CZ20021876A3 - Oligosacharidová směs - Google Patents

Description

Oligosacharidová směs

Oblast techniky

Vynález se týká oligosacharidové směsi obsahující oligosacharidy, které se získaly z jednoho nebo více druhů mléka ze zvířat; a které jsou složeny ze dvou nebo více monosacharidových jednotek, a použití této oligosacharidové směsi proti poruchám gastrointestinálních funkcí.

Dosavadní stav techniky

Koncentrace oligosacharidů ve zralém lidském (mateřském) mléku je přibližně 10 g/l. V lidském mléku bylo doposud popsáno přibližně 80 oligosacharidů odlišných ve své struktuře, které se skládají ze 3 až 13 monomerů; Newburg> D. S. a Neubauer, S. H. (1995) Carbohydrates in miík: Analysis, quantities and significance, in: Handbook of Milk Composition, Jensen, R.G., editor. Academie press, 273-349.

Ve strukturní mnohotvárnosti oligosacharidů hraje velkou roli strukturní a polohová izomerie. Poměr neutrálních oligosacharidů k sializovaným (kyselým) oligosacharidům, popřípadě oligosacharidovým strukturám je ve zralém mléku přibližně 10': 1.

Oligosacharidy hrají u lidí při specifické a nespecifické obraně proti infekcím následující důležité role:

1. Oligosacharidy z lidského mléka představují zdroj substrátu pro bifidobaktérie. Tím podporují normální střevní flóru potřebnou pro funkci gastrointestinálního traktu a potlačují choroboplodné zárodky; Rose, C. S., Kuhn, R.,

9 9 · 9 9 9 '9 9 • · 9 9 9 9 9 ·· · t

9.99· 9 9.9 *9 99 9* / 99 9 ·· 9999 \ 9 99

Zilliken, F. un’d Gyórgy, P. (1954) Bifidus factor. V) the' . activity of a- and β-methyl-N-acetyl-D-glucosaminides, Arch.. · Biochem. Biophys. 49, 123-129.

2. Oligosacharidy zabraňuji adhezi choroboplodných , zárodků a/nebo substancí, jako jsou například baktérie, toxiny a eukaryontní paraziti, tím, že působí jako specifické analogy receptorů, čímž se zabraňuje prvnímu stupni infekce.

V různých in vitro analýzách se mohl dokázat antiadhezívní účinek oligosacharidů proti nej různějším choroboplodným.·' mikroorganismům; Kúnz, C. a Rudloff, S. (1993) BiologičalFunctions of oligosaccharides in human milk, Acta ’paediatr. 82, 903-912.

3. Oligosacharidy podporují obranyschopnost proti infekcím ovlivňováním různých imunologicky účinných buněk. Imunomodulační účinek jistých oligosacharidových struktur, se. mohl prokázat na zvířecím modelu zvýšením produkce interleukinu 10 (Velupillai, P. a Harn, D. A (1994) Oligosaccharide-specific instruction of interleukin 10 production by B 220+ cells from schistosome-inf.ected mice: a mechanism for regulation of CD4+ T-cell subsets, Proč. Nati. Acad. Sci. 91, 1-2.

Heterogenita oligosacharidů z většiny dosud známých druhů mléka savců se liší z mnoha hledisek od lidských mléčných oligosacharidů. Vzhledem ke složení oligosacharidů existuje velký počet kvantitativních a také kvalitativních rozdílů. Druhové rozdíly v obsahu oligosacharidů v mléku savců se vztahují především k rozdílům v koncentraci jednotlivých složek a rovněž struktur s podobnými charakteristickými znaky a základní struktury samotné. Ve srovnání s oligosacharidy z lidského mléka je rozdílná • · · · · · • · · · ·. · · · ·· sekvence monosacharidů a také navázání. Kromě toho množství většiny jednotlivých složek ve většině druhů zvířecího mléka je výrazně’ nižší než v lidském mateřském mléku.

Předpokládá se, že tyto rozdíly jsou·podmíněny požadavky gastrointestinálního traktu novorozenců na složení oligosacharidů v mléku. Tyto požadavky se velmi mění v závislosti na druhu. Takové rozdíly vzhledem k požadavkům existují nyní nejenom ve srovnání novorozeného dítěte s novorozeným zvířetem, nýbrž také mezi různými novorozenými zvířaty. Rozdíly jsou založeny na stavu funkcí gastrointestinálního traktu novorozenců, na stupni vývinu imunitního systému, na výživě upřednostňované v závislosti na druhu a rovněž na velmi specifickém prostředí jedince příslušného druhu.

