CZ2003208A3 - Deriváty lipofilních molekul s větveným řetězcem a jejich použití - Google Patents

Description

Předložený vynález se týká nových fosfoderivátů lipofilních molekul s větveným řetězcem, jejich farmaceutických prostředků a jejich použití při zvyšování propustnosti biologických bariér reversibilním a selektivním způsobem a při inhibici růstu nádoru.

Dosavadní stav techniky

Hlavním omezením použití mnoha terapeutických činidel léčiv je jejich nedostatečná schopnost přenosu přes biologické bariéry. Toto představuje vážný problém zvláště při léčbě nemocí a poruch v nedostupných místech centrální nervové soustavy (CNS).

Krevní bariéra mozku (BBB), vytvořená ze speciálních mikrovaskulárních endoteliálních buněk spojených pevnými vazbami, je normálně zodpovědná za udržování homeostatického prostředí mozku a jeho ochranu před toxickými činidly a degradačními produkty přítomnými v oběhovém systému. Nicméně v jistých patologických situacích může přítomnost BBB překážet přenosu léčebných látek do mozku a tím znemožňovat léčbu poranění centrálního nervového systému, včetně nádorů, infekcí, abscesů a degenerativních onemocnění.

Podobným způsobem přítomnost krevní bariéry nádoru (BTB) znemožňuje dodání chemoterapeutického činidla do nádoru, a tím snižuje biologickou dostupnost léčiva a zabraňuje tak účinnému terapeutickému efektu tam, kde je potřeba. Problém nedostatečného přenosu terapeutického činidla do obtížně přístupného místa je zvláště obtížný v případě nádorů CNS a pacienti mající maligní nádory mozku mají jen malé vyhlídky.

S cílem zasáhnout obtížně přístupná místa klinicky použitelnými koncentracemi určitých léčiv, je často vyžadováno podávat tyto sloučeniny ve vysokých systémových dávkách. Vysoké systémové koncentrace jsou pak na druhou stranu doprovázeny nepříznivými vedlejšími účinky a vysokou hladinou toxicity.

Jednou strategií řešení tohoto problému je změna důležitých biofyzikálních vlastností hydrofilních molekul léčiva například navázáním takového léčiva na lipofilní

nosič. Protože přenos přes biologickou membránu závisí na lipofilitě léčiva, vzrůstající lipofilní povaha sloučeniny může teoreticky vylepšit svou biologickou dostupnost a zvýšit tak svůj terapeutický účinek. Tyto kovalentní polární lipidické konjugáty s neurologicky aktivními léčebnými sloučeninami jsou popsány v US patentu 5 827 819 Yatvin et al.

Dále lze obejít nepropustnost BBB využitím činidel, která přechodně uvolní BBB a umožní tak vstoupit konkrétnímu léčivu nebo činidlu do mozku. U činidel jakými je manitol bylo objeveno, že uplatňují tento potřebný účinek a byly použity k dodání chemoterapeutického činidla k malignímu nádoru mozku (Heisinger et al.(1986), Annals of Neurology, 19:50-59). Nicméně použití tohoto druhu narušení hyperosmolárních BBB při terapii mozkových nádorů bylo sporné protože kromě toho, že léčivo prošlo BBB, byly také vpuštěny ostatní molekuly jako neurotoxiny. Tím lze vysvětlit vysoký výskyt mrtvice, záchvatů, imunologických reakcí a zrakové toxicity spojených s použitím způsobů osmotického uvolnění dané bariéry.

Byla uveřejněna řada dalších léčebných postupů se zvýšenou propustností krevní bariéry mozku včetně: použití antagonistů bradykininu (WO 91/16 355, Alkermes) a dalších peptidů (WO 92\18 529, Alkermes), použití fragmentů stěn bakteriálních buněk (WO 92/16 064, Rockefeller Univ.) nebo dalších protilátek od vláknitého hemaglutininu z Bordetella pertussis nebo mozkové endoteliální x-molekuly (WO 92/19 269, Rockefeller Univ.). U jistých mastných kyselin jako je například kyselina olejová bylo shledáno, že nevratně uvolňují BBB (Sztríha and Betz (1991), Brain Res. 336:257-262).

Byla uveřejněna prospěšnost způsobů nevratného uvolnění propustnosti krevní bariéry mozku před tím, než je podáno diagnostické činidlo (patent US 5 059 415, Oregon Health Sci. U.) nebo terapeutické činidlo (WO 89/11 299, Oregon Health Sci. U.).

Již dříve bylo uveřejněno v mezinárodní patentové přihlášce číslo WO 99/02 120, že mastné kyseliny s větveným řetězcem a jejich lipofilní deriváty jsou prospěšné při nevratném uvolnění biomembrán. Nicméně sloučeniny, které obsahují fosfátovou skupinu nebyly dosud uveřejněny. Navíc nebylo uveřejněno, že upravením mastných kyselin s větveným řetězcem tak, že je přidána fosfátová skupina, je možné pozměnit uvolnění biologických bariér specifickým a různým způsobem.

• · · · • · • · · ·

Doposud vyvinuté farmaceutické prostředky k permeabilizaci biologických membrán a bariér vyvolávaly řadu nežádoucích vedlejších účinků. Proto je neuspokojená potřeba poskytnutí účinných a bezpečných prostředků pro dodávku dostatečných množství terapeutických a diagnostických činidel do obtížně přístupných míst.

Byla navržena řada farmaceutických prostředků za účelem použití při léčbě různých rakovin, mezi nimiž jsou sloučeniny obsahující uhlovodíkový řetězec a fosfocholinovou skupinu. Oba patenty US 4 837 023 a 5 049 552, Eibl, uveřejňují farmaceutické prostředky a způsoby použité při léčbě rakoviny. Aktivním materiálem v těchto případech je známá látka hexadecylfosfocholin (HePC). Nicméně podle popisu v těchto patentech, ze všech testovaných látek má pouze HePC v podstatě prospěšné působení proti nádorům, kdežto homology s kratšími alkylovýmy radikály nemají žádný nebo značně nižší účinek proti nádorům a naopak homology s delšími alkylovýmy radikály byly příliš toxické. Dosavadní stav techniky ani neuveřejňuje, ani nenavrhuje žádnou ze sloučenin, které jsou podstatou věci předloženého vynálezu.

Podstata vynálezu

Předložený vynález poskytuje z jednoho hlediska sloučeninu obecného vzorce I, kde

R1 \

CH /

R2

O

R3-O-—P—O —Z₁

O— Z₂ (D

R1 a R2 jsou stejné nebo odlišné, nasycené nebo nenasycené alifatické řetězce obsahující od 2 do 30 atomů uhlíku, R3 je A-[CH₂]m-B-[CH2]n-C-[CH2]_p-D, kde m, n a p jsou každý nezávisle nula nebo celé číslo od 1 do 12 a A, B, C a D jsou každé nezávisle vybrány z těchto kovalentních vazeb amino, amido, oxy, thio, karbonyl, karboxyl,

oxykarboxyl, thiokarbonyl, fosfo, aminofosfo a z mono- di- a tri-aminofosfátové skupiny s podmínkou, že žádné dva kyslíkové atomy nejsou mezi sebou přímo vázány.

Zi a Z₂ jsou stejné nebo odlišné, z nichž každý může být vynechán nebo může být nezávisle vybrán z a) vodíku, sodíku, lithia, draslíku, amonia, mono-, di-, tri- a tetraalkylamonia nebo může b) být spojen s fosfátovou skupinou tvořící fosfoester glycerolu, cholinu, ethanolaminu, inositolu, šeřinu, mono- nebo oligosacharidu nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl.

V jednom z výhodných provedení je sloučenina obecného vzorce I a-větvená molekula mastné kyseliny, kde R1 a R2 jsou uhlovodíkové řetězce mající 3 a od 12 do 16 uhlíkových atomů.

Podle jiného provedení R3 sloučenin obecného vzorce I obsahuje mono- nebo diethylenglykolovou skupinu.

V současnosti vhodné sloučeniny podle předloženého vynálezu jsou:

4-hexadecyl-fosfát (3, 12-P0₄),

4-oktadecyl-fosfát (3,14- P0₄),

4-eikosanyl-fosfát (3,16- P0₄),

8-pentadecyl-fosfát (7,7- P0₄),

4-hexadekanoyloxyethyl-fosfát (3,12-MEG- P0₄),

2-(4'-hexadekanoyloxy)ethoxyethyl-fosfát (3,12-DEG- P0₄),

4-hexadekanyloxyethyl-fosfát (3,12-(ether)-MEG- P0₄),

2-(4'-hexadekanyloxy)ethoxyethyl-fosfát (3,12-(ether)-DEG- P0₄),

4-hexadekyl-fosfocholin (3,12-PC),

2-(4-hexadekanoyloxy)ethyl-fosfocholin (3,12-MEG-PC),

2-(4-hexadekanoyloxy)ethoxyethyl-fosfocholin (3,12-DEG-PC),

2-{2'-[10-(hexadekyl-4-oxy)dekyl-1-oxy]ethoxy}ethyl-fosfát (3,12-0-Ci₀-DEG- P0₄), 2-{2'-[10-(hexadekyl-4-oxy)dekyl-l-oxy]ethoxy}ethyl-fosfocholin (3,12-0-C₁₀-DEG-PC), 4-oktadekanoyloxyethyl-fosfát (3,14-MEG- P0₄),

2-(4 '-oktadekanoyloxy)ethoxyethyl-fosfát (3,14-DEG- P0₄), • · • · ·

4-oktadekanyloxyethyl-fosfát (3,14-(ether)-MEG- P0₄),

2-(4 '-oktadekanyloxy)ethoxyethyl-fosfát (3,14-(ether)-DEG- P0₄), 4-oktadekyl-fosfocholin (3,14-PC),

2-(4-oktadekanoyloxy)ethyl-fosfocholin (3,14-MEG-PC), 2-(4-oktadekanoyloxy)ethoxyethyl-fosfocholin (3,14-DEG-PC), 4-eikosanoyloxyethyl-fosfát (3,16-MEG- P0₄),

2-(4'-eikosanoyloxy)ethoxyethyl-fosfát (3,16-DEG- P0₄), 4-eikosanyloxyethyl-fosfát (3,i6-(ether)-MEG- P0₄), 2-(4'-eikosanyloxy)ethoxyethyl-fosfát (3,16-(ether)-DEG-P0₄), 4-eikosanyl-fosfocholin (3,16-PC),

2-(4-eikosanoyloxy)ethyl-fosfocholin (3,16-MEG-PC),

2-(4-eikosanoyloxy)ethoxyethyl-fosfocholin (3,16-DEG-PC),

10-(4'-hexadekanoyloxy)dekanyl-fosfát,

10-(8'-pentadekanoyloxy)dekanyl-fosfát,

2-[2'-(2-propyleikosanoyloxy)-ethoxy]ethyl-fosfát (3,18-DEG- P0₄) a 2-(2'- propyleikosanoyloxy)ethoxyethyl-fosfocholin (3,18-DEG-PC).

V současnosti jsou nejvíce výhodné:

2-(4'-hexadekanoyloxy)ethoxyethyldihydrogen-fosfát sodný 2-(4'-hexadekanoyloxy)ethoxyethylhydrogen-fosfát sodný 2-(4'-hexadekanyloxy)ethoxyethyl-fosfát,

2-(4-hexadekanoyloxy)ethyl-fosfocholin a

2-(4-hexadekanoyloxy)ethoxyethyl-fosfocholin.

Sloučeniny vynálezu jsou prospěšné při zvyšování propustnosti biologických bariér. Z tohoto hlediska vynález poskytuje farmaceutické prostředky obsahující účinné množství sloučeniny obecného vzorce I zobrazeného výše nebo její farmaceuticky přijatelné soli a farmaceuticky přijatelný nosič.

Farmaceutické prostředky vynálezu mohou dále obsahovat farmaceuticky účinné množství biologicky aktivního činidla.

V jednom z výhodných provedení je biologicky aktivním činidlem terapeutické činidlo. Terapeutická činidla mohou být vybrána, ale nejsou omezena na protinádorová, antivirová, antimikrobiální, fungicidní, protizánětlivá a neuroprotektivní činidla a na biologicky aktivní peptidy a proteiny.

V dalším výhodném provedení farmaceutické prostředky vynálezu dále obsahují diagnostické činidlo.

Farmaceutické prostředky jsou prospěšné pro usnadnění podávání biologicky aktivních molekul, například terapeutických a diagnostických činidel do tkání a orgánů zvláště do těžce přístupných míst, která jsou chráněna biologickými bariérami.

V dalším výhodném provedení jsou farmaceutické prostředky prospěšné při zvyšování dodávky léčiva přes krevní bariéru sítnice (BRB), krevní bariéru mozku (BBB) a krevní bariéru nádoru (BTB). Farmaceutické prostředky v souladu s vynálezem mohou být také prospěšné při zvyšování propustnosti dalších biologických bariér, jakými jsou například usnadněná absorpce skrz epitel kůže, rohovky, spojivky, skrz nosní, bronchiální, ústní, vaginální a gastrointestinální epitel a skrz krevní bariéru varlat a krevní mezifázi ledvin.

Farmaceutické prostředky mohou být podávány orálně, parenterálně nebo lokálně nebo pomocí regionální perfúze, klystýru nebo meziorgánovém výplachu. Výhodně jsou farmaceutické prostředky vynálezu podávány aplikací do tepny nebo intratekálně.

V dalším provedení poskytuje předložený vynález způsoby pro zvýšení propustnosti biologických bariér. Tyto způsoby obsahují vystavení zmíněných bariér účinným množstvím sloučeniny obecného vzorce I nebo jejím farmaceuticky přijatelným solím a tak umožňuje nebo zvyšuje propustnost biologické bariéry.

Dále předložený vynález poskytuje způsob podání biologicky aktivního činidla do těžce přístupného místa nebo orgánu, jež sestává z vystavení daného místa nebo orgánu výše zmíněnému biologicky aktivnímu činidlu v přítomnosti účinného množství • » • · sloučeniny tohoto vynálezu a tak umožňuje nebo zvyšuje pronikání a/nebo akumulaci biologicky aktivního činidla v těžce přístupném místě nebo orgánu.

Obtížně přístupné místo nebo orgán může být vybrán, ale není omezen na míchu, mozek, oko, varlata, žlázy a nádory.

Předložený vynález dále poskytuje způsob léčby nádoru, jež sestává z podání nemocnému pacientovi terapeuticky účinného množství farmaceutického prostředku, obsahujícího aktivní složku sloučeniny obecného vzorce I podle vynálezu. Zmíněný nádor může být vybrán, ale nemusí být tímto omezen na karcinom (např. karcinomy prsu, tračníku, konečníku a močového měchýře), gliom (např. astrocytom), neuroblastom, retinoblastom, nitrooční zhoubný nádor, lymfom, leukémii, sarkom a melanom. Nádorem může být primární nebo sekundární nádor.

