesková chromatografie na koloně 175 x 25 mm silikagel 60 s elucí acetonitrilem (200 ml), 5% methanolem v acetonitrilu (500 ml) a 10% methanolem v acetonitrilu (750 ml) a jímání 50ml frakcí poskytlo 0,24 g (11 %) produktu. Teplota tání 110-112 °C. ¹H NMR (200 MHz; DMSO-de): δ 2,58 (2H, t, J = 6,4 Hz), 2,83 (2H, t, J = 6,4 Hz), 3,75 ·· 4444 • 4 4 44 • 4 4 4 4 * 4 • · 4 4 4 4 44 • · ·· 4444449 4 • · · · 4 4 4 • 44 4 44 (3H, s), 3,94 (2H, br s), 5,02 (2H, s), 6,93 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,31 (2H, d, J = 8,4 Hz), 8,48 (3H, br s). ¹³C NMR (50 MHz; DMSO-d₆): δ

27,1, 34,2, 46,4, 55,0, 65,4, 113,7, 127,9, 129,8, 159,1, 171,8, 202,5.

Dihvdrochlorid 3-pvridinylmethvl-5-amino-4-oxopentanoátu [sloučenina 261

Z 3-pyridinylmethanolu (0,55 g; 5,0 mmol) a 0,43M kyseliny N-t-BOC-5-amino-4-oxopentanové v dichlormethanu (10 ml; 4,3 mmol). Odpaření rozpouštědel z filtrátu poskytlo 1,0 g zbytku, který by! rozpuštěn v ethylacetátu. K světle hnědému roztoku byl přidán roztok chlorovodíku v ethylacetátu (2 ml). Po stání 4 hod při teplotě laboratoře byl zbytek zfiltrován a sušen na silikagelu při 30 °C a tlaku 0,01 mm Hg (1 Pa), za získání 0,63 g (68 %) hygroskopické pevné látky. ¹H NMR (200 MHz; DMSO-d₆): δ 2,69 (2H, t, J = 6,4 H), 2,91 (2H, t, J = 6,4 Hz), 3,9 - 4,0 (2H, m), 5,35 (2H, s), 8,0 - 8,2 (1H, m), 8,54 (3H, br s), 8,5 - 8,7 (1H, m), 8,9 - 9,0 (2H, m). ¹³C NMR (50 MHz; DMSO-de): δ 27,0, 34,3, 46,4, 61,9, 126,9, 140,8, 141,3, 144,4, 171,7,

202,5.

Hydrochlorid 4-difenvlmethyl-5-amino-4-oxopentanoátu [sloučenina 271

Z 4-difenylmethanolu (5,0 g; 40 mmol) a roztoku kyseliny N-t-BOC-5-amino-4-oxopentanové (10 ml; 4,3 mmol). Surový hydrochlorid byl čištěn bleskovou chromatografií na koloně 190 x 25 mm silikagelu 60 s elucí acetonitrilem (300 ml), 10% methanolem v acetonitrilu (1000 ml) a 20% methanolem v acetonitrilu (250 ml), za jímání 50ml frakcí. Výtěžek byl 0,39 g (16 %). Teplota tání 163 - 166 °C. ¹H NMR (200 MHz; DMSO-d6): δ 2,65 (2H, t, J = 6,4 Hz), 2,88 (2H, t, J = 6,4 Hz), 3,98 (2H, br s), 5,16 (2H, s), 7,2 - 7,5 (5H, m), 7,6 - 7,8 (4H, m), 8,52 (3H, br s). ¹³C NMR (50 MHz; DMSO-d6): δ 27,1, 34,3, 46,4, 65,3,

126,6, 126,7, 127,5, 128,5, 128,9, 135,2, 139,6, 139,8, 171,9, 202,5.

