MXPA02003782A - Complejo receptor del peptido n-formil con el agente modificado por la ruta senalada de la proteina g cinasa y metodos para alterar la ruta indicada por la transduccion esperada para la estimulacion por el pro-inflamatorio. - Google Patents

Abstract

Se describe un metodo para inhibir una respuesta pro-inflamatoria de una celula mononuclear o celula polimorfo nuclear de sangre periferica humana, o celula de tejido fijo. Las celulas se ponen en contacto con un agente pro-inflamatorio para estimular una respuesta pro-inflamatoria. Despues, la celula se pone en contacto con un agente de modificacion de la ruta senal de protein cinasa G, inhibiendo con eso las rutas de transduccion de senal de la respuesta inflamatoria mediadas por la proteina G. Se describe un complejo receptor en donde un agente de modificacion de la ruta senal de protein cinasa G se enlaza a un receptor de superficie celular de una celula mononuclear o celula polimorfonuclear de sangre periferica humana que ha sido estimulada por un agente pro- inflamatorio.

Description

COMPLEJO RECEPTOR DEL PEPTIDO N-FORMIL CON EL AGENTE MODIFICADO POR LA RUTA SEÑALADA DE LA PROTEÍNA G CINASA Y MÉTODOS PARA .ALTERAR LA RUTA INDICADA POR LA TRANSDUCCIÓN ESPERADA PARA LA ESTIMULACIÓN POR EL PRO-INFLAMATORIO BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a los receptores del péptido N-formilo, que se encuentran en la superficie de las células sanguíneas periféricas, y particularmente a complejos de dichos receptores con agentes que alteran o desorganizan la ruta señalada de la proteina G, particularmente algunos péptidos N-formilo, y a métodos para alterar la transducción de la señal debido a la co-estimulación por agentes- pro-inflamatorios . El cuerpo humano ha evolucionado hasta desarrollar mecanismos de defensa para infecciones bacterianas usando péptidos N-formilmetionilo bacterialmente generados • como quimioatrayentes para fagocitos, en particular, neutrófilos y monocitos. De los péptidos N-fo.rm.ilo, se identificó f-Met- Leu-Phe (FMLP) como el más potente en su habilidad para construir fagocitos y estimular la liberación de enzimas lisosomales por neutrófilos (Showell et al., J. Exp. Med. 143:1154-1169, 1976). Los tetrapéptidos sintéticos, particularmente f-Met-Ile-Phe-Leu y f-Met-Leu-Phe-Ile, se han mostrado también subsecuentemente que evocan respuestas de neutrófilos (Rot et al., Proc. Nati . Acad. Scie. USA 84:7967- 7971, 1987) . La potencia de estos péptidos se atribuyó inicialmente a: (1) un grupo formilo en el N-término, (2) una cadena secundaria de metionina, y (3) cadenas secundarias de leucina y fenilalanina. La clonación ADNc del receptor del péptido N-formilo (FRP) seguido por la delineación de la estructura primaria de la proteína FPR proporcionó un avance principal para entender el mecanismo de acción de los péptidos N-formilo (Boulay et al., Biochemistry 29: 11123-11133, 1990; Boulay et al., Biochem. Biophys . Res . Commun. 168: 1103-1109, 1990) . El FPR se encontró inicialmente en neutrólifos y monocitos pero se ha mostrado subsecuentemente .que se expresa en el cerebro humano, hepatocitos, células dendríticas, y astrocitos (Lacy et al., ". Neuroimmunol . 61: 71-78, 1995; Sozzani et al., J. Immunol . 155: 3292-3295, 1995) . Después se aislaron otros dos genes FPR, FPR2 (.también conocida como FPRL1 y FPRH1). (Bao et al., Genomics 13: 437-440, 1992; Murphy et al., J. Biol . Chem. 267: 7637-7643, 199; Ye et al., Biochem . Bi ophys . Res . Commun. 184: 582-589, 1992) y FPRL2 (Bao et al., supra) . El FPRL1 consiste de 351 aminoácidos y comparte 70% de identidad con FPR pero se encontró que tiene una afinidad 400 veces menor para FMLP que el FPR original. El FPRL2 comparte 56% de identidad con FPR y 83% de identidad con FPRL1. Sin embargo, a diferencia de FPRL1, que se expresa en monocitos y neutrófilos, se encontró que el FPRL2 se expresa en monocitos pero no en neutrófilos (Durstin et al., Biochem. Bi ophys . Res . Commun . 201: 174-179, 1994). El FPR contiene siete dominios hidrofóbicos que abarcan la membrana plasmática, conectada por secuencias hidrofilicas expuestas al espacio extracelular o al espacio intracelular (Murphy, Annu . Rev. Immunol . 12: 593-633, 1994). El primer y terceros bucles intracelulares son relativamente pequeños, consistiendo de 5 y 16 aminoácidos, respectivamente. El carboxi terminal se expone al espacio intracelular, mientras que el N-terminal se expone al espacio extracelular. Las secuencias intracelulares contienen adicionalmente un dominio de acoplamiento de proteína G (un dominio esencial para la función del receptor como se discute posteriormente), y un dominio de fosforilación potencial. El dominio de enlace de FMLP parece indicarse en el primer y tercer dominios intracelulares de FPR (Quehenberger et al., J. Bi ol . Chem. 268: 18167-18175, 1993). Además, han existidos sugerencias de estados intercomvertibles de FPR, que alternan entre estados de enlace de alfa afinidad y enlace de baja afinidad para el enlace de EMLP (Kermode et al. Biochem. J. 276: 715-723, "1991) . Se piensa que la proteína G regula dichos estados interconvertibles. El FPR solo, sin asociación con la proteína G, representa un estado de baja afinidad, mientras que el enlace de FPR a la proteína G presenta un estado de enlace de alta afinidad.. El modelo disecta adicionalmente el FPR enlazado a la proteína G en tres estados diferentes que cuentan por las diferentes potencias observadas para péptidos diferentes. El Estado I representa el estado de enlace de baja afinidad en el cual FPR no se asocia con la proteína G pero puede convertirse en el estado de alta afinidad del Estado II durante el enlace a la proteína G. El Estado III es un paso intermediario de alta afinidad en el cual el receptor enlaza el ligando, liberando a su vez la subunidad Ga de la proteína G. el Estado IV es un estado de baja afinidad transiente, en el cual, las subunidades de la proteína G restantes (Gß y G?) se disocian del receptor. La disasociación de la subunidad Ga de la proteína G conduce a las funciones de efecto de la proteína G, causando la activación celular. Un modelo similar se propuso por Sklar et al. ( J. Biol . Chem. 264: 8483-8486, 1989) . De acuerdo al modelo anterior, la potencia de un péptido se determina por el tiempo de residencia en el Estado III (Kermode et al., supra) . Los autores proponen que los péptidos formilo más potentes tales como fMet-Leu-Phe-Phe y fMet-Leu-Phe-NHBzl estabilizan temporalmente y mantienen el Estado III, la cual dispara una respuesta de desgranulación inmediata pero la duración en el Estado III permite una señal sostenida para respuestas quimiotácticas, permitiendo la máxima migración. Los péptidos formilo menos potente median una rápida conversión del Estado III de alta afinidad en el Estado IV de baja afinidad. Aunque la respuesta de desgranulación inicial en el Estado III no se afecta, la habilidad de señalización quimiotáctica se minimiza y así se limita la migración celular. Por lo tanto, en general, puede decirse que un ligando altamente potente efectúa respuestas quimiotácticas enlazándose al estado de alta afinidad de FPR, mientras que un ligando menos potente efectúa la respuesta de desgranulación enlazándose al estado de baja afinidad de FPR. La actividad agonista y la actividad antagonista también pueden definirse usando este modelo. Un agonista estabiliza el Estado III del receptor activado, y el grado de estabilización se refleja en su potencia. Un agonista, por otro lado, se enlaza al receptor pero desestabiliza el Estado III activado e inactiva el receptor. Dicho modelo no se limita a FPR. Además, se dice que ocurre la desensibilización cuando un ligando enlaza al receptor y el mismo o diferente receptor se vuelve refra-ctario a la estimulación subsiguiente por el mismo o diferente ligando. Este estado desensibilizado puede formarse después de la ocupación del receptor en el curso normal de la activación celular, resultando en la desensibilización del Estado III, o antes de la ocupación del receptor, en el cual Estado III nunca se logra. Cuando el estado refractario o la inactivación del receptor se induce por un estimulante y afecta los receptores no ligados múltiples, esta situación se llama desensibilización heteróloga. El péptido N-formilo más bien estudiado es f-Met- Leu-Phe (FMLP o fMLP) . Sin embargo, se han caracterizado péptidos más potentes con receptores sobre neutrófilos de conejo in vi tro, en particular, fMet-Leu-Phe-Phe y fMet-Leu-Phe-NHBzl (fMet-Leu-Phe benzilamida) , y fNle-Leu-Phe-Tyr (N-formil-L-norleucil-Leu-Phe-Tyr) (Kermode et al., supra) . Estos muestran la máxima migración (sobre el orden de 20-35 µm) y desgranulación (del orden de ED50 de 10-10 a 10-'') . Estudios más recientes sugieren que los péptidos no formulados también pueden enlazar FPR y pueden actuar como potentes activadores de la función de neutrófilos. Por ejemplo, Met-Met-Trp-Leu-Leu es un pentapéptido potente y es comparable en actividad con EMLP (Chen et al., J. Biol . Chem. 270:23398-23401, 1995) . La conversión del pentapéptido en una forma N-formilada levantaron su potencia 100-500 veces, demostrando que la N-formilación aún juega un papel significativo en la potencia de un péptido, aunque la bioactividad no parece determinar estrictamente por la N-formilación. Otras modificaciones