CZ20021342A3

CZ20021342A3 - Receptorový komplex, buněčný povrchový receptorový komplex a jejich pouľití

Info

Publication number: CZ20021342A3
Application number: CZ20021342A
Authority: CZ
Inventors: James A. Clagett; Craig Palmer
Original assignee: Histatek, Llc
Priority date: 1999-10-15
Filing date: 2000-10-12
Publication date: 2003-01-15
Also published as: EA200200451A1; PL356096A1; NO20021732L; JP2004507441A; NO20021732D0; BR0014742A; MXPA02003782A; WO2001029069A1; CA2387559A1; ZA200202937B; IL149125A0; CN100497374C; EP1222199A1; EP1222199A4; CN1633447A; KR20020057972A; AU8014200A; HUP0203688A2

Description

OBLAST TECHNIKY

Tento vynález se týká receptorů N-formylpeptidů, které se nacházejí na povrchu buněk z periferní krve, a zejména komplexů takových receptorů s činidly, které pozměňují nebo přerušují G-proteinovou signální dráhu, zejména určitých N-formylpeptidů, a způsobů pro pozměnění signálního přenosu díky kostimulace prozánětlivými činidly.

DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY

Lidské tělo vyvinulo obranné mechanismy proti bakteriálním infekcím za použití bakteriálně připravených N-formylmethionylpeptidů jako chemoatraktantů pro fagocytózu, zejména neutrofílů a monocytů. Z N-formylpeptidů byl f-Met-Leu-Phe (FMLP) určen jako nejsilnější ve schopnosti posílit fagocytózu a stimulovat uvolnění lysozomálních enzymů neurofily (Showell et al., J. Exp. Med. 143: 1154-1169, 1976). Následně bylo ukázáno, že syntetické tetrapeptidy, zejména f-Met-IIe-Phe-Leu a f-Met-Leu-Phe-Ile, vyvolávají neutrofílní odpověď (Rot et al., Proč. Nati. Acad. Scie. USA 84: 7967-7971, 1987). Účinnost těchto peptidů byla nejprve připisována: (1) formylové skupině na N-konci, (2) methioninovému bočnímu řetězci a (3) leucinovému a fenylalaninovému bočnímu řetězci.

Klonování N-formylpeptidového receptorů (FRP) cDNA, následované zobrazením primární struktury FPR proteinu, poskytlo hlavní průlom v porozumění mechanismu působení N-formylpeptidů (Boulay et al., Biochemistry 29: 11123-11 133, 1990; Boulay et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 168: 1 103-1 109, 1990). FPR byl nejprve nalezen na neutrofilech a monocytech, ale následně bylo ukázáno, že je exprimován v lidském mozku, hepatocytech, dendritických buňkách a astrocytech (Lacy et al., J. Neuroimmunol. 61: 71-78, 1995; Sozzani et al., J. Immunol. 155: 3292-3295, 1995). Později byly izolovány dva jiné FPR geny, FPR2 (také známý jako FPRL1 a FPRH1) (Bao et al., Genomics 13: 437-440, 1992; Murphy et al., J. Biol. Chem. 267: 7637-7643, 1992; Ye et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 184: 582-589, 1992) a FPRL2 (Bao et al., supra). FPRLl se skládá z 351 aminokyselin a vykazuje 70% shodnost s FPR, ale bylo zjištěno, že má 400 krát nižší afinitu k FMLP (Kd= 1 nM) než původní FPR. FPRL2 vykazuje 56% shodnost s FPR a 83% shodnost s FPRL1. Nicméně na rozdíl od FPRL1, který je exprimován v monocytech i neutrofilech, byla exprese FPRL2 nalezena v monocytech, ale ne v neutrofilech (Durstin et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 201: 174-179, 1994).

FPR obsahuje sedm hydrofóbních domén, rozprostírajících se v plasmové membráně, spojených hydrofilními sekvencemi, vystavených buď v extracelulárním prostoru nebo v intracelulárním prostoru (Murphy, Annu. Rev. Immunol. 12: 593-633, 1994). První a třetí intracelulární smyčky jsou relativně malé, skládající se z 5 a 16 aminokyselin. Karboxylový konec je vystaven do intracelulárního prostoru, zatímco N-konec je vystaven do extracelulárního prostoru. Intracelulární sekvence dále obsahují G-protein vazebnou doménu (doménu nezbytnou pro funkci receptoru, jak je diskutováno níže) a potenciální fosforylační doménu.

Ukazuje se, že FMLP vazebná doména je umístěna na první a třetí extracelulární doméně FPR (Quehenberger et al., J. Biol. Chem. 268: 18167-18175, 1993). Navíc jsou náznaky vzájemně převeditelných stavů FPR, střídající se mezi vysokoafinitním vazebným a nízkoafinitním vazebným stavem pro FMLP vázání (Kermode et al., Biochem. J. 276: 715-723, 1991). G-protein je považován za regulující takové vzájemně převeditelné stavy. FPR samotný, bez asociace s G-proteinem, představuje nízkoafinitní stav, zatímco FPR vázaný na G-protein vykazuje vysokoafinitní vazebný stav. Model dále rozděluje G-protein navázaný na FPR do tří různých stavů, které vysvětlují různé účinky, pozorované s různými peptidy. Stav I představuje nízkoafintní vazebný stav, ve kterém FPR není asociováno s G-proteinem, ale může být převedeno na vysokoafinitní stav stavu II při navázání na G-protein. Stav III je vysokoafinitní přechodný krok, ve kterém receptor váže ligand, zatímco odblokovává G_a podjednotku G-proteinu. Stav IV je přechodný, nízkoafinitní stav, ve kterém zbývající G-proteinové podjednotky (Gp a G_Y) disociují z receptoru. Disociace G-proteinové jednotky G_a vede k účinější funkci G-proteinu, způsobující buněčnou aktivaci. Podobný model byl navržen Sklářem et al. (J. Biol. Chem. 264: 8483-8486, 1989).

Podle výše uvedeného modelu je účinnost peptidu určena dobou pobytu ve stavu III (Kermode et al., viz. výše). Autoři navrhují, že nejvíce účinné peptidy, jako jsou fMet-Leu-Phe a fMet-Leu-Phe-NHBzl dočasně stabilizují a podporují stav III, který spouští okamžitou degranulační odpověď, ale trvání stavu III poskytuje trvalý signál pro chemotaktické odpovědi, dovolujících maximální migraci. Nižší síla formylovaných peptidů zprostředkovává rychlou přeměnu z vysokoafinitního stavu III na nízkoafinitní ί» « · « ·· · · · · » to · ···« · · · ······· ·· * · · · · · · · stav IV. Ačkoliv počáteční degranulační odpověď ve stavu III je neovlivněná, je chemotaktická signalizační schopnost minimalizována a tak je buněčná migrace omezena. Proto obvykle může být velmi účinný ligand uveden ke způsobení chemotaktických odpovědí vazbou na vysokoafinitní stav FPR, zatímco málo účinný ligand způsobuje degranulační odpověď vazbou na nízkoafinitní stav FPR.

Agonistická aktivita a antagonistická aktivita mohou také být definovány použitím tohoto modelu. Agonista stabilizuje aktivovaný receptorový stav III a stupeň stabilizace je odrazem jeho účinnosti. Antagonista se na druhé straně váže na receptor, ale destabilizuje aktivovaný stav III a inaktivuje receptor. Takový model se neomezuje na FPR.

Dále snížením citlivosti se nazývá, jestliže nastává to, že se ligand váže na receptor a stejný nebo jiný receptor se stává odolným k následující stimulaci stejným nebo jiným ligandem. Tento stav snížené citlivosti se může vytvořit po receptorovém obsazení v normálním průběhu buněčné aktivace, mající za následek destabilizaci stavu III, nebo před receptorovým obsazením, ve kterém stav III není nikdy dosažen. Jestliže odolný stav nebo receptorová inaktivace je indukována jedním stimulem a působí na četné neligandové receptory, je tato situace nazývána heterologní snížení citlivosti.

Nejlépe studovaný N-formylpeptid je f-Met-Leu-Phe (FMLP nebo fMLP). Nicméně účinější peptidy byly určeny s receptory na králičích neutrofilech in vitro, zejména fMet-Leu-Phe-Phe, fMet-Leu-Phe-NHBzl (fMet-Leu-Phe benzylamid) a fNle-Leu-Phe-Tyr (N-formyl-L-norleucyl-Leu-Phe-Tyr) (Kermode et al., viz. výše). Tyto vykazují maximální migraci (řádově 20 až 35 pm) i degranulaci (řádově ED₅o 1Ο’^Ιθ až 10’¹¹). Více nových studií navrhuje, že neformylované peptidy se mohou také vázat na FPR a mohou působit jako účinné aktivátory neutrofilové funkce. Například Met-Met-Trp-Leu-Leu je účinný pentapeptid a je srovnatelný v aktivitě s FMLP (Chen et al., J. Biol. Chem. 270: 23398-23401, 1995). Přeměna pentapeptidu na N-formylovanou formu, která zesílí jeho účinnost 100 až 500 krát, ukazuje, že N-formylace stále hraje významnou roli v účinnosti peptidu, ačkoliv bioaktivita se nezdá být striktně určená N-formylací.

Jiné modifikace peptidů ukázaly, že některé peptidy mohou být přeměněny na účinné agonisty FPR (Derian et al., Biochemistry 35:1265-1269, 1996; Higgins et al., J. Med. Chem. 39: 1013-1017, 1996). Takové modifikace zahrnují močovinovou substituci aminokoncové skupiny a karbamátové modifikace. Dále změna aminokyselinového • · · * ♦ · · ···· » · ····· ·· « • · ···· r · » «······ ·· #· ·· ♦ · · · složení MLF peptidu ukázala také změnu agonistů na antagonisty FPR, jak určuje uvolnění superoxidového aniontu a neutrofílová adheze na cévní endothelium.

Chemotaxe, stimulovaná N-formylpeptidy přes neutrofily, byla dobře prostudována. I před stimulací N- formylpeptidy se neutrofily přechodně vázaly na P-zóny, exprimované na endothelových buňkách. Aktivace neutrofilů, způsobené N-formylpeptidy, tvořenými v místě zánětu, vede k akumulaci neutrofilů v tomto místě.