Jestliže se zkouší nyní nahrazovat lidské mléko umělým mlékem nebo dětskou výživou (infant formula) na bázi mléka ze zvířat, potom dochází ke konfrontaci s tím problémem, že mléko jediného zvířecího druhu podle současného stavu poznání nemá heterogenní strukturní různorodost vzhledem k oligosacharidům, která se vyskytuje v lidském mléku.

Úkolem předloženého vynálezu je poskytnutí oligosacharidové směsi skládající se z oligosacharidů, které se získaly z jednoho nebo více druhů mléka zvířat, jejichž pozitivní účinek a zejména jejichž antiinfekční účinek co nejvíce odpovídá účinku- oligosacharidů z lidského mléka.

Tento úkol se řeší prostřednictvím oligosacharidové směsi podle znění patentových nároků.

0 · · · · • » * · • · · ·

Podstata vynálezu

Překvapivě se zjistilo, že pomoci nové směsi oligosacharidů z jednoho, ale také z rozličných druhů zvířecího mléka se zvyšuje antiinfekční a/nebo prebiotický účinek oligosacharidů ze zvířecího mléka. Proto je oligosacharidová směs podle vynálezu vytvořena z alespoň dvou oligosacharidových frakcí, přičemž každá z nich obsahuje alespoň dva rozdílné oligosacharidy. Tyto olígosacharidové frakce při tom mohou pocházet z jednoho druhu zvířecího mléka nebo rovněž z více druhů zvířecího mléka. I když by to mělo být samozřejmé, upozorňuje se na to, že pod zvířecím mlékem se nerozumí lidské mléko.

Každá z těchto oligosacharidových frakcí obsahuje alespoň dva rozdílné oligosacharidy. Za rozdílné oligosacharidy se pokládají takové, které se odlišují alespoň jedním charakteristickým znakem. Za rozdílné oligosacharidy se tedy považují například dva disacharidy, které se skládají ze stejných monosacharidových jednotek, ale jsou spojeny odlišným způsobem. Tyto.rozdíly mohou tedy spočívat v druhu struktury a také ve složení. >

Podstatný aspekt vynálezu spočívá tedy v tom, že se novým způsobem vytvoří olígosacharidové frakce ze zvířecího mléka jednoho druhu, popřípadě různých druhů tak, aby se dosáhlo zvýšeného biologického účinku. Při tomto novém vytváření, popřípadě směšování, se přirozeně musí zajistit, aby nevznikla žádná směs, která- by odpovídala původní směsi vyskytující se v jednom zvířecím mléku nebo ve více druzích zvířecího mléka. Z tohoto důvodu se musí celkové spektrum oligosacharidů nacházejících se v olígosacharidové směsi . odlišovat od spektra druhu zvířecího mléka nebo druhů zvířecího mléka, z kterého nebo z kterých byly získané olígosacharidové frakce. Pokud se oligosacharidová směs podle vynálezu získá pouze z jednoho.druhu zvířecího mléka, potom'se z tohoto důvodu má klást důraz na charakteristický znak týkající se celkového spektra, aby nová kompozice, popřípadě směs oligosachařidových frakcí získaná z tohoto jediného druhu zvířecího mléka nevedla znovu k původnímu druhu zvířecího mléka. Jestliže se oligosacharidová směs získá z více druhů zvířecího mléka, potom nová kompozice nebo nová.směs nemůže vést k tomu, aby získaná oligosacharidová směs odpovídala oligosacharidovému složení původně použitých druhů zvířecího mléka.

Jestliže se oligosacharidy z olígosacharidové směsi podle vynálezu získají pouze z jednoho druhu zvířecího mléka, potom je kromě toho poměr neutrálních oligosacharidů ke kyselým oligosacharidům 90 až .60 : 10 až 40 % hmotn. Jinými slovy existuje neutrální oligosacharidová frakce vedle kyselé olígosacharidové frakce. Obě tyto frakce obsahují alespoň dva rozdílné oligosacharidy. Změnou poměrů kyselé oligosacharidové frakce k neutrální olígosacharidové frakci ve srovnání s poměry neutrálních oligosacharidů ke kyselým oligosacharidům, původně existujícím ve zvířecím’mléku,· se dá dosáhnout zřetelného zvýšení .efektivnosti jejich fyziologického účinku.