Vynález dále poskytuje způsob léčby nemoci nebo poruchy centrálního nervového systému nemocného pacienta a to podáváním terapeuticky účinného množství farmaceutického prostředku sloučeniny obecného vzorce I nebo její farmaceuticky přijatelné soli v kombinaci s terapeutickým činidlem. Terapeutické činidlo může být obsaženo ve stejném farmaceutickém prostředku obsahujícím sloučeninu obecného vzorce I nebo v odděleném farmaceutickém prostředku.

Ve výhodném provedení je léčenou nemocí centrálního nervového systému nádor mozku a terapeutickým činidlem je protirakovinné léčivo. V jiném výhodném provedení je léčenou nemocí oftalmologická nemoc nebo porucha, například edem makulárních cystoidů (CME), makulární degenerace spojená s věkem (ARMD), nitrooční infekce, nitrooční zánět a nitrooční zhoubné nádory.

Předložený vynález poskytuje způsob zvýšení akumulace diagnostického činidla v orgánu, jež je chráněn biologickou bariérou sestávající z podání zmíněného diagnostického činidla v kombinaci s účinným množství sloučeniny obecného vzorce I danému individuu, čímž se zvyšuje akumulace diagnostického činidla v orgánu, který je chráněn biologickou bariérou. Diagnostické činidlo může být obsaženo ve stejném farmaceutickém prostředku obsahujícím sloučeninu obecného vzorce I nebo v odděleném farmaceutickém prostředku.

Ve výhodném provedení je zmíněný orgán chráněný biologickou bariérou centrální nervový systém.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 znázorňuje graf, který dává do vzájemného vztahu různou délku řetězců α-větvené mastné kyseliny typu 3,n s účinkem těchto sloučenin na extravazaci komplexu barviva „Evans blue“ a albuminu do krysího mozku.

Obrázek 2A-C znázorňuje akumulaci barviva „Evans blue“ v částech mozku krys majících bilaterální gliomy s následným unilaterálním podáváním sloučeniny v následujícím pořadí: 10 μΜ 3,12-DEG-HPO4Na (Obr. 2A), 40 μΜ 3,12-Na (Obr. 2B) nebo 25% manitolu (Obr.2C).

Obrázek 3A-C znázorňuje angografii sodné soli fluoresceinu (F-Na) v zadní části oka krysy zaznamenaném 30 sekund a 10 minut po podání samotného F-Na (Obr. 3A) nebo v kombinaci s 3,12-DEG-HPO₄Na (Obr. 3B) nebo nosiče (Obr. 3C).

Obrázek 4A-B znázorňuje akumulaci v přední části oka jak bylo zaznamenáno 10 minut po podání F-Na v kombinaci s 3,12-DEG-HPO₄Na (Obr. 4A) nebo nosiče (Obr. 4B) následující po postupu popsaném v příkladu 26.

Detailní popis vynálezu

Předložený vynález se týká sloučenin, farmaceutických prostředků a způsobů zvýšení propustnosti biologických bariér a inhibováním růstu nádoru.

Požadované činidlo pro usnadnění dodávky terapeutického nebo diagnostického činidla do těžce přístupného místa (např. mozku, oka, varlat atd.) je takové, které je schopné uvolnit zamezující biologickou bariéru. Nicméně požadované uvolnění musí být dokonalé ve specifitě způsobu bez vyvolání nepřijatelného stupně vedlejších účinků. Například v případě léčby mozkového nádoru je výhodné použít činidlo, které permeabilizuje BTB v daleko větším rozsahu než BBB v intaktních sousedních mozkových tkáních. Specifická permeabilizace v tomto případě umožňuje přednostní <- akumulaci toxických léčiv v patologické tkáni, ale způsobuje pouze minimální nebo žádné poškození okolní zdravé tkáně mozku. Podobné úvahy se vztahují pro další biologické bariéry. Například je žádoucí mít činidlo, které je schopné zvýšit dodávku • · · léčiva nebo jiných prospěšných molekul přes kožní a střevní bariéry vratným a specifickým způsobem.

Předložený vynález se týká nových sloučenin a je založen na novém zjištění, že tyto sloučeniny mohou zvyšovat propustnost biologických bariér reverzibilním a selektivním způsobem. Podle předloženého vynálezu jsou to nové sloučeniny obecného vzorce I, jak je výše definováno nebo jsou to jejich farmaceuticky přijatelné soli.

V přesném popisu sloučeniny obecného vzorce I budou společně nazývány jako „DP-BFAs“ nebo zaměnitelně obecným názvem fosfoderiváty lipofilních molekul s větveným řetězcem a zkráceně „P-BFA“. Lipofilní molekuly s větveným řetězcem nemající fosfátovou skupinu budou označovány jako „BFA“ nebo „karbo-BFA“.

V jednom z výhodných provedení jsou P-BFAs fosfoderiváty a-větvených lipofilních molekul obecné struktury R1(R2)-CH-. V jiném provedení podle předloženého vynálezu jsou P-BFAs fosfoderiváty větvených lipofilních molekul obecné struktury R1(R2)-CH-[CH₂]_m-, kde m je od 1 do 12 a tím se vztahuje k ω-větveným lipofilním molekulám, například v pozici β (m=1,), y (m=2) atd.

Specifické DP-BFAs budou zmiňovány v celém dokumentu pomocí charakteristických R1 a R2 popřípadě počtem atomů uhlíku na postranním a hlavním řetězci lipofilní molekuly s větveným řetězcem. Sloučeniny obecného vzorce I, kde je R3 monoethylenglykol nebo diethylenglykol budou zmiňovány jako R1, R2-MEG-PO₄ a R1, R2-DEG-PO₄. V některých případech je vazba spojující zbytek větveného řetězce a sousední chemické skupiny speciálně označena jako například v 3,12-O-Ci₀- DEG-PO4, 3,12-(ether)- DEG-PO4 atd.

Sloučeniny obecného vzorce I, kde Z-ι je cholin , budou zmiňovány jako R1.R2-PC.

V souladu s předloženým vynálezem je možné pomocí obměn různých součástí ve struktuře sloučenin obecného vzorce I dosáhnout zdokonalování ve stabilitě molekul a v jejich permeabilizačním účinku na biologické bariéry. Například obměnou počtu atomů uhlíku v alkylové skupině R1 a R2 a úrovně nasycení lze ovlivnit celkovou hydrofobicitu molekul, a to umožňuje optimalizaci její schopnosti prostupovat specifickými biologickými membránami.

V současnosti jsou výhodnými molekulami podle vynálezu DP-BFA molekuly, jejichž délka uhlíkového řetězce v R1 je od 2 do 14 a celkový počet atomů uhlíku v R2 a R3 dohromady je od 6 do 26. V současnosti jsou více výhodné sloučeniny s • · · ♦ α-větvenými řetězci sloučenin, kde R1 obsahuje 3 uhlíkové atomy a v R2 je od 12 do 16 atomů uhlíku.

Výhodné sloučeniny obecného vzorce I obsahují alifatický řetězec mající délku až 20 uhlíkových atomů počítaných od fosfátové skupiny k bodu větvení lipofilní molekuly s větveným řetězcem. Tento přibližný počet atomů uhlíku v R3 skupině obecného vzorce I, jak je definováno výše, je nejvhodnější pro účinnou perturbaci membrány pomocí molekuly DP-BFA, a tím i pro vyvolání žádaného permeabilizačního účinku. Stojí za povšimnutí, že výše zmíněný alifatický řetězec může být nepřerušovaný uhlovodíkový řetězec nebo může být přerušen jedním nebo více heteroatomy vybranými ze skupiny atomů kyslíku, síry, dusíku a fosforu, tak jak je zmíněno v definici R3.

V jednom z výhodných provedení tohoto vynálezu obsahuje R3 molekula obecného vzorce I karbonylovou skupinu spojující zbytek větveného řetězce s alespoň jednou glykolovou skupinou přes esterovou vazbu. V dalším z výhodných provedení obsahuje R3 kovalentní vazbu spojující zbytek větveného řetězce s alespoň jednou glykolovou skupinou přes etherovou vazbu.

Za fyziologických podmínek jsou etherové vazby všeobecně méně náchylné k enzymatickému štěpení a proto se očekává, že budou více stabilní než esterové vazby.

Dalším faktorem, který může ovlivnit schopnost sloučenin DP-BFA uvolňovat různé biologické bariéry je polarita různých chemických skupin v molekule. Toto se také podílí na vylepšení rozdílných permeabilizačních účinků.

Výhodné sloučeniny vynálezu jsou ve formě solí, které jsou buď jednomocné nebo dvojmocné soli daných sloučenin obecného vzorce I. Vhodné soli mohou obsahovat jakoukoli farmaceuticky přijatelnou sůl obsahující jednomocný nebo dvojmocný opačně nabitý iont, který může být vybrán ze skupiny, ale není na tuto skupinu omezen: Na⁺, Li⁺, K⁺, NH/, Ca⁺, Mg⁺, Mn⁺, mono-, di-, tri- a tetraalkylamonium. Výhodnější sloučeniny obsahují jednomocné soli. Zvláště výhodné jsou molekuly DP-BFA ve formě sodných solí, které jsou buď jednomocné nebo dvojmocné sodné soli.

Sloučeniny vynálezu mohou být připraveny pomocí způsobů chemické syntézy, které jsou v oboru známy. Některé z těchto způsobů jsou znázorněny v příkladech níže v tomto dokumentu. Mohou být použity také alternativní postupy, které jsou odborníkům známy.

• · · · • · • ·

Sloučeniny vynálezu byly shledány užitečnými při narušování pevných buněčných spojení in vitro a při zvyšování propustnosti biologických barier in vivo. Navíc je předložený vynález založen na nečekaném poznatku, že určité fosfoderiváty lipofilních molekul s větveným řetězcem mají rozdílné účinky na uvolnění BBB a BTB bariér. Dle toho různé P-BFA sloučeniny vynálezu mohou být použity při permeabilizaci biologických bariér a zároveň mohou vyvolávat minimální toxicitu a vedlejší účinky.

Některé DP-BFA sloučeniny jsou selektivní v tom smyslu, že jsou schopny rozdílně uvolňovat biologické bariéry pro molekuly různých velikostí. Tato charakteristika může být přisuzována vyšší hladině bezpečnosti fosfo-BFA činidel. Některé DP-BFAs se liší v trvání svého účinku, což se může osvědčit v dalších užitečných rysech za určitých terapeutických podmínek, kdy je žádána přechodná selektivní propustnost omezující bariéry.

Sloučeniny vynálezu a farmaceutické prostředky je obsahující mohou umožnit nebo usnadnit dodávku biologicky aktivního činidla přes biologické bariéry.

Výrazem „biologicky aktivní činidlo“ zahrnuje všechny přírodně se vyskytující i syntetické sloučeniny schopné vyvolat biologickou odpověď, mající účinek na biologický systém nebo sloučeniny sloužící jako indikační nástroje.

Terapeutická činidla mohou obsahovat, ale nejsou tímto omezena na protirakovinná, protiproliferační, protizánětlivá, neurologická, antibakteriální, antimykotická a antivirová činidla. Tyto sloučeniny v kombinaci se sloučeninami vynálezu jsou zvláště prospěšné při léčbě patologických stavů, nemocí a poruch v těžko dostupných místech, například při léčbě centrálního nervového systému a jeho poškození zahrnující nádory, infekce, abscesy a degenerativní poruchy.

Diagnostická činidla mohou obsahovat, ale nejsou tímto omezena na činidla na snímání, na kontrastní činidla a na barviva. Příklady diagnostických činidel zahrnují radioaktivně značené látky (např. činidla na bázi látek Technecium-99m a Fluorid-18) a kontrastní činidla, jakými jsou sloučeniny na bázi gadolinia. Sloučeniny vynálezu mohou být prospěšné například při způsobech diagnostiky a charakterizace mozkových poškození. V takovém případě sloučenina vynálezu použitá pro zvýšení BBB propustnosti, může být zavedena společně (buď v tom samém nebo odděleném farmaceutickém prostředku) s chemickým činidlem, které je značené takovým způsobem, že může být monitorováno.

• · · ·

Chemickým činidlem, které je monitorováno může být například obecný indikátor pro buňky mozku nebo struktury nebo je toto činidlo vázáno nebo speciálně akumulováno výhradně ve specifických oblastech poškození mozku.

Mozek pak může být analyzován tím, že je určeno značené činidlo. Analýza může být provedena s použitím skenovacích nebo snímacích prostředků, které jsou v oboru známy (např. techniky snímání magnetické rezonance (MRI), pozitron emisní tomografie (PET) a výpočetní tomografie (CT)).

V dalším z výhodných provedení vynálezu mohou být sloučeniny DP-BFA prospěšné pro vylepšení absorpce léčiva ve střevech nebo skrz kůži. Biologické bariéry ve střevech a kůži zabraňují pasivní difúzi řady sloučenin přes gastrointestinální nebo kožní epitel, a tím zabraňují účinné absorpci určitých chemikálií, živin a léčiv. Tato překážka může být překonána díky použití žádaných užitečných chemikálií, živin a léčiv v kombinaci s DP-BFA sloučeniny.

Odborníkům bude snadno zřejmý široký okruh biologicky aktivních sloučenin, které jsou vhodné pro použití společně s lipofilními molekulami s rozvětveným řetězcem obecného vzorce I, a tím jsou zahrnuty do rámce tohoto vynálezu jako sloučeniny prospěšné pro farmaceutické prostředky nebo způsoby léčby nebo stanovení diagnózy v souladu s tímto vynálezem. V souladu s vynálezem je sloučenina P-BFA podávána v kombinaci s užitečným biologicky aktivním činidlem. Mělo by být jasné, že prospěšné biologicky aktivní činidlo může být obsaženo ve stejném farmaceutickém prostředku sloučeniny obecného vzorce I nebo může být podáváno v odděleném farmaceutickém prostředku. Výhodně jsou obě aktivní činidla, tj. sloučenina obecného vzorce I a prospěšné biologicky aktivní činidlo, podávána současně nebo v rozmezí krátkého časového úseku. Biologicky aktivní činidlo může být podáváno před následným podáním sloučeniny P-BFA, za předpokladu že bude v takovém časovém rozmezí, ve kterém bude účinek P-BFA na biologickou bariéru dostatečný pro usnadnění průchodu důležitého činidla do obtížně přístupného místa.

Je také možné, že biologicky aktivní činidlo není podáno v přibližně stejném čase, kdy je podána P-BFA, ale je již přítomno v krvi (ať je již přirozeně tvořené v těle nebo je produkováno z léčiva postupným uvolňováním). Některé příklady obsahují biologicky aktivní peptidy a proteiny jako jsou neurotransmitery, růstové faktory, hormony, protilátky apod. V těchto případech je požadavkem, aby se permeabilizační účinek cílové bariéry vyskytoval dokud je přítomno dostatečné množství prospěšného biologicky aktivního činidla, aby byl uplatněn jeho biologický účinek.