a los péptidos han mostrado que algunos péptidos pueden convertirse en agonistas potentes para FPR (Derian et al., Bi ochemistry 35:1265-1269, 1996; Higgins et al., J. Med. Chem. 39:1013-1017, 1996). Dichas modificaciones incluyen la sustitución de urea del grupo amino terminal y modificaciones carbamato. Además, la alteración de la composición de aminoácido del péptido MLF ha mostrado también convertir los agonistas en antagonistas de FPR, como se determina por la liberación de anión superóxido y la adhesión de neutrófilos al endotelio vascular. La quimiotasis estimulada por péptidos N-formilo por medio de FPR en neutrófilos ha sido bien estudiada. Aún antes de la estimulación por péptidos N-formilo, los neutrófilos se enlazan transcientemente a P-selectina expresada en las células del endotelio. La activación de los neutrófilos mediada por péptidos N-formilo generados en el sitio de inflamación conduce a la acumulación de neutrófilos en este sitio. Los péptidos N-formilo regulan a la alta L-selectina en los neutrófilos y el enrollado directo de neutrófilos a lo largo del endotelio, seguido por la regulación a la alta de integrinas sobre la superficie de los neutrófilos. Las integrinas median las interacciones célula-célula y célula-matriz extracelular y se enlazan a laminina, fibronectina, victronectina, así como a ICAM (molécula de adhesión celular intracelular) y VCAM (molécula de adhesión celular vascular) encontradas en el endotelio. Durante el enlace de las integrinas a ICAM y VCAM, se transduce una señal al interior del neutrófilo a través de interacciones con el citoesqueleto. Los neutrófilos esparcen después L-selectina a extenderse a lo largo del endotelio. La regulación a la alta E-selectina e ICAM-1 sobre la superficie de las células del endotelio media después la migración de los neutrófilos a través del endotelio (Luscinskas et al., J. Immunol . 146:1617-1625, 1991). Al cruzar la barrera del endotelio, los neutrófilos migran hacia el sitio de inflamación al percibir un gradiente de concentración del péptido N-formilo. Al alcanzar su desfino, que contiene una alta concentración del péptido, los neutrófilos sueltan sus acciones antimicrobianas. Los neutrófilos estimulados rápidamente activan la explosión oxidasa respiratoria, que cataliza la generación del radical superóxido 02. El radical superóxido reacciona con otras moléculas para producir peróxido de hidrógeno y ácido hipocloroso, que son agentes altamente reactivos y son por lo tanto efectivos para interferir con funciones microbianas. La desgranulación es también un medio efectivo para destruir microbios extraños. Sin embargo, la desgranulación también puede dañar tejido huésped. La fagocitosis es otro mecanismo por el cual los neutrófilos elimina microbios extraños. Muchas de estas funciones se estimulan por medio de la proteína G usando fosfolipasas como segundos mensajeros, tres de los cuales se han caracterizado.

La fosfolipasa C, PLCp , genera dos segundos mensajeros, trifosfato de 1, 4, 5-ionsitol (IP.) y diacilglicerol (DG) . Las subunidades ß? de la proteina G generada durante la activación del FPR activan PLCp;. IP-, se enlaza a algunos canales de calcio para estimular la liberación de calcio a partir del depósito intracelular, resultando en un aumento en la concentración citosólica de calcio de la que se observa durante la estimulación por quimioatrayentes. DG, de acuerdo con el calcio liberado, activa la protein cinasa C (PKC) . Recientemente se ha reportado en la literatura PLC cinasa activada por proteína G (Beaven, et al, J. of Immunology 160:5136-5144, 1998) como una ruta principal para la desgranulación de mastocitos en células peritoneales de rata in vitro, asociada con aumentos de Ca2. La fosfolipasa A (PLA) genera ácido araquidónico a partir de los fosfolípidos de la cara interna de la membrana plasmática. El ácido araquidónico proporciona los precursores para los mediadores inflamatorios tales como leucotrienos y prostaglandinas. La PLA se activa durante la fosforilación por la protein cinasa activada por mitógeno (MAP) . La tercera foafolipasa es fosfolipasa D (PLD) , que genera ácido fosfatídico y colina a partir de fosfatidilcolina. El ácido fosfatídico puede estar involucrado en la activación de la explosión oxidasa respiratoria además de jugar un papel en la producción de DG, que activa PKC. Sin embargo, la activación PLD requiere calcio, y FMPL no puede estimular PLD en células agotadas de calcio (Kessels et al., J. Bi ol . Chem. 266:23152-23156, 1991) . Además, parece que la proteína G Arf y la proteína G Rho regulan la actividad de PLD (Brown et al., Cell 75 : 1137-1144, 1993; Cockcroft et al., Science 263:523-526, 1994; Singer et al., J. Bi ol . Chem . 270: 14944-14950, 1995). La fosforilación de proteína juega un papel central en la transducción de señales iniciada., por EMLP. Tres protein cinasas principales están involucradas en la fosforilación de las proteínas como un resultado de la estimulación de FMLP. Como se discutió anteriormente, PKC es activada por DG, que se genera por PLC. PKC actúa para fosforilar residuos de serina y treonina. PKC consiste de seis diferentes isoformas, tres de las cuales son sensibles al calcio intracelular (formas a, ß y ?) y tres que no lo son (formas 5, e y ?) . Los neutrófilos contienen las formas a, ß y ? pero no la forma ?. La PKC dependiente de calcio y dependiente de DG (PKC-ß) responde a la estimulación de FMPL y éster de forbol translocándose del citosol a la membrana. Entonces fosJ?arila un número de proteínas citosólicas, tales como aquellas involucradas en el sistema de explosión oxidasa respiratorio. Los FMLP también pueden activar la forma PKC independiente de calcio, dependiente de DG y dependiente de fosfatidil serina pero su función no es clara. Se reporta que la MAP cinasa (MAPK) se activa por las subunidades ß? de las proteínas G por las actividades de Ras y Raf. La literatura reciente sugiere que se involucra el señalamiento Ras de alta intensidad para inducir apoptosis (Bar-Sagi, et al., J. Mol . Cell Biol . 19 (9=: 5892-901, 1999) así como para promover la adherencia celular del endotelio (Finkel, et al., ) . Se coloca ahora a Ras con un papel central en las señales de crecimiento, incluyendo la sobrevivencia, crecimiento y diferenciación celular (Rapp, et al., ). Esta ruta de ci-nasa también se estimula por C5a y IL-8 (Buhl et al., J. Biol . Chem. 270: 19828-19832, 1995; Knall et al., J. Bi ol . Chem. 271:2832-2838, 1996). La MAP cinasa induce la fosforilación de tirosina de diversas proteínas reguladoras, tales como la cinasa regulada por señal extracelular (ERK)-l. Literatura reciente sugiere que las rutas de MAPK son responsables de la producción de citocina; sin embargo, la activación de TH-1 y TH-2 citocinas, así como otras moléculas pro-inflamatorias, tales como C5a, IL-8 y FMLP es dependiente de la txansducción de señal de la proteína G trimérica. Fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3K) es responsable de la formación de trifosfato de Pl (PIP3) que se observa durante la estimulación por FMLP. Los niveles de PIP; elevados contribuyen aparentemente a la activación del sistema explosión oxidasa respiratorio y a la polimerización de actina a neutrófilos, que se considera importante para regular los cambios del citoesqueleto y la migración celular. Literatura reciente (Rankin, et al. J. Exp. Med. 188(9) :1621-32, 1998) ha reportado que los niveles de PI3 cinasa elevados también pueden promover la desgranulación de eosinófilos, en base al señalamiento de la proteína G en base a la activación de IL-S. Adicionalmente, Sagi-Eisenbertg, et al, Eur. J. Immunol , 1998.28:3468-3478 sugiere que la señalización de la proteína G, usando las rutas intermedias de PKC y PI3 cinasas, puede activar el receptor de FCeR por IgE para la liberación de histaminas y otras situaciones pro-inflamatorias involucradas en la hipersensibilidad alérgica de vías aéreas. Uckun, et al. J. of Biolog. Chemistry, Vol. 274, No. 38, sep., 1999, pp . 27028-27038 reporta señalamiento de la proteína G en la ruta de JAK3 cinasa a través de reticulación de IgE/FCeRl como conduciendo a la desgranulación de mastocitos. Beaven, et al, J. of Immunology, 1998, 160:5136-5144 reporta que el señalamiento de la proteína G a través de la activación de PKC y la captación resultante de Ca'+, también conduce a la secreción y desgranulación de mastocitos. Así, la proteína G puede ser esencial para la activación corriente abajo del FCeRl durante el reto del antígeno IgE, y la habilidad correspondiente para interferir con el señalami en±o de la proteína G, puede ser una base importante para la inhibición corriente abajo de la activación del receptor FCeR. Se han identificado diversos antagonistas de FPR de neutrófilo de conejo pero las características que hacen algunas moléculas antagonistas son aún desconocidas; Algunos análogos de butoxicarbonilo de FMLP han mostrado inhibir competitivamente la activación celular inducida por péptido quimiotáctico, de los cuales BocPLPLP se encontró ser el más potente (Schiffman et al., FEBS Lett "117-1, 1980; Freer et al., Biochemistry 19:2404, 1980; Freér et al., Biochemistry 19:2404, 1980; Kanaho et al., J. Leukocyte Biol . Al-: 420, 1990) . La ciclosporina H, un undecapéptido cíclico y un análogo de la ciclosporina A, también ha mostrado poseer actividad antagonista hacia el receptor del péptido formilo. También se ha identificado un antagonista del receptor del péptido formilo (Wenzel-Seifert et al., J. Immunol . 