Pokud se oligosacharidy získají z různých, a tedy z alespoň· dvou druhů zvířecího mléka, nová kompozice, popřípadě nová směs se dá realizovat tak, že oligosacharidy získané ze dvou různých druhů zvířecího mléka tvoří alespoň vždy 10 % hmotn. z oligosacharidů nacházejících se celkem v olígosacharidové směsi. Pokud se oligosacharidy získají ze dvou druhů zvířecího mléka, potom musí oligosacharidy získané » 4 4 4 4 4

4 4 4 • 4 44·4 44 z jednoho druhu zvířecího mléka tvořit alespoň 10 % hmotn./ zatímco oligosacharidy získané z jiného druhu zvířecího mléka tvoří rovněž alespoň 10 % hmotn. a maximálně 90 % hmotn. a naopak. Pokud se oligosacharidy naproti tomu získají ze tří nebo více druhů zvířecího mléka, potom musí oligosacharidy pouze ze dvou druhů zvířecího mléka tvořit alespoň 10 % hmotn. Oligosacharidy získané z dalších druhů zvířecího mléka mohou tvořit méně než 10 % hmotn.

Jako zdroj pro přípravu oligosacharidové směsi podle vynálezu se mohou používat všechny druhy zvířecího mléka, přičemž se přednostně používají frakce z kravského, kozího, ovčího, kobylího, velbloudího a buvolího mléka.

t

Izolace oligosacharidových frakcí se provádí pomocí známých oddělovacích způsobů. Odtůčnění se může provádět prostřednictvím odstřeďování za použití odstředivky. Oddělení proteinů se může provádět ultrafiltrací, popřípadě vysrážením rozpouštědlem (například ethanolem, acetonem). Obsah laktózy ' se může snižovat pomocí jednoho nebo více ...následujících způsobů: krystalizací, filtrací, chromatografickými metodami (chromatografie s výměnou ligandů, gelová filtrace, eluční chromatografie, recyklační chromatografie a simulovaná protiproudová chromatografie (SMB)). Minerální látky se oddělují elektrodialýzou, nanofiltrací, iontovou výměnou a/nebo reverzní osmózou. Frakcionace oligosacharidů na neutrální a kyselé oligosacharidy se provádí jednou z výše · · uvedených chromatografických metod a/nebo anexovou chromatografií a rovněž alternativně filtrací.

Podle přednostní formy provedení se oligosacharidová směs podle vynálezu, jejíž oligosacharidy se získávají alespoň ze dvou druhů zvířecího mléka, novým způsobem vytváří tak, aby rovněž v tomto případě byl poměr neutrálních oligosacharidů ke kyselým oligosacharidům 90 až 60 : 10 až 40 % hmotn.

Pomocí hodnot poměrů v předložených podlohách 90 až 60 : 10 až 40 % hmotn. se zároveň zahrnují a zveřejňují alespoň všechny celočíselné mezihodnoty, například 89:11, 88:12, 87:13,....85:15,....80:20, 79:21,....75:25, 74:26, 73:27, 72:28,....68:32, 67:33, 66:34, 65:35, 64:36, 63:37, 62:38, 61:39.

Přednostně jsou oligosacharidy v oligosacharidové směsi podle vynálezu vystavěny z jedné nebo více následujících monosacharidových jednotek: D-glukózy, D-galaktózy, D-N-acetylglukosaminu, D-N-acetylgalaktosaminu, L-fukózy, D-manózy, sialových kyselin v D-formě (například D-N-acetylneuraminová kyselina a D-N-glykolylneuraminová kyselina) a rovněž jejich O-acetylovaných, sulfátovaných a fosforylovaných derivátů.

Volná laktóza nacházející se ve zvířecím mléku ve velkém množství se ostatně nepočítá k oligosacharidům získaným ze zvířecího mléka, které vytvářejí oligosacharidové frakce používané podle vynálezu. Avšak také.v oligosacharidové směsi podle vynálezu může být volná laktóza kromě oligosacharidových frakcí používaných podle vynálezu.