• · · · • · · ·

Vylepšená aktivita sloučenin vynálezu při permeabilizaci biologických bariér rozhoduje o zvýšené biologické dostupnosti podávaného léčiva a tím rozšiřuje terapeutickou použitelnost těchto léčiv i při podmínkách, které nemají odezvu při nižších dávkách léčiv. Toto je značně důležité při léčbě nemocí a poruch v těžko přístupných místech, např. mozku a oku.

Kromě toho sloučeniny vynálezu jsou výhodnější vhledem k tomu, že umožňují snížit použitou dávku léčiva a následně jsou tak snižovány nežádoucí vedlejší účinky v systému. Navíc pokud molekuly vynálezu umožňují selektivní propustnost bariéry, mohou výhodně zvyšovat absorpci léčiva na specifické místo (např. nádor) a ne na okolní buňky a okolní tkáně.

Během zkoumání permeabilizačního účinku P-BFA in vivo u krys mající nádor bylo překvapivě zjištěno, že některé testované sloučeniny vykazují značné cytotoxické účinky na nádor, vyznačující se schopností podstatně inhibovat růst léčeného nádoru. Tím bylo prokázáno, že určité sloučeniny vynálezu vykazují rozdílnou cytotoxickou aktivitu, když byly testovány pro svůj účinek na různé normální a nádorové buňky in vitro.

V souladu s principy předloženého vynálezu různé DP-BFA molekuly mohou být specificky vyrobeny tak, aby vyhovovaly cílovým místům a specifickým indikacím. Například bylo objeveno, že se molekuly vynálezu chovají odlišným způsobem při uvolňování BBB a BTB bariér. V tomto případě propustnost BTB pomocí určité DP-BFA je daleko větší ve srovnání s propustností BBB. Dalšími výhodnými znaky tohoto účinku některých molekul DP-BFA je zachování určitých hladin rozlišovací schopnosti propustit pouze určité sloučeniny. Tím DP-BFA ovlivňují propustnost bariéry selektivnějším způsobem ve srovnání s karbo-BFA nebo ve srovnání s hyperosmotickými činidly jakými je např. manitol. Očekává se tedy, že P-BFA sloučeniny jsou příčinou méně toxických vedlejších účinků ve srovnání s ostatními permeabilizačními látkami, které jsou v oboru známy. Navíc bylo zjištěno, že permeabilizační účinek je reversibilní a proto mohou být sloučeniny vynálezu použity pro chronické podávání léčiv.

Jak bylo zmíněno v popisu a nárocích „účinné množství“ P-BFA je takové množství sloučeniny vynálezu, které se použije pro požadovaný prospěšný účinek v souladu s vynálezem. Podle jednoho z hledisek daného vynálezu je množství P-BFA takové, které podstatně zvýší propustnost důležité bariéry pro požadovanou molekulu.

• · · · u-j ·=..^:·.·^:

Jmenovitě množství P-BFA, které zvýší propustnost důležité bariéry a umožní dostatečnému množství požadované molekuly přejít přes biologickou bariéru a umožní tak působení jejího terapeutického a profylaktického účinku nebo umožní diagnostické postupy. Podle dalšího hlediska daného vynálezu je množství P-BFA takové, že je terapeuticky účinné jako protirakovinné činidlo. Jmenovitě, že je to takové množství PBFA, které inhibuje nekontrolovatelný buněčný růst.

Účinné množství je stanoveno na individuální bázi a je založeno na uvážení velikosti individua, specifické nemoci, závažnosti léčených symptomů atd. Tak může být ve stavu techniky odborníkem snadno zjištěno účinné množství využívající těchto charakteristik a sestávající z rutinního dělání pokusů.

Rozmezí dávky a užitá životospráva závisí na cestě podání, věku, pohlaví, zdraví a hmotnosti recipienta a na účinnosti určité DP-BFA a závažnosti použití podávaného léčiva nebo činidla . Odborník je schopen upravit DP-BFA farmaceutické prostředky a dávky tak, aby získal požadovanou délku a stupeň působení.

Farmaceutické prostředky mohou být v tekuté, aerosolové nebo pevné dávkové formě a mohou být sestaveny do jakékoli vhodné sestavy sestávající, ale ne omezené na roztoky, suspenze, micely, emulze, mikroemulze, aerosoly, masti, gely, čípky, kapsle, tablety atd. podle toho, co je vyžadováno pro daný způsob podání.

Jakákoli vhodná cesta podání je obsažena ve vynálezu a sestává, ale není omezena na podání orální, nitrožilní, nitrosvalové, podkožní, inhalační, intranasální, povrchové, rektální nebo pomocí jiné známé cesty. V jednom z výhodných provedení permeabilizačního účinku na CNS je farmaceutický prostředek vynálezu podáván intraarteriálně nebo intratekálně. Při jeho použití jako protirakovinného léčiva je příslušný farmaceutický prostředek vynálezu výhodně podáván orálně neboje aplikován do tepny nebo povrchově nebo pomocí regionální perfúze, klystýru nebo pomocí meziorgánového výplachu.

Vynález bude nyní popsán pomocí následujících příkladů, které jej však nijak neomezují.

<

• * « · · · • · · • · « ·· ··

Příklady provedení vynálezu

I. Chemické příklady

V zájmu srozumitelnosti jsou níže vysvětleny způsoby syntézy konkrétních molekul P-BFA a jejich solí. Nicméně je rozuměno, že lze také použít obdobné způsoby syntézy dalších molekul P-BFA tohoto vynálezu včetně nasycených a nenasycených molekul s větveným řetězcem a sloučenin, kde je R1 a/nebo R2 alifatický řetězec obsahující cyklickou alkylovou skupinu, které nejsou těmito příklady omezeny. Mohou být také získány různé farmaceuticky přijatelné soli molekul P-BFA a tyto pak zahrnují sodné soli, amonné soli, soli alkylamonia a soli dvojmocných opačně nabitých iontů.

Všechny vyrobené sloučeniny byly charakterizovány pomocí NMR, pomocí hmotnostní spektroskopie a pomocí kvantitativního rozboru prvků.

Příklad 1

Syntéza alkylfosfátů

Byly připraveny fosfáty obecného vzorce RO-P(O)(OH)2. R označuje větvený řetězec alkylové skupiny, která má strukturu Ri(R2)-CH, kde R1 označuje počet atomů uhlíku v hlavním alkylovém řetězci.

Syntéza molekul RO-P(O)(OH)₂ sestává ze tří kroků. V prvním kroku byl připraven odpovídající alkohol (R-OH) z aldehydu a alkylbromidu podle Grignardovy reakce (Vogel’s „Textbook of practical organic chemistry“, Wiley, New York, pg. 531, (1996)).

V druhém kroku byl připraven ester difenylfosfátu z alkoholu a chloridu difenylfosfátu:

ROH + CIP(O)(OC₆H₅)₂+ C₅H₅N RO-P(O)(OC₆H₆)2 + C₅H₅N.HCI

Ve třetím kroku byl získán alkanyldihydrogenfosfát hydrogenací difenylesteru.

• · 4 ·

RO-P(O)(OC₆H₆)2 + 2H₂—> RO-P(O)(OH)₂ + 2C₆H₆

4-hexadekanyldifenylfosfát.

Chlorid difenylfosfátu (4,0 g, 0,015 mol) byl při teplotě místnosti pomalu přidán do míchaného roztoku hexadekan-4-olu (2,4 g, 0,01 mol) v bezvodém pyridinu (5 ml). Baňka byla uzavřena a ponechána v klidu 48 hodin. Potom byl obsah přelit do ledové 1N kyseliny chlorovodíkové (100 ml). Těžký olej, který se oddělil, byl extrahován etherem. Etherová vrstva byla promyta 1N kyselinou chlorovodíkovou (3 krát),

5% hydrogenuhličitanem sodným (5 krát) a vodou (5 krát). Po vysušení (MgSO4), byl ether odstraněn a zbytek byl přečištěn sloupcovou chromatografií (ether s příměsí benzínu (teplota varu 30-60°C): ether, 10:1). Po odpaření rozpouštědla bylo získáno 3,5 g kapaliny. Výtěžek 74 %.

4-hexadekanylfosfát. (3.12-PO4)

Suspenze oxidu platičitý (Adamův katalyzátor) (0,32 g) v ledové kyselině octové (20 ml) byl třepán pod atmosférou vodíku dokud neproběhla absorpce. Oxid platičitý byl potom promyt 2N kyselinou chlorovodíkovou, vodou a nakonec ledovou kyselinou octovou pomocí dekantace. Roztok 4-hexadekanyldifenylfosfátu (3,2 g) v ledové kyselině octové (40 ml) byl přidán ke katalyzátoru a roztok byl třepán pod vodíkem dokud neproběhla absorpce. Katalyzátor byl zfiltrován a promyt chloroformem. Rozpouštědla byla z filtrátu odstraněna pomocí vakua. Zbytek byl krystalizován z etheru s příměsí benzínu (teplota varu 30-60 °C) a vysušen při 65 °C. Bylo získáno 2,01 g konečného produktu. Výtěžek 92 %.

4-hexadekanylfosfát sodný (3,12-PO4Na₂).

4-hexadekanylfosfát (1 g, 0,0031 mol) byl rozpuštěn v ethanolu (100 ml). Byl přidán NaOH (0,25 g, 0,0062 mol) a směs byla 1 hodinu míchána a potom odpařena.

Byl přidán ethanol (2x100 ml), který byl pak odpařen. Byl přidán ether (2x100 ml) a posléze byl odpařen. Zbytek byl krystalizován z acetonu (30 ml) a vysušen při 65 °C (15 mm Hg). Bylo získáno 0,9 g konečného produktu. Výtěžek 79 %.

¹H-NMR (CD₃OD): δ 0,89 (m, 6H), 1,27(s,22H), 1,58 (m,4H), 4,22 (m,1H).

MS (FAB): m/z 367,06 (M+H)⁺.

• · * « ··

4-hexadekanylhydrogenfosfát sodný (3,12-HPO₄Na)

4-hexadekanylfosfát (3,13 g, 0,0097 mol) byl rozpuštěn v ethanolu (150 ml). Bylo přidáno (0,37 g, 0,0092 mol) NaOH a směs byla míchána 48 hodin a potom odpařena. Byl přidán ethanol (2x150 ml) a byl posléze odpařen. Byl přidán ether (2x100 ml), který byl potom odpařen. Získaná pevná látka byla rozmělněna v acetonu (100 ml) a byla přes noc vysušena při tlaku 1 mm Hg. Bylo získáno 2,98 g konečného produktu. Výtěžek 87 %.

^tNMRCCDsOD): δ 0,87 (m, 6H), 1,25 (s, 22H), 1,51 (m, 4H), 4,12 (m, 1H). MS (FAB): m/z 345,11 (M + H)⁺. <'

4-oktadekanylfosfát sodný (3,14-PO₄Na₂) ^JH“NMR (CD₃OD): δ 0^89 (m, 6H), 1,27 (s, 26H),' 1,58 (m, 4H), 4,17 (m, 1H). MS (FAB): m/z 395>20 (M + H)⁺.

4-oktadekanylhydrogenfosfát sodný (3,14-HPO₄Na) ^-NMR (CD3OD): δ 0,90 (m, 6H), 1,28 (s, 26H), 1,56 (m, 4H), 4,14 (m, 1H). MS (FAB): m/z 373,29 (M + H)⁺. ' , .

8-pentadekanylfosfát sodný (7,7-PO₄Na₂) *H-NMR (CD₃OD): δ 0,90 (m, 6H), 1/0 (s, 20H), 1/0 (m, 4H), 4,12 (m, 1H). MS (FAB): m/z 352,93 (M + H)⁺.

8-pentadekanylhydrogenfosfát sodný (7,7-HPO₄Na) ^NMR (CD3OD): δ 0,90 (m, 6H), 1/0 (s, 20H), 1/0 (m, 4H), 4,12 (m, 1H). MS (FAB): m/z 353/5 (M + Na)⁴. / • · « « #♦ , · » # • · « ·

Příklad 2

Syntéza 2-(2’-propyltetradekanoyloxy)ethylfosfátu

Tato sloučenina byla připravena pomocí stejného postupu popsaného výše v příkladu 1 s využitím alkoholu: C₃H7-C(C₁₂H25)H-C(O)-O-CH2-CH2-O-. Tento alkohol byl získán z anhydridu chloridu kyseliny 2-propylpentanové a ethylenglykolu (Vogel’s „Textbook of practical organic chemistry“, Wiley, New York, pg. 698, (1996)).

2-(2’-propyltetradekanoyloxy)ethylfosfát sodný (3,12-MEG-PO₄Na₂)

Ή-NMR (CDCI₃): δ 0,87 (m, 6H), 1,24 (s, 22H), 1,54 (m, 4H), 2,33 (m, 1H).

3,87 (m, 2H), 4,26 (m, 2H). MS (FAB): m/z 439,19 (M + H)⁺.

2-(2’-propyltetradekanoyloxy)ethylhydrogenfosfát sodný (3,12-MEG-HPO₄Na)

Ή-NMR (CDCI₃): δ 0,87 (t, 6H), 1,24 (s, 20H), l/2(m, 2H), 1,56 (m, 2H), 2,34 (m, 1H). 4,02 (m, 2H), 4,28 (m, 2H). MS (FAB): m/z 417_Z19(M + H)⁺.

Příklad 3

Syntéza 2-[2’-(2”-propyltetradekanoyloxy)ethoxy]ethylfosfátu

Tato sloučenina byla připravena pomocí stejného postupu popsaného výše v příkladu 1 s využitím alkoholu: C₃H₇-C(Ci2H₂5)H-C(O)-O-CH2-CH2-O- CH₂-CH₂-O-. Tento alkohol byl získán z anhydridu chloridu kyseliny 2-propylpentanové a diethylenglykolu (Vogel’s „Textbook of practical organic chemistry“, Wiley, New York, pg. 698, (1996)).

2-[2’-(2”-propyltetradekanoyloxy)ethoxy]ethylfosfát sodný (3,12-DEG-PO₄Na₂) ^lH-NMR (CD₃OD):6 0,90 (m, 6H), 1,30 (s, 20H), 1,44 (m, 2H), 1,59 (m, 2H)

2/39 (m, 1H). 3,72 (m, 4H), 4,09 (m, 2H), 4,24 (m, 2H). MS (FAB): m/z 483,03 (M + H)⁺ • · · ·

2-[2’-(2”-propyltetradekanoyloxy)ethoxy]ethylhydrogenfosfát sodný (3,12-DEG-HPO₄Na) ^-NMR (CD₃OD):5 0,90 (m, 6H), 1,30 (s, 20H), 1/14 (m, 2H), 1,59 (m, 2H)

2,39 (m, 1H). 3,72 (m, 4H), 4,09 (m, 2H), 4,24 (m, 2H). MS (FAB): m/z 461,31 (M + H)⁺.