Φ· ··«« φφ φφφφ

-37φφ » •φφφ φ φ · * φφφφ φφ φ φ φφ φφφφφφφ φ · • φφφ φ φ « · • φφ φ φφ φφ

Benzyl-5-ΓΓ 1 -(acetvloxv)ethoxv)karbonvHamino-4-oxopentanoát [sloučenina 301

Pyridin (0,32 ml; 0,32 g; 4,0 mmol) byl po kapkách přidán k míchané směsi hydrochloridu benzyl-5-amino-4-oxopentanoátu (0,52 g; 2,0 mmol) a 1-chlorethylchlorformátu (0,29 g; 2,0 mmol) v suchém tetrahydrofuranu (10 ml). Po míchání 2 hod při teplotě laboratoře byla směs promyta (1x2 ml) a nasyceným roztokem NaCl (1x2 ml) a sušena (MgSO₄). Filtrace a odpaření poskytly 0,65 g světle hnědého oleje. Tento olej byl rozpuštěn v ledové kyselině octové (10 ml) a byl přidán octan rtuťnatý (0,64 g; 2,0 mmol). Po míchání 3 dny při teplotě laboratoře byl přebytek kyseliny octové odpařen při přibližně 30 °C (teplota vsádky) a tlaku 8 až 10 mm Hg (1,1 až 1,3 kPa). Zbytek byl míchán s diethyletherem (10 ml) a zfiltrován. Po promytí zbytku větším množstvím etheru (15 ml) byly spojené filtráty neutralizovány NaHCC>3 a promyty nasyceným roztokem NaCl (1x10 ml). Po usušení (MgSO₄), zfiltrování a odpaření byl surový produkt čištěn bleskovou chromatografií na koloně 190 x 25 mm silikagel 60 s elucí směsí ethylacetát-hexan (2 : 1) (500 ml), za jímání 25ml frakcí. Výtěžek byl 0,43 g (61 %) bleděžlutého oleje. ¹H NMR (200 MHz; DMSO-d6): δ 1,41 (3H, d, J = 5,6 Hz), 2,00 (3H, s), 2,57 (2H, t, J = 6,0 Hz), 2,73 (2H, t, J = 6,0 Hz), 3,90 (2H, d, J = 6,0 Hz), 5,08 (2H, s), 6,68 (1H, q, J = 5,4 Hz), 7,36 (5H, s), 7,71 (1H, t, J = 5,8 Hz). ¹³C NMR (50 MHz; DMSO-d6): δ 19,6, 20,6, 27,3, 33,7, 49,5, 65,5, 88,8, 127,8, 127,9, 128,4, 136,1, 154,2, 168,6, 172,0,

205,1.

flfl ···· • fl · ·· ··»· • · · » fl · · « • · · flflfl· fl fl · • flfl fl · · ··«· · · · · pp ··· ··· ····

Příklad 2

Měření tvorby porfyrinu v buněčné kultuře in vitro

Metody

V porovnání s ALA byly testovány následující sloučeniny:

1. 1 -methylpentylester ALA

2. p-isopropylbenzylester ALA

3. p-methylbenzylester ALA

4. benzylester ALA

5. 2-fenylethylester ALA

6. hexylester ALA

7. cyklohexylester ALA

8. 4-methylpentylester ALA

9. p-[tri-fluormethyl]benzylester ALA

10. p-[t-butyl]benzylester ALA

11. p-nitrobenzylester ALA

Testované sloučeniny byly rozpuštěny v DMSO na koncentraci 100 mM (zásobní roztok). Vhodné koncentrace byly získány ředěním zásobního roztoku fyziologickým roztokem s fosfátovým pufrem (PBS) nebo kultivačním médiem.

Kultivace buněk

Buňky WiDr, odvozené z primárního adenokarcinomu rektosigmoidního kolonu byly subkultivovány v médiu RPMI 1640 (Gibco) obsahujícím 10 % fetálního telecího séra, 100 U/ml penicilinu, 100 pg/ml streptomycinu a 1 % glutaminu. Buňky byly dvakrát týdně děleny v poměru 1 : 100 a udržovány při 37 °C a 5% CO2 ve zvlhčeném prostředí.

