SK288337B6 - Oligosacharidová zmes - Google Patents

Abstract

Oligosacharidová zmes na báze oligosacharidov, majúca aspoň dve oligosacharidové frakcie, z ktorých každá sa skladá aspoň z dvoch rozdielnych oligosacharidov, pričom k nim nepatrí voľná laktóza, kde celkové spektrum oligosacharidov nachádzajúcich sa v oligosacharidovej zmesi sa líši od spektra oligosacharidov tohto druhu zvieracieho mlieka alebo týchto druhov zvieracieho mlieka, z ktorého alebo z ktorých sa získali oligosacharidové frakcie, a ak sa oligosacharidy získali len z jedného druhu zvieracieho mlieka, pomer neutrálnych oligosacharidov ku kyslím oligosacharidom je 90 až 60 : 10 až 40 % hmotn., alebo ak sa oligosacharidy získali aspoň z dvoch druhov zvieracieho mlieka, tieto oligosacharidy získané z každého druhu zvieracieho mlieka tvoria vždy aspoň 10 % hmot. z celkových oligosacharidov nachádzajúcich sa v oligosacharidovej zmesi, pričom pomer neutrálnych oligosacharidov ku kyslím oligosacharidom je 90 až 60 : 10 až 40 % hmotn. Táto zmes môže byť zavedená do dojčenskej výživy, diétnych potravín alebo farmaceutického prostriedku a môže byť užitočná pri poruchách gastrointestinálnych funkcií, ktoré boli spôsobené bakteriálnym alebo vírusovým obsadením gastrointestinálneho traktu, alebo na zachovanie normálnych gastrointestinálnych funkcií.

Description

(54) Názov: Oligosacharidová zmes (57) Anotácia:

Oligosacharidová zmes na báze oligosacharidov, majúca aspoň dve oligosacharidové frakcie, z ktorých každá sa skladá aspoň z dvoch rozdielnych oligosacharidov, pričom k nim nepatrí voľná laktóza, kde celkové spektrum oligosacharidov nachádzajúcich sa v oligosacharidovej zmesi sa líši od spektra oligosacharidov tohto druhu zvieracieho mlieka alebo týchto druhov zvieracieho mlieka, z ktorého alebo z ktorých sa získali oligosacharidové frakcie, a ak sa oligosacharidy získali len z jedného druhu zvieracieho mlieka, pomer neutrálnych oligosacharidov ku kyslým oligosacharidom je 90 až 60 : 10 až 40 % hmotn., alebo ak sa oligosacharidy získali aspoň z dvoch druhov zvieracieho mlieka, tieto oligosacharidy získané z každého druhu zvieracieho mlieka tvoria vždy aspoň 10 % hmotn. z celkových oligosacharidov nachádzajúcich sa v oligosacharidovej zmesi, pričom pomer neutrálnych oligosacharidov ku kyslým oligosacharidom je 90 až 60 : 10 až 40 % hmotn. Táto zmes môže byť zavedená do dojčenskej výživy, diétnych potravín alebo farmaceutického prostriedku a môže byť užitočná pri poruchách gastrointestinálnych funkcií, ktoré boli spôsobené bakteriálnym alebo vírusovým obsadením gastrointestinálneho traktu, alebo na zachovanie normálnych gastrointestinálnych funkcií.

Oblasť techniky

Vynález sa týka oligosacharidovej zmesi obsahujúcej oligosacharidy, ktoré sa získali z jedného druhu alebo viacerých druhov mlieka zo zvierat a ktoré sú zložené z dvoch alebo viacerých monosacharidových jednotiek a použitia tejto oligosacharidovej zmesi na prípravu liečiva proti poruchám gastrointestinálnych funkcií.

Koncentrácia oligosacharidov v zrelom ľudskom (materskom) mlieku je približne 10 g/1. V ľudskom mlieku bolo doteraz opísaných približne 80 oligosacharidov odlišujúcich sa svojou štruktúrou, ktoré sa skladajú z 3 až 13 monomérov; Newburg, D. S. a Neubauer, S. H. (1995) Carbohydrates in Milk: Analysis, Quantities and Significance, in: Handbook of Milk Composition, Jensen, R. G., editor. Academic press, 273 až 349. V štruktúrnej mnohotvárnosti oligosacharidov hrá veľkú úlohu štruktúrna a polohová izoméria. Pomer neutrálnych oligosacharidov k sializovaným (kyslým) oligosacharidom, prípadne oligosacharidovým štruktúram je v zrelom mlieku približne 10 : 1.