Ostatní sloučeniny byly připraveny podobným způsobem. Například sloučenina 2-[2’-(2”-propyleikosanoyloxy)-ethoxy]ethylfosfát byla připravena pomocí alkoholu: C₃H₇-C(Ci₈H₃₇)H-C(O)-O-CH2-CH₂-O- CH2-CH2-O-. Tento alkohol byl získán z anhydridu chloridu kyseliny 2-propyleikosanové a diethylenglykolu.

2-[2’-(2”-propyleikosanoyloxy)ethoxy]ethylhydrogenfosfát sodný (3,18-DEG-HPO₄Na) ^JH-NMR (CD₃OD):6 0,9Ó (m, 6H), 1,30 (s, 34H), 1/14 (m, 2H), 1,59 (m,

2,39 (m, 1H). 3,72 (m, 4H), 4,09 (m, 2H), 4,24 (m, 2H). MS (FAB): m/z 544,31 (M + H). ⁷

2H)

Příklad 4

Syntéza 2-{2’-[10”-(hexadecyl-4-oxy)decyl-1 -oxy]ethoxy}ethylhydrogenfosfátu sodného

Tato sloučenina byla připravena pomocí stejného postupu popsaného výše v příkladu 1 s využitím alkoholu: C₃H₇-C(Ci2H25)H-(0)-(CH2)io-0-CH₂-CH2-0- CH₂-CH₂OH-. Tento alkohol byl získán dvoustupňovou přípravou: nejdříve reagoval 4-hexadekanoltosylát (Vogel’s „Textbook of practical organic chemistry“, Wiley, New York, pg. 698, (1996)) s 1,10-dekandiolem sodným za tvorby 10-(hexadecyl-4-oxy)dekanolu. V druhém stupni byl připraven alkohol 2’-Γ 10”-(hexadecyl-4-oxy)decyl-ethyloxyethanol reakcí 10-(hexydecyl-4-oxy)dekanoltosylátu (vytvořený v prvním stupni) s 2-(2-hydroxyethoxyoxy)ethylátem .

¹H-NMR (CD3OD): δ 0,90 (m, 6H), 1,30(s,38H), 1,44 (m,2H), 1,59 (m,2H), 3,15 (m,

1H), 3,37 (m, 4H), 3,45-3,62 (6H), 3,95 (m, 2H). MS (FAB): m/z 565,45 (M+H)⁺.

a

Μ *·»· ··« · • ·*

Příklad 5

Syntéza 2(4-hexadekanoxy)ethoxyethylfosfátu

Tato sloučenina byla připravena pomocí stejného postupu popsaného výše v příkladu 1 s využitím alkoholu: C3H₇-C(Ci2H25)H-O-CH2-CH₂-O- CH₂-CH₂-O-. Tento alkohol byl získán z 2-(2-hydroxyethoxyoxy)ethylátu a 4-hexadekanoltosylátu (Vogel’s „Textbook of practical organic chemistry“, Wiley, New York, pg. 698, (1996)).

4-hexadekansulfonylchlorid

4-hexadekanol (12.29 g, 0,051 mol) a p-toluensulfonylchlorid (12 g, 0,063 mol) byly rozpuštěny v pyridinu (100 ml) a přes noc máchány při teplotě místnosti. Byl přidán dichlormethan (400 ml). Roztok dichlormethanu byl potom dobře promyt vodou, H₂SO4 (3%), vodou, NaHCCh (3%) a vodou a vysušen bezvodým síranem hořečnatým (10 g). Po odpaření rozpouštědla bylo získáno 20 g surového 4-hexadekansulfonylchloridu.

2(4-hexadekanoxy)ethoxyethansulfonylchlorid

Po malých kouscích byl přidán sodík (3,5 g, 0,15 mol) do diethylenglykolu (140 ml, 1,5 mol) při 60 °C. 4-hexadekanoltosylát (surový 20 g) byl rozpuštěn v THF (300 ml) při stejné teplotě. Roztok byl míchán pod refluxem po dobu 6 hodin. Při teplotě místnosti byla přidána voda (100 ml). Směs byla extrahována ethylacetátem (300 ml). Po odpaření rozpouštědla byl zbytek přečištěn pomocí sloupcové chromatografie (ether s příměsí benzínu, teplota varu 30-60 °C: ether, 1:1). Byly získány 4 g 2(4hexadekanoyl)ethoxyethylu. Výtěžek 24 % z počátečního 4-hexydekanolu.

2(4-hexadekanoxy)ethoxvethvlfosfát sodný (3.12-eter-DEG-POj-Nag) ^-NMR (CD₃OD): δ 0,9 (m, 6H), 1,28 (s; 22H), 1/13 (m, 4H), 3,30 (m, 1H),

3,60 (m, 4H), 3,69 (m, 2H), 4,07 (m, 2H). MS (FAB): m/z 455,45(M + H) .

·· 4··· ·* ···· »·Φ ··

Příklad 6

Syntéza 2-(2’-propyltetradekanoyloxy)ethoxyethylfosfocholinu

Fosfocholin obecného vzorce: C3H7-C(Ci2H25)H-C(O)-O-CH2-CH₂-O- CH₂-CH₂-O-PO'(O)-O-CH₂-CH₂N⁺(CH3)3 byl připraven následovně:

2-(2’-propyltetradekanoyloxy)ethoxyethylfosfocholin (3,12-DEG-PC)

K vychlazenému roztoku (0 °C) 2-(2’-propyltetradekanoyloxy)ethoxyethanolu (15,8 g, 0,044 mol) a triethylaminu (10 ml, 0,075 mol) ve vysušeném etheru (250 ml) byl přidán 2-chloro-2-oxo-1,3,2-dioxofosfolan (7 ml, 0,075 mol) v 200 ml vysušeného etheru. Směs byla míchána při teplotě místnosti 2 hodiny. Krystalický (C₂H₅)₃N.HCI, který byl vysrážen byl odfiltrován a rozpouštědlo bylo odstraněno pomocí vakua.

Zbytek byl rozpuštěn v 500 ml roztoku trimethylaminu (0,27M) v bezvodém acetonitrilu a pak byl přesunut do tlakové nádoby. V tlakové nádobě byl ponechán po dobu 48 hodin na olejové lázni při 60-65 °C. Potom byla nádoba ochlazena a otevřena. Rozpouštědlo bylo odstraněno a zbytek byl přečištěn pomocí sloupcové chromatografie (CHCI3:CH₃OH:H₂O, 1:9:1). Olej získaný po odpaření rozpouštědla byl lyofilizován během 72 hodin při 65 °C. Bylo získáno 17,4 g světle žlutého vosku. Výtěžek 75 %.

’Η-ΝΜΚ (CD₃OD): δ Q/> (t, 6H), 1/29 (s, 22H), 1/46 (m, 2H), 1,59 (m, 2H),

2-38 (m, 1H), 3,25 (S, 9H), 3,69 (m, 6H), 3,99 (m, 2H), 4,29 (m, 4H). MS (FAB): m/z 524,6 (M + H)⁺.

Následující sloučeniny byly získány analogickým výše zmíněným postupem.

2-(2’-propyleikosanoyloxy)ethoxyethylfosfocholin (3,18-DEG-PC)

Ή-NMR (CD₃OD): δ 0/9 (t, 6H), 1/29 (s, 34H), 1/16 (m, 2H), 1,59 (m, 2H), 2/38 (m, 1H), 3,25 (S, 9H), 3/69 (m, 6H), 3,99 (m, 2H), 4,29 (m, 4H). MS (FAB): m/z 608,6 (M + H)⁺.

• · ···· * · ···· • · · ♦ · · · • ·· · · ·· · ·· ·· ·· ··

2-{2’-[10”-(hexadecyl-4-oxy)decyl-1Oxy]ethoxy}ethylfosfocholin (3,12-O-Cio-DEG-PC) ^δ °'⁹ ft ^6H). fe 34H), 1/16 (m, 2H), 1,59 (m, 2H),

SF <· ·»>’ v’ <- '·«»

Příklad 7

Syntéza 2-(2’-propyltetradekanoyloxy)ethylfosfocholinu

Fosfocholin obecného vzorce: C₃H7-C(C₁₂H₂5)H-C(O)-O-CH₂-CH₂-O-PO'(O)-O-CH2-CH₂N⁺(CH₃)3 byl připraven stejným postupem jako v příkladu 6 kromě toho, že odpovídající alkohol, tj. 2-(2’-propyltetradekanoyloxy)ethanol byl použit místo 2-(2’-propyltetradekanoyloxy)ethoxyethanolu.

2-(2’-propyltetradekanoyloxy)ethylfosfocholin (3,12-MEG-PC) ^-NMR (CD₃OD): δ 0,9 (t, 6H), 1,29 (s, 22H), 1/6 (m, 2H), 1,59 (m, 2H),

2/9 (m, 1H), 3,24 (S, 9H), 3/6 (m, 2H), 4,07 (m, 2H), 4,28 (m, 4H). MS (FAB): m/z 480,7 (M + H)⁺.

Příklad 8

Syntéza alkylfosfocholinů

Sloučeniny fosfocholinu obecného vzorce: RO-PO'(O)-O-CH₂-CH₂N⁺(CH₃)₃ byly připraveny stejným postupem jako v příkladu 6 kromě toho, že byl v počátečním kroku jako alkohol použit R-OH. R znázorňuje větvený řetězec alkylů typu R₁-C(R₂)H.

4-hexadekanylfosfocholin (3,12-PC)

Ή-NMR (CD₃0D): δ 0,91 (t, 6H), 1,28 (s, 22H), 1/7 (m, 4H), 3,21 (S, 9H),

3/2 (m, 2H), 4,25 (m, 3H). MS (FAB): m/z 408/8 (Μ + H) .

• · · · · · · ··· e · • · · · · · ···· ····· ·· · · ·· · ·

4-oktadekanylfosfocholin (3,14-PC) 'H-NMR (CD₃OD): δ 0,9 (t, 6H), 1,28 (s, 26H), 1>57 (m, 4IT), 3/21 (S, 9H),

3,61 (m, 2H), 4,23 (m, 3H). MS (FAB): m/z 436,91 (M + H)\

8-pentadekanylfosfocholin (7,7-PC) 'H-NMR (CD3OD): δ 0,92 (t, 6H), 1,32 (s, 20H), 1,59 (m, 4H), 3,23 (S, 9H), 3/3 (m, 2H), 4,26 (m, 3H). MS (FAB): m/z 394,35 (M + H)⁺.

Příklad 9

Syntéza ω-větvených P-BFA ω-větvené P-BFA sloučeniny jsou připraveny stejným postupem jako v příkladu 1 a 6 s použitím odpovídajících ω-alkoholů. Příprava ω-větvených BFA je šestikroková syntéza. Výchozími činidly je 1-bromo-m-alkohol a n-alkyl-m-alkylketon. Prvním krokem je ochrana hydroxylové skupiny 1-bromo-m-alkoholu pomocí dihydropyranu (DPH) a dále následuje postup popsaný v Kocienski („Protectin Group“, Georg. Thieme Verlag Stuttgart, N-Y, pg. 83-84(1994)).

Krokl: Br(CH₂)_wOH + DHP Br(CH₂)_wOTHP

I II

THP označuje tetrahydropyranylether.

Druhý a třetí krok jsou standardní Grignardovy syntézy terciálních alkoholů (Vogel’s „Textbook of practical organic chemistry“, Wiley, New York, pg. 475, 538 (1996)).

·· ·· ···· ·· ····

Krok 2: Mg + Br(CH₂)_wOTHP -+ BrMg(CH₂)_wOTHP

III

Krok 3: BrMg(CH₂)_wOTHP + RR’-CO - RR’C(OH)-(CH₂)_wOTHP

IV

R,R’- označují alkylové skupiny.

Čtvrtým krokem je redukce terciální hydroxylové skupiny sloučeniny (IV) pomocí iontové hydrogenační reakce jak je popsáno v Carey and Tremper (JACS, v. 91, p. 2967, (1969)).

Krok 4: RR’C(OH)-(CH₂)_WOTHP + SiHEt₃ — RR’CH(CH₂)_WOTHP

V

Pátý krok je rozštěpení chránící skupiny získaného ω-větveného alkoholu (V) („Protectin Group“, Georg. Thieme Verlag Stuttgart, N-Y, pg. 83-84(1994)).

Poslední krok, krok 6, je oxidace ω-větveného alkoholu na odpovídající ω-větvené BFA. Toto je provedeno pomocí postupu popsaném v Manger and Lee (Tetraehedron letters, v.22, N. 18, p. 1655(1981)).

Krok 6:

RR’CH(CH₂)_wOTHP + [O] - RR’CH(CH₂)_WCOOH

II. Fyzikálně chemické vlastnosti:

Příklad 10

Měření lipofilicity DP-BFA in vitro

Hodnoty lipofilicity různých derivátů větvených mastných kyselin byly určeny pomocí srovnání rozpustnosti těchto sloučenin v organických a vodných roztocích. Oktanol a fyziologický roztok byly použity jako organické a vodné roztoky. Hodnota rozdělovacího koeficientu (P_c), tj. měření rozdělení oktanol/fyziologický roztok pomocí třepání v baňce. Výsledky, tj. mg/ml rozpustnost v oktanolu a vodě a vypočtený logP_c jsou ukázány v tabulce 1.

Tabulka 1: Koeficienty oktanol-fyziologický rozíok. (P_c)

Molekula *	oktanol mg/ml	voda mg/ml	LogPc
7,7	>50	>25	1,33.
3,12	>20	. . >10	0,99
3,14	>20	>10	í,26
.3,16	>20	¥	1,26
7,7-PO4	>10	>10	' <5
. 3,12-PO4	• <5	<2,5	1,9
3,14-PO4	>10	<0.5	1#11
3,12-MĚG-PO4	>10	. >10	1,09
3,12-DEG-PO4 .	>5	S	1,31
3,12-(eťher)-DEG-PO4	>5	>5	0,83
3,12-PC	>10	>10
3,12-MEG-PC	>10	>10	1,22 .
3,12-DEG-PC .	. >50	>10	0,73

* sodné soli větvených mastných kyselin a jejich PO₄ deriváty ····· · ··· · · • · · · · · · · · · · ··

Příklad 11

Strukturně funkční vztah

V této analýze byla stanoven vztah mezi fyzikálně chemickými vlastnostmi větvených řetězců molekul a jejich biologickými účinky. Analýza byla provedena s cílem zjistit, zda existuje vztah mezi délkou větveného řetězce molekuly a jejími účinky na krysí mozek nasycený barvivém “Evans blue“ (EB) (viz příklad 18 pro postup využitý k měření EC50 hodnot). Byly použity různé větvené mastné kyseliny 3,n typu, kdy jeden větvený řetězec sestává ze tří atomů uhlíku a druhý uhlovodíkový řetězec, n, má od 7 do 16 atomů uhlíku. Výsledky jsou graficky znázorněny na obrázku 1.