·· ··*<

Podmínky ošetření x 10⁵ buněk WiDr ve 2 ml média RPMI jak bylo popsáno v předchozím odstavci, bylo přidáno do každé jamky 6-jamkových plastových destiček pro tkáňové kultury (Nunc) a ponecháno 48 hod při 37 °C a 5% CO₂ ve zvlhčeném prostředí pro řádné přichycení k podložce. Buňky byly potom dvakrát promyty médiem RPMI 1640 bez séra a potom byla do jamek přidána příslušná ředění testovaných sloučenin ve 2 ml čerstvého kultivačního média na konečné koncentrace 0,001, 0,01, 0,1 a 1 mM, přičemž experimenty byly prováděny v duplikátech. Buňky byly inkubovány při 37 °C 4 hod.

Měření obsahu porfyrinu v buňkách

Po ošetření popsaném v odstavci „Podmínky ošetření“ byly buňky dvakrát promyty PBS a přeneseny do roztoku 1M HCIO₄ v 50% MeOH seškrabáním buněk ze substrátu pomocí škrabky Costar cell scraper. Úlomky buněk byly odstraněny centrifugací. Obsah porfyrinu v každém vzorku byl zjišťován fluorometricky použitím spektrofluorometru Perkin Elmer LS50B (excitace 407 nm, emise 606 nm s použitím širokospektrálního filtru s mezní vlnovou délkou 530 nm na emisní straně). Fluorescence v každém vzorku byla přepočtena na obsah proteinu v kontrolních buňkách při měření Bradfordovou metodou.

Výsledky

Výsledky jsou ukázány na obr. 1 až 4 pro testy sloučenin 1 až 3, 4 a 5, 6 až 8 a 9 až 11.

Z obr. 1 je vidět, že strmé křivky závislosti odpovědi na dávce byly zjištěny pro p-methylbenzyl- a p-isopropylbenzylester. Tyto estery měly stejnou účinnost při indukci syntézy porfyrinu v buňce a byly přibližně 200 krát účinnější než ALA. Křivka pro 1-methylpentylester

-40 ·· ···· Φ· · • · · · · · • · « · · · 4 • · · · 4 · ···· • · · · 4 4

4· ···· • · · • 4 4 • · · · • 4 4 · ·· 44 stoupala se stoupajícími koncentracemi esteru pomalu. 1Methylpentylester měl při nízkých koncentracích pouze mírně lepší výsledky při indukci tvorby porfyrinu než ALA. Z obr. 2 je vidět, že benzyl- i 2-fenylethylester měly podstatně vyšší účinnost než ALA při indukci syntézy buněčného porfyrinu. Tvorba porfyrinu indukovaná 0,001 mM benzylesterem je stejná jako bylo získáno s použitím 0,6 mM ALA. Podobně je vidět, že fluorescence po přidání 0,001 mM

2-fenylethylesteru odpovídá fluorescenci indukované 0,4 mM ALA.

Obr. 3 ukazuje, že hexyl- a 4-methylpentylester měly stejnou účinnost. Je také zřejmé, že schopnost těchto esterů indukovat tvorbu porfytinu v buňce byla přibližně stonásobná, než stejná schopnost ALA. Cyklohexylester měl při nízkých koncentracích pouze mírně vyšší účinnost než ALA při indukci tvorby porfyrinu. Při vyšších koncentracích měl cyklohexylester nižší účinnost než ALA.

Z obr. 4 je vidět, že p-[trifluormethyl]benzyl-, p-[t-butyl]benzyl- a p-nitrobenzylester měly přibližně dvousetnásobně vyšší účinnost indukce tvorby porfyrinu než ALA.