Jinými slovy oligosacharidové směs podle vynálezu může být vytvořena výlučně z oligosacharidových frakcí, které obsahují oligosacharidy, které se získaly z jednoho nebo více druhů zvířecíhomléka a jsou složeny z dvou nebo více monosacharidových jednotek, přičemž volná laktóza k nim nepatří. Avšak oligosacharidová směs, jak se uvedlo, může obsahovat volnou laktózu, i když nyní pochází ze zvířecího' • ·

• · · ·· · • · · · • flfl · • · fl flfl mléka nebo nikoliv. Dále oligosacharidová směs může obsahovat jeden ’ nebo vice oligosacharidů, které nepocházejí ze zvířecího mléka, '· ..-v. [

Tedy oligosacharidová směs podle vynálezu se může například smíchat s obvyklými sacharidy, které se používají pro přípravu výživy a zejména kojenecké výživy. Kromě toho v oligosacharidové směsi podle vynálezu mohou být obsaženy rovněž takové oligosacharidy, které se uvolnily při získávání oligosacharidů, popřípadě oligosacharidových frakcí, používaných podle vynálezu, chemickou, enzymatickou a/nebo technologickou přeměnou z glykolipidů a/nebo glykoproteinů.

Když se v rámci předložených podloh mluví o oligosacharidech, potom se tento výraz vztahuje zejména'k takovým oligosacharidům, které se získaly ze zvířecího mléka. Kromě toho mohou být přítomné také jiné oligosacharidy, jak se to uvedlo výše, přičemž tato okolnost se zmiňuje nebo vyplývá z této souvislosti.

Přednostní zdroj pro izolaci oligosacharidů představují mléčné výrobky, ze kterých se částečně a/nebo úplně odstranily proteinové frakce a rovněž tuk. Zpracování a frakcionace z produktů, jako je například frakce laktózy a minerálních látek, která vzniká při získávání smetany, kazeinové frakce a dalších složek, se zřetelně zjednodušuje. Supernatant vzniklý při výrobě farmaceutické laktózy rovněž představuje vhodný výchozí zdroj pro- různé oligosacharidy.

Při tom se před prováděním vlastní izolace frakci může mléko, popřípadě syrovátka od jednoho zvířecího druhu nebo od různých zvířecích druhů před frakcionací oligosacharidů v požadovaném poměru míchat, jak je to potřebné pro účinnou • ·, 000« ·* « ·0 0 ol-igosacharidovou směs jednotlivých struktur nebo strukturních skupin·.

Oligosacharidová směs podle vynálezu se může používat ve formě s vysokou koncentrací nebo v čisté formě, při poruchách gastrointestinálních funkcí, při kterých hraje roli dysbaktérie (tj. porucha gastrointestinální flóry, například po podávání antibiotik nebo jiných medikamentů ovlivňujících střevní flóru po nesnášenlivosti potravin atd.), popřípadě virové infekce. Může se používat rovněž pro prevenci takových gastrointestinálních infekcí·. Kromě toho oligosacharidová směs podle vynálezu se může přidávat do kojenecké výživy, · dietních potravin nebo farmaceutického prostředku.

A

Oligosacharidová směs podle vynálezu může představovat také přísadu k jinak kompletní výživě. Takovými výživami jsou například kojenecké výživy, popřípadě infant formulae a přípravky pro enterální klinickou výživu. Dále se může používat jako přísada do obvyklých potravin pro zachování normálních gastrointestinálních funkcí (ve smyslu prevence) a rovněž pro zlepšení gastrointestinálních funkcí po poruchách, při kterých hraje roli Špatné bakteriální nebo virové rozložení v gastrointestinálním traktu.

Oligosacharidová směs podle vynálezu může být upravena ve formě kapslí, popřípadě prášku nebo ve zředěné formě, jako přísada k jinak kompletní instantní výživě.

Oligosacharidová směs podle vynálezu se přednostně používá v množství alespoň 10 mg/kg až 4 g/kg tělesné hmotnosti a na den, přičemž miligramové hodnoty se vztahují k těm oligosacharidům v oligosacharidové směsi podle vynálezu, které se získaly ze zvířecího mléka. Jiné oligosacharidy, které jsou popřípadě k dispozici, jako je • · © ·· · ©· ·* © « ·· ·©·· • · 4 • © · · ·· «© například laktóza a oligosacharidy nepocházející ze zvířecího mléka, se při tom nechávají nepovšimnuté. Obzvláště přednostně se podává přibližně 100 mg/kg a den.