Oligosacharidy hrajú u ľudí pri špecifickej a nešpecifickej obrane proti infekciám nasledujúce dôležité úlohy:

1. Oligosacharidy z ľudského mlieka predstavujú zdroj substrátu pre bifidobaktérie. Tým podporujú normálnu črevnú flóru potrebnú pre funkciu gastrointestinálneho traktu a potláčajú choroboplodné zárodky; Rose, C. S., Kuhn, R., Zilliken, F. und Gyorgy, P. (1954) Bifidus Factor. V. the Activity of a- and β-methylN-acetyl-D-glucosaminides, Árch. Biochem. Biophys. 49, 123 - 129.

2. Oligosacharidy zabraňujú adhézii choroboplodných zárodkov a/alebo substancií, ako sú napríklad baktérie, toxíny a eukaryotické parazity tým, že pôsobia ako špecifické analógy receptorov, čím sa zabraňuje prvému stupňu infekcie. V rôznych in vitro analýzach sa mohol dokázať antiadhezívny účinok oligosacharidov proti najrôznejším choroboplodným mikroorganizmom; Kunz, C. a Rudloff, S. (1993) Biological Functions of Oligosaccharides in Human Milk, Acta paediatr. 82, 903 - 912.

3. Oligosacharidy podporujú obranyschopnosť proti infekciám ovplyvňovaním rôznych imunologický účinných buniek. Imunomodulačný účinok istých oligosacharidových štruktúr sa mohol dokázať na zvieracom modeli zvýšením produkcie interleukínu 10 (Velupillai, P. a Harn, D. A (1994) OligosaccharideSpecific Instruction of Interleukin 10 Production by B 220+ Cells from Schistosome-Infected Mice: a Mechanism for Regulation of CD4+ T-cell subsets, Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 1 - 2.

Heterogenita oligosacharidov z väčšiny doteraz známych druhov mlieka cicavcov sa líši z mnohých hľadísk od ľudských mliečnych oligosacharidov. Vzhľadom na zloženie oligosacharidov existuje veľký počet kvantitatívnych a aj kvalitatívnych rozdielov. Druhové rozdiely v obsahu oligosacharidov v mlieku cicavcov sa vzťahujú predovšetkým na rozdiely v koncentrácii jednotlivých zložiek a taktiež štruktúry s podobnými charakteristickými znakmi a základnú štruktúru samotnú. V porovnaní s oligosacharidmi z ľudského mlieka je rozdielna sekvencia mo no sacharidov a aj naviazanie. Okrem toho množstvo väčšiny jednotlivých zložiek vo väčšine druhov zvieracieho mlieka je výrazne nižšie ako v ľudskom materskom mlieku.

Predpokladá sa, že tieto rozdiely sú podmienené požiadavkami gastrointestinálneho traktu novorodencov na zloženie oligosacharidov v mlieku. Tieto požiadavky sa veľmi menia v závislosti od druhu. Také rozdiely vzhľadom na požiadavky existujú teraz nielen v porovnaní novorodeného dieťaťa s novorodeným zvieraťom, ale aj medzi rôznymi novorodenými zvieratami. Rozdiely sú založené na stave funkcií gastrointestinálneho traktu novorodencov, na stupni vývinu imunitného systému, na výžive uprednostňovanej v závislosti od druhu a taktiež na veľmi špecifickom prostredí jedinca príslušného druhu.

Ak sa skúša teraz nahrádzať ľudské mlieko umelým mliekom alebo detskou výživou (infant formula) na báze mlieka zo zvierat, potom dochádza ku konfrontácii s tým problémom, že mlieko jediného zvieracieho druhu podľa súčasného stavu poznania nemá heterogénnu štruktúrnu rôznorodosť vzhľadom na oligosacharidy, ktorá sa vyskytuje v ľudskom mlieku.

Úlohou predloženého vynálezu je poskytnutie oligosacharidovej zmesi skladajúcej sa z oligosacharidov, ktoré sa získali z jedného alebo viacerých druhov mlieka zvierat, ktorých pozitívny účinok a najmä ktorých antiinfekčný účinok čo najviac zodpovedá účinku oligosacharidov z ľudského mlieka.

Táto úloha sa rieši prostredníctvom oligosacharidovej zmesi podľa znenia patentových nárokov.

Podstata vynálezu

Prekvapivo sa zistilo, že pomocou novej zmesi oligosacharidov z jedného, ale aj z rozličných druhov zvieracieho mlieka sa zvyšuje antiinfekčný a/alebo prebiotický účinok oligosacharidov zo zvieracieho mlieka.