Výsledky mohou být shrnuty následovně:

Sloučenina (tj. postranní řetězec esteru) (Sloučenina No.)	Účinnost*
ALA	1
1-methylpentyl [1]	3
4-methylpentyl [8]	100
2-fenylethyl [5j	500
benzyl [4]	100 - 600
hexyl [6]	100
p-isopropylbenzyl [2]	200
p-methylbenzyl [3]	200
cyklohexyl [7]	1
p-nitrobenzyl [11]	200
p-[trifluormethyl]benzyl [9]	200
p-[t-butyl]benzyl [10]	200

*Relativní schopnost indukovat tvorbu porfyrinu

Příklad 3

Tvorba porfyrinu po místní aplikaci na kůži myší

Metody

V porovnání s ALA byly testovány následující sloučeniny (včetně sloučenin 1 až 11 testovaných v příkladu 2):

1. 1 -methylpentylester ALA

2. p-isopropylbenzylester ALA

3. p-methylbenzylester ALA • · • ·

-42• · ·

benzylester ALA

2-fenylethylester ALA hexylester ALA cyklohexylester ALA

4-methylpentylester ALA p-[trifluormethyl]benzylester ALA p-[t-butyl]benzylester ALA p-nitrobenzylester ALA

1- ethylbutylester ALA

2- methylpentylester ALA

4-fenylbutylester ALA p-fluorbenzylester ALA

3,3’-dimethyl-1-butylester ALA

2-fluorbenzylester ALA

2.3.4.5.6- pentafluorbenzylester ALA

4-chlorbenzylester ALA

2- methoxyethylester ALA

3- nitrobenzylester ALA

3,4- [dichlor]benzylester ALA

3.6- dioxa-1-oktylester ALA

3-fluorbenzylester ALA

3,6,9-trioxa-1-decylester ALA

3- pyridinylmethylester ALA

4- difenylmethylester ALA

4-methoxybenzylester ALA

2- methylbenzylester ALA benzyl-5-[(1-acetyloxyethoxy)-karbonyl]aminolevulinát

3- methylbenzylester ALA ······ ··· ·· ·· ···· · · · fcfc · 9 · · · ·· · • · · · · ······· tt · ··· · · · ····

- 43 - ·· · ·· · ·· ··

Metody

Testované sloučeniny byly formulovány v krémovém základu Unguentum Merck (krémový základ firmy Merck obsahující oxid křemičitý, parafinový olej, bílou vazelínu, cetostearol, polysorbát 40, glycerolmonostearát, Miglyol®812 (směs rostlinných mastných kyselin), polypropylenglykol a čištěnou vodu) na požadovanou koncentraci. Koncentrace se uvádějí jako % (hmotn./hmotn.), přepočteno jako hydrochloridy. Formulace byly připraveny 1 den před experimentem a uchovávány v chladicím boxu až do dne použití. Při studiích byly použity samice bezthymových nahých myší Balb/c, hmotnost přibližně 22 g, získané z Department of Laboratory Animals, The Norwegian Radium Hospital (Montebello, Oslo, Norsko).

V každé skupině byly tři myši. Na každou myš bylo aplikováno místně 0,05 až 0,1 g prostředku na pravém boku, rovnoměrně rozetřeno a pokryto náplastí (Opsite Flexigrid; Smith and Nephew Medical Ltd., Hulí, Anglie). Bodové měřicí zařízení se skládalo ze svazku optických vláken napojených na spektrofluorometr, který poskytl excitační záření vlnové délky 407 nm. Excitační záření, které je schopno proniknout 0,1 až 0,5 mm do tkáně, bylo vedeno ke kůži myši polovinou vláken. Výsledné emisní spektrum fluorescence (550 až 750 nm) bylo vedeno zbývajícími optickými vlákny do fotonásobiče pro kvantifikaci.

Po aplikaci formulace ve formě krému bylo měřeno fluorescenční spektrum porfyrinů v kůži metodou optických vláken v různých časových intervalech po podání.