Vynález se v následujícím textu blíže vysvětluje na základě příkladů popisujících přednostní formy provedení.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 /

100 1 kravského mléka se zpracuje následujícím způsobem: Oddělení tuku se provádí prostřednictvím odstřeďování při teplotě 45 °C. Vzniklé odstředěné mléko se deproteinuje srážením ethanolem (konečná koncentrace 66 % ethanolu). Vysrážený precipitát se oddělí pomocí odstředivky. Ethanol a část vody se odpaří pomocí spádové odparky tak, aby objem byl 4.0 1. V něm jsou přibližně 4 kg laktózy, 1 kg minerálních látek a jiné rozpustné složky, jako například ve vodě rozpustné vitaminy, močovina nebo citráty. Podíl oligosacharidů je přibližně 10 g. Oligosacharidová frakce sestává přibližně ze stejných dílů neutrálních a sialyzovaných struktur. Pomocí anexové chromatografíe na AG 1 x 2 se provádí dělení na neutrální (eluční činidlo: deminerálizovaná voda) a kyselou frakci (eluční činidlo: 300 mM octan amonný). Z neutrální frakce se odstraní 60 % laktózy pomocí krystalizační techniky. Pomocí gelové chromatografíe na Toy.opearl HW 40 (S) se dosáhne toho, že se získá 5 g neutrální oligosacharidové frakce, ve které zbytkový obsah ' laktózy je přibližně 10 %. Z frakce ^sialyzovaných oligosacharidů se elektrodialýzou odstraní anexový eluční pufr (octan amonný) a frakce se rovněž lyofilizuje jako neutrální oligosacharidová frakce.. Tímto způsobem se může ·♦·· získat 4,5 g sialyzované oligosacharidové frakce. Pomocí nové kompozice z 1 g kyselé frakce s 5 g neutrální frakce se získá aktivnější směs než v případě přírodního složení.

Příklad 2

Syrovátky vznikající při výrobě sýru z kozího, ovčího a kravského mléka se před zpracováním smíchají v poměru 3:1:1 tak, aby bylo k dispozici 4000 1 celkové syrovátky od tří různých druhů zvířat. Ultrafiltrací s polysulfonovou membránou {cutoff 20 kDa) se oddělí zbytkový tuk, glykomakropeptid nacházející se v roztoku a proteiny ze syrovátky. Permeát se nechá následkem reverzní osmózy zkoncentrovat na 900 1. Další způsob postupu odpovídá výše popsanému, přičemž nejdříve se provádí krystalizace laktózy a potom anexová chromatografíe s cílem oddělit peptidy. Frakce z elučních stupňů., s demineralizovaňou vodou a 300mM octanem amonným se spojí, zkoncentrují, elektrodialyzují a lyofilizují. Může se získat směs oligosacharidó tří různých druhů v množství 570 g: Po dalším dělení gelovou filtrací a odsoleni elektrodialýzou se může získat požadovaný produkt lyofilizací. Analýza prostřednictvím gelové filtrace, HPAEC-PAD a MALDI-MS ukazuje, že podle použitých druhů mléka a směšovacího poměru je poměr kyselých oligosacharidů k neutrálním oligosacharidům 1:5. Podíl galaktozyllaktózy se může vyčíslit v důsledku vysokého podílu kozí syrovátky na 120 g. V ovčím mléku převládá N-glykolylneuraminová kyselina ve srovnání s N-acetylneuraminovou kyselinou jako důležitá složka kyselých oligosacharidů. Proto se podíl glykolylneuraminyloligosacharidů zvyšuje ve srovnání s kozím a kravským mlékem.

• · • · · *

Příklad 3

Současně se zpracovává kobylí a kozí mléko. Z každého je k dispozici 50 1. Z každého se odstředěním, vysrážením proteinů ethanolem a separací získá frakce obsahující cukry a minerální látky. Použitím rotační odparky se oba roztoky zkoncentrují na 8 1. Pomocí chromatografie s výměnou ligandů na. AG 501 x 8 (Ca²⁺-forma) a eluce demineralizovanou vodou se dosáhne chromatografického oddělení laktózy a monosacharidů na jedné straně a na druhé'· straně subfrakcionace oligosacharidů. Z kobylího.mléka se mezi elučni oblastí vyloučeného objemu a tetrasacharidy shromáždí frakce, která se použije pro pozdější novou kompozici oligosacharidů. Oddělení frakce obsahující cukry a minerální látky z kozího mléka na stejné fázi má za následek vznik celkové oligosacharidové frakce ochuzené o laktózu a monosacharidy. Po odsolení asoučasném zkoncentrování nanofiltrací každé frakce se provádí lyofilizace. Obě frakce se.smíchají ve.směšovacím poměru 2:5 (kobylí oligosacharidová frakce: kozí oligosacharidová frakce).