Predmetom vynálezu je oligosacharidová zmes na báze oligosacharidov, ktoré sa získali z jedného alebo viacerých druhov zvieracieho mlieka a ktoré sa skladajú z dvoch alebo viacerých monosacharidových jednotiek, ktorých podstata spočíva v tom, že má aspoň dve oligosacharidové frakcie, z ktorých každá sa skladá aspoň z dvoch rozdielnych oligosacharidov, pričom k nim nepatrí voľná laktóza, že celkové spektrum oligosacharidov nachádzajúcich sa v oligosacharidovej zmesi sa od spektra oligosacharidov tohto druhu zvieracieho mlieka alebo týchto druhov zvieracieho mlieka, z ktorého alebo z ktorých sa získali oligosacharidové frakcie, líši a že

a) ak sa oligosacharidy získali len z jedného druhu zvieracieho mlieka, pomer neutrálnych oligosacharidov ku kyslým oligosacharidom je 90 až 60 : 10 až 40 % hmotn., alebo

b) ak sa oligosacharidy získali aspoň z dvoch druhov zvieracieho mlieka, tieto oligosacharidy získané z každého druhu zvieracieho mlieka tvoria vždy aspoň 10 % hmotn. z celkových oligosacharidov nachádzajúcich sa v oligosacharidovej zmesi, pričom pomer neutrálnych oligosacharidov ku kyslím oligosacharidom je 90 až 60 : 10 až 40 % hmotn.

Výhodne sú vystavané z jednej alebo viacerých z nasledujúcich monosacharidových jednotiek: D-glukózy, D-galaktózy, D-N-acetyglukozamínu, D-N-acetylgalaktozamínu, L-fukózy, D-manózy, sialových kyselín v D-forme a taktiež ich O-acetylovaných, sulfátovaných a fosforylovaných derivátov.

Výhodne sa oligosacharidy získali z jedného alebo viacerých z nasledujúcich druhov zvieracieho mlieka: kravského, kozieho, ovčieho, kobylieho, ťavieho a byvolieho mlieka.

Oligosacharidy sa získali z nemiešaného alebo zmiešaného mlieka alebo srvátky alebo nezmiešaných alebo zmiešaných mliečnych výrobkov z jedného alebo viacerých druhov zvierat.

Výhodne oligosacharidová zmes okrem oligosacharidov, prípadne oligosacharidových frakcií, získaných zo zvieracieho mlieka obsahuje taktiež laktózu, ktorá môže pochádzať z jedného druhu zvieracieho mlieka alebo z viacerých druhov zvieracieho mlieka, z ktorých sa získali oligosascharidy, jeden alebo viac oligosacharidov nepochádzajúcich zo zvieracieho mlieka a/alebo oligosacharidy uvoľnené pri získavaní týchto oligosacharidov chemickou, enzymatickou a/alebo technologickou a/alebo technologickou premenou glykolipidov a/alebo glykoproteínov.

Výhodne je oligosacharidová zmes zavedená do dojčenskej výživy, diétnych potravín alebo farmaceutického prostriedku alebo predstavuje prísadu do inak kompletnej výživy.

Výhodne je oligosacharidová zmes zavedená do dojčenskej výživy, diétnych potravín alebo farmaceutického prostriedku alebo predstavuje prísadu do inak kompletnej výživy.

Predmetom vynálezu je tiež použitie oligosacharidovej zmesi podľa vynálezu pre prípravu liečiva proti poruchám gastrointestinálnych funkcií, ktoré boli spôsobené bakteriálnym alebo vírusovým obsadením gastrointestinálneho traktu, alebo na zachovanie normálnych gastrointestinálnych funkcií.

Výhodne je oligosacharidová zmes určená pre použitie v množstve 10 mg/kg až 4 g/kg telesnej hmotnosti a deň.

Podstatný aspekt vynálezu spočíva teda v tom, že sa novým spôsobom vytvoria oligosacharidové frakcie zo zvieracieho mlieka jedného druhu, prípadne rôznych druhov tak, aby sa dosiahol zvýšený biologický účinok. Pri tomto novom vytváraní, prípadne zmiešavaní, sa prirodzene musí zaistiť, aby nevznikla žiadna zmes, ktorá by zodpovedala pôvodnej zmesi vyskytujúcej sa v jednom zvieracom mlieku alebo vo viacerých druhoch zvieracieho mlieka. Z tohto dôvodu sa musí celkové spektrum oligosacharidov nachádzajúcich sa v oligosacharidovej zmesi odlišovať od spektra druhu zvieracieho mlieka alebo druhov zvieracieho mlieka, z ktorého alebo z ktorých boli získané oligosacharidové frakcie. Ak sa oligosacharidová zmes podľa vynálezu získa len z jedného druhu zvieracieho mlieka, potom sa z tohto dôvodu má klásť dôraz na charakteristický znak týkajúci sa celkového spektra, aby nová kompozícia, prípadne zmes oligosacharidových frakcií získaná z tohto jediného druhu zvieracieho mlieka neviedla znovu k pôvodnému druhu zvieracieho mlieka. Ak sa oligosacharidová zmes získa z viacerých druhov zvieracieho mlieka, potom nová kompozícia alebo nová zmes nemôže viesť k tomu, aby získaná oligosacharidová zmes zodpovedala oligosacharidovému zloženiu pôvodne použitých druhov zvieracieho mlieka.