N- formylpeptidy regulují L-zóny na neutrofilech a přímo koncentrují neutrofily podél endothelia, následované regulací integrinů na povrchu neutrofilů. Integriny zprostředkované interakce buňka-buňka a buňka-extracelulární matrice a vazba na laminin, fibronectin, victronectin, stejně jako na ICAM (vnitrobuněčnou buněčnou adhezi molekul) a VCAM (vaskulární buněčnou adhezi molekul) byly nalezeny v endotheliu. Při vazbě integrinů na ICAM a VCAM je signál převeden dovnitř neurofilu přes interakci s cytoskeletem. Neutrofily pak odloučí L-zónu a začnou se šířit podél endothelia. Regulace E-zóny a ICA-1 na povrchu endothelových buněk pak zprostředkuje migraci neutrofilů přes endothelium (Luscinskas et al., J. Immunol. 146:

1617-1625, 1991). Při přecházení endothelové bariéry neutrofily migrují k místu zánětu citlivostí ke koncentračnímu gradientu N-formylpeptidu. Při dosahování cíle, který obsahuje vysokou koncentraci peptidu, spouštějí neutrofily antimikrobiální působení.

Stimulované neutrofily rychle aktivují respirační rychlou oxidázu, která katalyzuje vznik superoxidového radikálu O₂’. Superoxidový radikál reaguje s dalšími molekulami za vzniku peroxidu vodíku a kyseliny chlorné, oba jsou vysoce reaktivní činidla a jsou proto účinná při zasahování do mikrobiálních funkcí. Degranulace je také účinný prostředek pro destrukci cizích mikrobů. Nicméně degranulace může také poškodit hostitelskou tkáň. Fagocytóza je jiný mechanismus, kterým neutrofily eliminují cizí mikroby. Mnoho těchto funkcí je stimulováno G-proteinem, používající fosfolipázy jako druhých poslů, tři z nich byly charakterizovány.

Fosfolipáza C, PLCp₂, tvoří dva druhé posly, 1, 4, 5- ionsitoltrifosforečnan (IP3) a diacylglycerol (DG), βγ podjednotky G-proteinu tvoří v průběhu aktivace FPR aktivovaný PLCp₂. IP3 se váže na některé vápenaté kanály pro stimulování uvolnění vápníku z vnitrobuněčných rezerv, mající za následek zvýšení cytosolické koncentrace vápníku, která je pozorována v průběhu stimulace chemoatraktanty. DG, v souladu s uvolňováním vápníku, aktivuje proteinkinázu C (PKC). G-protein, aktivovaný PLC kinázou, byl nedávno popsán v literatuře (Beaven, et al., J. of Immunology 160: 51365 • « ···· ··· ······· ·« «· · · ····

-5144, 1998) jako hlavní cesta pro degranulaci mastocytů v krysích peritoneálních buňkách in vitro, spojené se vzrůstem Ca²⁺.

Fosfolipáza A₂ (PLA₂) tvoří arachidonovou kyselinu z fosfolipidů vnitřní strany plasmové membrány. Arachidonová kyselina poskytuje prekurzory pro zánětlivé mediátory, jako jsou leukotrieny a prostaglandiny. PLA₂ je aktivována při fosforylaci mitogenaktivovanou protein (MAP) kinázou.

Třetí fosfolipáza je fosfolipáza D (PLD), která tvoří fosfatidovou kyselinu a cholin z fosfatidylcholinu. Fosfatidová kyselina může být zahrnuta v aktivaci respirační rychlé oxidázy mimoto, že hraje roli v produkci DG, která aktivuje PKC. Nicméně aktivace PLD vyžaduje vápník a FMLP nemůže stimulovat PLD ve vápníku zbavených buňkách (Kessels et al., J. Biol. Chem. 266: 23152-23156, 1991). Dále se zdá, že G-protein Arf a G-protein Rho regulují PLD aktivitu (Brown et al., Cell 75: 1137-1144, 1993; Cockcroft et al., Science 263:523-526, 1994; Singer et al., J. Biol. Chem. 270:14944-14950, 1995).

Proteinová fosforylace hraje centrální roli v přenosu signálů, iniciovaném FMLP. Ve fosforylaci proteinů jsou zahrnuty tři hlavní proteinkinázy jako výsledek FMLP stimulace.

Jak je diskutováno výše, PKC je aktivovaná DG, která je tvořena PLC. PKC způsobuje fosforylaci serinových a threoninových zbytků. PKC se skládá ze šesti různých izoforem, tři z nich jsou citlivý k vnitrobuněčnému vápníku (α, β a γ formy) a tří, které nejsou (δ, ε a ζ formy). Neutrofily obsahují α, β a ζ formy, ale ne γ formu. Vápník-závislé a DG-závislé PKC (PKC-β) reaguje na FMLP a forbolesterovou stimulaci přesunem z cytosolu k membráně. Pak fosforyluje množství cytosolických proteinů, jako jsou ty zahrnuté v systému respirační rychlé oxidázy. FMLP také může aktivovat vápník-závislou, DG-závislou a fosfatidylserin-závislou PKC formu, ale jejich funkce je nejasná.

MAP kináza (MAPK) je údajně aktivována βγ podjednotkami G-proteinů aktivitou Ras a Raf. Současná literatura naznačuje zahrnutí vysoce intenzivní Ras signalizace při navozování apoptózy (Bar-Sagi et al., J. Mol. Cell Biol. 19(9): 5892-901, 1999) stejně jako při podpoře adheze endothelových buněk (Fikel et al., ........................). Nyní se předpokládá, že Raf má klíčovou roli v růstových signálech, které zahrnují přežití buněk, růst a diferenciaci (Rapp et al., ...................). Tato kinázová dráha je také stimulována C5a a IL-8 (Buhl et al., J. Biol. Chem. 271: 2832-2838, 1996). MAP kináza způsobuje fosforylaci tyrozinu některých regulatorních proteinů, jako je extracelulární ··*· ··· ···· • · ····· « · · « · «··· · · » ·«····· ·· · · ·* ·«·· signálem regulovanou kináza (ERK)-l. Současná literatura naznačuje, že MAPK cesty jsou odpovědné za produkci cytokinů; nicméně aktivace TH-1 i TH-2 cytokinů, stejně jako jiných prozánětlivých molekul, jako jsou C5a, IL-8 a FMLP, je závislá na G-proteinové signální přeměně, tvořené třemi články.

Fosfatidylinositol 3-kináza (PI3K) je odpovědná za tvorbu PI trifosfátu (PIP3), který je pozorován při simulaci FMLP. Zvýšená hladina PIP3 zřejmě přispívá k aktivaci systému dýchací prudké oxidázy a ke spuštění polymerizace v neutrofilech, která je považována za důležitou při regulaci cytoskeletálních změn a buněčné migraci. Současná literatura (Rankin et al, J. Exp. Med. 188(9): 1621-32, 1998) popsala, že zvýšená hladina PI3 kinázy může také podporovat degranulaci eozinofilů na základě G-proteinové signalizace na základě aktivace IL-5. Dále Sagi et al., Eur. J. Immunol., 1998. 28: 3468-3478 navrhuje, že G-proteinová signalizace použitím prostředních cest PKC a PI3 kináz může IgE aktivovat PCsR receptor pro uvolnění histaminů a jiných prozánětlivých cytokinů, které jsou zahrnuty v alergické hypercitlivosti dýchacích cest. Uckun et al., J. of Biolog. Chemistry, Vol. 274, No. 38, Sep., 1999, pp. 27028-27038 zveřejnil G-signalizaci v JAK3 kinázové cestě přes IgE/FCcRl zesítění, což vede k degranulaci mastocytů. Beaven et al., J. of Immunology, 1998, 160: 5136-5144 zveřejnil, že G-proteinová signalizace přes aktivaci PKC a mající za následek absorbci Ca²⁺ také vede k sekreci a degranulaci mastocytů. Tak G-protein může být nepostradatelný pro pokračování aktivace FCcRl na IgE antigenní odezvy a odpovídá schopnosti zasahovat do G-proteinové signalizace, může být základní podklad pro pokračování inhibice aktivace FCcR receptoru.

Byli identifikováni někteří antagonisté králičího neutrofilu FPR, ale znaky, které dělají některé molekuly antagonisty, jsou stále nejasné. Bylo ukázáno, že některá butoxykarbonylová analoga FMLP jsou kompetitivně inhibující chemotaktickou peptidem indukovatelnou buněčnou aktivaci, ve které byl BocPLPLP shledán nejúčinnějším (Schiffman et al., FEBS Lett. 117: 1, 1980; Freer et al., Biochemistry 19: 2404, 1980; Kanaho et al., J. Leukocyte Biol. 420, 1990). Bylo také ukázáno, že cyklosporin H, cyklický undekapeptid a analog cyklosporinu A, má antagonistovou aktivitu k formylpeptidovému receptoru (Wenzel-Seifert et al., J. Immunol. 150: 4591 -4599, 1993). Také byl určen přirozeně se vyskytující antagonista formylpeptidového receptoru, z retroviru získaný hexapeptid (Oostendorp et al., J. Immunol. 149: 1010, 1992). Nicméně žádný z těchto antagonistů se neváže na formylpeptidový receptor s vysokou afinitou a nejsou proto prakticky využitelné jako výzkumné prostředky nebo jako protizánětlivé léky.

Zajímavě byla inhibice degranulace mastocytů N- formyl- methionyl- leucyl-fenylalaninem popsána v Inflammation, Vol. 5, No. 1, pp. 13-16 (1981). Bylo tam popsáno, že dva strukturálně odlišné peptidy, např. pepstatin a N- formylmethionyl-leucyl- fenylalanin, inhibují vzrůst cévní permeability v krysí kůži, způsobené nitrokožní injekcí 40/80, séra proti krysímu IgE nebo makromolekulárního aniontového permeabiličního faktoru, izolovaného z telecích plic. Bylo popsáno, že se zdá, že tyto peptidy působí přímo na mastocytech. Mechanismus takové inhibice je nejasný, protože nebyla popsána exprese FPR na mastocytech.

Jasně řečeno je mnoho nezodpovězených otázek co se týká funkce a mechanismu působení FPR. Dále objev, že FPR je exprimován v buňkách, které nejsou leukocyty, jako je mozek a dendridské buňky, naznačuje, že FPR může mít nové funkce v buňkách jiného typu, než bylo objasněno. Tak jsou potřeba další činidla pro inhibici prozánětlivé odpovědi v buňkách, stejně jako způsoby pro studování prozánětlivé odpovědi v buňkách.