Intenzita fluorescence se měnila mezi jednotlivými experimenty. Jako vnitřní kontrola byl proto v každém experimentu použit 1% (hmotn./hmotn.) hydrochlorid kyseliny hexyl-5-aminolevulové.

- 44 ·· ··· · ··

Výsledky

Výsledky jsou ukázány na obr. 5 až 17 pro následující testované sloučeniny: obr. 5 - sloučeniny 1, 6, 12 a 13; obr. 6 - sloučeniny 5-8; obr. 7 - sloučeniny 3 a 6; obr. 8 - sloučeniny 2, 6 a 14; obr. 9 sloučeniny 6, 11 a 15; obr. 10 - sloučeniny 6, 9 a 10; obr. 11 sloučeniny 4 a 6; obr. 12 - sloučeniny 6 a 16; obr. 13 - sloučeniny 6 a 17 až 19; obr. 14 -sloučeniny 6 a 20 až 22; obr. 15 - sloučeniny 6 a 23 až 25; obr. 16 - sloučeniny 6 a 26 až 28; obr. 17 - sloučeniny 6 a 29 až 31. Všechny sloučeniny byly použity v koncentraci 1% (hmotn./hmotn.) kromě sloučenin na obr. 12 a 17, kde byly použity 3,3-dimethyl-1butylester ALA, 2-methylbenzylester ALA, benzyl-5-[(acetyloxyethoxy)karbonyl] ester ALA, a 3-methylbenzylester ALA v koncentraci 3 % (hmotn./hmotn.), a v obr. 13, kde byly použity 2-fluorbenzylester ALA, 2,3,4,5,6-pentafluorbenzylester ALA a 4-chlorbenzylester ALA v koncentraci 10 % (hmotn./hmotn.).

Z obr. 5 je vidět, že hexyl-, 1-methylpentyI-, 1-ethylbutyl- a 2-methylpentylester všechny poskytují tvorbu porfyrinu. Navíc poskytl hexylester nejvyšší fluorescenci a za ním následovaly 2-methylpentyla 1-ethylbutylester. Při této studii poskytl střední intenzitu fluorescence 1 -methylpentylester.

Obr. 6 ukazuje, že hexylester a 4-methylpentylester poskytují vysoké intenzity fluorescence, zatímco cyklohexyl- a 2-fenylethylester poskytly nízké hladiny fluorescence.

Obr. 7 ukazuje, že vysoké a podobné intenzity fluorescence poskytly hexyl- i p-methylbenzylester ALA.

Z obr. 8 je zřejmé, že p-isopropylbenzyl-5-aminolevulinát poskytl střední intenzity fluorescence, zatímco 4-fenylbutyl-5-aminolevulinát poskytl pouze nízké intenzity fluorescence. V tomto ohledu je zajímavé, že analog naposledy uvedené látky (2-fenylethyl-5-aminolevulinát) poskytl také relativné mírné intenzity fluorescence (obr. 6). To ukazuje, že jestliže se benzyl-5-aminolevulinát (obr. 11)

-45 „prodlouží“ o jednu nebo více methylenových (-CH2-) skupin mezi benzylem a ALA, vede to ke snížené schopnosti indukovat tvorbu porfyrinu.

Obr. 9 ukazuje, že p-nitrobenzyl- a hexylester poskytly oba vysoké intenzity fluorescence. Mírně nižší intenzity byly získány s p-fluorbenzylesterem.

Obr. 10 ukazuje, že vysoká tvorba porfyrinu (ukázaná vysokými intenzitami fluorescence) byla získána pro hexyl- a p-[trifluormethyljbenzylester. Střední intenzity fluorescence byly získány pro p-(terc-butyl)benzylester. To je pravděpodobně způsobeno poměrně objemnou esterovou skupinou.

Z obr. 11 je zřejmé, že pro hexyl- i benzylestery byly získány vysoké hladiny fluorescence.