Ak sa oligosacharidy z oligosacharidovej zmesi podľa vynálezu získajú len z jedného druhu zvieracieho mlieka, potom je okrem toho pomer neutrálnych oligosacharidov ku kyslým oligosacharidom 90 až 60 : 10 až 40 % hmotn. Inými slovami existuje neutrálna oligosacharidová frakcia vedľa kyslej oligosacharidovej frakcie. Obidve tieto frakcie obsahujú aspoň dva rozdielne oligosacharidy. Zmenou pomerov kyslej oligosacharidovej frakcie k neutrálnej oligosacharidovej frakcii v porovnaní s pomermi neutrálnych oligosacharidov ku kyslým oligosacharidom, pôvodne existujúcim vo zvieracom mlieku, sa dá dosiahnuť zreteľné zvýšenie efektívnosti ich fyziologického účinku.

Ak sa oligosacharidy získajú z rôznych, a teda z aspoň dvoch druhov zvieracieho mlieka, nová kompozícia, prípadne nová zmes sa dá realizovať tak, že oligosacharidy získané z každého druhu zvieracieho mlieka tvoria aspoň vždy 10 % hmotn. z oligosacharidov nadchádzajúcich sa celkom v oligosacharidovej zmesi. Ak sa oligosacharidy získajú z dvoch druhov zvieracieho mlieka, potom musia oligosacharidy získané z jedného druhu zvieracieho mlieka tvoriť aspoň 10 % hmotn., zatiaľ čo oligosacharidy získané z iného druhu zvieracieho mlieka tvoria taktiež aspoň 10 % hmotn. a maximálne 90 % hmotn. a naopak. Ak sa oligosacharidy naproti tomu získajú z troch alebo viacerých druhov zvieracieho mlieka, potom musia oligosacharidy len z dvoch druhov zvieracieho mlieka tvoriť aspoň 10 % hmotn. Oligosacharidy získané z ďalších druhov zvieracieho mlieka môžu tvoriť menej ako 10 % hmotn.

Ako zdroj na prípravu oligosacharidovej zmesi podľa vynálezu sa môžu používať všetky druhy zvieracieho mlieka, pričom sa prednostne používajú frakcie z kravského, kozieho, ovčieho, kobylieho, ťavieho a byvolieho mlieka.

Izolácia oligosacharidových frakcií sa uskutočňuje pomocou známych oddeľovacích spôsobov. Odtučnenie sa môže uskutočňovať prostredníctvom odstreďovania použitím odstredivky. Oddelenie proteínov sa môže uskutočňovať ultrafiltráciou, prípadne vyzrážaním rozpúšťadlom (napríklad etanolom, acetónom). Obsah laktózy sa môže znižovať pomocou jedného alebo viacerých z nasledujúcich spôsobov: kryštalizáciou, filtráciou, chromatografickými metódami (chromatografia s výmenou ligandov, gélová filtrácia, elučná chromatografia, recyklačná chromatografia a simulovaná protiprúdová chromatografia (SMB)). Minerálne látky sa oddeľujú elektrodialýzou, nanofiltráciou, iónovou výmenou a/alebo reverznou osmózou. Frakcionácia oligosacharidov na neutrálne a kyslé oligosacharidy sa uskutočňuje jednou z vyššie uvedených chromatografických metód a/alebo anexovou chromatografiou a taktiež alternatívne filtráciou.

Podľa prednostnej formy uskutočnenia sa oligosacharidová zmes podľa vynálezu, ktorej oligosacharidy sa získavajú aspoň z dvoch druhov zvieracieho mlieka, novým spôsobom vytvára tak, aby taktiež v tomto prípade bol pomer neutrálnych oligosacharidov ku kyslým oligosacharidom 90 až 60 : 10 až 40 % hmotn.

Pomocou hodnôt pomerov v predložených podkladoch 90 až 60 : 10 až 40 % hmotn. sa zároveň zahŕňajú a zverejňujú aspoň všetky celočíselné medzihodnoty, napríklad 89 : 11, 88 : 12, 87 : 13, 85 : 15, 80 : 20, 79 : 21, 75 : 25, 74 : 26, 73 : 27, 72 : 28, 68 : 32, 67 : 33, 66 : 34, 65 : 35, 64 : 36, 63 : 37, 62 : 38, 61 : 39.