PODSTATA VYNÁLEZU

Nyní bylo objeveno, že ošetření lidských mononukleárních buněk nebo polymorfonukleárních buněk z periferní krve nebo fixovaných tkáňových buněk modifikačními činidly G-proteinkinázové signální dráhy po stimulaci těchto buněk prozánětlivým činidlem inhibuje obvyklou prozánětlivou odpověď, zejména pokračování prozánětlivých odpovědí, indukovaných prozánětlivými činidly jako jsou, například, C5a, FMPL, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, ÍL-13 a TNFa, nebo FCe receptoru. Změna buněčné produkce G-proteinu inhibuje dráhy přenosu signálů zánětlivé odpovědi, zprostředkované G proteinem. Zejména užitečným modifikačními činidly G-proteinkinázové signální dráhy jsou N-formylmethionyl-leucyl („f-Met-Leu“) peptidy, které mají obecný vzorec f-Met-Leu X, kde sloučenina obecného vzorce X je vybrána ze skupiny, která se skládá z Tyr, Tyr-Phe, Phe-Phe a Phe-Tyr, přednostně f-Met-Leu-Phe-Phe.

Lidské mononukleární buňky nebo polymorfonukleární buňky z periferní krve nebo fixované tkáňové buňky mohou být lymfocyty a granulocyty, přednostně eozinofily, bazofily a aktivované T-buňky a mastocyty.

G-proteinkinázová signální dráha tvoří komplex s povrchovým buněčným receptorem, přednostně formylpeptidovým receptorem („FPR“), který je přítomný na povrchu těch buněk, které, v přítomnosti prozánětlivých činidel, v upřednostňované části inhibují fosforylaci G-proteinové podjednotky γ. Dále inhibici nebo blokováním pokračování fosforylace G-proteinu jsou různé dráhy, závislé na trimerických G-proteinových složkách, blokovány nebo málo regulují odpověď buněk na prozánětlivá činidla.

V upřednostňované části vynálezu, při hladině FCs receptoru (FCzR), toto modifikační činidlo G-proteinkinázové signální dráhy, v přítomnosti IgE, inhibuje aktivaci FCeR IgE.

V souladu s předkládaným vynálezem jsou prozánětlivá činidla, použitá ke stimulování lidských mononukleárních buněk nebo polymorfonukleárních buněk z periferní krve nebo fixovaných tkáňových buněk, cytokiny, chemotaxiny nebo mitogeny. Zejména upřednostňovaná prozánětlivá činidla jsou N-formylpeptidy, jako je FMLP, aktivovaný komplementový fragment (C5a), leukotrien B4 (LTB4), destičkový aktivační faktor (PAF) a cytokininy, jako jsou TNFa, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 a IL-13, plus zesítěné antigeny IgE, IgG nebo IgA.

V jiné části předkládaného vynálezu je popsán způsob inhibice prozánětlivé odpovědi lidských mononukleárních buněk nebo polymorfonukleárních buněk z periferní krve, způsob, který obsahuje kontakt buňky s modifikačním činidlem G-proteinkinázové signální dráhy a vazbu činidla na receptor na buňce. Prozánětlivá mediátorová buňka může být lymfocyt nebo granulocyt. Přednostně je buňka prvně stimulována prozánětlivým činidlem, jako je jeden z výše uvedených.

V upřednostňované části vynálezu je ligand vázající receptor formylpeptidový receptor. Pokračování blokování G-proteinové aktivace FCsR receptoru poskytuje podobné léčebné výhody.

Předkládaný vynález dále popisuje způsob pro určení modifikačního činidla G-proteinkinázové signální dráhy, způsob, který obsahuje kroky:

a) kontakt prozánětlivých mediátorových buněk, vybraných ze skupiny, která se skládá z aktivovaných T-lymfocytů, mastocytů, eozinofilů a bazofilů, se známým prozánětlivým mediátorem, vybraným ze skupiny, která se skládá z cytokinů, chemotaxinů a mitogenů, a vyvolává prozánětlivou odpověď;

b) přidání ke kroku a) kandidáta modifikačního činidla G-proteinkinázové signální dráhy; a « · «·*· ··· «··«··· ·· · * * * · · · ·

c) detekce poklesu v množství G-proteinkinázy nebo rozpad proteinkinázy na disociovanou v (i) prozánětlivých buňkách, současně kontaktovaných s uvedeným kandidátem na činidlo a uvedeným prozánětlivým mediátorem, porovnaný s (ii) prozánětlivými buňkami, kontaktovanými se samotným prozánětlivým mediátorem. Upřednostňovaná G-proteinkináza je G-protein γ kináza.

V jiné části předkládaného vynálezu je popsán receptor spojený s modifikačním činidlem G-proteinkinázové signální dráhy na povrchu prozánětlivých mediátorových buněk, vybraných ze skupiny, která se skládá z aktivovaných T-lymfocytů, mastocytů, eozinofilů a bazofilů, kontaktem prozánětlivých mediátorových buněk s modifikačním činidlem G-proteinkinázové signální dráhy, čímž inhibuje prozánětlivou odpověď.

V další části vynálezu obsahuje způsob pro určení modifikačního činidla G-proteinkinázové signální dráhy kroky:

kontaktu prozánětlivých mediátorových buněk, vybraných ze skupiny, která se skládá z aktivovaných T-lymfocytů, mastocytů, eozinofilů a bazofilů, s kandidátem modifikačního činidla G-proteinkinázové signální dráhy; a určení distribuce proteinkináz, produkovaných uvedenými buňkami, kde ve srovnání s buňkami nekontaktovanými kandidátem modifikačního činidla G-proteinkinázové signální dráhy nebyl rozdíl v množství PLC_Y, Pp60 Src a ERK-1, vzrostlo množství PI3 (102 Kd) a PI3 (83 Kd) a pokleslo množství Raf, Ras, G-protein a a G-protein β kináz.

Tak předkládaný vynález také popisuje nový receptorový komplex krevních mononukleárních buněk nebo polymorfonukleárních buněk z periferní krve, které obsahují povrchový receptor, a modifikačního činidla G-protein signální dráhy, kde, ve srovnání s buňkami, které nedělaly uvedený receptorový komplex, je distribuce proteinkináz v buňkách taková, že nebyl rozdíl v množství PLC_y, Pp60 Src a ERK-1, vzrostlo množství PI3 (102 Kd) a PI3 (83 Kd) a pokleslo množství Raf, Ras, G-protein a a G-protein β kináz. Přednostně je buněčný povrchový receptor FPR receptor. Sekundární blokování G-proteinové aktivace FCeR receptoru je také upřednostňováno. Stimulace IL-4 krevních mononukleárních buněk nebo polymorfonukleárních buněk z periferní krve, které mají buněčný povrchový receptor spojený s modifikačním činidlem G-protein signální dráhy, zajišťuje distribuci proteinkináz, produkovaných uvedenými buňkami, kde, ve srovnání se stimulovanými buňkami, které nedělaly uvedený receptorový komplex, vzrostlo množství PLC_Y, PI3 (102 Kd) a PI3 (83 Kd) a pokleslo množství Ras a G-protein γ kinázy.

··*· * · · ···· • 9 ····· ·· · * ·«··*·«·· · • · · · · · ··· ······· · · «· · · · · · ·

Stimulace IL-6 lidských mononukleárních buněk nebo polymorfonukleárních buněk z periferní krve, které mají buněčný povrchový receptor spojený s modifikačním činidlem G-protein signální dráhy, zajišťuje distribuci proteinkináz, produkovaných uvedenými buňkami, kde, ve srovnání se stimulovanými buňkami, které nedělaly uvedený receptorový komplex, vzrostlo množství PLC_y, PI3 (102 Kd), Raf, Pp60 Src, ERK-1 a G-protein a a pokleslo množství PI3 (83 Kd), G-protein β a G-protein γ kináz. Stimulace IL-10 krevních mononukleárních buněk nebo polymorfonukleárních buněk z periferní krve, které mají buněčný povrchový receptor spojený s modifikačním činidlem G-protein signální dráhy, zajišťuje distribuci proteinkináz, produkovaných uvedenými buňkami, kde, ve srovnání se stimulovanými buňkami, které nedělaly uvedený receptorový komplex, vzrostlo množství PI3 (102 Kd), ERK-1 a G-protein γ a pokleslo množství PLC_y, PI3 (83 Kd), Ras a kináz.

Stimulace prozánětlivým činidlem, IL-13, krevních mononukleárních buněk nebo polymorfonukleárních buněk z periferní krve, které mají buněčný povrchový receptor spojený s modifikačním činidlem G-protein signální dráhy, zajišťuje distribuci proteinkináz, produkovaných uvedenými buňkami, kde, ve srovnání se stimulovanými buňkami, které nedělaly uvedený receptorový komplex, vzrostlo množství PLC_y, PI3 (102 Kd), PI3 (83 Kd), ERK-1 a Raf a pokleslo množství Ras, Pp60 Src, G-protein a, G-protein β a G-protein γ kináz.

Stimulace prozánětlivým činidlem, C5a, lidských mononukleárních buněk nebo polymorfonukleárních buněk z periferní krve, které mají buněčný povrchový receptor spojený s modifikačním činidlem G-protein signální dráhy, zajišťuje distribuci proteinkináz, produkovaných uvedenými buňkami, kde, ve srovnání se stimulovanými buňkami, které nedělaly uvedený receptorový komplex, vzrostlo množství Pp60 Src a Raf a pokleslo množství PLC_y, PI3 (102 Kd), G-protein a, G-protein β a G-protein γ kináz.

Stimulace prozánětlivým činidlem, TNFa, lidských mononukleárních buněk nebo polymorfonukleárních buněk z periferní krve, které mají buněčný povrchový receptor spojený s modifikačním činidlem G-protein signální dráhy, zajišťuje distribuci proteinkináz, produkovaných uvedenými buňkami, kde, ve srovnání se stimulovanými buňkami, které nedělaly uvedený receptorový komplex, vzrůst množství Raf, Ras a Pp60 Src a pokles množství PLC_y, PI3 (83 Kd), protein a, G-protein β a G-protein γ kináz.