Jak je vidět na obrázku 1, BFA 3, 12, 3, 14 a 3, 16 byly shledány jako aktivní při permeabilizaci BBB. Při použitých experimentálních podmínkách byly mezi testovanými molekulami nejvíce účinné BFA-3,12.

III. Biologické příklady:

lll-a) In vitro analýza

Příklad 12

Srovnávací analýza toxicity in vitro

Různé DP-BFA molekuly byly prověřovány při kultivaci AA8 buněčné linie vaječníku „Chinese Hamster“ (CHO), aby byla určena jejich toxicita. Hodnoty LC50, tj. koncentrace způsobující smrt 50 % buněčné populace byly odečteny z křivek odezvy na danou dávku. Hodnoty LC₅₀ fosfo-BFA byly srovnány s odpovídajícími mastnými kyselinami s větveným řetězcem (=karbo-BFA).

Postup

Uvolnění laktát dehydrogenázy (LDH) bylo použito pro kvantitativní rozbor integrity buněčné membrány, a tím i pro stanovení toxicity. 96-komůrek (2x10⁵/ml) bylo • · · ♦ ···· · · ···· na destičce naočkováno (150 μΙ/komůrka) v médiu RPMI-1640 obsahujícím 10%FCS. Po dvou dnech byly na destičku přidány testované DP-BFA sloučeniny a kontrolní sloučenina kyselina myristová v klesajících koncentracích, které byly v rozmrzí mezi 500 až 1 μΙ/ml. Buňky byly sklizeny po jedné hodině. 45 minut před sklizením bylo do prvních šesti komůrek přidáno 16,5 μΙ lyzačního roztoku, aby se projevila kompletní lýze a bylo uvolněno maximum laktát dehydrogenázy, která je známkou buněčné smrti. Další kontroly zahrnovaly dvě komůrky se slepým vzorkem a pět komůrek obsahujících buňky bez žádných dalších činidel. Následovala centrifugace (1 500 otáček za minutu, minut), 75 μΙ supernatantu bylo přemístěno na novou destičku s 45 μΙ LDH směsi pro kvantitativní rozbor (Tox-7 kit, Sigma). Po 10 až 20 minutách při teplotě místnosti byla měřena absorbance pomocí zařízení „Elisa Reader“ 490 nm.

Data toxicity získaná po jedné hodině inkubace s různými DP-BFA jsou shrnuta v tabulce 2. Každý pokus byl proveden v trojím vyhotovení.

Tabulka 2: Toxicita BFA a jejich fosfoderivátů na buněčné kultury.

Testovaná sloučenina

7.7- Na

7.7- PO₄Na₂

3.12- Na

3.12- PO₄Na₂

3.12- DEG-PO₄Na₂

LCsojuM)

320

165

320

320

Obecně bylo pozorováno, že buňky jsou více citlivé vůči karbo-BFA a méně citlivé vůči testovaným fosfo-BFA derivátům. Netoxické dávky u karbo-BFA byly odhadnuty po 1 hodinové inkubaci mezi 30 až 100 μΜ. Za stejných podmínek byly netoxické dávky fosfo-BFA derivátů v rozmezí od 160 μΜ do více než 640 μΜ.

Závěr: Bylo shledáno, že fosfo-BFA jsou 2 krát až 5 krát méně toxické než odpovídající karbo-BFA molekuly.

• ····· · ··· · · • · · · · · ···· ····« · · ·· · · ··

Příklad 13

Účinek DP-BFA na spojení epiteliálních buněk

Účinek různých BFA derivátů na spojení buňka-buňka byl zkoumán s použitím buněčné linie lidského adenokarciomu (A431). Tyto buňky mají charakteristickou polarizovanou strukturu střevních buněk.

V této analýze byly zkoumány kvantitativní změny v subcelulární distribuci ZO2, proteinu asociovaným s těsným propojením komplexů (Anderson et al. (1993)) Current Opinion in Cell Biology 5:772-778).

A431 buňky kultivované v DMEM se sérem na proužcích pokrytým sklem, byly inkubovány 1 hodinu v přítomnosti nebo nepřítomnosti netoxických dávek DP-BFA. Buňky byly fixovány a permeabilizovány 2 minuty směsí 3% paraformaldehydu a 0,5% Tritonu-X-100 a potom dále fixovány 20 minut pomocí samotného 3% paraformaldehydu. Fixované buňky byly promyty a inkubovány 45 minut při teplotě místnosti s králičí polyklonní protilátkou ZO2 (Zymed Laboratories, Inc. USA), promyty 3 krát PBS a inkubovány 45 minut společně s fluorescenčně značenou sekundární protilátkou v elvanolu (Mowiol 4-88, Hoechst, Frankfurt, Germany) před tím, než byly sledovány v mikroskopu. Bylo sledováno rozmístění imuno-fluorescentně značeného proteinu ZO2.

A431 buňky, které byly inkubovány 1 hodinu v pervandátu, který inhibuje fosfotyrosin fosfatázu a proto porušuje spojení buněk, byly použity jako pozitivní kontrola.

Fluorescentní snímání ZO₂ ukázalo, že DP-BFA má zřetelný účinek na porušení těsných propojení A431 buněk.

Příklad 14

Účinek DP-BFA na propustnost jednoduché vrstvy epiteliálních buněk

Cílem této analýzy bylo určení kinetiky a celkového účinku DP-BFA sloučeniny na úpravu propustnosti jednoduché vrstvy epiteliálních buněk, která slouží jako in vitro model biologických bariér a zejména střevní bariéry.

Pro určení účinku DP-BFA na propustnost biologických bariér byly zvoleny dva přístupy. Jedním přístupem bylo sledování transportu radioaktivně značené sloučeniny přes jednoduchou vrstvu epiteliálních buněk. Druhým přístupem bylo monitorování změn v elektrickém odporu, jehož měření značilo hladinu propustnosti vrstvy buněk.

Epiteiiální buňky byly kultivovány na membránovém filtru (0,4 mikron, 1 cm²). Membrána s jednoduchou vrstvou epiteliálních buněk byla umístěna mezi dvě části, komoru donorovou a akceptorovou. Testovaná P-BFA sloučenina o předem určené netoxické koncentraci a ¹⁴C- sacharózový radioaktivní izotopový indikátor (1 Ci v 0,5 ml pufru) byl přidán na apikální (donorovou) stranu. Vzorky, každý o objemu 0,5 ml, byly odebírány na akceptorové straně v desetiminutových intervalech celkového času trvání pokusu 90 minut. Inkubace byla provedena v médiu tkáňové kultury obsahující 1 % FCS při třepání 70 otáček za minutu. Při každém odběru vzorků byla apikální komora a membrána přenesena do nové akceptorové komory. To bylo prováděno proto, aby byla udržována konstantní koncentrace izotopového indikátoru v apikální komoře a neměnné objemy kapaliny v obou komorách. Koncentrace radioaktivní izotopové látky v odebraných vzorcích byla vyhodnocena pomocí zařízení „Trilux microbeta counter“ (Wallac, Finland). Poměr přenosu radioaktivního izotopového indikátoru byl vypočten a vyjádřen jako koeficient propustnosti.

Integrita jednoduché vrstvy epiteliálních buněk použitých v pokusu byla monitorována na začátku a na konci inkubace pomocí měření transepiteliálního elektrického odporu (TEER) pomocí „millicell - ERC“ (Millipore).

Paralerní sada pokusů byla provedena s využitím stejného experimentálního systému, který byl popsán výše, ale bez přidání radioaktivního izotopového indikátoru. Transepiteliální elektrický odpor (TEER) byl monitorován každých deset minut během celkové doby 90 minut.

Závěr: fakt, že i) P-BFA významně zvyšují průchod sacharózy přes jednoduchou vrstvu epiteliálních buněk a ii) snižují TEER jednoduché vrstvy epiteliálních buněk podporuje závěr, že P-BFA sloučeniny uvolňují biologické bariéry.

• · · ·

Příklad 15

Cytotoxická aktivita různých fosfoderivátů mastných kyselin s větveným řetězcem (DP-BFA) na normální a maligní typ buněk

Cytotoxická aktivita různých fosfoderivátů mastných kyselin s větveným řetězcem (DP-BFA) byla zkoumána in vitro v buněčných kulturách, které obsahuji normální a maligní typ buněk. Byly použity následující buněčné systémy;

Primární fibroblasty (lidské)

Normální buňky kostní dřeně (myší)

Primární bronchiální epiteliální buňky (lidské, od Clonetics, cat. no. CC-2541) Caco-2-buněčná linie rakoviny tračníku (lidské, ATTC, HTB-37)

C6 buněčná linie gliomu (krysí, ATCC, CRL-2199)

Neuro2a buněčná linie neuroblastomu (myší, ATCC, CCL-131)

SKBR-3 buněčná linie rakoviny prsu (lidská, ATTC, HTB-30)

HL60 buněčná linie myeloidní leukémie (lidská, ATCC, CCL-240)

U937 buněčná linie myeloidní leukémie (lidská).

Buňky byly umístněny na mikrotitrační destičku v MEM obsahující 2 mM L-glutaminu, 100 jednotek/ml penicilinu, 100 μΙ/ml streptomycinu a 10%FCS při teplotě 37 °C. Jak je ukázáno kultivované buňky byly inkubovány během své lineární růstové fáze v nepřítomnosti (kontrolní skupina) nebo přítomnosti různých DP-BFA. Konečná koncentrace testovaných DP-BFA byla v rozmezí od 1,5 do 200 μΜ. Na konci inkubační doby, která byla 5 dní pro buňky kostní dřeně a 3 dny pro ostatní buněčné linie, byl vyhodnocen cytotoxický účinek přidaných DP-BFA vůči buňkám pomocí kalorimetrického MTT kvantitativního rozboru. MTT kvantitativní rozbor (Mosmann (1983) J. Immunol. Methods 65:55-63) měří aktivitu mitochondriální reduktázy a slouží ke kvantitativnímu stanovení buněčné životaschopnosti. Koncentrace léčiva, která způsobuje 50% snížení buněčné životaschopnosti v porovnání s kontrolní skupinou je definována jako EC50. Hodnoty EC50 testovaných DP-BFA sloučenin byly vyčísleny z křivek odezvy na dávku, vyhotovených pro každou ze zkoumaných buněčných linií. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 3. Každá EC50 hodnota je průměrem hodnot EC50 získaných z 1 až 5 nezávislých pokusů.

• ·

Jak je vidět z výsledků v tabulce 3, různé DP-BFA molekuly byly různě aktivní ve svém cytotoxickém účinku vůči různým buňkám. Mezi testovanými sloučeninami byly nejůčinnějšími cytotoxickými činidly vůči maligním buňkám 3,12-DEG-PO₄,

3.12- (ether)-DEG-PO₄, 3,12-MEG-PC, 3,12-DEG-PC, 3,18-DEG-PC a 3,14-DEG-PC. Dvě z těchto sloučenin 3,12-DEG-PO₄ a 3,12-(ether)-DEG-PO₄ měly nejnižší cytotoxickou aktivitu vůči normálním epiteliálním buňkám. Další sloučenina

3.12- DEG-PC měla nejnižší cytotoxickou aktivitu vůči normálním fibroblastům a normálním buňkám kostní dřeně.

Tabulka 3: Toxicita DP-BFA vůči různým buněčným liniím

Buněčná linie	Caco-2	C6 glionia'	Neuro2a	SKBR	HL60	U937	Normální INormáln primární kOstní fibroblastyfdřeň	Mormální ximární SDitel
Sloučenina	EC50 (μΜ)
3,12-Na	100		76	130		68
3,12- PO4-Na2	>200		105	>200		90
3,12-MEG- POzjNaa	>200		60	>200		.75
3,12-DEG- P04Ha2	40	38	58	60		25	65	62	>200
3,12-(ether)- DEG-PO4Na2	47	40	37 '	58		10	65	68	>200
3,12-PC	150			62	47
3,12-MEG-PC	75		70	50	20	9	. 160	95	94
3,12-DEG-PC	113	95	134	40	11	6	170	166	90
3,18-DEG-PC					13	6		80	60
3,14-PC					7	4		160	72

Závěr: Fosfo-BFA sloučeniny vykazují cytotoxický účinek v závislosti na buněčném typu. Některé z těchto sloučenin byly shledány jako nejúčinnější cytotoxická činidla, pokud byly testovány na maligních buněčných liniích a zároveň vykazovaly mnohem nižší toxicitu, když byly testovány na normálních buňkách z různých buněčných tkání.

Tato data naznačují, že tyto sloučeniny mohou být účinnými protirakovinnými činidly s malými vedlejšími účinky.

Příklad 16

3,12-DEG-PC indukuje aktivaci kaspázy-3 a fragmentaci DNA v buněčné linii neuroblastomu.

Aby byl dále prozkoumán možný mechanismus způsobující cytotoxického účinek různých použitých DP-BFA, byly zkoumány dva stanovené indikátory apoptózy, kaspáza-3 a fragmentace DNA (Lincz (1998) Immunol. Cell Biol. 76:1-19). Buňky neuroblastomu Neuro2a (ATCC, CCL-131) byly umístěny do MEM obsahujícího 2mM L-glutaminu, 100 jednotek/ml penicilinu, 100 μΙ/mi streptomycinu a 10%FCS při teplotě 37 °C. Po 24 hodinách, když byly buňky v logaritmické fázi růstu PC byl přidán

3,12-DEG v celkové koncentraci 25 μΜ, 50 μΜ nebo 100 μΜ. Buňky pěstované pouze v přítomnosti nosiče sloužily jako kontrolní skupina.

Kvantitativní rozbory aktivity kaspázy-3 a fragmentace DNA byly provedeny na buněčných lyzátech získaných po 6 popřípadě 24 hodinách inkubace s léčivem. Kaspáza-3 byla zkoumána s využitím fluorogenního substrátu Ac-DEVD-AMC (Pharmingen, Becton Dickinson, cat.no.66081U) dle instrukcí výrobce.

Výsledky jsou shrnuty v tabulce 4. Měřená aktivita kaspázy je vyjádřena jako procenta aktivity na kontrolních destičkách normalizovaných na množství proteinu. Fragmentace DNA byla vyčíslena pomocí „Cell Death Detection Elisa plus kiť (Roche, cat. no. 1774 425) podle instrukcí výrobce.

Tabulka 4: Indikátory apoptózy v buňkách Neuro2a ošetřených 3,12-DEG-PC

Přidané léčivo	Aktivita kaspázy (% z kontroly)	Fragmentace DNA (OD405 nm)
kontrola	100%	0,030
3,12-DEGÁPC, 25 μΜ	210%	0,036
3,12-DEG-PC, 50 μΜ	540%	0,153
3,12-DEG-PC, 100 μΜ	-	0,389

Jak je zřejmé z výsledků v tabulce 4, inkubace buněk Neuro2a se sloučeninou

3,12-DEG-PC zapříčinila 5 krát výšší aktivitu kaspázy-3 a významný nárůst ve fragmentaci DNA. Obdobné výsledky byly získány, když byla sloučenina testována v jiné maligní buněčné linii, caco-2, získané z karciomu tračníku.