150:4591-4599, 1993) que ocurre naturalmente, un hexapéptido derivado de retrovirus (Oostendorp et al., J. Immunol . 149:1010, 1992) . Sin embargo, ninguno de estos antagonistas se enlaza a los receptores del péptido formilo con alta afinidad y por lo tanto no son de uso práctico como herramientas para investigación de como fármacos anti-inflamatorios. Interesantemente, la invención de la desgranulación del mastocito por N-formil-metionil-leucil-fenilalanina se reportó en Inf lamma tion, Vol. 5, No. 1 pp . 13-16(1981). .Ahí, se reporto que dos péptidos quimiotácitos estructuralmente diferentes, es decir, pepstatin y N-formil-metionil-leucil-fenilalanina, inhiben el aumento de la permeabilidad vascular en la piel de rata producida por inyección intradérmica de 40/80, suero IgE anti-rata, o factor de permeabilidad aniónico y macromolecular a partir de pulmón de becerro. Se reportó que estos péptidos parecen actuar directamente sobre los mastocitos. El mecanismo de dicha inhibición es desconocido debido a que no es DPR se expresa en mastocitos. Claramente, existen muchas preguntas sin respuesta respecto a la función y mecanismo de acción de FPR. Además, el descubrimiento de FPR se expresa en células no leucosíticas, tales como las células del cerebro y dendríticas, sugiere que FPR puede realizar nuevas funciones en otros tipos de células que deben aún alucidarse. Así, se necesitan agentes adicionales para inhibir la respuesta pro-inflamatorias de las células así como métodos para estudiar la respuesta pro-inflamatoria de las células. Contenido Se ha descubierto ahora que el tratamiento de células mononucleares o células polimórfonucleares de sangre periférica humana, o células de tejido fijo con un agente de modificación de la ruta señal de la protein cinasa G después de la estimulación de dichas células con un agente pro- inflamatorio y mide la respuesta pro-inflamatoria convencional, particularmente respuestas pro-inflamatorias corriente abajo inducidos por agente pro-inflamatorios tales como, por ejemplo C5a, FMLP, IL-4, IL-6, IL-8, 11-10, IL-13 y TNFa o por el receptor FCe. La alteración de la producción celular de la proteína G inhibe las rutas de transducción de señales de la respuesta inflamatoria mediadas por la proteína G. agentes de modificación de la ruta señal de protein cinasa G, particularmente útiles son péptidos N-formil-metionil-leucil (??f-Met-Leu") que tienen la fórmula f-Met-Leu X en donde X se selecciona a partir del grupo que consiste de Tyr, Tyr-Phe, Phe-Phe y Phe-Tyr, más preferentemente f-Met-Leu-Phe-Phe. Las células mononucleares o polimorfonucleares de sangre periférica humana o células de tejido fijo pueden ser linfocitos y granulocitos, preferentemente eosinofilos, basófilos, y células T activadas, y mastocitos. El agente de modificación de la ruta señal de protein cinasa G forma un complejo con un receptor de la superficie celular, preferentemente el receptor péptido formilo ("FPR") , que está presente sobre estas células que, en la presencia de agentes pro-inflamatorios, inhibe la fosforilación de la subunidad ? de la proteína G en modalidades preferidas de la presente invención. Adicionalmente, al inhibir o bloquear la fosforolización corriente abajo de la proteína G, diversas rutas dependientes de los componentes de la proteína G trimérica bloquean o regulan a la baja la respuesta de las células a los agentes pro-inflamatorios . Una modalidad preferida de _ la invención, a nivel del re.ceptor FCe (FCeR) , este agente de modificación de la ruta señal de protein cinasa G, en la presencia de IgE, inhibe la activación del FCeR por IgE. De acuerdo con la presente invención, los agentes pro-inflamatorios usados para estimular las células mononucleares y polimorfonucleares de sangre periférica humana, o células de tejido fijo son preferentemente citocinas, quimiotaxinas, o mitógenos. Los agentes pro-inflamatorios especialmente preferidos son péptidos N-formilo tales como EM.LP, fragmento de complemento activado (C5a) , leucotrieno (B4 (LTB4) , factor que activa plaquetas (PAF) y citocinas tales como TNFa, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 y IL-13, más IgE, IgG o IgA reticuladas con antígeno. En otra modalidad de la presente invención, se proporciona un método para inhibir una respuesta pro-inflamatoria de una célula mononuclear o polimorfonuclear de sangre periférica humana, comprendiendo el método de poner en contacto la célula con un agente de modificación de la ruta señal de protein cinasa G, y enlace del agente a un receptor sobre las células. La célula mediadora pro-inflamatoria puede ser un linfocito o un granulocito. Preferentemente,- la célula se estimula primero por un agente pro-inflamatorio tal como se indicó anteriormente. En una modalidad preferida de la invención, el receptor enlazado a ligando es un receptor de péptido formilo. El bloqueo corriente abajo de la activación de la proteína G del receptor FCeR proporciona un beneficio terapéutico similar. La presente invención proporciona adicionalmente un método para identificar un agente de modificación de la ruta final de protein cinasa G, comprendiendo el método los pasos de: a) poner en contacto una célula mediadora pro-inflamatoria selecciona a partir del grupo que consiste de linfocito T activado, mastocito, eosinófilo y basófilo con un mediador pro-inflamatorio conocido seleccionado a partir del grupo que consiste de una citosina, qui otaxina, y itógeno y produciendo una respuesta pro-in lamatoria; b) agregar al paso a) un agente de modificación de la ruta señal de la proteína G candidato; y c) detectar una disminución en la cantidad de una protein cinasa G o la falla de la protein cinasa G para disasociarse en (I) una célula pro-inflamatoria simultáneamente puesta en contacto con el agente candidato y el mediador pro-inflamatorio en comparación con (ii) una célula pro-inflamatoria puesta en contacto con el mediador inflamatorio solo. Una protein cinasa G preferida es la protein ?cinasa G. 5 En otra modalidad de la presente invención, se proporciona un complejo de receptor con un agente de modificación de la ruta señal de protein cinasa G sobre la superficie de una célula mediadora pro-inflamatoria seleccionada a partir del grupo que consiste de linfocito T 10 activado, mastocito, eosinófilo y basófilo poniendo en contacto la célula mediadora pro-inflamatoria con el agente de modificación de la ruta señal de protein cinasa G inhibiendo con ello una respuesta pro-inflamatoria. En una modalidad adicional de la invención, un 15 método para identificar un agente de modificación de la ruta señal de protein cinasa G comprende los pasos de: Poner en contacto una célula mediadora pro- inflamatoria seleccionada a partir del grupo que consiste de linfocito T activado, mastocito, eosinófilo y basófilo cto un 20 agente de modificación de la ruta señal de la proteína G candidato; y Determinar la distribución de protein cinasas producidas por la célula, Donde comparada con las células no puestas en Z ~ contacto por el agente de modificación de la ruta señal de la 13 proteína G candidato no existe cambio en la cantidad de PLC?, Pp60 Src, y ERK-1, existe un aumento en la cantidad de PI3 (102 Kd) y PI3 (83 Kd) , y existe una disminución en la cantidad de Raf, Fas, proteína a G y proteína ß G cinasas. Así, la presente invención proporciona también un nuevo complejo receptor de una célula mononuclear o una célula polimorfonuclear sanguínea periférica humana que comprende un receptor de superficie celular y un agente de modificación de la ruta señal de la proteína G en donde, en comparación con las células que no presentan el complejo receptor, la distribución de protein cinasa en las células es tal que no existe cambio en la cantidad de PLC?, PP60-Src, y ERK-1, existe un aumento en la cantidad de Pll, (102 Kd) y PI3 (83 Kd) , y existe una disminución en la cantidad de Raf, Ras, proteína a G y proteína ß G cinasa. Preferentemente, el receptor de la superficie celular es un receptor FPR. También se prefiere el bloqueo secundario de la activación de la proteína G del receptor FCeR. La estimulación por IL-4 de una célula mononuclear o una célula polimorfonuclear de sangre periférica humana que tiene un receptor de superficie celular en complejo con un agente de modificación de la ruta señal de la proteína G proporciona una distribución de protein cinasas producidas por la célula en donde, con comparación con las células estimuladas que no presentan el complejo receptor, existe un aumento en la cantidad de PLC?, PI3 (102 Kd) y PI3 (83 Kd) , y una disminución en la cantidad de Ras y proteína ? cinasa G. La estimulación por IL-6 de una célula mononuclear o una célula polimorfonuclear de sangre periférica humana que tiene un receptor de superficie celular en complejo con un agente de modificación de la ruta señal de la proteína G proporciona una distribución de protein cinasas producidas por la célula en donde, con comparación con las células estimuladas que no presentan el complejo receptor, existe un aumento en la cantidad de PLC?, PI3 (102 Kd) , Raf, Pp60 Src, ERK-1 y proteína a G, y una disminución en la cantidad de PI3 (83 Kd) , proteína