• · · · • · · · · · · · · ··»···· ·· · ·· ···»

V souladu s předkládaným vynálezem bylo objeveno, že modifikační činidla G-proteinkinázové signální dráhy inaktivují některé prozánětlivé odpovědi lidských buněk z periferní krve, které byly stimulovány prozánětlivými činidly nebo molekulami. Upřednostňované modifikační činidla G-proteinkinázové signální dráhy se, v souladu s předkládaným vynálezem, mohou vázat na receptory, nalezených na prozánětlivých mediátorových buňkách, jako jsou lymfocyty, zejména aktivované T-buňky, granulocyty, jako jsou eozinofily, bazofily a fixované tkáňové buňky, jako jsou mastocyty.

Při vázání modifikačního činidla G-proteinkinázové signální dráhy na receptor jsou prozánětlivé odpovědi inhibovány. V souladu s upřednostňovanými částmi předkládaného vynálezu jsou G-proteinové podjednotky α, β a γ modifikovány a také je inhibována jejich fosforylace. Prozánětlivé odpovědi, které mohou být inhibovány činidlo-receptorovým komplexem, je sekrece, degranulace a migrace receptor nesoucích buněk, stejně jako syntéza a sekrece jiných prozánětlivých molekul.

Přednostně modifikační činidla G-proteinkinázové signální dráhy podle předkládaného vynálezu mohou inaktivovat receptor předtím stimulovaný prozánětlivou molekulou, ale nemají vliv na nestimulované buňky. Příklady prozánětlivých činidel, užitečných pro stimulaci buněk, jsou IL-8, N-formylpeptidy, aktivovaný komplementový fragment (C5a), leukotrien B4 (LTB4) a destičkový aktivační faktor (PAF). Přednostně činidlo-receptorový komplex podle předkládaného vynálezu také může znecitlivovat receptor před další stimulací stejným prozánětlivým činidlem nebo různými prozánětlivými činidly.

Pozorovaný účinek modifikačního činidlo-receptorového komplexu G-proteinkinázové signální dráhy na receptor nesoucích buněk může být použit k identifikování modifikačních činidel G-proteinkinázové signální dráhy. Screening takových činidel může být proveden kontaktem prozánětlivých mediátorových buněk se známým prozánětlivým mediátorem k vyvolání prozánětlivé odpovědi, po které následuje přidání kandidáta na činidlo a detekcí poklesu množství G-proteinkinázy v prozánětlivých buňkách, kontaktovanými současně s kandidátem na činidlo a prozánětlivými molekulami, ve srovnání s množstvím v prozánětlivých mediátorových buňkách, kontaktovanými pouze s prozánětlivými molekulami.

Zejména užitečné modifikační činidlo G-proteinkinázové signální dráhy je f-Met-Leu-Phe-Phe. Jiná užitečná činidla mohou být určena běžným testováním za použití jedné z výše uvedených postupů.

Jak je použito zde, prozánětlivé odpovědi zahrnují sekreci nebo degranulaci prozánětlivých mediátorových buněk a týkají se leukotrienů, histaminů a jiných cytokinů. Takové odpovědi také zahrnují infiltraci eozinofilů, bazofilů a mastocytů do zánětlivých tkání jako výsledek chemotaktické adheze, migrace a agregace lymfocytů, eozinofilů, bazofilů, mastocytů a neutrofilů. Cévní permeabilita v místě zánětu a vzrůst produkce IgE, IgG a IgA a jejich samostatných FC receptorů také může být spojováno s protizánětlivými odpověďmi.

Inhibice prozánětlivých odpovědí tak může zahrnovat pokles degranulace a týká se leukotrienů, histaminů a jiných cytokinů prozánětlivých mediátorových buněk nebo úplné zastavení v upřednostňované části, následované vazbou peptid-receptor podle předkládaného vynálezu. Infiltrace a migrace prozánětlivých buněk může také být značně snížena nebo úplně inhibována. Cévní permeabilita v místě zánětu a hladina IgE může být také snížena.

Aby zde popsanému vynálezu mohl být zcela porozuměno, jsou uvedeny následující příklady. Rozumí se, že tyto příklady jsou pouze pro ilustrativní účely a nejsou uvedeny jako omezující tento vynález jakýmkoliv způsobem.

PŘEHLED OBRÁZKŮ NA VÝKRESECH

Obr. 1 je graf, ukazující vázání FITC-značeného HK-X (f-Met-Leu-Phe-Phe) na lidské jaderné buňky z periferní krve.

Obr. 2A až 2C jsou bodové grafy FITC-značeného HK-X, vázaného na aktivované lymfocyty. Obr. 2A ukazuje lymfocyty stimulované 6 pg Concanavalinu A (ConA) 24 hodin po umístění v kultuře navíc se 100 nM FITC-značeného HK-X; obr. 2B ukazuje lymfocyty stimulované 6 pg Concanavalinu A (ConA) 120 hodin po umístění v kultuře, ale bez FITC-značeného HK-X; a obr. 2C ukazuje lymfocyty stimulované 6 pg Concanavalinu A (ConA) 120 hodin po umístění v kultuře navíc se 100 nM FITC-značeného HK-X.

Obr. 3A až obr 3B jsou histogramy obsahu DNA lymfocytů z obr. 2A až C. Obr. 3A je histogram buněk z obr. 2A a obr. 3B je histogram buněk z obr. 2B a obr. 2C.

Obr. 4 je autoradiograf ³⁵S-methionylem značených proteinů, získaných z celého lyzátu lidských neutrofilních buněk a různých pryskyřic.

Obr. 5A až obr. 5B ukazují přítomnost fosforylovaných proteinů v mononukleárních buňkách, ošetřených nosičem (0,3% DMSO), jak byly detekovány monoklonálními ·· ···· ··· ······· ·· · · · · · · · · protilátkami k fosfotyrosinu. Obr. 5A je denzitometrie SDS-PAGE normálních buněk a obr. 5B je fotografie SDS-PAGE normálních buněk, ošetřených pouze nosičem (DMSO).

Obr. 6A až obr. 6B ukazují přítomnost fosforylovaných proteinů v mononukleárních buňkách, ošetřených HK-X, jak byly detekovány monoklonálními protilátkami k fosfotyrosinu. Obr. 6A je denzitometrie SDS-PAGE buněk, ošetřených HK-X, a obr. 6B je fotografie SDS-PAGE normálních buněk, ošetřených pouze HK-X.

Obr. 7A až obr. 7B ukazují přítomnost fosforylovaných proteinů v mononukleárních buňkách, ošetřených IL-8, jak byly detekovány monoklonálními protilátkami k fosfotyrosinu. Obr. 7A je denzitometrie SDS-PAGE buněk, ošetřených IL-8, a obr. 7B je fotografie SDS-PAGE normálních buněk, ošetřených pouze IL-8.

Obr. 8A až obr. 8B ukazují přítomnost fosforylovaných proteinů v mononukleárních buňkách, ošetřených HK-X a IL-8, jak byly detekovány monoklonálními protilátkami k fosfotyrosinu. Obr. 8A je denzitometrie SDS-PAGE buněk, ošetřených HK-X a IL-8, a obr. 8B je fotografie SDS-PAGE normálních buněk, ošetřených HK-X a IL-8.

Obr. 9A až obr. 9B ukazují přítomnost fosforylovaných proteinů v mononukleárních buňkách, čerstvě odebraných z periferní krve, jak byly detekovány monoklonálními protilátkami k fosfotyrosinu. Obr. 9A je denzitometrie SDS-PAGE čerstvě odebraných buněk a obr. 9B je fotografie SDS-PAGE gelu čerstvě odebraných buněk.

PŘÍKLADY PROVEDENÍ VYNÁLEZU

Příklad 1: Vazba značeného HK-X na jaderné buňky z periferní krve

Byly určeny Kd a Bmax (nasycená vazba) HK-X („f-Met-Leu-Phe-Phe“) na jaderných buňkách z periferní krve. 2x10⁵ buněk ve 100 μΐ roztoku z různých frakcí (monocyty, lymfocyty, granulocyty), připravených gradientovou centrifugám, byly předtím promyty 1% BSA-PBS roztokem, obsahujícím 0,1 % azidu sodného. 100 μΐ následujících molárních koncentrací FITC-značeného HK-X (v 1% BSA-PBS roztoku) bylo přidáno do každé řady zkumavek podle tabulky 1:

• ···· · · · ··· ·· · · · · · · · · tabulka 1

zkumavka #	FITC-značený HK-X molární koncentrace
1	9,06x10'”
2	2,71x10’”
3	5,43x10'”
4	7,25x10’”
5	9,06x10'”
6	2,71x10’’°
7	5,43x10’’°
8	7,25x10’’°
9	9,06x10’’°

Zkumavky byly míchány a vortexovány 30 sekund. Zkumavky pak byly dány na 30 minut do 4 až 8 °C. Pak bylo přidáno 100 pl Cal-Lyse, inkubováno 5 minut, nebo bylo přidáno 500 pl 1% formaldehydu. Jestliže byl přidán Cal-Lyse, byl přidán 1 ml vody a inkubovalo se dalších 5 minut. Pak byly buňky analyzovány průtokovým cytometrem (Coulter Epics Elitě). Výsledky navázání jsou uvedeny na obr. 1. Bmax byl určen jako 47,66 a Kd=l,674 x 10'^1θ M. Tak tyto výsledky ukazují, že HK-X se váže na jaderné buňky z periferní krve, jako jsou monocyty, lymfocyty a granulocyty.

Podobnou metodologií bylo také určeno, že HK-X se váže na aktivované T-buňky, mastocyty, eozinofíly a bazofíly, stejně jako je známa vazba na neutrofíly.

Příklad 2: HK-X se váže na aktivované receptory

Lymfocyty z periferní krve byly stimulovány mitogenem Concavalin A (ConA) 24 hodin nebo 120 hodin po umístění do kultury. Buňky pak byly buď vystaveny 100 nM FITC-značenému HK-X nebo vystaveny nebyly. Buňky byly také barveny DAPI pro určení buněčného cyklu. Buňky pak byly analyzovány průtokovou cytometrií. Obr. 2A až 2C ukazují vztah mezi lymfocyty aktivovanými ConA a objevením se vazebných míst pro FITC-značený HK-X. Čtyři kvadranty ukázaly následující charakteristiky: horní levý kvadrant ukazuje buňky s vyšším než ln obsahem DNA a zvýšení množství FITC HK-X vazby nad hladinu pozadí, stanovené použitím profilu v obr. 1;

horní pravý kvadrant ukazuje buňky, které obsahují vyšší než ln obsah DNA a FITC-ligand vazbu vyšší než pozadí;

• · · · · · · ·· ·· · · ···· dolní pravý kvadrant obsahuje buňky, které mají vyšší než ln obsah DNA, ale mají vazbu FITC-ligand nad hladinu pozadí; a spodní levý kvadrant obsahuje buňky s obsahem DNA lna FITC-ligand na hladině pozadí.