Prednostne sú oligosacharidy v oligosacharidovej zmesi podľa vynálezu vystavané z jednej alebo viacerých z nasledujúcich monosacharidových jednotiek: D-glukózy, D-galaktózy, D-N-acetylglukozamínu, D-N-acetylgalaktozamínu, L-fukózy, D-manózy, sialových kyselín v D-forme (napríklad kyselina D-N-acetylneuramínová a kyselina D-N-glykolylneuramínová) a taktiež ich O-acetylovaných, sulfátovaných a fosforylovaných derivátov.

Voľná laktóza nachádzajúca sa vo zvieracom mlieku vo veľkom množstve sa ostatne nepočíta k oligosacharidom získaným zo zvieracieho mlieka, ktoré vytvárajú oligosacharidové frakcie používané podľa vynálezu. Ale aj v oligosacharidovej zmesi podľa vynálezu môže byť voľná laktóza okrem oligosacharidových frakcií používaných podľa vynálezu.

Inými slovami oligosacharidová zmes podľa vynálezu môže byť vytvorená výlučne z oligosacharidových frakcií, ktoré obsahujú oligosacharidy, ktoré sa získali z jedného alebo viacerých druhov zvieracieho mlieka a sú zložené z dvoch alebo viacerých monosacharidových jednotiek, pričom voľná laktóza k nim nepatrí. Ale oligosacharidová zmes, ako sa uviedlo, môže obsahovať voľnú laktózu, i keď teraz pochádza zo zvieracieho mlieka alebo nie. Ďalej oligosacharidová zmes môže obsahovať jeden alebo viac oligosacharidov, ktoré nepochádzajú zo zvieracieho mlieka. Teda oligosacharidová zmes podľa vynálezu sa môže napríklad zmiešať s obvyklými sacharidmi, ktoré sa používajú na prípravu výživy a najmä dojčenskej výživy. Okrem toho v oligosacharidovej zmesi podľa vynálezu môžu byť obsiahnuté taktiež také oligosacharidy, ktoré sa uvoľnili pri získavaní oligosacharidov, prípadne oligosacharidových frakcií, používaných podľa vynálezu, chemickou, enzymatickou a/alebo technologickou premenou z glykolipidov a/alebo glykoproteínov.

Keď sa v rámci predložených podkladov hovorí o oligosacharidoch, potom sa tento výraz vzťahuje najmä na také oligosacharidy, ktoré sa získali zo zvieracieho mlieka. Okrem toho môžu byť prítomné aj iné oligosacharidy, ako sa to uviedlo vyššie, pričom táto okolnosť sa zmieňuje alebo vyplýva z tejto súvislosti.

Prednostný zdroj na izoláciu oligosacharidov predstavujú mliečne výrobky, z ktorých sa čiastočne a/alebo úplne odstránili proteínové frakcie a taktiež tuk. Spracovanie a frakcionácia z produktov, ako je napríklad frakcia laktózy a minerálnych látok, ktorá vzniká pri získavaní smotany, kazeínová frakcia a ďalšie zložky, sa zreteľne zjednodušuje. Supernatant vzniknutý pri výrobe farmaceutickej laktózy taktiež predstavuje vhodný východiskový zdroj pre rôzne oligosacharidy. Pri tom sa pred uskutočnením vlastnej izolácie frakcií môže mlieko, prípadne srvátka od jedného zvieracieho druhu alebo od rôznych zvieracích druhov pred frakcionáciou oligosacharidov v požadovanom pomere miešať, ako je to potrebné pre účinnú oligosacharidovú zmes jednotlivých štruktúr alebo štruktúrnych skupín.

Oligosacharidová zmes podľa vynálezu sa môže používať vo forme s vysokou koncentráciou alebo v čistej forme pri poruchách gastrointestinálnych funkcií, pri ktorých hrá úlohu dysbaktéria (t. j. porucha gastrointestinálnej flóry, napríklad po podávaní antibiotík alebo iných medikamentov ovplyvňujúcich/drevnú flóru po neznášanlivosti potravín atď.), prípadne vírusové infekcie. Môže sa používať taktiež na prevenciu takých gastrointestinálnych infekcií. Okrem toho oligosacharidová zmes podľa vynálezu sa môže pridávať do dojčenskej výživy, diétnych potravín alebo farmaceutického prostriedku.

Oligosacharidová zmes podľa vynálezu môže predstavovať aj prísadu k inak kompletnej výžive. Takými výživami sú napríklad dojčenské výživy, prípadne infant formulae a prípravky na enterálnu klinickú výživu. Ďalej sa môže používať ako prísada do obvyklých potravín na zachovanie normálnych gastrointestinálnych funkcií (v zmysle prevencie) a taktiež na zlepšenie gastrointestinálnych funkcií po poruchách, pri ktorých hrá úlohu nevhodné bakteriálne alebo vírusové rozloženie v gastrointestinálnom trakte.