ß G y proteína ? G cinasa. La estimulación por IL-10 de una célula mononuclear o una célula polimorfonuclear de sangre periférica humana que tiene un receptor de superficie celular en complejo con un agente de modificación de la ruta señal de la proteína G proporciona una distribución de protein cinasas producidas por la célula en donde, con comparación con las células estimuladas que no presentan el complejo receptor, existe un aumento en la cantidad de PI3 (102 Kd) , ERK-1 y proteína ? G, y una disminución en la cantidad de PLC?, PI3 (83 Kd) , Ras y cinasas. La estimulación por el agente pro-inflamatorio IL-13, de una célula mononuclear o una célula polimorfo nuclear de sangre periférica humana que tiene un receptor de superficie celular en complejo con un agente de modificación de la ruta señal de la proteína. G proporciona una distribución de protein cinasa producida por la célula en donde, en comparación con las células estimuladas que no presentan el complejo receptor, existe un aumento en la cantidad de PLC?, PI3 (102 Kd) , PI3 (83 Kd) , ERK-1 y Raf, y una disminución en la cantidad de Ras, Pp60 Src, proteína a G, proteína ß G y proteína ? G cinasas. La estimulación por el agente pro-inflamatorio C5a, de una célula mononuclear o una célula polimorfo nuclear de sangre periférica humana que tiene un receptor de superficie celular en complejo con un agente de modificación de • la ruta señal de la proteína G proporciona una distribución de protein cinasa producida por la célula en donde, en comparación con las células estimuladas que no presentan el complejo receptor, existe un aumento en la cantidad -de Pp60 Src y Raf, y una disminución en la cantidad de PLC?, PI3 (102 Kd), proteina a G, proteína ß G y proteína ? G cinasas. La estimulación por el agente pro-inflamatorio TNFa, de una célula mononuclear o una célula polimorfo nuclear de sangre periférica humana que tiene un receptor de superficie celular en complejo con un agente de modificación de la ruta señal de la proteína G proporciona una distribución de protein cinasa producida por la célula en donde, en comparación con las células estimuladas que no presentan el complejo receptor, existe un aumento en la cantidad de Raf, Ras y PpßO Src, y una disminución en la cantidad de PLC?, PI3 (83 Kd), proteína a G, proteína ß G y proteína ? G cinasas. 5 BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una gráfica que muestra el enlace de HK-X (f-Met-Leu-Ohe-Phe) marcado con FITC a células nucleadas de sangre periférica humana. Las Figuras 2A-2C son gráficas de punto de enlace 10 de HK-X marcado con FITC con linfocitos activados. La Figura 2A muestra linfocitos estimulados con__6µg de Concanavalin A (ConA) a las 24 horas después de colocado el cultivo con adicción de 100 nM de HK-X marcado con FITC; la Figura 2B muestra linfocitos estimulados con 6 µg de ConA a 120 horas 15 después de colocados en cultivo pero sin HK-X marcado con FITC; y la Figura 2C muestra linfocitos estimulados con 6 µg de ConA a 120 horas después de colocados en cultivo con la adición de lOOnM de HK-X marcado con FITC. Las Figuras 3A-3B son histogramas del contenido de 20 ADN de los linfocitos de la Figura 2A-C. la Figura 3A es un histograma de las células de la Figura 2A y la Figura 3B es un histograma de las células de las Figura 2B y"2C. La Figura 4 es una autoradiografía de proteínas .marcadas con J~'S-metianil recuperadas de usados de células de _.:. r.euLrófilos humanos completos y diversas resinas. ?3 Las Figura 5A-Figura 5B muestran la presencia de proteínas fosforiladas en células mononucleares tratadas con vehículo (0.3 % de DMSO) como se detectan por anticuerpos monoclonales para fosfotirosina. La Figura 5a es una densitometría de SDS-PAGE de células normales y la Figura 5B es una fotografía del gel de SDS-PAGE de células • normales tratadas con vehículo (DMSO) solamente. Las Figuras 6A-6B muestran la presencia de proteínas fosforiladas en células mononucleares tratadas con HK-X como se detectan por anticuerpos monoclonales para fosfotirosina. La Figura 6A es una densitometría de SDS-PAGE de células tratadas con HK-X y la Figura 6B es una fotografía del SDS-PAGE de células normales tratadas con HK-X solamente. Las Figuras 7A-7B muestran la presencia de proteínas fosforiladas en células nucleares tratadas con IL-8 como se detecta por anticuerpos monoclonares . para fosfotirosina. La Figura 7A es una densitometría de SDS-PAGE de células tratadas con IL-8 y la Figura 7B es una fotografía de SDS-PAGE de células normales tratadas con IL-8 solamente. Las Figuras 8A-8B muestran la presencia de proteínas fosforiladas en células mononucleares tratadas con HK-X y IL-8 como se detecta por anticuerpos monoclonales para fosfotirosina. La Figura 8A es una densitometría de SDS-PAGE de células tratadas con HK-X y IL-8 y la Figura 8B es una fotografía del SDS-PAGE de células normales tratadas con HK-X y IL-8. Las Figuras 9A-9B muestran la presencia de proteína's fosforiladas en celdas mononucleares recientemente recolectadas a partir de sangre periférica como se detecta por anticuerpos monoclonales para fosfotirosina. La Figura 9A es una densitometría de SDS-PAGE de células recientemente recolectas y la Figura 9B es una fotografía del gel SDS-PAGE de células recientemente recolectadas. De acuerdo con la presente invención, se ha encontrado que los agentes de modificación de la ruta señal de protein cinasa G inactivan algunas respuestas pro-inflamatorias de células de sangre periférica humana que se han estimulado por agentes o moléculas pro-inflamatorias. Los agentes de modificación de la ruta señal de protein cinasa G preferidos, de acuerdo con la presente invención, pueden enlazarse a receptores encontrados en celdas mediadoras pro-inflamatorias tales como linfocitos, particularmente células T activadas, granulocitos tales como eosinofilos, basófilos y células de tejido fijo tales como mastocitos. Durante el enlace del agente de modificación de la ruta señal de protein cinasa G con su receptor, se inhiben las respuestas pro-inflamatorias. De acuerdo con las modalidades preferidas de la presente invención, las subunidades a, ß y ? de proteína G se modifican y también se inhibe la fosforilación de estas subunidades. Las respuestas pro-inflamatorias que pueden inhibirse por el complejo agente-receptor son secreción, desgranulación y migración de la célula que lleva el receptor, así como la síntesis y secreción de otras moléculas pro-inflamatorias. Preferentemente, los agentes de modificación de la ruta señal de protein cinasa G de la presente invención pueden inactivar el receptor previamente estimulado por una molécula pro-inflamatoria pero no tienen efecto sobre las células no estimuladas. Ejemplos de agentes pro-inflamatorios útiles para estimular las células son IL-8, péptidos N-formilo, fragmento de complemento activado (C5a) , leucotrieno B4 (LTB4) y factor que activa plaquetas (PAF) . Preferentemente, el complejo agente-receptor de la presente invención también puede desensibilizar el receptor de estimulación adicional por el mismo agente pro-inflamatorio por un diferente agente pro-inflamatorio. El objeto observado del complejo agente-receptor de modificación de la ruta señal de protein cinasa G sobre la célula que lleva el receptor puede usarse para identificar los agentes de modificación de la ruta señal de protein cinasa G. la selección de dichos agentes puede llevarse a cabo poniendo en contacto una célula mediadora pro-inflamatoria con un mediador pro-inflamatorio conocidos para producir una respuesta pro-inflamatoria, seguido por la adición de un agente candidato y detectando la disminución en la cantidad de una protein cinasa G en una célula pro-inflamatoria puesta en contacto simultáneamente como el agente candidato y comparar la molécula pro-inflamatoria con la cantidad en una célula mediadora pro-inflamatoria puesta en contacto con la molécula pro-inflamatoria sola. Un agente de modificación de la ruta señal de la protein cinasa G particularmente útil es f-Met-Leu-Phe-Phe. Otros agentes útiles pueden identificarse por prueba rutinaria usando uno de los procedimientos anteriores. Como se usa en la presente, las respuestas pro-inflamatorias incluyen secreción o desgranulación de .celdas mediadoras pro-inflamatorias y liberación de leucotrienos, histaminas y otras citocinas. Dichas respuestas también incluyen filtración de los eosinófilos, basófilos y mastocitos dentro de los tejidos inflamados como un resultado de la adhesión quimotactica, migración y agregación de linfocitos, eosinófilos, basófilos, mastocitos y neutrófilos. La permeabilidad vascular en el sitio de la inflamación y la producción aumentada de IgE, IgG y IgA, y sus receptores FC respectivos, también puede asociarse con respuestas pro-inflamatorias . La inhibición de las respuestas pro-inflamatorias puede incluir así la disminución de la desgranulación y liberación de leucotrianos, histaminas y otras citocinas por células mediadoras pro-inflamatorias, o el cese completo en las modalidades preferidas, después del enlace péptido-receptor de acuerdo a la presente invención. La infiltración y migración de las células mediadoras pro-inflamatorias también puede reducirse grandemente, o inhibirse completamente, la permeabilidad vascular en el sitio de la inflamación y los niveles de IgE también se pueden reducir. Para que la invención descrita en la presente pueda ser más completamente entendida, se indican los siguientes ejemplos. Debe entenderse que estos ejemplos son para propósitos ilustrativos solamente y no deben interpretarse como que limitan esta invención en ninguna forma. EJEMPLO 1: Enlace de KL-X Marcado a Células Nucleadas Sanguíneas Periféricas Se determino el Kd y Bmax (enlace de saturación) de HK-X ("f-Met-Leu-Phe-Phe") sobre células nucleadas sanguíneas periféricas. 