Jak je patrné po prohlédnutí obr. 2B a 2C, vystavení rostlinnému lektinu nebo mitogenu stimuluje buňky k započetí buněčného cyklu a expresi vazebných míst pro FITC-značený HK-X. Dlouhá kultivační perioda 120 hodin umožnila větší části buněk započetí buněčného cyklu (srovnej s obr. 2A). Přesnější určení hladiny pozadí endogenní fluorescence bylo získáno úpravou mezí (kvadrantů) použitím buněk, kultivovaných s ConA, ale nebarvených FITC-značeným HK-X (viz. obr. 2B).

Statistická analýza potvrdila kvalitativní pozorování poskytnutím posouzení bodového grafu. Přibližně 25 % buněk na obr. 2C obsahovalo vyšší než ln obsah DNA a byly nad hladinou pozadí FITC-ligand vazby. To je značný rozdíl k počtu buněk v horním pravém kvadrantu na obr. 2A a 2B.

Více formálního posouzení distribuce buněk v různých fázích buněčného cyklu bylo získáno použitím softwarového souboru „MultiCycle“ Phoenix Software, Phoenix, AZ. Tento software rozplétá DNA histogram a staticky analyzuje složky pro stupeň vazby a účinnosti.

Obr. 3A ukazuje stejné vzorky, obsažené na obr. 2A a obr. 3B ukazuje ty, obsažené na obr. 2B a 2C. Jak je patrné z posouzení procenta buněk, které jsou diploidní (>ln obsah Dna), frakce vzrostly z 2,2 % na obr. 2A na 29 % na obr. 2B a 2C.

Tak je zřejmé, že stimulace lidských lymfocytů z periferní krve mitogenem stimuluje duplikaci jejich DNA a současně s tímto procesem expresi vazebných míst pro FITH-značený HK-X. Pouze frakce buněk s obsahem DNA ln nebo v G0/G1 fázi buněčného cyklu ukazují vzrůst expresevazebných míst pro ligand. Na druhé straně všechny buňky s diploidním obsahem DNA (> 1 n) obsahují vazebné místo pro ligand.

Příklad 3: Identifikace a charakterizace HK-X receptorů

Receptory, které váží HK-X a jiné N-formylpeptidy, byly izolovány a určeny z myších peritoneálních mastocytů, lidských polymorfonukleárních a mononukleárních buněčných populací. Dále G-proteinová aktivace FCcR receptorů jako pokračující důsledek vzrůstu PKC, PI3 a uvolnění Ca²⁺ způsobuje na FCs receptorů G-proteinové ovlivnění ve směru efektor receptor.

···* ··· ·*·· * · «··· · ♦ · ·· ···· » · · ··· ···· ·· ·· ·· ·*··

Buňky, které váží HK-X, zahrnují mastocyty, bazofily a eozinofily, jak je zřejmé ze změny biologické reaktivity po vystavení HK-X a vazbou fluorescenčně nebo radioaktivně značeného HK-X. Receptory pro HK-X nebyly identifikovány. Na druhé straně neutrofily na povrchu exprimují formylpeptidové receptory. Nicméně zdá se, že krevní lymfocyty a monocyty váží HK-X méně než neutrofily.

podrobné materiály a postupy:

1. Izolace buněk - Krysí peritoneální mastocyty byly izolovány infúzí 35 ml Tyrodova roztoku do dutiny pobřišniční znecitlivěných myší. Krysy pak byly utraceny injekcí nadměrné dávky znecitlivujícího prostředku. Peritoneální buňky byly odebrány, umístěny do 15 ml centrifugačních zkumavek. Buňky byly odstředěny při 250 g za 10 min. při pokojové teplotě.

Lidské mononukleární a polymorfonukleární buňky z periferní krve byly izolovány z periferní krve, získané od obvyklých dárců. Krev byla shromážděna v heparinu. Různé buněčné typy byly izolovány centrifugací přes Ficoll-Hypaque při 500 g 60 minut při pokojové teplotě. Každá frakce byla odebrána, samostatně shromážděna a promyta lx RPMI 1640 s antibiotiky.

2. Metabolické značení buněk ³⁵S-methioninem - Buňky byly upraveny na 1 x 10⁷na ml methionin neobsahujícím RPMI 1640 médiem a umístěny přes noc v 37 °C v přítomnosti 5 % CO₂.

3. Odebrání buněk a příprava izolovaných membrán - Buňky byly promyty 3x v PBS a postupně lyžovány sonikací v Hepes pufru, pH 7,2, obsahujícím 0,3% NP40 a proteinázový inhibiční koktejl. Výsledný buněčný preparát byl odstředěn při 600 g za 10 minut a supernatant byl odebrán pro další analýzy.

4. Chromatografické rozdělení různých buněčných proteinů na sefaróze a sefaróze HK-X - Buněčný přípravek prošel přes kolonu sefarózové nesubstituované pryskyřice nebo sefarózové HK-X pryskyřice a byl rozdělen na dvě části, A a B.

Alikvot A: prošel přes HK-X substituovanou sefarózovou kolonu. Kolony byly promyty a pak eluovány pufrem, obsahujícím HK-X (5 mg/ml) a pak 0,1 M glycinem, pH 2,5. Alikvot B byl vázán na HK-X substituovanou kolonu v přítomnosti rozpustného HK-X a proteiny byly eluovány. Každá frakce byla zakoncentrována a lyofilizována.

Postup, provedený v tomto kroku, zahrnuje navázání HK-X na sefarózovou pryskyřici za vzniku HK-X substituované pryskyřice. Před vystavením HK-X substituované pryskyřice prošla směs značených buněčných proteinů přes pryskyřici nesubstituovanou HK-X pro odstranění proteinových typů, které reagují s přírodní pryskyřicí. Tak když • 4 · » · ♦ * · · · « « « ·»··· · ♦ · • ········» ·

F F · · · · ··· ··· ««·· ·· ·· ·· ·»· buněčné proteiny, zahrnující receptorové proteiny, prošly přes HK-X substituovanou pryskyřici ve vhodném iontovém prostředí, receptorové proteiny (pro HL-X receptor) se mezi ostatními proteiny pevně vázaly s HK-X. Pryskyřice byla promyta mírným činidlem, jako je fosfátový pufr s neutrálním pH, pro odstranění navázaných proteinů s nízkou afinitou. Později byla pryskyřice vystavena přebytku volného HK-X pro kompetitivní eluci receptorových proteinů, vázaných na pryskyřici. Radioaktivní proteiny, uvolněné v každém z těchto kroků, byly zakoncentrovány a analyzovány na

12% SDS-PAGE systému, jak je podrobně popsáno v následujícím kroku.

5. 12% SDS-PAGE - Do každé dráhy gelu bylo aplikováno 25 μΐ radioaktivního buněčného přípravku, obsahujícím 250 cpm až 2000 cpm radioaktivity. Gel běžel při 90

V a 30 mA až bylo získáno dobré rozlišení barevných standardů. Standardy byly fosforyláza b (MH=94 000); hovězí sérový albumin (MH=68 000); ovalbumin (MH=43 000); uhličitá anhydráza (MH=30 000); a sojový trypsinový inhibitor (MH=21 000).

6. Odhad molekulové hmotnosti rozdělených radioaktivních proteinů - Pro standardy a pro každou molekulovou hmotnost, vizualizovanou na gelu, byly vypočítány relativní mobility. Byl sestrojen graf logaritmů molekulových hmotností standardů proti relativní mobilitě každého standardu. Data byla vložena do PRISM softwaru a molekulové hmotnosti neznámých proteinů byly odhadnuty podle programu standardních křivek. Výsledky byly srovnány s FPR receptorovými proteiny, publikovanými v literatuře (Goetzl et al., Biochemistry 20; 5717-5722, 1981).

Obr. 4 ukazuje výsledek vzorového pokusu. Všechny proteiny, přítomné v buněčném lyzátu, jsou ukázány v dráze A. V dráze B ukazuje nenavázaná látka ze sefarózové kolony bez HK-X substituce vzor distribuce proteinových bendů, podobný celému buněčnému lyzátu. Dráha C obsahuje předeluované látky. Dráha D je slepá dráha.

V dráze E jsou přítomny tři proteinové bendy, jestliže kolona byla eluována v přítomnosti 1 mg HK-X (kompetitor). Molekulové hmotnosti jsou odhadnuty na ~94 000, ~68 000 a ~40 000 Daltonů. Tyto pokusné podmínky potvrdily specifitu navázání. Srovnání relativní početnosti bendů, eluovaných v tomto pokuse, s těmi popsanými Goetzlem et al., odhalily zajímavé odlišnosti (viz. tabulka 2). Prozkoumání normalizovaných částí receptorů odhalilo značnou odlišnost v distribuci tří druhů, získaných z FMLP kolony (Goetzl) a z HK-X kolony (tento příklad). 68 Kd druh byl dominantní druh, získaný Goetzlem et al. z FMLP afinitní kolony, zatímco 40 Kd druh byl převládajícím druhem, získaným z HK-X afinitní kolony.

«·

9 * · • * ♦ ·» a 9 · >

• - *· ♦ · · · • « » tabulka 2 odlišnosti publikovaných formyl receptorů, získaných z FMLP-sefarózy a získaných z HK-X sefarózy

molekulová	# celkových	část celkové	část	celkové	normalizované
hmotnost	zbytků,	receptorové	receptorové	části
	obsahujících	populace FMLP	populace HK-X	receptorových
	methionin				proteinů
					FMLP	HK-X
94 000	14	15	26	1,07	1,8
68 000	11	80	28	7,27	2,54
40 000	4	5	41	1,25	10,25

Z radiografu na obrázku 4 je zřejmé, že tři molekulární druhy byly eluovány z peritoneálních mastocytů přídavkem 1 mg HK-X. Spočítané molekulové hmotnosti těchto proteinů souhlasily molekulovými hmotnostmi, uvedenými Goetzlem et al. Molekulové hmotnosti proteinů, získané po kompetici s HK-X nebo kyselinou z krysích peritoneálních mastocytů a neutrofilů byly stejné jako ty popsané Goetzlem et al. pro lidské neutrofily.