Oligosacharidová zmes podľa vynálezu môže byť upravená vo forme kapsúl, prípadne prášku alebo v zriedenej forme, ako prísada k inak kompletnej instantnej výžive.

Oligosacharidová zmes podľa vynálezu sa prednostne používa v množstve aspoň 10 mg/kg až 4 g/kg telesnej hmotnosti a na deň, pričom miligramové hodnoty sa vzťahujú na tri oligosacharidy v oligosacharidovej zmesi podľa vynálezu, ktoré sa získali zo zvieracieho mlieka. Iné oligosacharidy, ktoré sú prípadne k dispozícii, ako je napríklad laktóza a oligosacharidy nepochádzajúce zo zvieracieho mlieka, sa pri tom nechávajú nepovšimnuté. Obzvlášť prednostne sa podáva približne 100 mg/kg a deň.

Vynález sa v nasledujúcom texte bližšie vysvetľuje na základe príkladov opisujúcich prednostne formy uskutočnenia.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

100 1 kravského mlieka sa spracuje nasledujúcim spôsobom:

Oddelenie tuku sa uskutočňuje prostredníctvom odstreďovania pri teplote 45 °C. Vzniknuté odstredené mlieko sa deproteinuje zrážaním etanolom (konečná koncentrácia 66 % etanolu). Vyzrážaný precipitát sa oddelí pomocou odstredivky. Etanol a časť vody sa odparí pomocou spádovej odparky tak, aby objem bol 40 1. V ňom sú približne 4 kg laktózy, 1 kg minerálnych látok a iné rozpustné zložky, ako napríklad vo vode rozpustné vitamíny, močovina alebo citráty. Podiel oligosacharidov je približne 10 g. Oligosacharidová frakcia pozostáva približne z rovnakých dielov neutrálnych a sialyzovaných Štruktúr. Pomocou anexovej chromatografie na AG 1 x 2 sa uskutočňuje delenie na neutrálnu (elučné činidlo: demineralizovaná voda) a kyslú frakciu (elučné činidlo: 300 mM octan amónny). Z neutrálnej frakcie sa odstráni 60 % laktózy pomocou kryštalizačnej techniky. Pomocou gélovej chromatografie na Toyopearl HW 40 (S) sa dosiahne to, že sa získa 5 g neutrálnej oligosacharidovej frakcie, v ktorej zvyškový obsah laktózy je približne 10 %. Z frakcie sialyzovaných oligosacharidov sa elektrodialýzou odstráni anexový elučný tlmivý roztok (octan amónny) a frakcia sa taktiež lyofilizuje ako neutrálna oligosacharidová frakcia. Týmto spôsobom sa môže získať 4,5 g sialyzovanej oligosacharidovej frakcie. Pomocou novej kompozície z 1 g kyslej frakcie s 5 g neutrálnej frakcie sa získa aktívnejšia zmes ako v prípade prírodného zloženia.

Príklad 2

Srvátky vznikajúce pri výrobe syra z kozieho, ovčieho a kravského mlieka sa pred spracovaním zmiešajú v pomere 3:1:1 tak, aby bolo k dispozícii 4000 1 celkovej srvátky od troch rôznych druhov zvierat. Ultrafiltráciou s polysulfónovou membránou (cutoff 20 kDa) sa oddelí zvyškový tuk, glykomakropeptid nachádzajúci sa v roztoku a proteíny zo srvátky. Permeát sa nechá následkom reverznej osmózy skoncentrovať na 900 1. Ďalší spôsob postupu zodpovedá vyššie opísanému, pričom najskôr sa uskutočňuje kryštalizácia laktózy a potom anexová chromatografia s cieľom oddeliť peptidy. Frakcie z elučných stupňov s demineralizovanou vodou a 300 mM octanom amónnym sa spoja, skoncentrujú, elektrodialyzujú a lyofilizujú. Môže sa získať zmes oligosacharidov troch rôznych druhov v množstve 570 g. Po ďalšom delení gélovou filtráciou a odsolení elektrodialýzou sa môže získať požadovaný produkt lyofilizáciou. Analýza prostredníctvom gélovej filtrácie, HPAEC-PAD a MALDI-MS ukazuje, že podľa použitých druhov mlieka a zmiešavacieho pomeru je pomer kyslých oligosacharidov k neutrálnym oligosacharidom 1:5. Podiel galaktozyllaktózy sa môže vyčísliť v dôsledku vysokého podielu kozej srvátky na 120 g. V ovčom mlieku prevláda kyselina N-glykolylneuramínová v porovnaní s kyselinou N-acetylneuramínovou ako dôležitá zložka kyslých oligosacharidov. Preto sa podiel glykolylneuraminyloligosacharidov zvyšuje v porovnaní s kozím a kravským mliekom.