2 x 10' células en 100 µl de solución de diversas fracciones (monocitos, linfocitos, granulocitos) preparadas por centrifugación de densidad se lavaron previamente en 1° de solución de BSA-PBS que contiene 0.1% de azida de sodio. 100 µl de las siguientes concentraciones de HK-X marcada con FITC (en 1% de solución BSA-PBS) se agregó a cada conjunto de tubos conforme a la Tabla 1: TABLA 1 # de Tubo Concentración Molar de HK-X marcada con FITC 1 9.06 x ??" 2 2.71 x 10" 3 5.43 x 10" 4 7.25 x 10" ? 5 9.06 x 10" 6 2.71 x 10" 7 5.43 x 10"1 8 7.25 x 10"1 9 9.06 x 10"1 ' Los tubos se mezclaron y agitaron con remolino durante 30 segundos. Los tubos se mantuvieron después a 4-8 °C durante 30 minutos. Se agregó después 100 µl de Cal-Lyse, se incubó durante 5 minutos, o se agrego 500 µl de formaldehído al 1 . Si se agregó Cal-Lyse, se agregó 1 ml de agua y se incubó durante 5 minutos adicionales. Las células se analizaron después en un citómetro de flujo (Coulter Epics Élite) . Los resultados de enlace se muestran en la Figura 1. 3max se determinó que es 47.66 y Kd=1.674 x 10-10M. Así, estos resultados muestran que HK-X se enlaza a células nucleadas sanguíneas periféricas tales como monocitos, linfocitos y rranulocitos .

También se determinó por metodología similar que HK-X se enlaza a células T activadas, mastocitos, eosinófilos, y basófilos, así como el enlace conocido con neutrófilos . EJEMPLO 2: HK-X se Enlaza a Receptores Activados Los linfocitos de sangre periférica se estimularon con el mitógeno Concanavalin A (ConA) a las 24 horas o a las 120 horas después de colocarse en cultivo. Las células se expusieron después a los 100 nM de HK-X marcado con FITC o no se expusieron. Las células también se tiñeron con DAPI para la determinación del ciclo celular. Las células se analizaron después por citometría de flujo. Las Figuras 2A-2C muestran la relación entre los linfocitos activados por ConA y la aparición de sitios de enlace por HK-X marcado con FITC. Los cuatro cuadrantes revelan las siguientes características: el cuadrante izquierdo superior denota células con más de In de contenido de ADN y niveles aumentados de enlace de HK-X con FITC arriba de los niveles bajo establecidos al usar el perfil en la Figura 1; el cuadrante derecho superior denota células que contiene más de ln de contenido de aADN y tiene enlace de ligando-FITC mayor que la base; el cuadrante derecho inferior contiene células que contiene In de contenido de .ADN pero tiene ligando FITC enlazado arriba de los niveles base; y el cuadrante izquierdo inferior contiene células con ln de contenido de ADN y niveles base de ligando-FITC . Como es aparente del examen de las Figura 2b y 2C, la exposición a la lectina vegetal o mitógeno estimula las células a entrar dentro del ciclo celular y expresar sitios de enlace para el HK-X marcado con FITC. El período de cultivo más largo de 120 horas permitió entrar a una mayor porción de las células al ciclo celular (en comparación a la lll Figura 2A) . La determinación más precisa de los niveles base de fluorescencia halógena se obtuvo determinando los umbrales (cuadrantes) usando células cultivadas con ConA pero no teñidas con HK-X marcado con FITC (ver Figura 2B) . El análisis estadístico confirma las observaciones cualitativas proporcionadas por examen de las gráficas de punto. Aproximadamente 25% de las células en la Figura 2C contienen más de In de contenido ADN y estuvieron arriba de los niveles base del enlace de ligando-FITC. Esto está marcado en contraste con el número de células en el cuadrante 20 derecho superior en las Figuras 2A y 2B, respectivamente. Un examen más formal de la distribución de las células en diversas fases del ciclo celular se obtuvo usando un paquete de software "MultiCycle" por Phoenix Software, Phoenix, AZ . Este software desconvulociona el histograma de A y analiza estadísticamente los componentes por grado de 21 ajuste y significancia. La Figura 3A muestra las mismas muestras contenidas en la Figura 2A y la Figura 3B muestra aquellas contenidas en las Figuras 2B y 2C. como es aparente del examen del porciento de células que son diploides (>ln de contenido ADN) las fracciones aumentaron de 2.2% en la Figura 2A- a 29% en las Figuras 2B y 2C. Así, parece que la estimulación de los linfocitos sanguíneos periféricos humanos con mitógeno inicia la duplicación de su ADN y, simultáneamente con este proceso, la expresión de sitios de enlace para el HK-X marcado con FITC. Solamente una fracción de las células con contenido de- .ADN de ln, o en fase G0/G1 del ciclo solar, muestra expresión aumentada de los sitios de enlace para ligando. En contraste, todas las células con contenido de ADN diploide (>ln) contienen sitios de enlace para el ligando. EJEMPLO 3: Identificación y Caracterización de los receptores HK-X Los receptores que enlazan HK-X y otros péptidos N-formilo se aislaron y caracterizaron a partir del mastocitos peritoneales de murino, poblaciones de células polimorfonucleares y mononucleares humanas. Adicionalmente, la activación de la proteína G del receptor FCeR como una consecuencia corriente abajo de los aumentos en PKC, PI3 y la movilización de Ca"', hacen el receptor FCe un receptor efector corriente abajo de interferencia de proteína G. Las células que enlazan HK-X incluyen mastocitos, basófilos y eosinófilos como se evidencia por el cambio de reactividad biológica después de la exposición a HK-X y por enlace de un HK-X marcado radiactivo o fluorescente. No se han identificado receptores para HK-X. en contraste, los neutrófilos expresan receptores de péptido formilo sobre su superficie. Sin embargo, los linfocitos y monocitos sanguíneos parecen enlazar menos HK-X que los neutrófilos .MATERIALES Y MÉTODOS DETALLADOS: 1. AISLAMIENTO DE CÉLULAS -"Se aislaron mastocitos peritoneales de rata por infusión de 35 ml de Solución Tyrode dentro de la cavidad peritoneal de ratas anestesiadas. Las ratas se sacrificaron después por inyección de una sobredosis de anestésico. Las células perifonéales se cosecharon, se colocaron dentro de tubos de centrifuga de 15 ml . Las células se peletizaron por centrifugación a 250-x g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células _ mononucleares y polimorfonucleares de sangre periférica humana se aislaron a partir de sangre periférica obtenidas de donadores normales. La sangre se recolectó en heparina. Los diversos tipos celulares se aislaron por centrifugación sobre Ficoll-Hypaque a 500-x g durante 60 minutos a temperatura ambiente. Cada fracción se ccsecho, reunió separadamente y se lavó Ix en RPMI 1640 con -}-> antibióticos. 2. MARCA METABÓLICA DE LaAS CÉLULAS CON '"S-METIONINA Las células se ajustaron a 1 x 107 por ml de medio RPMI 1640 sin metionina que contiene 10 µl de 35S-metionina y se mantuvo durante la noche a 37 °C en la presencia de 5% de C0 . 3. COSECHA DE LAS CÉLULAS Y PREPARACIÓN DE LAS MEMBRANAS SIN REFINAR - las células se lavaron con 3X en PBS y se usaron subsecuentemente por sonicagión en regulador de Hepes, pH 7.2 conteniendo 0.3% de NP40 y cóctel inhibidor de proteinasa. La preparación celular resultante se centrifugó a 600 x g durante 10 minutos y el sobrenadante se recolectó para análisis adicional. 4. SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA EN SEFAROSA Y SEPAROSA HK-X DE DIVERSAS PROTEÍNAS CELULARES - La preparación celular se paso a través de una columna de resina no sustituida de Separosa o una de resina de Sefarosa HK-X dividida en dos porciones, A y B. alícuota A: se paso sobre columna de sefarosa sustituida con HK-X. las columnas se lavaron y después se eluyeron con regulador que contiene HK-X (5 mg/ml) , y después con 0.1 M de glicina pH 2.5. La alícuota B se enlazo a una columna sustituida con HK-X en la presencia de HK-X soluble y las proteínas se eluyeron. Cada fracción se concentró y liofilizó. La propuesta emprendida en este paso involucra el enlace de HK-X a una resina de sefarasa para ser una resina sustituida con HK-X, antes de la exposición a la resina sustituida con HK-X, la mezcla de proteina celular se paso sobre una resina no sustituida con HK-X para eliminar 5 cualquier especie de proteína que reaccione con la resina nativa. Así, cuando las proteínas celulares incluyendo las proteínas receptoras se pasaron a través de la resina sustituida con HK-X bajo ambientes iónicos apropiados, las proteínas receptoras (para el receptor de HK-X) entre las 10 otras proteínas se enlazaron fuertemente con el HK-X. La resina se lavó con un agente suave, tal como regulador de fosfato a pH neutro, para eliminar cualquier proteína de enlace de baja afinidad. Subsecuentemente, la resina se expuso a una cantidad en exceso de HK-X libre para eluir 15 competitivamente las proteínas receptoras enlazadas a la resina. Las proteínas radiactivas liberadas en cada uno de estos pasos se concentraron y se analizaron sobre un sistema al 12a de SDS-PAGE como se detalla en el paso siguiente. 