Na obr. 12 je vidět, že podobné intenzity fluorescence byly získány pro 1% hexylester a 3% formulaci 3,3’-dimethyl-1-t-butylesteru. Tyto dva estery tedy mají přibližně stejnou účinnost indukce tvorby porfyrinu v kůži.

Z obr. 13 je vidět, že 4-chlorbenzylester poskytl vysokou intenzitu fluorescence, zatímco 2,3,4,5,6-pentafluorbenzyl- a 2-fluorbenzylester poskytly střední/vysoké aktivity.

Z obr. 14 a 15 je zřejmé, že všechny testované estery ALA kromě hexylesteru poskytly střední intenzitu fluorescence kůže po místním podání.

Z obr. 16 je zřejmé, že hexylester poskytl vysoké úrovně fluorescence a 3-pyridinylmethyl- a 4-methoxybenzylestery poskytly střední intenzity fluorescence. Relativně nízkou fluorescenci měl 4-difenylmethylester.

Z obr. 17 je zřejmé, že N-substituovaný benzylester ALA poskytl střední/vysokou fluorescenci, zatímco tři další testované estery poskytly vysoké hladiny fluorescence.

Claims (20)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Sloučenina pro použití při fotochemoterapii nebo při diagnostice, kde tato sloučenina má vzorec I R²2N-CH₂COCH2-CH₂CO-OR¹ (I) kde

   R¹ znamená Cí nebo C₂ alkylovou skupinu substituovanou jednou nebo více arylovými skupinami; a

   R² nezávisle znamená atom vodíku nebo popřípadě substituovanou alkylovou skupinu, nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.
2. 2. Sloučenina podle nároku 1, kde ve skupině R¹ je alkylová skupina koncově substituovaná uvedenou arylovou skupinou.
3. 3. Sloučenina podle nároku 1 nebo 2, kde ve skupině R¹ je alkylová skupina methyl.
4. 4. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 3, kde arylová skupina je substituována jednou nebo více skupinami alkyl, např. Ci-₂ alkyl, alkoxy, např. methoxy, fluor, chlor, nitro nebo trifluormethyl.
5. 5. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 4, kde arylová skupina je fenyl, difenyl nebo monocyklická 5 až 7-členná heteroaromatická skupina, s výhodou fenyl.

   • * ··· · • · A · · ······· A · • · · · A · ··«·

   - 49 - ·· * .......
6. 6. Sloučenina podle nároku 5, kde heteroaromatická skupina je pyridinyl.
7. 7. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 6, kde každá skupina R² znamená atom vodíku.
8. 8. Sloučenina vzorce I

   R²2N-CH₂COCH₂-CH₂CO-OR¹ (I) kde

   R¹ znamená Cí nebo C₂ alkylovou skupinu substituovanou skupinou aryl, s výhodou Cí nebo C₂ alkylovou skupinu substituovanou neheteroaromatickou arylovou skupinou, přičemž arylová skupina je substituovaná, s výhodou substituovaná jednou nebo více skupinami alkyl, např. Ci-₂ alkyl, alkoxy, např. methoxy, fluor, chlor, nitro nebo trifluormethyl;

   R², které mohou být stejné nebo různé, znamenají atom vodíku nebo popřípadě substituovanou alkylovou skupinu, např. skupinu R¹;

   kde uvedené substituenty jsou zvolené ze skupiny hydroxy, alkoxy, acyloxy, alkoxykarbonyloxy, amino, aryl, nitro, oxo, fluor, -SR³, -NR³2 a -PR³2, a uvedená alkylová skupina je popřípadě přerušená jednou nebo více skupinami -0-, -NR³-, -S- nebo -PR³-; a R³ znamená atom vodíku nebo Ci.₆ alkylovou skupinu, nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