Závěr: Apoptóza může být možným mechanismem využívajícím cytotoxický účinek fosfocholinových derivátů BFA v určitých maligních buňkách.

lil-b) In vivo analýzy

Příklad 17

In vivo modelový systém pro měření účinku DP-BFA na propustnost BBB

Propustnost BBB pomocí DP-BFA byla zkoumána na krysím modelovém systému pomocí sledování akumulace dvou indikátorů v mozku: a) barviva „Evans blue“ (EB), které se in vivo rychle váže s albuminem (molámí hmotnost 70 kDa) a je indikátorem paracelulámího transportu a b) sodné soli fluoresceinu (F-Na), molámí • · · hmotnost 376 D, který je transportován přes celulární prostor a umožňuje sledování transcelulárního transportu. Po narušení BBB se „Evans blue“ barvivo-albumin komplex shromažďuje v intercelulárním prostoru mozku. Podstatně menší izotopový indikátor fluorescein může být intracelulárně transportován a obsazuje jak intertak intracelulární prostor v mozku.

Propustnost krevní bariéry mozku u „Sprague-Dawley“ krys byla indukována pomocí krátké expozice DP-BFA. Zvířata byla umrtvena pomocí rampun-imalgenu a testovaná DP-BFA sloučenina byla podána přes artery carotis externa zpětným tokem do mozku (Smith, Q.R. Methods of study. ln:Physiology and Pharmacology of the Blood-Brain Barrier. Ed. Bradbury M.W.B. Spinger-Verlag. Berlin - Heideberg - NZ, 2452). Artery pterygopalathina byla podvázána, aby se zabránilo úniku infuzí podávaných roztoků do vnějšího cévního uspořádání hlavy. DP-BFA roztoky byly podávány infuzí během 30 sekund nebo půl hodiny pomocí „Harvard Apparaturs Syringe Pump“. Tok krve přes artery carotis communis byl přerušen pouze během infúze.

Všechny testované DP-BFA molekuly byly připraveny zředěním zásobních vodných nebo ethanolových roztoků 200 až 1 000 krát v roztoku izotonického manitolu (5 %), v pufru tromethaminu (Sigma) nebo PBS (pH 7,4).

Indikátory barvivo „Evans blue“ (EB, 25 mg/ml) a fluorescein (F-Na, 12,5 mg/ml) v 1 ml roztoku, byly injektovány nitrožilně ihned po podání testované DP-BFA nebo po určitém časovém intervalu pokud byla zkoumána reverzibilita děje. Po 8 minutách byla provedena podpůrná infúze F-Na (12,5 mg/ml až 100 pg/min). Mozky byly promyty solným roztokem (60 ml) 10 minut potom, co byla puštěna vnitřní tepna. Mozkové ipsilaterální a kontralaterální hemisféry a nádory byly homogenizovány odděleně s 50% kyselinou trichloroctovou (TCA). Koncentrace indikátorů v kůře a v nádorech byla určena spektrofluorometricky (Uyana, O. et al., (1996) Neurosci. Lett. 208, 85-88). Množství indikátorů bylo vyčísleno jako pg indikátoru na jeden gram mozkové tkáně.

Pro statistickou hodnotu byl použit test určující standardní chybu a Studentův test.

·· · · » · · · ·· ···· • ····· · · · · · · • · · · · · ····

999 99 99 99 99 9 9

Příklad 18

Účinek mastných kyselin s větveným řetězcem různých délek na propustnost BBB

V prvním kroku této analýzy byl testován účinek molekul BFA s různě dlouhými řetězci na propustnost krevní bariéry mozku (BBB).

Pokus byl proveden na „Sprague-Dawley“ krysích samcích vážících 250 až 320 g. Bylo postupováno podle postupu, který je popsaný v příkladu 17.

Účinek testovaných sloučenin na uvolnění BBB byl vyhodnocen pomocí dvou parametrů:

a) účinnosti - stupně uvolnění BBB vyhodnoceným z hlediska akumulace komplexu „Evans blue“ barvivo-albumin (pg EB/g mozkové tkáně).

b) síly - měřené z hlediska hodnot EC₅₀ a minimální účinné koncentrace (MEC). EC50 je koncentrace testované sloučeniny produkující 50 % maximálního účinku extravazace barviva „Evans blue“. MEC je definována jako koncentrace, která umožňuje akumulaci třikrát většího množství barviva „Evans blue“, než jeho množství akumulovaného u kontrolních zvířat, v tomto případě bylo celkové množství 3 pg EB/g mozku. Čím menší jsou hodnoty EC50 a MEC, tím vyšší je síla testované sloučeniny.

Výsledky vyhodnocení účinků různých DP-BFA na BBB propustnost jsou shrnuty v tabulce 5.

• ·· · · ··«· ·· ···· • · · · ·· · · · · • · · ··· · · · • ···«· * · · · · · • · ···· ···· • · · · 4 ·· ·· ·· ··

Tabulka 5: Účinky mastných kyselin s větveným řetězcem na propustnost BBB

Molekula	EC50 QiM)	MEC	pg EB/g mozku (při EC50)
3,7-Na	>450	-	0,8
3,10-Na	-700	-	0,8
3,12-Na	20 ±3	6,5 ±0,7	32 ±4
3,14-Na	40±5	9,1 ± 1,2	16,5 ± 2,5
3,16-Na	137 ±17	18±2.	34 ±5
7,7-Na	184 ±21	132 ± 19	4,2 ±0,6

Jak lze vidět z výsledků v tabulce 5, existuje značné kolísání ve stupni extravazace barviva „Evans blue“ v závislosti na délce řetězce DP-BFA. Molekuly s nejkratším řetězcem jsou téměř kompletně neúčinné v tomto modelovém systému. Molekuly s nejvyšší účinností byly 3,12-Na a 3,16-Na, každá vyvolávající akumulaci více než 30 pg EB/g mozku. V použitém pokusném systému je nejúčinnějším permeabilizačním činidlem 3,12-Na, které má nejnižší hodnoty EC50 a MEC mezi testovanými sloučeninami.

Závěr: Za použitých podmínek v pokusném systému bylo zjištěno, že BFA

3,12-Na nejvíce zlepšuje účinnost propustnosti z hlediska jak síly tak účinnosti. Proto DP-BFA deriváty založené na 3,12-Na byly dále podrobněji zkoumány.

Příklad 19

Účinek různých DP-BFA na propustnost BBB

Účinek různých DP-BFA na propustnost BBB byl testován na modelovém systému krysích mozků tak, jak bylo popsáno v příkladu 17. Účinnost, zvláště hladina • a a • · · ·

uvolnění BBB, byla vyjádřena jako množství barviva „Evans biue“ akumulovaného v mozku (pg EB/g mozku). Síla testovaných molekul byla stanovena pomocí jejich vypočtených EC50 a z hodnot minimální účinné koncentrace (MEC).

Tabulka 6: Účinek různých DP-BFA na propustnost BBB (v krysích mozcích)

Molekula	EC50 (pM)	MEC	pg EB/g mozku (při EC50)
3,12-PO4-Ňa2	55 ±1	3,3 ± 0,5	20 ± 3
3,14-HPO4-Na	67±11	6,2 ±0,9	10 ±1
7,7-HPO4-Na	150	-	1
3,12-MEG-PO4Na2	18 ±3	11±2	5 ±1
3,12-DEG-PO4Na2	20 ±2	3,3 ±0,5	18 ±3
3,12-(ether)-DEG-PO4Na2	54 ±5	7,3 ± 1,4	26 ± 5,2
3,12-PC	76 ± 14	23 ± 4	10 ±1
3,12-MEG-PC	19,5 ± 1/5	. 10 ± 1	15±2
. 3,12-DEG-PC	70 ± 12.	15 ± 2	14±2
Manitol	25%	-	10±2

Jak je vidět v tabulce 6, různé DP-BFA molekuly podporují přenos albuminu, který je navázán na barvivo „Evans blue“, přes BBB. Testované sloučeniny se liší ve své síle a účinnosti.

Při experimentálních podmínkách byla z derivátů 3,12-BFA nejvíce účinná sloučenina 3,12-DEG-PO₄Na₂, mající hodnotu EC₅o=2O μΜ a minimální účinnou koncentraci (MEC) 3,3 μΜ. Nejvíce účinné sloučeniny při zvyšování propustnosti byly

3,12-(ether)-DEG-PO₄Na₂, 3,12-PO₄Na₂, 3,12-DEG-PO₄Na₂. Hladiny akumulace barviva „Evans blue“ v krysím mozku po ošetření sloučeninami 3,12-(ether)-DEG-PO₄Na₂, 3,12-PO₄Na₂ a 3,12-DEG-PO₄Na₂ v koncentraci EC₅₀ byly 26, 20 a 18 pg EB/g mozku.

a « * « »·l < ·* ··* « • ··>**» · · · » · · • » ·«·· · · · • ·· «« «· ·· ·· *·

Příklad 20

Vliv DP-BFA na transport „Evans blue“ barvivo barviva s navázaným albumunem a fluoresceinem přes BBB

Vliv DP-BFA na propustnost BBB vůči různě velkým molekulám byla zkoumána in vivo na modelovém systému normálních krysích mozků.

Přenos dvou indikátorů byl následující: a) barvivo „Evans blue“ navázané na albumin (molekulární hmotnost 70 kD), jako indikátor paracelulárního přenosu a

c) sodná sůl fluoresceinu (molekulární hmotnost), která reprezentuje molekuly o malých velikostech.

„Evans blue“ barvivo (EB) a sodná sůl fluoresceinu (F-Na) byly infuzí podány do artery carotis externa během 30 sekund podle postupu popsaném výše v příkladu 17. Testované sloučeniny byly použity v EC₅o koncentracích. Kontrolní zvířata byla ošetřena pouze roztokem s nosičem.

Extravazace barviva „Evans blue“ je vyjádřena jako procento celkového množství EB, které se akumulovalo v jednom gramu mozkové tkáně. Přenos fluoresceinu do mozku, který závisí na koncentraci této molekuly v séru, je vyjádřen jako procento hladiny F-Na v séru.

Poměr akumulace F-Na a EB v mozku byl vyhodnocen a výsledky jsou shrnuty v tabulce 7.

·· ♦»»«

Tabulka 7: Vliv různých DP-BFA na propustnost BBB vůči EB-albuminu a fluoresceinu.

Molekula	% F-Na/ g mozek	% EB/ g mozek	Poměr * F-Na/EB
Kontrola	0 3 ±0,08	0,04 ±0,01	9,5 ± 1,6
Manitol - 25%	2,4 ± 0,4	0,6 ±0,21	• 4/) ± 0,5
3,14-Na	3,8 ± 0,5	0,8 ±0,07	4,7 ±1,7
. 3,12-Na .	6,4 ± 1,1	1,8 ±0,2	4,9 ±0,9
3,12-PO4-Na2	8,2 ± 0,9	2/9 ± 0,6	5/9 ±1,0
3,12-MEG-P04-Na2	5,0 ±0,8	0,8 ±0,1	8/t ± 0,9
3,12-DEG-PO4-Na2	9,0 ± 1,4	1,4 ±0,2	9,0 ±1,2
3,12-(ether)-DEG-PO4Na2	4,4 ±0,9	4 ± 0,8	1,1 ± 0,2
3,12-PC	3,0 ± 0,5	0,8 ±0,1	7,8 ± 1,3
3,12-MEG-PC	5,2 ±0,8	0,9. ± 0,2	6,9 ± 0,1
3,12-DEG-PC	2,9 ±0,5	0,6 ±0,1	6,8 ± 0,8

• průměr jednotlivých poměrů

Jak lze vidět z tabulky 7, normální BBB (= kontrola) je téměř 10 krát více propustná vůči fluoresceinu než vůči komplexu EB-albumin. Hyperosmoticky permeabilizující látka, manitol, zvýšila propustnost vůči EB ve větším míře, než vůči F-Na (F-Na/EB poměr se rovná 4). Obdobně testované mastné kyseliny s větveným řetězcem 3,14-Na a

3,12- Na poskytly poměry F-Na/EB 4,7 popřípadě 4,9.

Různé fosfoderiváty BFA ovlivňují propustnost BBB vůči zmíněným dvěma indikátorům různým způsobem. Bylo zjištěno, že 3,12-PO4 zvyšuje propustnost BBB vůči komplexu EB-albumin 1,5 krát více ve srovnání se zvýšením propustností vůči • · ·

I fluoresceinu. Na druhou stranu bylo zjištěno, že látka 3,12-DEG-PO₄ zvýšila propustnost BBB více fyziologickým způsobem, tj. zvýšil se transport F-Na stejně jako extravazace EB. Poměr F-Na/EB v krysích mozcích po vystavení 3,12-DEG-PO₄ byl okolo 9.

Závěr: Různé DP-BFA sloučeniny ovlivňují propustnost BBB různými způsoby. Některé DP-BFA, tj. 3,12-DEG-PO₄ a 3,12-PO₄ (odpovídající poměry F-Na/EB 1,1 a 5,9) indukovaly selektivní uvolnění BBB, které napomáhalo transportu velkých molekul oproti molekulám s malou molekulární hmotností. Naproti tomu další molekuly, tj.

3.12- DEG-PO₄ , stejnoměrně zvyšovaly transport jak malých molekul, tak F-Na a větších molekul jakým je komplex EB-albumin.

Příklad 21

Doba trvání vlivu DP-BFA na uvolnění BBB

Vliv DP-BFA na extravazaci barviva „Evans blue“ a fluoresceinu v krysích mozcích byl zkoumán při různých časech po podání DP-BFA.

Různé DP-BFA sloučeniny byly infuzí podány do artery carotis externa krys (Sprague Dawley) podle postupu v příkladu 17. Testované sloučeniny byly použity v koncentracích EC50. Extravazace barviva „Evans blue“ a fluoresceinu v mozku byla určena 10, 30, 60, 120 a 240 minut po podání DP-BFA. Množství barviva „Evans blue“ (pg/g) a fluoresceinu (% séra) v mozcích krys byla vyčíslena jako průměr hodnot u tří zvířat v daném čase.

Získané výsledky v experimentálním systému popsaném výše ukazují, že vliv DP-BFA na propustnost BBB je reversibilní. Navíc se předpokládá, že vliv DP-BFA na uvolnění BBB je poměrně krátký. Většina testovaných derivátů DP-BFA-3,12 udržela propustnost BBB méně než jednu hodinu a měla tak D_1/2 okolo 30 minut. D_1/2 je definován jako doba trvání, kdy je alespoň 50 % BBB uvolněných a kdy je použitá koncentrace testovaných sloučenin rovna EC50. Dvě sloučeniny 3,12-PC a

3.12- MEG-PC, obě obsahující fosfocholinovou skupinu, mají Dv₂ čtyřikrát delší než ostatní testované deriváty 3,12-BFA, tj. Di_/2 je přibližně 120 minut.