5. SDS-PAGE al 12?, - se aplicó 25 uL de la 20 preparación celular radiactiva que contiene de 250 cpm a 2000 cpm de radiactividad a cada línea del gel. El gel se corrió a 90 V a 30 mA hasta que se obtuvo buena resolución de los estándares coloreados. Los estándares fueron fosforilaza b i PM = 94,000); albúmina de suero bovino (PM=68,000); L -l cvalbúmina (PM=43, 000) ; anhídrasa carbónica (PM=30,000); e inhibidor de tripsina de soya (MW_21,000). 6. ESTIMACIÓN DEL PESO MOLECULAR DE LAS PROTEÍNAS RADIACTIVAS RESUELTAS - Las movilidades relativas se calcularon para los estándares y para cada especie distinta de peso molecular visualizadas sobre el gel. Una gráfica de peso molecular log de los estándares se gráfico en contra de la movilidad relativa para cada estándar. Los datos se emitieron a software PRISM y los pesos moleculares de las proteínas desconocidas se produjeron a partir del programa de curva estándar. Los resultados se compararon con los de las proteínas receptoras FPR publicados en la literatura (Goetzl et al., Biochemistry 20:5717-5722, 1981). La Figura 4 muestra el resultado de un experimento representativo. Todas las proteínas presentes en el lisado celular se muestran en la Línea A. en la Línea B, el material no enlazado a partir de la columna Sefarosa sin sustitución HK-X muestra un patrón de distribución de bandas de proteína similar alisado celular completo. La Línea C contiene el material de pre-elución. La Línea D es una línea blanca. En la Línea E son visibles tres bandas de proteína cuando la columna se eluyó en la presencia de un mg de HK-X (competidor) . Se estima que los pesos moleculares son -94,000, -68,000 y -40,000 Daltones, " respectivamente . Esta condición experimental estableció la especificidad del enlace.

La comparación de la abundancia relativa en las Dandas eluídas en este experimento con el reportado por Goetzl et al. reveló diferencias interesantes (ver Tabla 2) . El examen de las proporciones normalizadas de los receptores revela una diferencia sustancial en la distribución de las tres especies recuperadas a partir de la columna FMLP (Goetzl) y de la columna HK-X (este Ejemplo) . La especie de 68 Kd fue la especie dominante recuperada por Goetzl et al . a partir de la columna de afinidad FMLP mientras que la especie de 40 KD fue la especie predominante recuperada a partir de la columna de afinidad HK-X. TABLA 2 Diferencias en la Recuperación Reportada de Receptores Formilo a partir de Sefarosa-FMLP de la Recuperada de la Sefarosa- HK-X Es evidente a partir de la autoradiografía en la Figura 4 que existen tres especies moleculares eluídas a partir de mastocitos peritoneales de rata por la adición de 1 mg de HK-X. los pasos moleculares calculados -de estas proteínas concuerdan con los tamaños moleculares reportados por Goetzl et al. los pesos moleculares de las proteínas recuperadas después de la competencia con HK-X o ácido a partir de mastocitos y neutrófilos peritoneales de rata fueron los mismos que los reportados por Goetzl para neutrófilos humanos. Aunque el número medio total de residuos de metionina en la molécula de 40 Kd es 5.1, tiene una imagen radiográfica más intensa que las especies de 68,000 y 94,000 que contienen 11 y 14 residuos por molécula, respectivamente. En este Ejemplo, la abundancia relativa de cada una 'de las especies de proteína recuperadas se determinó por radiomarca biosintética con o5S-metionina. Las proporciones relativas recuperadas a partir de la cromatografía de afinidad se determinaron por integración de las áreas bajo las curvas a partir de las autoradiografías. Goetzl midió la abundancia relativa de cada especie de proteína por determinación de la proteína por métodos químicos. Por lo tanto, para comparar más precisamente la distribución de las proteínas recuperadas en los dos estudios, los valores de distribución se normalizaron dividiendo la abundancia relativa de cada especie por su número de residuos de metionina. Esta proporción corrige variaciones potenciales en los valores debido a las diferentes en las metodologías. Las proporciones corregidas revelan un perfil de enlace y/o recuperación castamente diferente entre los valores reportados por Goetzl y los valores obtenidos en este Ejemplo. Una posibilidad es que el complejo de receptor disasociado detergente se enlaza a la Sefarosa sustituida con FMLP en una forma selectiva diferente de la Sefarosa sustituida con HK-X. En resumen, en este Ejemplo se uso HK-X para recuperar selectivamente las proteínas de enlace en un lisado celular recuperado después de la marca de proteínas con o5S-metionina in vitro. Se aislaron tres especies de peso molecular que concuerdan con los reportes previos del tamaño de los péptidos asociados con el complejo receptor FMLP. También se ha demostrado por las técnicas usadas en este Ejemplo que HK-X se enlaza a los receptores en las células poli orfonucleares y mononucleares humanas, particularmente células T activadas, mastocitos, eosinófilos y basófilos. EJEMPLO 4: Transducción de Señal y Mecanismo de Acción. Los leucocitos responden a un gran número de quimioatrayentes y otros mediadores pro-inflamatorios. Algunos mediadores causan quimiotaxos, activación de sistemas enzimáticos y liberación de mediadores patológicamente significativos. Los péptidos N-formilo típicos (el arquetipo — FMLP) , fragmento de complemento activado (C5a) , leucotrion 34 (LTB4) , factor activador de plaqueta (PAF) , y algunas citrinas quimiotácticas, (tales como IL-8) son agentes quimiotácticos y pro-inflamatorios bien reconocidos. Estos agentes se enlazan a receptores acoplados de proteína G (los GPCRs) con la generación subsecuente de la transducción de señales múltiple mediada por el sistema de protein cinasa. Las cascadas que resultan de los eventos iniciales son complejas e hiperelacionadas, sin embargo son responsables del comportamiento completo de todas las células nucleadas. La muerte celular programada (apoptosis), la generación de respuestas inmunes, eliminación de células T auto-reconocidas, y el control de la síntesis de matrices extracelulares son solo unos cuantos ejemplos de la acción de las rutas de transducción de señales. Las protein cinasas se identificaron por su capacidad para transferir un grupo fosfato a partir de un donador de fosfatos sobre un aminoácido aceptor ubicado dentro de una proteína. Normalmente el fosfato ? del ATP es el donador. Los tres residuos amino aceptores principales dentro de las proteínas son tirosina, serina y treonina. Como de 1999, se han identificado y descrito en la literatura 155 protein cinasa. El comportamiento de las células en respuesta a la estimulación con FMLP se describe -bien en .la literatura (Prosnítz et al., Pharmacol . Ther. 74: 73-102, 1997). El enlace de FMLP a los fagocitos estimula la fosforilación, que se correlaciona con las funciones celulares. FMLP y otros quimioatrayentes estimulan fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3K) que estimula la protein cinasa (PKC). En los neutrófilos, EMLP en enlace de FMLP inicia la fosforilación de una cinasa regulada extracelular (ERK-1) que pertenece a una familia general de cinasas denominada protein cinasas activadas por mitógeno (MAP cinasas) . Algunos de los miembros de la familia MAP son: Raf-1 y Ras. Los miembros de la familia de protein cinasas difieren normalmente en peso molecular a tal grado de que pueden resolverse una de otra por tecnología de SDS-PAGE. Adicionalmente, las proteínas de fosfotirosina . pueden detectarse a partir de la masa completa de proteínas intracelulares por anticuerpos onoclonares que reconocen solamente el epítope de fosfotirosina (Ross et al., Nature ( London) 294:654, 1981; Frackleton et al., Mol . Cell Biol . 3: 1343, 1983) . Los cambios en las protein cinasas mediados por la adición de HK-X a células mononucleares y polimorfonucleares de sangre periférica humana se analizaron para elucidar el mecanismo de acción de HK-X. El HK-X se agregó solo y con la adición de FMLP o IL-8, que son agentes quimiotácticos y pro-inflamatorios conocidos. MATERIALES Y MÉTODOS DETALLADOS : 1. AISLAMIENTO DE CÉLULAS - Se aislaron células mononucleares y polimorfonucleares de sangre periférica humana a partir de sangre periférica obtenida de donadores normales. La sangre se recolectó en -heparina. Los diversos tipos celulares se aislaron por centrifugación sobre Ficoll-Hypaque a 500-x 9 durante 60 minutos a temperatura ambiente. Cada fracción se cosecho, reunió separadamente y se lavó lx en RPMI 1640 con antibióticos. 2. CULTIVO Y TRATAMIENTO DE LAS CÉLULAS - 107 células por ml de medio se mantuvieron á 37 °C durante 30 minutos antes de la adición de estimulantes para permitir alcanzar a las células un estado continuo dentro de las reuniones de proteína fosforilada. Después, se agregaron los siguientes estimulantes a cada ml de células: A. 100 uL de vehículo (solución al 0.3% de DMSO en medio) B. 100 uL de -HK-X contiene 20 ug de HK-X. C. 100 uL del EMLP contiene 0.1 ug de FMLP. D. 100 uL de IL-8 contiene 0.1 ug de IL-8 (IL-8 humano recombinante. E. 100 uL de HK-X contiene 20 ug de HK-X más 100 uL de FMLP contiene 0.1 ug de FMLP. F. 100 uL de HK-X contiene 20 ug de HK-X más 100 uL de IL-8 contiene 0.1 ug de IL-8. G. medio de cultivo celular sin ningún estimulante.