Příklad 4 ,

Kozí mléko se zpracuje tak, jak se popisuje v příkladu

1. Pomocí anexové chromatografie na AG 1 x 2 se získá kyselá frakce, jejíž hlavní složky jsou 2,3'- a 2,6'-sialyllaktóza a 2,3- a 2,6-N-glykolylneuraminyllaktóza. Tyto frakce se dále dělí chromatografií na materiálu s reverzními fázemi tak, že vznikne frakce skládající se z 2,3- a 2,6-N-glykolylneuraminyllak.tózy. Tato se odsolí elektrodialýzou, vysuší rozprašováním a dá se k dispozici pro další směsi.

9999

Z kravské syrovátky se pomocí gelové filtrace izoluje frakce složená ze šesti neutrálních trisacharidů: tři izomerní galaktozyllaktózy, fukozylovaný laktosamin a dvě laktózové jednotky prodloužené N-acetylgalaktosaminem, popřípadě N-acetylglukosaminem.

Kyselá frakce kozího mléka, jejíž převládající strukturu tvoří 2,3-izomer, se smíchá v poměru 1:7 s neutrální frakcí trisacharidů z kravské syrovátky V .suchém stavu a dá se k dispozici pro pokusy s krmivý.

Příklad -5

Z kobylího mléka se uvedenými metodami izoluje struktura lakto-N-neotetrózy a lakto-N-neohexózy. Tyto oligosacharidy se nacházejí rovněž v lidském mléku.

Z kravského mléka se uvedenými metodami chromatograficky izoluje a disialyllaktóza a lyofilizuje se.

Z kozího mléka se známými zavedenými způsoby izolují dva polohové izomery fukozylovaného tetrasacharidu.

Oligosacharidy se smíchají ve směšovacím poměru 2:1:2 (oligosacharidy z kobylího mléka; oligosacharidy z kravského mléka; oligosacharidy z kozího mléka).

Příklad 6

Z kozí syrovátky se může izolovat frakce neutrálních oligosacharidů,·která se skládá z již popsaných tetróz a dalších pentóz, popřípadě hexóz s doposud neznámým monosacharidovým složením (2 hexosaminy a 4 hexózy, popřípadě • Φ φφφφ • · *· φφ φφ φφ φφφφ · φ · • φ φ · * · φ φ φφφφ * φφφ φφφφ φφ φφφφ Φφ ·· hexosaminy a 4· hexózy' a také 3 hexosaminy a 3 hexózy) . Ze stejného zpracování se poskytne kyselá frakce, která se .frakcionuje pomocí anexové chromatografie tak, že vznikne směs složená·ze dvou různých sialyllaktóz a dvou různých glykolylneuraminyllaktóz. Kyselé oligosacharidy s delším řetězcem a také neutrální galaktozyllaktózy se pro nové vytvoření nové oligosacharidové směsi nepoužívají. Izolovaná kyselá a neutrální frakce se smíchá v poměru 2:1.

Příklad 7

Syrovátka vznikající při výrobě sýru obsahuje obvykle kromě volných oligosacharidů rovněž početné vázané oligosacharidy ve formě N- a O-glykanů. Glykomakropeptid se O-glykozyluje a laktoferin se N-glykoziduje. Příslušné glykanové struktury se v značné míře sialují. Původní poměr kyselých glykanů k neutrálním glykanům, popřípadě oligosacharidům je přibližně 1:1. Aby se tento poměr posunul ve prospěch neutrálních oligosacharidů, provádí se anexová chromatografie. Všechny sialované a vázané kyselé oligosacharidy (frakce 2) se vážou na gelovou matrici a neutrální oligosacharidy (frakce 1) se eluují demineralizovanou vodou. Všechny zavedené složky se eluují velkou iontovou sílou (například 1M NaCl) a dále zpracovávají.