• ·· ·· ···· • · · · · · ·

Závěr: DP-BFA bylo zjištěno, že ovlivňují uvolnění BBB v krysím mozku a to reversibilním způsobem. Různé DP-BFA mají různé doby trvání permeabilizačního efektu.

Příklad 22

Toxikologie a analýza bezpečnosti

Molekuly DP-BFA byly vyhodnoceny z hlediska bezpečnosti a toxicity. Zvyšující se dávka testované sloučeniny byla podávána krysám nitrožilně (i.a.) a potom následoval postup popsaný v příkladě 17. Byla sledována životaschopnost zvířat během 24 hodin, aby byla určena letální koncentrace (LC). LC je definována jako minimální koncentrace, která způsobuje smrt.

Tabulka 8: Data poměrné bezpečnosti různých DP-BFA (u krys)

Molekula*	LC(pM)	MEC	Bezpečnost LC/MEC
3,12	40± 10	6,5 ± 0,7	6/1
3,14	78 ±11	9,1 ±1,2	8,6
3,16	431 ± 55	18 ±2	23,9
7,7	360 ±67	132 ± 19	2,7
3,12-PO4	63 ±12	3,3 ± 0,5	19,1
3,14-PO4	134 ±18	6,2 ± 0,9	21,6
3,12-MEG-PO4	80 ±15	11 ±2	- 7/5
3,12-DEG-PO4	30 ±5	3.0 ±0.5	10
3,12-PC	80 ±16	23 ± 4	3,5
3,12-MEG-PC .	15 ±2	10 ±1	1,5
3,12-DEG-PC	300 ± 60	15 ±2	20

• sodná sůl • · • · · · • · • · · ·

Index bezpečnosti je definován jako poměr mezi letální dávkou (LC) a minimální účinnou koncentrací (MEC), kde MEC odpovídá vypočtené koncentraci testované sloučeniny, která vyvolává akumulaci trojnásobného množství barviva „Evans blue“ než je akumulováno u kontrolních zvířat, ošetřených pouze nosičem, tj. celková akumulace 3 pg EB. Čím vyšší je poměr LC/MEC, tím vyšší je index bezpečnosti.

Závěr: Vpravení fosfátové skupiny zvýšilo index bezpečnosti 2 krát až třikrát, aniž by došlo k výraznému snížení účinnosti.

Příklad 23

In vivo modelový systém pro měření vlivu DP-BFA na uvolnění BTB (krysy mající nádor)

Aby byla prostudována schopnost sloučenin DP-BFA oslabit krevní bariéru nádoru (BTB), byl použit modelový systém krys majících C6 gliom.

„Sprague Dawley“ (SD) krysy byly naočkovány buňkami C6 gliosarkomu a poté podrobeny postupu, který je popsán v Bartus et al.( Exp Neurol (1996), 142:14-28).

Na přední kosti iebeční krysy, upevněné v aparatuře na stereotaxi (poz, př. aparatura pro neurologickou operační metodu, která je založená na přesní prostorové lokalizaci), byl vyvrtán otvor. Pomocí Hamilton injekční stříkačky bylo inokulováno 10 μΙ nebo 5 μΙ média obsahujícího 2,5 x 10⁵ buněk C6 gliosarkomu do mozkové kůry krys. Koordináty byly 1 mm za kraniometrickým bodem, 2,5 mm laterálně a v hloubce 3 mm. Injekční jehla v místě zůstala 5 minut. Po odstranění jehly byla tenká vrstva volné tučné pojivové tkáně pod kůží a kůže na temeni hlavy sešita. Krysy byly zkontrolovány 6 až 8 dnů po inokuiaci, kdy se vyvinuly nádory dostatečné velikosti (20-60 mg). Nádory byly zváženy po F-Na vizualizaci a pitvě. Část krysích mozků byla podrobena histologickým analýzám a byla monitorována absorpce barviva „Evans blue“ a fluoresceinu v ipsilaterální nádorové tkáni, peritumorální tkáni a kontrlaterální tkáni.

Získané výsledky (nejsou ukázány) z pokusů provedených na kontrolních krysách majících nádor (neošetřené sloučeninami předloženého vynálezu) ukázaly, že • * • ·

propustnost krevní bariéry nádoru vůči EB a fluoresceinu je 2 krát a popřípadě 4 krát vyšší než propustnost zjištěná u intaktní BBB.

Příklad 24

Vliv různých molekul BFA na uvolnění BBB a BTB (analýza na krysách majících nádor)

Modelový systém bilaterálního nádoru u krys majících C6 gliom popsaný výše v příkladu 23, byl použít pro sledování různých derivátů DP-BFA a jejich schopnosti uvolňovat krevní bariéru mozku ve srovnání s jejich vlivem na krevní bariéru nádoru. Experimentální postup popsaný v příkladu 23 byl proveden stejně kromě toho, že krysy mající nádor byly ještě dále ošetřeny DP-BFA. Testované sloučeniny, hodnoty koncentrací okolo EC₅₀, byly unilaterálně infuzí dodány do artery carotis externa během 30 sekund jako je popsáno v příkladu 17. Zvířata ošetřená pouze nosičem sloužila jako kontrolní skupina. Permeabilizační efekt byl vyčíslen pomocí měření akumulace barviva „Evans blue“ s navázaným albuminem v nádoru (T) oproti nenádorové tkáni (NT).

Hodnoty vypočtené účinnosti a indexy specifity jsou shrnuty v tabulce 9. Index specifity je definován jako poměr mezi hodnotami EB akumulovaného v nádoru a hodnotami akumulovanými v nenádorové tkáni mozku (T/NT).

• · · · ·· ··.···: . • · ! : .

Tabulka 9: Srovnání uvolnění BBB a BTB pomocí různých DP-BFA

Molekula	ECS0* (μΜ)	1 BTB EB V&fe Nádor	BBB EB ur /e Mozek bez nádoru	Specifita , nádor/bez nádoru
3,12-Na	22 ±. 4	44±8	43 ±9	1,1 ±0,3
3,12-PO4 .	10±2	14 ± 6	2,5 ± 1,5	6/3 ±1,3
3,12-MEG-PO4	22 ±3	25 ±3	21 ±4	1,2 ± op
3,12-DEG-PO4	7±2	34±8	2/0 ± Op	. 22±5
3,12-PC -	52±7	17±2	10 ±2	1, 8 ± 0/5
3,12-MEG-PC-	20	12	6	2
3,12-DEG-PC	60	11	5	2
Manitol	25%	12±2	7±2	2/1 ± 0/5

* EC₅₀ hodnoty pro krysy mající nádor

Jak je vidět z tabulky 9, většina testovaných sloučenin vykazuje podobné hladiny akumulace EB v nádoru a v nenádorové tkáni mozku, tj. poměr T/NT je od 1 do 2.

S manitolem (25%) byla akumulace EB dvakrát větší než akumulace v nenádorové tkáni mozku. V použitém experimentálním systému vykazovala sloučenina 3,12-DEG-PO₄ vysokou specifitu při uvolnění krevní bariéry nádoru (BTB) projevující se jako akumulace EB v nádoru, která byla 22 krát vyšší než hladiny EB v nenádorové tkáni mozku (poměr T/NT=22).

Závěr: 3,12-DEG-PO₄ vykazovala nejvíce specifický vliv na uvolnění BTB u C6 gliomů. Tato sloučenina uvolňuje krevní bariéru nádoru C6 gliomú ve větším rozsahu než normální krevní bariéru mozku (BBB). Deriváty DP-BFA mohou proto sloužit jako činidla schopná specifického a selektivního uvolnění krevní bariéry nádoru.

• · · «

Příklad 25

Unilaterální podávání DP-BFA krysám majícím SD nádor

Proniknutí barviva „Evans blue“ a fluoresceinu bylo zkoumáno na nádorech v nervové soustavě po unilaterálním vpíchnutí buď 10 μΜ 3,12-DEG-HPC>4Na (Obr. 2A), 40 μΜ 3,12-Na BFA (Obr. 2B) nebo 25% manitolu (Obr.2C) do artery carotis externa. Odpovídající sloučenina byla vpíchnuta do krysího mozku 9 až 12 dní po inokulaci buněk C6 gliomu jak je popsáno v příkladu.

Z obrázku 2A je jasně vidět, že po podání 3,12-DEG-PO₄ krysám s bilaterálními gliomy je barvivo „Evans blue“ pouze v nádorové tkání ipsilaterální hemisféry. Na druhou stranu karbo varianta DP-BFA, tj. BFA 3,12 a hyperosmotické činidlo, manitol, rovnocenně uvolňují nádorovou a nenádorovou mozkovou tkáň.

Příklad 26

Vliv DP-BFA na uvolnění krevní bariéry sítnice (BRB)

Uvolnění krevní bariéry sítnice (BRB) pomocí DP-BFA bylo zkoumáno na krysách, monitorováním propouštění fluorescentního indikátoru, sodné soli fluoresceinu (F-Na) z krevních váčků sítnice.

„Sprague-Dawly“ (SD) krysy, vážící od 250 do 350 g byly usmrceny injekcí roztoku Ketamin (100 mg/ml) a Xylasin (2%) 0,1 ml/100 g tělesné hmotnosti. Usmrceným zvířatům bylo v aparatuře na stereotaxi infuzí dodáno 0,25 ml F-Na (12,5 mg/ml) do artery carotis externa. Krevní váčky sítnice byly zaznamenány pomocí 3CCD barevného fotoaparátu (telí CS 5850) připojeného ke krycímu sklíčku mikroskopu INAMI L-0960 pro chirurgii oka. Mikroskop je vybaven zdrojem světla a vhodným filtrem k detekci F-Na. Po deseti minutách byla sítnice očištěna od F-Na. V tomto kroku bylo během 30 sekund do tepny injekčně vpraveno 1,5 ml 3,12-DEG-HPO₄Na (12,5 pg/ml) společně s další nitrožilní injekcí F-Na. Obrázky krevních váčků byly pořízeny v čase 0, 0,25,0,5 , 1, 2, 4, 8 a 10 minut po podání léčiva. Ten samý pokus byl opakován u kontrolní skupiny krys, kde bylo namísto 3,12-DEG-HPO₄Na nitrožilně podáváno 1,5 ml nosiče (Tab-manitol 5%).

• · · · ·

Sledováním distribuce F-Na v krevních váčcích v zadní části oka zvířete na úrovni sítnice bylo zjištěno, že 10 minut po podání samotného F-Na, byla oblasti okolo krevních váčků sítnice vyčištěna od veškerého fluorescentního barviva. Nicméně intravenozní injekce F-Na v kombinaci s intravenozní injekcí 3,12-DEG-HPO₄Na měla za následek akumulaci F-Na v okolí krevních váčků v úrovni sítnice. Toto prosáknutí F-Na z krevních váčků v přítomnosti 3,12-DEG-HPO₄Na naznačuje uvolnění krevní bariéry sítnice. U kontrolní skupiny zvířat, kde byl podán pouze nosič namísto DP-BFA léčiva, byl výsledek podobný jako u zvířat, která byla injektována pouze samotným F-Na, deset minut po podání nebyla detekována žádná fluorescence v okolí krevních váčků na úrovni sítnice. Tyto výsledky znázorněné na obrázku 3A-C představují angiografii oka, jmenovitě obraz oční krve opatřený z provedeného snímání na úrovni sítnice tak, jako bylo zaznamenáno 30 sekund a 10 minut po podání samotného F-Na (obr. 3A) nebo v kombinaci s 3,12-DEG-HPO₄Na (obr. 3B) nebo po podání samotného nosiče (obr. 3C).

V souladu s tímto pozorováním, 10 minut po podání může být detekováno vyšší množství ve sklivci oka u zvířat ošetřených 3,12-DEG-HPO₄Na než ve sklivci oka u kontrolních zvířat, která byla injektována nosičem nebo F-Na (obr. 4A-B). Akumulace fluorescentního signálu ve sklivcích je díky uvolnění BRB a prosáknutí F-Na z krevních váčků na úrovni sítnice.

Závěr: 3,12-DEG-HPO₄Na umožňuje uvolnění krevní bariéry sítnice a výsledkem je F-Na akumulace v sítnici a sklivci.

Příklad 27

Protinádorová aktivita DP-BFA

Protinádorový účinek různých P-BFA byl studován na in vivo modelovém systému popsaném výše v příkladu 17. Testované P-BFA byly nitrožilně podány v předem určených koncentracích, tak aby byly účinné při uvolnění BBB nebo BTB pro extravazaci barviva „Evans blue“ a fluoresceinu. Experimentální postup inokulace nádoru byl proveden podle příkladu 23.

« · · · ·« až 4 den po inokulaci buněk C6 gliosarkomu byla krysám zavedena kanyla skrz artery carotis externa a testované P-BFA byly vpíchnuty během 30 sekund, tak jak je popsáno v příkladu 17, s tím rozdílem že v tomto pokusu nebyl podáván indikátor. Ošetřené krysy byly ponechány do 7 až 9 dne a potom usmrceny. Byly získány lebeční části obarveny pomocí oesin-hematoxylin a podrobeny histologickému rozboru, aby byl určen objem nádoru. Zvířata ošetřená pouze nosičem sloužila jako kontrola. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 10.

Jak lze vidět z výsledků v tabulce 10, sloučeniny P-BFA vykazují cytostatický účinek na růst nádoru nervové soustavy in vivo. Při použitých experimentálních podmínkách vykázala sloučenina 3,12-DEG-HPO4Na nejvíce prokazatelný protinádorový účinek na nádor.

Tabulka 10: Protinádorové účinky různých P-BFA na růst nádorů.

Molecule	P-BFA Koncentrace ' (μΜ) ·	Objem mozku (mm3) ± SE	P (pro kontrolu)
Kontrola	0	8,1 ±2,22	-
3,12-MEG-HPO4Na	30 '	4,2 ±1,6	>0,1
3,12-PC	50	3,8 ± 0,8	>0,1
' 3,12-MEG-PC	10	2,88 ± 0,6	<0,05*
3,12-DEG-PC	60	3,9 ±1,0	>0,1
3!12-DEG-HPO4Na	5	1,5 ± 0,3	<0,01*
3,12-DEG-PO4Na2	30	1,6 ±0/4	<0,01*

SE - standardní chyba z průměru ‘statický významná odchylka • 9

Příklad 28

Protitnádorový vliv DP-BFA

Protinádorový vliv DP-BFA byl vyhodnocen pomocí sledování objemu nádoru a jeho vzhledu v modelovém systému krys majících C6 gliom. „Sprague-Dawley“ (SD). Krysy byly inokulovány 2,5x105 buněk C6 gliomu v 5 μΙ PBS postupem popsaným níže. Krysy byly upevněny v aparatuře na stereotaxi, tak aby byla lebka v rovné pozici. Po proražení okostice byl vyvrtán vrtáčkem 1 mm otvor v následujících koordinátách: kraniometrický bod -1,0, 3,5 mm laterálně od středové čáry na levé straně a v hloubce 3,5 mm. Buněčná suspenze byla ručně injektována do hloubky 3,5 mm pomocí Hamiltonovy injekční stříkačky. Krysy mající nádor byly 72 hodin po inokulaci ošetřeny jednou dávkou v rozmezí od 5 do 20 μΜ sloučeniny 3,12-diethylenglykolfosfátu (3,12-DEG-PC>4, sodná sůl) nebo nosičem (izotonický pufr, pH=7,4) vpravenou do artery carotis externa během 30 sekund rychlostí 3ml/min.