Las células se incubaron durante 30 minutos adicionales a 37°C en 5% de CO; . 3. COSECHA DE CÉLULAS Y ANÁLISIS DE SDS-PAGE -Las células se peletizaron a 250 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se eliminó y se agrego 25 uL de regulador inicial 2X SDS-PAGE. Las pellas se hirvieron durante 15 minutos y centrifugaron a 10,000 x durante 5 minutos, se eliminaron muestras pequeñas para electroforesis en geles al 12% de acrilamida. 4. DETECCIÓN POR INMUNOTINCIÓN DE FOSFOPROTEÍ AS - Las proteínas se transfirieron sobre una membrana de nylón a 13V durante 30 minutos y bloquearon subsecuentemente con BSA al 1% durante 12 horas. El anticuerpo conjugador con HRP en BSA al 0.3% se agregó durante 60 minutos. Las membranas se lavaron, fijaron y fotografiaron. 5. ANÁLISIS DE DATOS - Las fotografías se llevaron a un laboratorio profesional y se hizo una copia en negativo de cada gel usando pelicula de muy alto contraste y grano fino. Las fotografías subsecuentes se escanearon a 600 dpi y se realizó análisis densitométrico usando software Image Pro Plus, SPSS. Los pesos moleculares se calcularon para cada banda. Para estandarizar la cantidad de proteína celular aplicada a cada línea del SDS-PAGE, el mismo número de células se uso para cada tratamiento y aproximadamente el mismo volumen de muestra se aplicó a cada línea. En las Figuras 5 hasta 9, se muestran los patrones de quimioluminiscencia de las fosfoproteinas detectadas por el anticuerpo anti-fosfotirosina monoclonal. Se hizo un negativo de las imágenes quimioluminiscentes por un fotógrafo profesional para obtener el más alto grado de resolución de las bandas y su intensidad correspondiente de quimioluminiscencia. Por ejemplo, en la Figura 5A, las proteína cinasas presentes en las celdas expuestas a vehículo durante 30 minutos reveló 9 especies de proteína distintas como se muestra por los picos en un análisis de densitometría del gel. Por razón de claridad, los picos en el análisis de densitometría se marcan por flechas y las especies moleculares correspondientes en el gel también se marcan por las mismas flechas. (EL origen del gel está en el lado derecho del gel en donde se ubican las especies de peso molecular más grandes) . En la Figura 6, se representan las respuestas de protein cinasa de las células para HK-X. Un aumento aparente en una especie de peso molecular de aproximadamente 83 Kd se aetecto la cual no se observó en otros tratamientos. Se vieron diferencias sorprendentes después del tratamiento simultáneo de las células con 20 ug de HK-X y 0.1 ug de IL-8 y 20 ug de HK-X y 0.1 ug de FMLP (datos no mostrados) . Las especies de peso molecular más pequeñas aparecieron ? : grandemente reducidas (porción más a la izquierda del gel) . Esta reducción se refleja cuantitativamente por el área de los picos. Esta área en la huella deasitométrica se muestra por la flecha horizontal de cabeza doble. El contenido de protein cinasa y la distribución de células mononucleares recientes se muestra en la Figura 9. La distribución de cinasas de estas células es sorprendentemente similar a la de las células tratadas con vehículo (Figura 5) y las células tratadas con HK-X (Figura 6) . Los patrones de respuesta de cinasa ala estimulación con FMLP sola y HK-X más estimulación más FMPLP no se muestra. Sin embargo, los patrones de cada uno de estos son sustancialmente idénticos a los observados con IL-8 solo y HK-X más IL-8 respectivamente, El patrón y distribución de protein cinasas para las células polimorfonucleares de sangre periférica fue esencialmente el mismo que para las células mononucleares . La diferencia principal entre los dos tipos celulares fue que laS células mononucleares fueron más metabólicamente activas que las células polimorfonucleares. Usando la propuesta analítica densitométrica, el área bajo los picos para cada especie de peso molecular se calculo. Así, la valoración cuantitativa de cada cinasa como un porciento del contenido de cinasa total se calculó. Además, se comparó el peso molecular de las cinasas conocidas con el calculado para el cálculo de migración- relativa (Rf) en este experimento. Así, las cinasas en este estudio podrían identificarse. La Tabla 3 muestra el cambio cuantitativo en la distribución de las protein cinasas a partir de células de sangre periférica humana después de la exposición a HK-X. TABLA 3 La Tabla 4 muestra la cantidad cuantitativa de protein ? cinasa G para diversos experimentos, lo cual confirmó y extendió los datos cualitativos previos . Aunque se intentó usar el mismo número de células que se usaron para cada tratamiento y aproximadamente la misma cantidad de proteína recuperada que se aplicó cada línea, la cantidad total de cinasas difirió como se ve por las áreas observadas.

TABLA 4 Resumen de la Protein cinasa de Células de Sangre Periférica después de la Exposición a HK-X y IL-8 y FMLP La Tabla 5 ilustra los resultados de otro experimento que muestra el cambio en la distribución de protein cinasa a partir de células de sangre periférica humana después de la exposición a HK-X en comparación a la exposición co-estimuladora a (1) HK-X y (2) fMLP" ó IL-8. Las Tablas 6 y 7 ilustran los resultados de un experimento adicional que ilustra el cambio en la distribución de las protein cinasas a partir de células de sangre periférica humana después de la exposición a HK-X en comparación a la exposición co-estimuladora a (1) HK-X y (2) Ca5, TNFa, IL-4, IL-6 IL-10 o IL-13.

Tabla 5 Resumen de identificación de protein cinasas de tirosina y distribución en células de sangre periférica -Distribución de porcientos- Tabla 6 Resumen de identificación de protein cinasas de tirosina y distribución en células de sangre periférica • Tabla 7.

Un número de eventos importantes acontece durante la estimulación de las células que llevan receptores para péptidos formilo. Estos incluyen: A. Durante en enlace de FMLP u otros análogos, el FPR interactúa con la reunión de proteína G que es común a otros receptores quimioatrayentes tales como los receptores LTB4 y C5a (Jacobs et al., J. Leukoc . Biol . 57: 679-686, 1995; McLeish et al., Mol. Pharm. 36: 384-390. B. Después de la estimulación con FMLP u otros quimioatrayentes, las células se vuelven refractarias a la responsibidad adicional o subsecuente al mismo u otros quimioatrayentes. Cuando el estado refractario y la inactivación del receptor se induce por un estimulante y afecta los receptores no ligados múltiples, esta situación es de sensibilización heteróloga. Se ha especulado que esta forma de desensibilización puede resultar de la fosforilación de los receptores no ligados por cinasas activadas corriente abajo, como con el receptor FCe. C. IL-8, C5a y FMLP desensibiliza los receptores de cada uno. Estos estudios se extendieron para incluir los receptores PAF y LTB4. El mecanismo por el cual este proceso puede iniciarse puede involucrar la fosforilación del receptor por PKC. Sin embargo, el FPR no contiene dominios intracelulares capaces de ser fosforilados por PKC, pero otra cinasa parece ser responsable.