V důsledku podmínek slabé hydrolýzy při pH 2,0 a 45 °C se během několika hodin dosáhne odštěpení sialové kyseliny. Po neutralizaci pomocí roztoku NaOH se tato frakce 2 spoji s neutrálními oligosacharidy (frakce 1). Poměr neutrálních oligosacharidů ke kyselým oligosacharidům se posune ve prospěch neutrálních oligosacharidů.

Claims (9)

1 až 5 proti poruchám gastrointestinálních- funkcí, které byly způsobeny bakteriálním nebo virovým obsazením gastrointestinálního traktu, nebo pro zachování' normálních gastrointestinálních funkcí..

1. Oligosacharidová směs na bázi oligosaeharidů,. které se získaly z jednoho nebo více druhů zvířecího mléka a které se skládají ze dvou nebo více monosacharidových jednotek, vyznačující se tím, že má alespoň dvě oligosacharidové frakce, z kterých každá se skládá alespoň ze dvou rozdílných oligosachar.idů, přičemž k nim nepatří volná laktóza, že celkové spektrum oligosaeharidů nacházejících se v oligosacharidové směsi se od spektra oligosaeharidů druhu zvířecího mléka nebo druhů zvířecího mléka, z kterého nebo z kterých se získaly oligosacharidové frakce, liší a že

a) pokud se oligosacharidy získaly pouze z jednoho druhu zvířecího mléka, poměr neutrálních oligosaeharidů ke kyselým · oligosacharidům je 90 až 60 : .10 až 40 % hmotn. nebo

b) pokud se oligosacharidy získaly alespoň ze dvou druhů .zvířecího mléka, tyto oligosacharidy získané ze dvou různých druhů zvířecího mléka tvoří vždy alespoň 10 % hmotn. z celkových oligosaeharidů nacházejících se v oligosacharidové směsi.

2. Oligosacharidové'směs podle nároku 1, vyznačující se tím, že pokud se oligosacharidy získaly alespoň ze dvou druhů zvířecího mléka, poměr neutrálních oligosaeharidů ke kyselým oligosacharidům je 90 až 60 : 10 až 40 % hmotn.

3. Oligosacharidová směs podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že oligosacharidy jsou vystavěny z jedné nebo více následujících monosacharidových jednotek:. D-glukózy, D-galaktózy, D-N-acetylglukosaminu, D-N-ačetylgalaktosaminu, L-fukózy, D-manózy, sialových kyselin v D-formě (D-N-acetylneuraminová kyselina a

9· 9999

99 *»*» • 9 99 • 9 999··· · • 99 ·· 9

D-N-glykolylneuraminová kysel-ina) a rovněž jejich

O-acetylovaných, sulfátovaných a fosforylovaných derivátů, /

4. Oligosacharidová směs podle jednoho z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že oligosacharidy se získaly z jednoho nebo více následujících druhů zvířecího mléka: kravského, kozího, ovčího, kobylího, velbloudího a buvolího mléka.

5. Oligosacharidová směs podle jednoho z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že oligosacharidy se získaly z nesmíchaného nebo smíchaného mléka nebo syrovátky nebo nesmíchaných nebo smíchaných mléčných výrobků z jednoho nebo více druhů zvířat.

6. Oligosacharidová.směs podle jednoho z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že kromě oligosacharidů, popřípadě oligosacharidových frakcí, získaných ze zvířecího mléka obsahuje rovněž laktózu, která může pocházet z jednoho druhu zvířecího mléka nebo z více druhů zvířecího mléka, z kterých se získaly oligosacharidy, jeden nebo více oligosacharidů nepocházejících ze;

c.r,. . zvířécího mléka a/nebo oligosacharidy uvolněné při získávání těchto oligosacharidů chemickou, enzymatickou a/nebo technologickou přeměnou glykolipidů a/nebo glykoproteinů.

7. Oligosacharidová směs podle jednoho z předcházejících nároků, .v yzn<ačující se tím, že je zavedena do kojenecké výživy, dietních potravin nebo farmaceutického prostředku nebo představuje přísadu do jinak kompletní výživy.

«· ·♦** • · • ·

8. Použití oligosacharidové směsi podle jednoho z nároků

9. Použití podle nároku 8, kde oligosacharidové směs se používá v množství 10 mg/kg až .4 g/kg tělesné hmotnosti a den.