Ačkoliv celkový střední počet zbytků methioninu ve 40 Kd molekule je 5,1, měl vyšší intenzitu radiografického obrázku než oba 68 000 a 94 000 druhy, které obsahují 11 a 14 zbytků na molekulu. V tomto příkladě byl určen relativní nadbytek každého získaného druhu proteinu biosyntetickým radioznačením ³⁵S-methioninu. Relativní části, získané afmitní chromatografií, byly určeny integrací ploch pod křivkami autoradiografů. Goetzl naměřil relativní nadbytek každého druhu proteinu určením proteinu chemickými způsoby. Proto pro přesnější srovnání distribuce proteinů, získanými dvěma studiemi, byly distribuční hodnoty normalizovány vydělením relativního nadbytku každého druhu počtem methioninových zbytků. Tento poměr koriguje možné odchylky v hodnotách, způsobené různými metodologiemi. Korigované poměry odhalily ohromě odlišné navázání a/nebo získaný profil mezi hodnotami, uvedenými Goetzlem, a hodnotami, získanými v tomto příkladě. Jedna možnost je, že detergent disocioval receptorový komplex, vázaný na FMLP-substituovanou sefarózu, selektivním způsobem jiným od toho na HK-X substituované sefaróze.

«· ·» ·* ·· *· • ··· ···· • ·«#·· · «, · • « · «V « · « # » • · * * » · · · • · · »« ·· · · · · · ·

Stručně, v tomto příkladě byl HK-X použit pro selektivní získání vazebných proteinů v buněčném lyzátu, získaném po proteinovém značení ³⁵S-methioninem in vitro. Byly izolovány tři typy molekulových hmotností, což souhlasí s dřívějšími publikacemi na velikost peptidů, asociovaných s FMLP receptorovým komplexem.

Bylo také ukázáno technikami použitými v tomto příkladě, že se HK-X váže na receptory na lidských mnohojaderných a mononukleárních buněk, zejména aktivovaných T-buněk, mastocytů, eozinofilů a bazofilů.

Příklad 4: Převod signálu a mechanismus působení

Leukocyty odpovídají na velké množství chemoatraktantů a jiných prozánětlivých mediátorů. Některé mediátory způsobují chemotaxi, aktivaci enzymového systému a týkají se patologických účinných mediátorů. Typické N-formylpeptidy (jeden prototyp-FMLP), aktivovaný komplementový fragment (C5a), leukotrien B4 (LTB4), destičkový aktivační faktor (PAF) a některé chemotaktické cytokiny (jako je IL-8), jsou velmi dobře rozpoznávaná chemotaktická a prozánětlivá činidla. Tyto činidla se váží na G-protein-spřažené receptory (GPCR) s následným vyvoláním vícenásobného signálního převodu, zprostředkovaného proteinkinázovými systémy. Kaskády, mající za následek začátek procesů, jsou komplexní a návazné, jsou přece odpovědné za celkové chování všech jaderných buněk. Programová buněčná smrt (apoptóza), tvorba imunitní odpovědi, odstranění samostatně rozpoznávajících T buněk a kontrola syntézy mimobuněěné matrice je jenom malá část příkladů působení převodních drah signálů. Proteinkinázy byly identifikovány pro jejich schopnost přenosu fosfátové skupiny z fosfátového donoru na aminokyselinový akceptor, umístěný v proteinu. Obvykle je donor γ fosfát ATP. Tři hlavní akceptorové aminozbytky v proteinech jsou tyrosin, serin a threonin. V 1999 bylo přes 115 proteinových kináz určeno a popsáno v literatuře. Chování buněk při odpovědi na stimulaci FMLP je v literatuře dobře popsáno (Prosnitz et al., Pharmacol. Ther. 74: 73-102, 1997). FMLP, vázající se na fagocyty, stimuluje fosforylaci, která upravuje buněčné funkce. FMLP a jiné chemoatraktanta stimulují fosfatidylinositol 3-kinázu (P13K), která střídavě aktivuje proteinkinázu (PKC). V neutrofilech FMLP navázání způsobuje fosforylaci extracelulární regulující kinázy, (ERK-1), která náleží do obecné rodiny kináz, nazývaných mitogen-aktivujících proteinkináz (MAP kináz). Někteří členové MAP kinázové rodiny jsou: Raf-1 a Ras. Členové proteinkinázových rodin se obvykle liší v molekulové hmotnosti až tak, že mohou být rozlišeny jeden od druhého SDS-PAGE technologií. Dále fosfotyrozinové

ř » · • « • » # · * fc · » « « * » a · · » · proteiny mohou být detekovány z celé škály intracelulárních proteinů monoklonálními protilátkami, které rozpoznávají pouze fosfotyrozinový epitop (Ross et al., Nátuře (London) 294: 654, 1981; Frackleton et al., Mol. Cell Biol. 3: 1343, 1983).

Změny v proteinkinázách, způsobené přídavkem HK-X k lidským mononukleárním a polymorfonukleárních buňkám z periferní krve, byly analyzovány, aby objasnily mechanismus působení HK-X. HK-X byl přidán samotný a s přídavkem FMLP nebo IL-8, které jsou známé chemotaktika a prozánětlivá činidla.

podrobné materiály a postupy:

1. Izolace buněk - lidské mononukleární a polymorfonukleárních buňky z periferní krve byly izolovány z periferní krve, získané od obvyklých dárců. Krev byla shromážděna v heparinu. Různé buněčné typy byly izolovány centrifugací přes Ficoll-Hypaque při 500 g během 60 minut při pokojové teplotě. Každá frakce byla odebrána, uložena odděleně a promyta lx RPMI 1640 s antibiotiky.

2. Kultivace a ošetření buněk - 10⁷ buněk na ml média bylo dáno do 37 °C na 30 minut před přídavkem stimulantů, aby se umožnilo dosáhnout buňkám stejného stavu poolu fosforylovaných proteinů. Pak byly přidány následující stimulanty do každého ml buněk:

A. 100 μΐ nosiče (0,3% roztok DMSO v médiu).

B. 100 μΐ HK-X, obsahující 20 μg HK-X.

C. 100 μΐ FMLP, obsahující 0,1 μg FMLP

D. 100 μΐ IL-8, obsahující 0,1 μg IL-8 (rekombinantní lidský IL-8)

E. 100 μΐ HK-X, obsahující 20 μg HK-X plus 100 μΐ FMLP, obsahující 0,1 pg

FMLP

F. 100 μΐ HK-X, obsahující 20 pg HK-X plus 100 μΐ IL-8, obsahující 0,1 pg IL-8

G. buněčné kultivační médium bez nějakého stimulantu.

Buňky byly inkubovány dalších 30 min při 37 °C v 5 % CO₂.

3. Odebrání buněk a SDS-PAGE analýza - Buňky byly odstředěny při 250 g během 5 min při pokojové teplotě. Supernatant byl odstraněn a bylo přidáno 25 μΐ 2x startovního SDS-PAGE pufru. Pelety byly povařeny 15 minut a odstředěny při 10 000 g během 5 min. Malé vzorky byly odebrány na gelovou elektroforézu na 12% akrylamidovém gelu.

4. Imunoblotová detekce fosfoproteinů - Proteiny byly přeneseny na nylonovou membránu při 13 V během 30 minut a následně blokovány 1% BSA 12 hodin. Protilátka ·· »·

99 99

9 9 9 9 ^ 9*99 · 9 * 999 * · • 9 · · ·' : » · · * · * 9 » 9 9 9 9 » 999 999 > ·· *»· »· ···· konjugovaná s HRP v 0,3% BSA byla přidána na 60 min. Membrány byly promyty, upevněny a fotografovány.

5. Analýza dat - Fotografie byly dodány do profesiální laboratoře a pro každý gel byla udělána negativní kopie za použití vysoce kontrastního a slabězrnícího filmu. Následné fotografie byly naskenovány při 600 dpi a byla provedena densitometrická analýza použitím Image Pro Plus softwaru, SPSS. Pro každý bend byly vypočítány molekulové hmotnosti.

Aby se standardizovalo množství buněčných proteinů, aplikovaných do každé dráhy SDS-PAGE, bylo použito pro ošetření stejné množství buněk a přibližně stejný objem vzorku, aplikovaný do každé dráhy. Na obr. 5 až 9 jsou ukázány chemiluminiscenční obrazce fosfoproteinů, detekovaných monoklonální antifosfotyrosinovou protilátkou. Negativ chemiluminiscenčních obrázků byl vyroben profesionálním fotografem, aby se získal vysoký stupeň rozlišení bendů a intenzita, odpovídající chemiluminiscenci. Například na obr. 5A proteinkináza, přítomná v buňkách, vystavených nosiči po dobu 30 minut, odhalila 9 jednoznačných proteinových typů, jak ukazují píky na densitometrické analýze gelu. Pro zřetelnost byly píky na densitometrické analýze také označeny stejnými šipkami. (Začátek gelu je na pravé straně gelu, kde se nacházejí největší molekulové hmotnosti).

Na obr. 6 jsou zobrazeny proteinkinázy buněk, odpovídajících na HK-X. Byl detekován zřejmý vzrůst v molekulových hmotnostech přibližně 83 Kd, který nebyl pozorován v jiných ošetřeních. Nápadné rozdíly byly pozorovány po současném ošetření buněk 20 pg HK-X a 0,1 pg IL-8 a 20 pg HK-X a 0,1 pg FMLP (data nejsou ukázána). Menší molekulová hmotnost se ukázala značně snížená (levá větší část gelu). Toto snížení je kvantitativně odraženo v ploše píků. Tato plocha je v densitometrickém sledování ukázána horizontálními dvouhlavými šipkami. Obsah a distribuce proteinkinázy v Čerstvých mononukleárních buňkách je ukázána na obr. 9. Distribuce kináz těchto buněk je nápadně podobná buňkám, ošetřených nosičem (obr. 5) a buňkám, ošetřených HK-X (obr. 6). Charakter kinázové odpovědi na stimulaci samotným FMLP a stimulaci HK-X plus FMLP nejsou ukázány. Nicméně charakter každé z nich byly v podstatě shodný s pozorováním samotné IL-8 a HK-X plus IL-8.