Príklad 3

Súčasne sa spracováva kobylie a kozie mlieko. Z každého je k dispozícii 50 1. Z každého sa odstredením, vyzrážaním proteínov etanolom a separáciou získa frakcia obsahujúca cukry a minerálne látky. Použitím rotačnej odparky sa obidva roztoky skoncentrujú na 8 1. Pomocou chromatografie s výmenou ligandov na AG 501 x 8 (Ca²⁺-forma) a elúcie demineralizovanou vodou sa dosiahne chromatografické oddelenie laktózy a monosacharidov na jednej strane a na druhej strane subfrakcionácia oligosacharidov. Z kobylieho mlieka sa medzi elučnou oblasťou vylúčeného objemu a tetrasacharidmi zhromaždí frakcia, ktorá sa použije na ďalšiu novú kompozíciu oligosacharidov. Oddelenie frakcie obsahujúcej cukry a minerálne látky z kozieho mlieka na rovnakej fáze má za následok vznik celkovej oligosacharidovej frakcie ochudobnenej o laktózu a monosacharidy. Po odsolení a súčasnom skoncentrovaní nanofiltráciou každej frakcie sa uskutočňuje lyofilizácia. Obidve frakcie sa zmiešajú v zmiešavacom pomere 2 : 5 (kobylia oligosacharidová frakcia : kozia oligosacharidová frakcia).

Príklad 4

Kozie mlieko sa spracuje tak, ako sa opisuje v príklade 1. Pomocou anexovej chromatografie na AG 1 x 2 sa získa kyslá frakcia, ktorej hlavné zložky sú 2,3'- a 2,6'-sialyllaktóza a 2,3'- a 2,6'-N-glykolylneuraminyllaktóza. Tieto frakcie sa ďalej delia chromatografiou na materiáli s reverznými fázami tak, že vznikne frakcia skladajúca sa z 2,3'- a 2,6'-N-glykolylneuraminyllaktózy. Táto sa odsolí elektrodialýzou, vysuší rozprašovaním a dá sa k dispozícii pre ďalšie zmesi.

Z kravskej srvátky sa pomocou gélovej filtrácie izoluje frakcia zložená zo šiestich neutrálnych trisacharidov: tri izomérne galaktozyllaktózy, fukozylovaný laktozamín a dve laktózové jednotky predĺžené N-acetylgalaktozamínom, prípadne N-acetylglukozamínom.

Kyslá frakcia kozieho mlieka, ktorej prevládajúcu štruktúru tvorí 2,3-izomér, sa zmieša v pomere 1 : 7 s neutrálnou frakciou trisacharidov z kravskej srvátky v suchom stave a dá sa k dispozícii na pokusy s krmivami.

Príklad 5

Z kobylieho mlieka sa uvedenými metódami izoluje štruktúra lakto-N-neotetrózy a lakto-N-neohexózy. Tieto oligosacharidy sa nachádzajú taktiež v ľudskom mlieku.

Z kravského mlieka sa uvedenými metódami chromá to graficky izoluje a disialyllaktóza a lyofilizuje sa.

Z kozieho mlieka sa známymi zavedenými spôsobmi izolujú dva polohové izoméry fukozylovaného tetrasacharidu.

Oligosacharidy sa zmiešajú v zmiešavacom pomere 2:1:2 (oligosacharidy z kobylieho mlieka; oligosacharidy z kravského mlieka; oligosacharidy z kozieho mlieka).

Príklad 6

Z kozej srvátky sa môže izolovať frakcia neutrálnych oligosacharidov, ktorá sa skladá z už opísaných tetróz a ďalších pentóz, prípadne hexóz s doteraz neznámym monosacharidovým zložením (2 hexozamíny a 4 hexózy, prípadne 2 hexozamíny a 4 hexózy a aj 3 hexozamíny a 3 hexózy). Z rovnakého spracovania sa poskytne kyslá frakcia, ktorá sa frakcionuje pomocou anexovej chromatografie tak, že vznikne zmes zložená z dvoch rôznych sialyllaktóz a dvoch rôznych glykolylneuraminyllaktóz. Kyslé oligosacharidy s dlhším reťazcom a neutrálne galaktozyllaktózy sa na nové vytvorenie novej oligosacharidovej zmesi nepoužívajú. Izolovaná kyslá a neutrálna frakcia sa zmieša v pomere 2:1.

Príklad 7

Srvátka vznikajúca pri výrobe syra obsahuje obvykle okrem voľných oligosacharidov taktiež početné viazané oligosacharidy vo forme N- a O-glykánov. Glykomakropeptid sa O-glykozyluje a laktoferín sa N-glykoziduje. Príslušné glykánové štruktúry sa v značnej miere sialujú. Pôvodný pomer kyslých glykánov k neutrálnym glykánom, prípadne oligosacharidom je približne 1:1. Aby sa tento pomer posunul v prospech neutrálnych oligosacharidov, uskutočňuje sa anexová chromatografia. Všetky sialované a viazané kyslé oligosacharidy (frakcia 2) sa viažu na gélovú matricu a neutrálne oligosacharidy (frakcia 1) sa eluujú demineralizovanou vodou. Všetky zavedené zložky sa eluujú veľkou iónovou silou (napríklad IM NaCl) a ďalej spracovávajú.