Artery pterygopalathina byla uvolněna a artery carotis communis byla v době infúze zasvorkována.

Pět dnů po inokulaci nádorových buněk C6 byly krysy usmrceny pomocí ketaminu/xylazinu (1:1) 0,1 ml/100 g tělesné váhy, promyty fyziologickým roztokem a fixovány 4% roztokem formaldehydu. Mozky byly vyňaty a zamraženy v roztoku sacharózy po dobu 48 hodin. Potom byly mozky rozkrájeny v lebečních švech, obarveny pomocí sloučeniny hemotoxylin-eosine a byly podrobeny patologickému vyhodnocení.

U ošetřených zvířat bylo pozorováno významné zmenšení velikosti nádorů ve srovnání se zvířaty, která nebyla ošetřena. Objem nádorů byl 8,1+ 2,2 mm³ (N=7) u zvířat ošetřených pouze nosičem a 1,6 ± 0,2 mm³ (N=12) u zvířat ošetřených 3,12-DEG-PO4. Navíc mikroprostředí a povaha nádorů byla odlišná. U krys, které byly ošetřeny pouze nosičem byl zaznamenána značná lokální buněčná expanse do mozkové kůry, bílé hmoty a mozkových plen. C6 gliomy vypadaly nesouměrně a byly velmi pronikající a vykazovaly vysoký sklon k napadání perivaskulární lymfatické oblasti. Naproti tomu ošetření DP-BFA podané třetí den po buněčné inokulaci výrazně změnilo charakter růstu nádoru. Agresívnost buněk C6 gliomu přes perivaskulární prostor byla snížena a byl pozorovatelný pevný nádor s definovaným ohraničením.

• a

Určité omezené narušení bylo nalezeno v mozkových plenách v okolí místa inokulace a v oblasti subependymu.

Závěr:3,12-DEG-PO4 ukázaly značný protirakovinný účinek tím, že inhibují agresívnost nádoru a rychlost jeho růstu. Takto DP-BFA sloučeniny mohou být použitelné při inhibici rozšiřujících se agresivních nádorů.

Zkušený odborník ocení to, že principy předloženého objevu jsou přístupné mnoha provedením a různým změnám nebo modifikacím, které všechny spadají do rámce předloženého vynálezu. Příklady jsou uvedeny s tím, že nejsou omezující a rámec vynálezu je definován pomocí nároků, které následují.

Claims (40)

1. Sloučenina obecného vzorce I,

R1 \

CH—- R3

Z

R2

O-P-0-¾ o—z₂

R1 a R2 jsou stejné nebo odlišné, nasycené nebo nenasycené alifatické řetězce obsahující od 2 do 30 atomů uhlíku, R3 je A-[CH₂]_m-B-[CH2]n-C-[CH2]_p-D, kde m, n a p jsou každý nezávisle nula nebo celé číslo od 1 do 12 a A, B, C a D jsou každé nezávisle vybrány z těchto kovalentních vazeb amino, amido, oxy, thio, karbonyl, karboxyi, oxykarboxyl, thiokarbonyl, fosfo, aminofosfo a z mono- di- a tri-aminofosfátové skupiny s podmínkou, že žádné dva kyslíkové atomy nejsou mezi sebou přímo vázány, Zi a Z₂ jsou stejné nebo odlišné, z nichž každý může být vynechán nebo může být nezávisle vybrán z a) vodíku, sodíku, lithia, draslíku, amonia, mono-, di-, tri- a tetraalkylamonia nebo může b) být spojen s fosfátovou skupinou tvořící fosfoester glycerolu, cholinu, ethanolaminu, inositolu, šeřinu, mono- nebo oligosacharidu nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl.

2. Sloučenina obecného vzorce I podle nároku 1, kde R1 má délku 3 atomy uhlíků a R2 má délku od 12 do 16 atomů uhlíku.

3. Sloučenina obecného vzorce I podle nároku 1, kde R1 je propylová skupina a R2 je dodecylová skupina.

• ... · · · ... · · • . .... ····

... .. ·· ·· ·· ··

4. Sloučenina obecného vzorce I podle nároku 1, kde R3 obsahuje skupinu monoethylenglykolu nebo diethylenglykolu.

5. Sloučenina obecného vzorce I podle nároku 1, kde R1 je celkový počet atomů uhlíku v R2 a R3 dohromady od 6 do 26.

6. Sloučenina obecného vzorce I podle nároku 1, kde R1 je celkový počet atomů uhlíku v R2 a R3 dohromady od 16 do 22.

7. Sloučenina obecného vzorce I podle nároku 1, kde 7.^ je cholin.

8. Sloučenina obecného vzorce I podle nároku 1, kde Ζ_Ί je sodík a Z₂ je vodík a sodík.

9. Sloučenina obecného vzorce I podle nároku 1, kterou je

4-hexadecyl-fosfát (3, 12-PO4),

4-oktadecyl-fosfát (3,14- P0₄),

4-eikosanyl-fosfát (3,16- P0₄),

8-pentadecyl-fosfát (7,7- P0₄),

4-hexadekanoyloxyethyl-fosfát (3,12-MEG- P0₄),

2-(4'-hexadekanoyloxy)ethoxyethyl-fosfát (3,12-DEG- P0₄),

4-hexadekanyloxyethyl-fosfát (3,12-(ether)-MEG- P0₄),

2-(4'-hexadekanyloxy)ethoxyethyl-fosfát (3,12-(ether)-DEG- P0₄),

4-hexadekyl-fosfocholin (3,12-PC),

2-(4-hexadekanoyloxy)ethyl-fosfocholin (3,12-MEG-PC),

2-(4-hexadekanoyloxy)ethoxyethyl-fosfocholin (3,12-DEG-PC),

2-{2'-[10-(hexadekyl-4-oxy)dekyl-1 -oxy]ethoxy}ethyl-fosfát (3,12-0-C₁₀-DEG- P0₄),

2-{2'-[10-(hexadekyl-4-oxy)dekyl-l-oxy]ethoxy}ethyl-fosfocholin (3,12-0-Ci₀-DEG-PC), 4-oktadekanoyloxyethyl-fosfát (3,14-MEG- P0₄), • · « ·

2-(4 ’-oktadekanoyloxy)ethoxyethyl-fosfát (3,14-DEG- PO4), 4-oktadekanyloxyethyl-fosfát (3,14-(ether)-MEG- PO4),

2-(4 ’-oktadekanyloxy)ethoxyethyl-fosfát (3,14-(ether)-DEG- PO4), 4-oktadekyl-fosfocholin (3,14-PC),

2-(4-oktadekanoyloxy)ethyl-fosfocholin (3,14-MEG-PC), 2-(4-oktadekanoyloxy)ethoxyethyl-fosfocholin (3,14-DEG-PC), 4-eikosanoyloxyethyl-fosfát (3,16-MEG- PO4),

2-(4'-eikosanoyloxy)ethoxyethyl-fosfát (3,16-DEG- PO4), 4-eikosanyloxyethyl-fosfát (3,i6-(ether)-MEG- PO4), 2-(4'-eikosanyloxy)ethoxyethyl-fosfát (3,16-(ether)-DEG-P0₄), 4-eikosanyl-fosfocholin (3,16-PC),

2-(4-eikosanoyloxy)ethyl-fosfocholin (3,16-MEG-PC),

2-(4-eikosanoyloxy)ethoxyethyl-fosfocholin (3,16-DEG-PC),

10-(4'-hexadekanoyloxy)dekanyl-fosfát,

10-(8'-pentadekanoyloxy)dekanvl-fosfát,

2-[2'-(2-propyleikosanoyloxy)-ethoxy]ethyl-fosfát (3,18-DEG- PO4) a 2-(2'- propyleikosanoyloxy)ethoxyethyl-fosfocholin (3,18-DEG-PC).

10. Sloučenina podle nároku 1, kterou je 2-(4'-hexadekanoyloxy)ethoxyethyldihydrogen-fosfát sodný.

11. Sloučenina podle nároku 1, kterou je 2-(4'-hexadekanoyloxy)ethoxyethylhydrogen-fosfát sodný.

Sloučenina podle nároku 1, kterou je 2-(4'-hexadekanoyloxy)ethoxyethyl-fosfát.

Sloučenina podle nároku 1, kterou je 2-(4'-hexadekanoyloxy)ethyl-fosfocholin.

14. Sloučenina podle nároku 1, kterou je 2-(4'-hexadekanoyloxy)ethoxyethyl-fosfocholin

15. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič a sloučeninu obecného vzorce I,

O)

R2

O I

R3-O-—P—O —Z,

O kde R1 a R2 jsou stejné nebo odlišné, nasycené nebo nenasycené alifatické řetězce obsahující od 2 do 30 atomů uhlíku, R3 je A-[CH₂]_m-B-[CH2]n-C-[CH₂]pD, kde m, n a p jsou každý nezávisle nula nebo celé číslo od 1 do 12 a A, B, C a D jsou každé nezávisle vybrány z těchto kovalentních vazeb amino, amido, oxy, thio, karbonyl, karboxyl, oxykarboxyl, thiokarbonyl, fosfo, aminofosfo a z monodi- a tri-aminofosfátové skupiny s podmínkou, že žádné dva kyslíkové atomy nejsou mezi sebou přímo vázány, Zi a Z₂ jsou stejné nebo odlišné, z nichž každý může být vynechán nebo může být nezávisle vybrán z a) vodíku, sodíku, lithia, draslíku, amonia, mono-, di-, tri- a tetraalkylamonia nebo může b) být spojen s fosfátovou skupinou tvořící fosfoester glycerolu, cholinu, ethanolaminu, inositolu, šeřinu, mono- nebo oligosacharidu nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl.

16. Farmaceutický prostředek podle nároku 15, vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 2 až 14.

17. Farmaceutický prostředek podle nároku 15, vyznačující se tím, že dále obsahuje biologicky aktivní činidlo.

• · · • · • · ► I

I I

18. Farmaceutický prostředek podle nároku 17, vyznačující se tím, že biologicky aktivní činidlo je terapeutické činidlo.

19. Farmaceutický prostředek podle nároku 17, vyznačující se tím, že biologicky aktivní činidlo je protirakovinné činidlo.

20. Farmaceutický prostředek podle nároku 17, vyznačující se tím, že biologicky aktivní činidlo je diagnostické činidlo.

21. Použití sloučeniny obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 14 pro výrobu léčiva.

22. Způsob zvýšení propustnosti biologické bariéry, vyznačující se tím, že se bariéra vystaví účinnému množství sloučeniny obecného vzorce I, jak je definována v kterémkoli nároku 1 až 14.

23. Způsob podle nároku 22, vyznačující se tím, že použije biologická bariéra vybraná ze skupiny sestávající z epitelu kůže, rohovky, spojivky, nosního epitelu, bronchiálního epitelu, ústního epitelu, vaginálního a gastrointestinálního epitelu a z krevní bariéry sítnice, krevní bariéry varlat, krevní bariéry nádoru a krevní mezifázi ledvin.

24. Způsob podávání biologicky aktivního činidla do obtížně přístupného místa nebo orgánu, vyznačující se tím, že se takové místo nebo orgán vystaví biologicky aktivnímu činidlu v přítomnosti účinného množství farmaceutického prostředku podle nároku 15 a tím umožní nebo zvýší proniknutí a/nebo akumulaci biologicky aktivního činidla v obtížně přístupném místě nebo orgánu.

25. Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím, že obtížně přístupné místo nebo orgán je mícha, mozek, oko, varlata, žláza nebo nádor.

• « • · »· • ·

26. Způsob léčby nemocí nebo poruch centrálního nervového systému, vyznačující se tím, že se pacientovi podá účinné množství farmaceutického prostředku podle nároku 15 v kombinaci s terapeutickým činidlem.

27. Způsob podle nároku 26, vyznačující se tím, že se použije terapeutické činidlo vybrané ze skupiny sestávající z protinádorových, protivirových, antimikrobiálních, antifungálních, protizánětlivých a neuroprotektivních činidel a bioaktivních peptidů a proteinů.

28. Způsob léčby nádoru, vyznačující se tím, že se pacientovi podá účinné množství farmaceutického prostředku podle nároku15.

29. Způsob podle nároku 28, vyznačující se tím, že se dále pacientovi podá účinné množství protirakovinného léčiva.

30. Způsob podle nároku 29, vyznačující se tím, že se protirakovinné léčivo podá v odděleném farmaceutickém prostředku.

31. Způsob podle nároku 28, vyznačující se tím, že nádor je v centrální nervové soustavě.

32. Způsob podle nároku 28, vyznačující se tím, že nádor je v mozku.

33. Způsob podle nároku 28, vyznačující se tím, že se nádor je karcinom, gliom, neuroblastom, retinoblastom, lymfom, leukémie, sarkom a melanom.

34. Způsob podle nároku 28, vyznačující se tím, že nádor je primární nebo sekundární nádor.

35. Způsob léčby oční nemoci nebo poruchy, vyznačující se tím, že se pacientovi podá účinné množství farmaceutického prostředku podle nároku 15.

36. Způsob podle nároku 35, vyznačující se tím, že se dále pacientovi podá účinné množství doplňkového biologicky aktivního činidla.

• « · · · * • ·

37. Způsob podle nároku 35, vyznačující se tím, že se oční nemoc nebo porucha vyskytuje ve skupině sestávající z edemu makulárních cystoidů (CME), makulární degenerace spojené s věkem (ARMD), nitrooční infekce, nitroočního zánětu a nitroočních zhoubných nádorů.

38. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 24 až 37, vyznačující se tím, že se farmaceutický prostředek podá orálně, parenterálně nebo povrchově nebo pomocí regionální perfúze, klystýrem nebo pomocí meziorgánového výplachu.

39. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 24 až 37, vyznačující se tím, že se farmaceutický prostředek podá pomocí aplikace do tepny.

40. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 24 až 37, vyznačující se tím, že se farmaceutický prostředek podá intratekálně.

41. Způsob zvýšení akumulace diagnostického činidla v orgánu chráněném biologickou bariérou, vyznačující se tím, že se pacientovi podá diagnostické činidlo v kombinaci s účinným množstvím farmaceutického prostředku podle nároku 15 a tím se zvýší akumulace diagnostického činidla v orgánu chráněném biologickou bariérou.

42. Způsob podle nároku 41, vyznačující se tím, že orgánem chráněným biologickou bariérou je centrální nervový systém.