Charakter a distribuce proteinkináz pro polymorfonukleární buňky z periferní krve byl v podstatě stejný jako pro mononukleární buňky. Základní rozdíl mezi dvěma buněčnými typy byl ten, že mononukleární buňky byly více metabolicky aktivní než polymorfonukleární buňky.

Použitím densitometrického analytického přístupu byla vypočítaná plocha píku pro každou molekulovou hmotnost. Tak bylo vypočítáno kvantitativní určení každé kinázy jako procenta celkového kinázového obsahu. Dále molekulová hmotnost známých kináz byla srovnána s těmi vypočítanými z relativního migračního (Rf) výpočtu v tomto pokuse.

Tak mohlýbýt identifikovány kinázy v této studii.

Tabulka 3 ukazuje kvantitativní změnu v distribuci proteinkináz z lidských buněk z periferní krve po vystavení HK-X.

tabulka 3

proteinkináza	molekulová hmotnost	% změny s HK-X
PLCy	150 Kd	NC
PI3	102 Kd	+57
PI3	83 Kd	+55
Raf	65-68 Kd	-42
Pp60 Src	62 Kd	NC
G-protein a	56 Kd	-49
ERK-1	44-49 Kd	NC
G-protein β	33-35 Kd	-25
Ras	21 Kd	-32
G-protein γ	9 Kd	NC

Tabulka 4 ukazuje kvantitativní množství G-protein γ kinázy v různých pokusech, které potvrzuje a rozšiřuje předcházející kvalitativní data. Ačkoliv se pokusilo o použití stejného počtu buněk pro každé ošetření a přibližně stejné množství získaných intracelulárních proteinů bylo aplikováno do každé dráhy, celkové množství kináz se lišilo, jak je vidět na pozorovaných plochách.

• · · · tabulka 4 přehled proteinkináz z buněk z periferní krve po vystavení HK-X a IL-8 a FMLP

protein-kináza	MH (kD)	nosič	HK-X samotný	FMLP samotný	IL-8 samotný	HK-X + FMLP	HK-X 4“ IL-8	čerstvé normální buňky
G-protein γ	9	10	11,4	10,1	14,8	2,7	3,4	11,9
celková plocha		164,413	246,023	189,169	170,985	98,097	128,937	176,442

Tabulka 5 ilustruje výsledky jiného pokusu, který ukazuje změnu v distribuci proteinkináz z lidských buněk z periferní krve po expozici HK-X ve srovnání s kostimulačním vystavením (1) HK-X a (2) fMLP nebo IL-8.

Tabulky 6 a 7 ilustrují výsledky dalšího pokusu, který ukazuje změnu v distribuci proteinkináz z lidských buněk z periferní krve po expozici HK-X ve srovnání s kostimulačním vystavením (1) HK-X a (2) Ca5, TNFa, IL-4, IL-6, IL-10 nebo IL-13.

tabulka 5 přehled určení a distribuce tyrozinových proteinkináz v buňkách z periferní krve procent distribuce-----------------------------------

protein-	molekulová	nosič..	IHK-X HK-X HK-X +	éerst\é
kina/d	1 váhá		““Sý ^,LJ	‘ i* normální. biÉfcv ·. ’ -
PI3 kináza	102 Kd		14 ⁴
PI3 kináza	83 Kd	I··!!	•7,7 íVjM.ý'; 10,4	4;í''
	65 až 68 Kd		•7,8 8,9	lili·
Ras	21 Kd	i	,12,7 11,3
ΡρύΟ Sre	62 Kd		!^{5 8}’⁸	*3S. ⁴
1 RK-1	44 až 49 Kd	Mil	’·⁶’^{9 8}·⁶	8,5'
G-protein a	56 Kd	Β»	6,3 7,'StV ; 8,2	12,3
G-protein β	33 až 35 Kd		7 ⁵³	9,3.-‘ ·
G-protein γ	9 Kd	11111	1X4 22 ϊ - M	lL9f

tabulka 6 přehled určení a distribuce tyrozinových proteinkináz v buňkách z periferní krve procent distribuce-----------------------------------

protein- kináza	molekulová váhá	C5a plus HK-X	TNFa plus HK-X	IL-4 plus HK-X	HK-X
PLCy	150 Kd	2,2	2,4	7,7	4*2
PÍ 3 kináza	102 Kd	2,7	3,1	6,0	1B1B·
PI3 kináza	83 Kd	6,9	5,5	7,7
Rař	65 až 68 Kd	6,4	5,7	3,1
Ras	21 Kd	16,5	20,9	9,9	a··
PpbO Stc	62 Kd	5,8	7,4	4,5
ERK-1	44 až 49 Kd	6,5	5,9	6,4
G-protein α	56 Kd	5,5	6,3	7,9
G-protein β	33 až 35 Kd	6,2	6,2	8,0
(i-protein y	9 Kd	o	1Λ		9,4

tabulka 7 přehled určení a distribuce tyrozinových proteinkináz v buňkách z periferní krve procent distribuce----------------- --------------

protein-	molekulová	IL-6 plus	IL-10 plus	IL-13 plus	nosíc
kináza	váhá	HK-X	HK-X	HK-X
. PLGy.	150 Kd	5,0	3,8	11,2	5.8
PI 3 kináza	102 Kd	3,5	3,4	13,3
PI 3 kina/a	83 Kd	4,3	5,7	7,2	SBI8
	65 až 68 Kd	6,7	2,6	5,7
Ras	21 Kd	17,6	15,8	9,8
Pp60 Src	62 Kd	6,7	4,7	4,4	Μ
ERK-1	44 až 49 Kd	8,9	8,8	6,9
G-protein α	56 Kd	8,7	8,1	4,9
G-protein β	33 až 35 Kd	6,6	8,5	5,2	lllllB
G-protein y	9 Kd	£4	iLi	X4	6J

V průběhu stimulace buněk, zaměřené na receptory formylpeptidů, nastává množství důležitých jevů. Ty zahrnují:

• ·

A. Po navázání FMLP nebo jiného analogu FPR interaguje s G-proteinovým poolem, což je společné jiným chemoatraktantovým receptorům, jako jsou LTB4 a C5a receptory (Jacobs et al., J. Leukoc. Biol. 57: 679-686, 1995; McLeish et al., Mol. Pharm. 36: 384-390).

B. Následující stimulací FMLP nebo jinými chemoatraktanty se buňky staly odolné vůči další nebo následné odezvě na stejné nebo jiné chemoatraktanty. Jestliže je odolnost nebo inaktivace receptorů indukována jedním stimulantem a působí na četné receptory bez ligandu, je tato situace heterologní snížení citlivosti. Spekulovalo se, že tato forma snížení citlivosti může pocházet od fosforylace receptorů bez ligandu pokračováním aktivovaných kináz, jako s FCsR receptorem·

C. IL-8, C5a a FMLP snižují citlivost svým receptorům navzájem. Tyto studie byly rozšířeny o zahrnutí PAF a LTB4 receptorů. Mechanismy, kterým může být tento proces zahájen, zahrnují fosforylaci PKC. Nicméně FPR neobsahuje intracelulární domény, schopné být fosforylovány PKC, ale zdá se, že je za to odpovědná jiná kináza.

D. Snížení citlivosti pokračováním FPR odpovědí nastává při absenci FPR fosforylace.

Samotné ošetření HK-X specificky nesnižuje regulaci kináz. G-protein γ kináza byla selektivně a významně snížena po současné stimulaci mononukleárních buněk HK-X a IL-8 nebo HK-X a FMLP. Tyto pozorování naznačují následující mechanismus účinku HK-X, který je popsán níže.

HK-X a účinné prozánětlivé molekuly, jako je IL-8 a FMLP, mohou být přítomny společně. Nastává snížení regulace jedné části z trimerického G-proteinkomplexu. Přesněji byla za podmínek ustáleného stavu snížena G-protein γ fosforylace. Proto se HK-X v přítomnosti IL-8 nebo FMLP zdá, že iniciuje snížení citlivosti receptorů tak, že buď přímo nebo nepřímo inhibuje fosforylaci G-protein γ podjednotky.

Z dat, zveřejněných zde a v dřívějších sděleních, může být utvořeno množství závěrů. Jsou to:

1. HK-X vykazuje specifítu pro buňky schopné odpovědi na prozánětlivé stimuly, zprostředkované specifickými pro zánětlivými receptory.

2. Jestliže HK-X je udržováno v systému v průběhu prozánětlivých jevů, může HK-X udržovat snížení citlivosti silně reagujících buněk.

3. Použitím in vitro kultivačního systému, jak je popsáno v této zprávě, mohou být pro citlivost k účinku HK-X vybrány jiné cílové buňky a jiné prozánětlivé mediátory.

• · ♦ · · · · ···· • · ····· · · · • · ···· ··· ······· ·· ·· ·* ····

Může být tak použita jednoduchá cesta k rychlému prověření potenciálních léčebných účinků a ke stanovení vytyčení léčby.

Částečně se jeví, že léčebná účinnost HK-X je způsobena díky snížení citlivosti prozánětlivých mediátorových receptorů. Pokračování tohoto jevu je zprostředkováno inaktivací prozánětlivých buněk a provedeno buď přímo nebo nepřímo inhibici fosforylace G-protein γ podjednotky.

Předkládaný vynález byl popsán v detailech, které zahrnují jeho upřednostňované části. Nicméně uznává se, že odborníci v oboru ho mohou pozměňovat a zlepšovat v duchu a rozsahu vynálezu, jak je vyložen v nárocích.