   ·· ···· ·· · «· ··«·

   4 · 4 · · · 4 · ·

   44 4 · 4 4 4 · · 4

   4 44 44 44444·· · 4 _ _ ··· ·· · ····

   - 50 - ** * ·· ’ ·· ··
9. 9. Sloučenina podle nároku 8, kde arylová skupina je fenyl, difenyl nebo monocyklická 5 až 7-členná heteroaromátická skupina, s výhodou fenyl.
10. 10. Sloučenina podle nároku 8 nebo nároku 9, kde ve vzorci I znamenají všechny skupiny R² atom vodíku.
11. 11. Sloučenina podle nároku 10, kde ve skupině R¹ je arylová skupina fenyl a alkylová skupina je methyl.
12. 12. Sloučenina podle nároku 8, zvolená ze skupiny pmethylbenzylester ALA, p-nitrobenzylester ALA, p-[trifluormethyljbenzylester ALA, p-fluorbenzylester ALA, 4-chlorbenzylester ALA, 3-methylbenzylester ALA a 2-methylbenzylester ALA.
13. 13. Sloučenina podle nároku 12 nebo benzylester ALA pro použití při fotochemoterapii nebo diagnostice.
14. 14. Způsob výroby sloučenin vzorce I podle některého z nároků 8 až 12, vyznačující se tím, že zahrnuje alespoň jeden z následujících kroků:

    (a) provede se reakce sloučeniny vzorce li

    R²2N-CH₂COCH2-CH₂CO-X (II) kde

    X znamená odštěpitelnou skupinu, např. hydroxylovou skupinu, atom halogenu nebo alkoxylovou skupinu, nebo COX znamená skupinu anhydridu kyseliny, a R² je jak definováno v nároku 11, se sloučeninou vzorce III

    R¹-OH (III) kde

    R¹ je jak definováno v nároku 11; a (b) sloučenina vzorce I se převede na farmaceuticky přijatelnou sůl.
15. 15. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, ž e obsahuje sloučeninu podle některého z nároků 1 až 13 nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl, spolu s alespoň jedním farmaceuticky přijatelným nosičem nebo pomocnou látkou.
16. 16. Použití sloučeniny podle některého z nároků 1 až 13, nebo její farmaceuticky přijatelné soli, pro výrobu léčiva pro použití při fotochemoterapii, nebo diagnostického prostředku pro použití při diagnostice.
17. 17. Použití podle nároku 16, kde fotochemoterapie nebo diagnostika se provádějí u onemocnění nebo abnormalit vnějších nebo vnitřních povrchů těla, které reagují na fotochemoterapii.
18. 18. Výrobek, vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu podle některého z nároků 1 až 13, nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl, spolu s alespoň jednou látkou napomáhající penetraci do povrchu, a popřípadě jednou nebo více chelatačními látkami, jako kombinovaný prostředek pro současné, oddělené nebo postupné použití při léčení φφ φ φφφ φ φ φ φφφφ φ φ ♦ φ φφφφφφφ φ · φ φ φ φφφφ φφ φφφφ φφ φφφφ

    52 onemocnění nebo abnormalit vnějších nebo vnitřních povrchů těla, které reagují na fotochemoterapii.
19. 19. Kit pro použití při fotochemoterapii onemocnění nebo abnormalit vnějších nebo vnitřních povrchů těla, vyznačující se tím, že obsahuje:

    (a) první nádobku obsahující sloučeninu podle některého z nároků 1 až 13, nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl, (b) druhou nádobku obsahující alespoň jednu látku napomáhající penetraci do povrchu; a popřípadě (c) jednu nebo více chelatačních látek obsažených buď v uvedené první nádobce, nebo ve třetí nádobce.
20. 20. Způsob diagnostiky abnormalit nebo onemocnění in vitro tetováním vzorku tělesné tekutiny nebo tkáně pacienta, vyznačující se tím, že zahrnuje alespoň následující kroky:

    (i) tělesná tekutina nebo tkáň se smísí se sloučeninou podle některého z nároků 1 až 13, (ii) tato směs se vystaví působení světla, (iii) zjistí se intenzita fluorescence, a (iv) intenzita fluorescence se porovná s intenzitami kontrol.