V dôsledku podmienok slabej hydrolýzy pri pH 2,0 a 45 °C sa v priebehu niekoľkých hodín dosiahne odštiepenie kyseliny sialovej. Po neutralizácii pomocou roztoku NaOH sa táto frakcia 2 spojí s neutrálnymi oligosacharidmi (frakcia 1). Pomer neutrálnych oligosacharidov ku kyslým oligosacharidom sa posunie v prospech neutrálnych oligosacharidov.

Claims (8)

1. Oligosacharidová zmes na báze oligosacharidov, ktoré sa získali z jedného alebo viacerých druhov zvieracieho mlieka a ktoré sa skladajú z dvoch alebo viacerých monosacharidových jednotiek, vyznačujúca sa tým, že má aspoň dve oligosacharidové frakcie, z ktorých každá sa skladá aspoň z dvoch rozdielnych oligosacharidov, pričom k nim nepatrí voľná laktóza, že celkové spektrum oligosacharidov nachádzajúcich sa v oligosacharidovej zmesi sa od spektra oligosacharidov tohto druhu zvieracieho mlieka alebo týchto druhov zvieracieho mlieka, z ktorého alebo z ktorých sa získali oligosacharidové frakcie, líši a že

a) ak sa oligosacharidy získali len z jedného druhu zvieracieho mlieka, pomer neutrálnych oligosacharidov ku kyslým oligosacharidom je 90 až 60 : 10 až 40 % hmotn., alebo

b) ak sa oligosacharidy získali aspoň z dvoch druhov zvieracieho mlieka, tieto oligosacharidy získané z každého druhu zvieracieho mlieka tvoria vždy aspoň 10 % hmotn. z celkových oligosacharidov nachádza júcich sa v oligosacharidovej zmesi, pričom pomer neutrálnych oligosacharidov ku kyslým oligosacharidom je 90 až 60 : 10 až 40 % hmotn.

2. Oligosacharidové zmes podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že oligosacharidy sú vystavané z jednej alebo viacerých z nasledujúcich monosacharidových jednotiek: D-glukózy, D-galaktózy, D-N-acetyglukozamínu, D-N-acetylgalaktozamínu, L-fukózy, D-manózy, sialových kyselín v D-forme a taktiež ich O-acetylovaných, sulfátovaných a fosforylovaných derivátov.

3. Oligosacharidová zmes podľa jedného z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúca sa tým, že oligosacharidy sa získali z jedného alebo viacerých z nasledujúcich druhov zvieracieho mlieka: kravského, kozieho, ovčieho, kobylieho, ťavieho a byvolieho mlieka.

4. Oligosacharidová zmes podľa jedného z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúca sa tým, že oligosacharidy sa získali z nezmiešaného alebo zmiešaného mlieka alebo srvátky alebo nezmiešaných alebo zmiešaných mliečnych výrobkov z jedného alebo viacerých druhov zvierat.

5. Oligosacharidová zmes podľa jedného z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúca sa tým, že okrem oligosacharidov, prípadne oligosacharidových frakcií, získaných zo zvieracieho mlieka obsahuje taktiež laktózu, ktorá môže pochádzať z jedného druhu zvieracieho mlieka alebo z viacerých druhov zvieracieho mlieka, z ktorých sa získali oligosacharidy, jeden alebo viac oligosacharidov nepochádzajúcich zo zvieracieho mlieka a/alebo oligosacharidy uvoľnené pri získavaní týchto oligosacharidov chemickou, enzymatickou a/alebo technologickou premenou glykolipidov a/alebo glykoproteínov.

6. Oligosacharidová zmes podľa jedného z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúca sa tým, že je zavedená do dojčenskej výživy, diétnych potravín alebo farmaceutického prostriedku alebo predstavuje prísadu do inak kompletnej výživy.

7. Použitie oligosacharidovej zmesi podľa jedného z nárokov 1 až 4 pre prípravu liečiva proti poruchám gastrointestinálnych funkcií, ktoré boli spôsobené bakteriálnym alebo vírusovým obsadením gastrointestinálneho traktu, alebo na zachovanie normálnych gastrointestinálnych funkcií.

8. Použitie podľa nároku 7, kde oligosacharidová zmes je určená pre použitie v množstve 10 mg/kg až 4 g/kg telesnej hmotnosti a deň.