• ·

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Receptorový komplex, vyznačuj ící se tím, že obsahuje modifikační činidlo Gproteinkinázové signální dráhy a buněčný povrchový receptor lidských mononukleárních buněk nebo polymorfonukleámích nukleráních buněk z periferní krve nebo fixovaných tkáňových buněk, které byly stimulovány prozánětlivým činidlem.
2. Receptorový komplex podle nároku 1, vyznačující se tím, že lidské mononukleámí buňky z periferní krve jsou vybrány z lymfocytů a monocytů nebo polymorfonukleámí buňky jsou vybrány z eozinofilů a bazofilů.
3. Receptorový komplex podle nároku 1,vyznačující se tím, že fixované tkáňové buňky jsou vybrány z mastocytů, dentritických buněk, astrocytů a makrofágů.
4. Receptorový komplex podle nároku 1,vyznačující se tím, že modifikační činidlo G-proteinkinázové signální dráhy je f-Met-Leu.
5. Receptorový komplex podle nároku 1,vyznačující se tím, že modifikační činidlo G-proteinkinázové signální dráhy je f-Met-Leu-Phe-Phe.
6. Receptorový komplex podle nároku 1, v y z n a č u j í c í se t í m, že prozánětlivé činidlo je vybráno z cytokinů, chemokinů, chemotaxinů a mitogenů.
7. Receptorový komplex podle nároku 1, vy zn a č u j í c í se t í m, že prozánětlivé činidlo je vybráňo z fMLP, aktivovaného, komplementárního fragmentu, leukotrienu B4 a destičkového aktivačního faktoru nebo IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13 a TNFa.
8. Způsob určení modifikačního činidla G-proteinkinázové signální dráhy, vyznačující se t í m, že způsob obsahuje kroky:

a) kontakt prozánětlivých mediátorových buněk, vybraných ze skupiny, která se skládá z aktivovaných T-lymfocytů, mastocytů, eozinofilů a bazofilů, se známým prozánětlivým mediátorem, vybraným ze skupiny, která se skládá z cytokinů, chemotaxinů a mitogenů, a vyvolává prozánětlivou odpověď;

• ·

b) přidání ke kroku a) kandidáta modifikačního činidla G-proteinkinázové signální dráhy;a

c) detekce poklesu nebo vzrůstu množství regulující G-proteikinázy v (i) prozánětlivých mediátorových buňkách, současně kontaktovaných s uvedeným kandidátem na činidlo a uvedeným prozánětlivým mediátorem, porovnaný s (ii) prozánětlivými mediátorovými buňkami, kontaktovanými se samotným prozánětlivým meditátorem.
9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že prozánětlivé činidlo je vybráno z fMLP, aktivovaného komplementárního fragmentu, leukotrienu B4 a destičkového aktivačního faktoru nebo IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13 a TNFa.
10. Buněčný povrchový receptorový komplex, ,vyznačuj ící se tím, že obsahuje modifikační činidlo G-proteinkinázové signální dráhy navázané na receptor na povrchu prozánětlivých mediátorových buněk, vybraných ze skupiny, která se skládá z aktivovaných T-lymfocytů, mastocytů, eozinofilů a bazofilů, čímž je zajištěna inhibice prozánětlivé buněčné odpovědi na prozánětlivé činidlo.
11. Způsob určení modifikačního činidla G-proteinkinázové signální dráhy, vyznačující se t i m, že uvedený způsob obsahuje kroky:

kontakt prozánětlivých mediátorových buněk, vybraných ze skupiny, která se skládá z aktivovaných T-lymfocytů, mastocytů, eozinofilů a bazofilů, s kandidátem modifikačního činidla G-proteinové signální dráhy; a určení distribuce proteinkináz, produkovaných uvedenými buňkami, kde ve srovnání s buňkami nekontaktovanými kandidátem modifikačního činidla Gproteinové signální dráhy nebyl rozdíl v množství PLC_y, Pp60 Src a ERK-1, vzrostlo množství PI3 (102 Kd) a PI3 (83 Kd) a pokleslo množství Raf, Ras, G-protein a a Gprotein β kináz.
12. Buněčný povrchový receptorový komplex, vyznačující se tím, že obsahuje: buněčný povrchový receptor lidských mononukleráních buněk nebo polymorfonukleárních buněk z periferní krve a modifikační činidlo G-proteinové signální dráhy, • · · · kde ve srovnání s buňkami, které nedělaly uvedený receptorový komplex, je distribuce proteinkináz v buňkách taková, že není rozdíl v množství PLC_Y, Pp60 Src a ERK-1, vzrostlo množství PI3 (102 Kd) a PI3 (83 Kd) a pokleslo množství Raf, Ras, G-protein a a G-protein β kináz.
13. Buněčný povrchový receptorový komplex podle nároku 12, v y z n a č u j í c í se tím, že buněčný povrchový receptor je FPR receptor.
14. Buněčný povrchový receptorový komplex podle nároku 12, v y z n a č u j í c í se tím, že stimulace IL-4 lidských mononukleárních buněk nebo polymorfonukleárních buněk z periferní krve zajišťuje distribuci proteinkináz, produkovaných uvedenými buňkami, kde, ve srovnání se stimulovanými buňkami, které nedělaly uvedený receptorový komplex, vzrostlo množství PLC_Y, PI3 (102 Kd) a PI3 (83 Kd) a pokleslo množství Ras a G-protein γ kinázy.
15. Buněčný povrchový receptorový komplex podle nároku 12, vyznačující se tím, že stimulace prozánětlivým činidlem IL-13 lidských mononukleárních buněk nebo polymorfonukleárních buněk z periferní krve zajišťuje distribuci proteinkináz, produkovaných uvedenými buňkami, kde, ve srovnání se stimulovanými buňkami, které nedělaly uvedený receptorový komplex, vzrostlo množství PLC_Y, PI3 (113 Kd) a PI3 (83 Kd) a pokleslo množství Raf, Ras, Pp60 Src, G-protein a a G-protein β kináz.
16. Buněčný povrchový receptorový komplex podle nároku 12, vyznačující se tím, že stimulace prozánětlivým činidlem, C5a, lidských mononukleárních buněk nebo polymorfonukleárních buněk z periferní krve zajišťuje distribuci proteinkináz, produkovaných uvedenými buňkami, kde, ve srovnání se stimulovanými buňkami, které nedělaly uvedený receptorový komplex, vzrostlo množství PI3 (83 Kd) a Raf a pokleslo množství PLC_Y, PI3 (113 Kd), G-protein a a G-protein β kináz.
17. Buněčný povrchový receptorový komplex podle nároku 12, v y z n a č u j í c í se tím, že stimulace prozánětlivým činidlem, TNFa, lidských mononukleárních buněk nebo polymorfonukleárních buněk z periferní krve zajišťuje distribuci proteinkináz, produkovaných uvedenými buňkami, kde, ve srovnání se stimulovanými buňkami, které • « • · • · nedělaly uvedený receptorový komplex, vzrostlo množství Raf, ERK.-1, Ras, G-protein ot, G-protein β a G-protein γ kináz a pokleslo množství PLC_Y, PI3 (113 Kd) a PpóOSrc kináz.
18. Použití modifikačního činidla pro přípravu léčiva pro inhibici prozánětlivé odpovědi lidských mononukleárních buněk nebo polymorfonukleámích buněk z periferní krve nebo fixovaných tkáňových buněk, jestliže jsou v kontaktu s prozánětlivým činidlem.
19. Použití podle nároku 1, ve kterém lidské mononukleámí buňky z periferní krve jsou vybrány z lymfocytů a monocytů nebo polymorfonukleární buňky jsou vybrány z granulocytů.
20. Použití podle nároku 1, ve kterém lidské mononukleámí nebo polymorfonukleární buňky z periferní krve jsou vybrány z eozinofilů, bazofilů a aktivovaných T-buněk.
21. Použití podle nároku 1, ve kterém fixované tkáňové buňky jsou vybrány z mastocytů, dentritických buněk, astrocytů nebo makrofágů.
22. Použití podle nároku 1, ve kterém prozánětlivé činidlo je vybráno z cytokinů, chemotaxinů a mitogenů.
23. Použití podle nároku 1, ve kterém prozánětlivé činidlo je vybráno z fMLP, aktivovaného komplementárního fragmentu, leukotrienu B4, destičkového aktivačního faktoru, IL-4, IL6, IL-8, IL-10, IL-13 aTNFa.
24. Použití podle nároku 1, ve kterém modifikační činidlo G-proteinkinázové signální dráhy je peptid f-Met-Leu.
25. Použití podle nároku 1, ve kterém modifikační činidlo G-proteinkinázové signální dráhy je f-Met-Leu-Phe-Phe.
26. Použití komplexu buněčného povrchového receptoru s modifikačním činidlem Gproteinové signální dráhy pro přípravu léčiva pro inhibici prozánětlivé odpovědi lidských mononukleárních buněk nebo polymorfonukleárních buněk z periferní krve nebo fixovaných tkáňových buněk, jestliže jsou v kontaktu s prozánětlivým činidlem.
27. Použití podle nároku 26, ve kterém buněčný povrchový receptor je formylpeptidový receptor.
28. Použití podle nároku 26, ve kterém prozánětlivá odpověď zahrnuje inhibici následných receptorů, kde přívodní receptor je FC receptor, což je receptor pro činidlo, vybrané z imunoglobulinů, cytokinů, vybraných ze skupiny, která se skládá z IL-4, IL-6, IL-8, IL10, IL-13 a TNFa nebo chemokinů, vybraných ze skupiny, která se skládá z C5a, FMLP, PAF, LTB4.
29. Použití podle nároku 26, ve kterém lidské mononukleámí buňky z periferní krve jsou vybrány z lymfocytů a monocytů nebo polymorfonukleámí buňky jsou vybrány z eozinofilů a bazofilů.
30. Použití podle nároku 26, ve kterém lidské mononukleámí nebo polymorfonukleámí buňky z periferní krve jsou vybrány z eozinofilů, bazofilů a aktivovaných T-buněk.
31. Použití podle nároku 26, ve kterém fixované tkáňové buňky jsou vybrány z mastocytů, dentritických buněk, astrocytů nebo makrofágů.
32. Použití podle nároku 26, ve kterém prozánětlivé činidlo je vybráno z cytokinů, chemotaxinů a mitogenů.
33. Použití podle nároku 26, ve kterém prozánětlivé činidlo je vybránoz fMLP, aktivovaného komplementárního fragmentu, leukotrienu B4, destičkového aktivačního faktoru, IL-4, IL6, IL-8, IL-10, IL-13 aTNFa.
34. Použití podle nároku 26, ve kterém modifikační činidlo G-proteinkinázové signální dráhy je f-Met-Leu.
35. Použití podle nároku 26, ve kterém modifikační činidlo G-proteinkinázové signální dráhy je f-Met-Leu-Phe-Phe.