D. La desensibilización de la respuesta FPR corriente abajo ocurre en la ausencia de la fosforilación de FPR. El tratamiento con HK-X solo no reguló ala baja específicamente las cinasas. La proteína ? cinasa G se disminuyó selectivamente y significativamente después de la estimulación simultánea de las células mononuclearés con HK-X y IL-8 o con HK-X y FMLP. Estas observaciones sugieren el siguiente mecanismo de acción de HK-X, el cual se describe posteriormente . HK-X y las moléculas pro-inflamatorias potenciales, tales como IL-8 y FMLP pueden estar presentes juntas. Existe una regulación a la baja de uno de los complejos de proteína G triméricos. Específicamente, se disminuyó la fosforilación de proteína ? G bajo las condiciones de estado continuo. Por lo tanto, HK-X en la presencia de IL-8 o FMLP parece iniciar una desensibilización del receptor que inhibe directamente o indirectamente la fosforilación de la subunidad de proteína ? G. Existe un número de colorarlos que puede deducirse de los datos presentados aquí en los reportes previos. Ellos son: 1. HK-X demuestra especificidad para células capaces de responder a estímulos pro-inflamatorios mediados por receptores pro-inflamatorios específicos. 2. Si HK-X se mantiene en el sistema durante eventos inflamatorios, HK-X debe mantener la desensibilización de las células que responden potencialmente. 3. Usando un sistema de cultivo in vitro como se describe en este reporte, pueden seleccionarse otras células objetivo y otros mediadores pro-inflamatorios por su sensibilidad a la acción de HK-X. Así, una prueba sencilla puede usarse para seleccionar rápidamente por la eficiencia terapéutica potencial y para establecer la capacidad de predicción terapéutica. En parte, HK-X parece mediar la suficiencia terapéutica a través de la desensibilización de los receptores mediadores pro-inflamatorios. Corriente abajo a partir de este evento, la inactivación de la célula inflamatoria se media y mantiene directamente o indirectamente a través de la inhibición de la fosforilación de la subunidad de proteína ? G. La presente invención se ha descrito en detalle incluyendo las modalidades preferidas de la misma. Sin embargo, se apreciará que aquellos expertos en la técnica pueden hacer modificaciones y mejoras dentro del espíritu y alcance de la invención como se indica en las reivindicaciones .

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para inhibir una respuesta pro-inflamatoria de una célula mononuclear o célula polimorfonuclear de sangre periférica humana, o una célula de tejido fijo cuando se pone en contacto con un agente pro-inflamatorio, el método comprende poner en contacto la célula con un agente de modificación de la ruta señal de protein cinasa G, inhibiendo con eso las rutas de transducción de señal de la respuesta inflamatoria mediadas por la proteína G. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula mononuclear de sangre periférica humana se selecciona a partir de linfocitos y monocitos o una célula polimorfonuclear seleccionada a partir de granulocitos. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula mononuclear o célula polimorfonuclear de sangre periférica humana se selecciona a partir de eosinófilos, basófilos y células T activadas. . El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula_ de tejido fijo se selecciona a partir de células mastocitos, células dendríticas, astrocitos o macrófagos. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente pro-inflamatorio se selecciona a partir de citocinas, quimiotaxinas y mitógenos. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente pro-inflamatorio se selecciona a partir de fMLP, fragmento de complemento activado, leucotrieno B4, factor de activación de plaquetas IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13 y TNFa. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente de modificación de la ruta de señal de protein cinasa G es un péptido f-Met-Leu. 8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente de modificación de la ruta señal de protein cinasa G es un péptido f-Met-Leu-Phe-Ph.e. 9. Un método para inhibir una respuesta pro-inflamatoria de una célula mononuclear, célula polimorfonuclear de sangre periférica humana, o una célula de tejido fijo cuando se pone en contacto con un agente pro-inflamatorio, comprendiendo el método formar un complejo de un receptor de superficie celular con un agente de modificación de la ruta señal de protein cinasa G, inhibiendo con eso una respuesta pro-inflamatoria. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el receptor de superficie celular es un receptor de péptido formilo. 11. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la respuesta pro-inflamatoria incluye I . c- inhibir un receptor corriente abajo, en donde el receptor corriente abajo es un receptor FC que es un receptor para un agente seleccionado a partir de _ una inmunoglobulina, una citosina seleccionada a partir del grupo que consiste de IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13 y TNFa, o una quimiocina seleccionada a partir del grupo que consiste de C5a, FMLP, PAF, LTB4. 12. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la célula "mononuclear de sangre periférica humana se selecciona a partir de linfocitos y monocitos o una célula polimorfonuclear seleccionada a partir de eosinófilos y basófilos. 13. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la célula mononuclear o célula polimorfonuclear de sangre periférica humana se selecciona a partir de eosinófilos, basófilos y células T activadas. 14. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la célula de tejido fijo se selecciona a partir /*/*/de células mastocitos, células dendríticas, astrocitos o macrófagos. 15. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el agente pro-inflamatorio se selecciona a partir de citocinas, quimiocinas, quimiotaxinas y mitógenos. 16. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el agente pro-inflamatorio se selecciona a partir de fMLP, fragmento de complemento activado, leucotrieno B4, y factor de activación de plaquetas ó IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13 y TNFa. 17. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el agente de modificación de la ruta señal de protein cinasa G es un péptido f-Met-Leu. 18. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el agente de modificación de la ruta señal de protein cinasa G es f-Met-Leu-Phe-Phe. 19. Un complejo receptor que comprende un agente de modificación a la ruta señal de protein cinasa G. y un receptor de superficie celular de una célula mononuclear o célula polimorfonuclear de sangre periférica humana, o una célula de tejido fijo que se ha estimulado con un agente pro-inflamatorio. 20. El complejo receptor de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la célula se sangre periférica humana es una célula mononuclear seleccionada a partir de linfocitos y monocitos o una célula polimorfonuclear seleccionada a partir de eosinófilos y basófilos . 21. El complejo receptor de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la célula de tejido fijo se selecciona a partir de células mastocitos, células c-7 dendríticas, astrocitos y macrófagos. 22. El complejo receptor de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el agente de modificación de la ruta señal de protein cinasa G es un péptido f-Met-Leu. 23. El complejo receptor de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el agente de modificación de la ruta señal de protein cinasa G es f-Met-Leu-Phe-Phe. 24. El complejo receptor de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el agente pro-inflamatorio se selecciona a partir de citocinas, quimiocinas, quimiotaxinas y mitógenos. 25. El complejo receptor de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el agente pro-inflamatorio se selecciona a partir de fMLP, fragmento de complemento activado, leucotrieno B4, y factor de activación de plaquetas ó IL-4, IL-6, IL-8, IL-1Q/ IL-13 y TNFa. 26. Un método para identificar un agente de modificación de la ruta señal de protein cinasa G comprendiendo el método los pasos de: a) poner en contacto una célula mediadora pro-inflamatoria seleccionada a partir del grupo que consiste de linfocito T activado, mastocito, eosinófilo y basófilo con un mediador pro-inflamatorio conocido seleccionado a partir del grupo que consiste de una citosina, quimiocina, quiraiotaxina, y itógeno y produciendo una respuesta pro-inflamatoria; b) agregar al paso a) un agente de modificación de la ruta señal de protein cinasa candidato; y c) detectar una disminución o aumento en la cantidad de una protein cinasa G reguladora en (i) una célula mediadora pro-inflamatoria puesta simultáneamente en contacto con el antagonista candidato y el mediador pro-inflamatorio comparado con (ii) una célula mediadora pro-inflamatoria puesta en contacto con el mediador pro-inflamatorio solo. 27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el mediador pro-inflamatorio se selecciona a partir de fMLP, fragmento de complemento activado, leucotrieno B4, y factor de activación de plaquetas o IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13 y TNFa. 28. Un complejo receptor de superficie celular que comprende un agente de modificación de la ruta señal de protein cinasa G que se enlaza con un receptor sobre la superficie de una célula mediadora pro-inflamatoria seleccionada a partir del grupo que consiste de linfocito T activado, mastocito, eosinófilo y basófilo, con lo cual se proporciona la inhibición de una respuesta celular pro-inflamatoria para un agente pro-inflamatorio. 29. Un método para identificar un agente de modificación de la ruta señal de protein cinasa G, c,Q comprendiendo el método los pasos de: poner en contacto una célula mediadora pro-inflamatoria seleccionada a partir del grupo que consiste de linfocito T activado, mastocito, eosinófílo y basófilo con un agente de modificación de la ruta señal de proteína G trimérica; y determinar la distribución de protein cinasas producidas por la célula, en donde en comparación con las células no puestas en contacto por el agente de modificación de la ruta señal de proteína G trimérica candidato no existe cambio en la cantidad de PLC?, Pp60 Src y ERK-1, existe un aumento en la cantidad de PI3 (102 Kd) y PI3 (83 Kd) , y existe una disminución en la cantidad de Ref, Ras, proteína a G y proteína ß G. 30. Un complejo receptor de superficie celular que comprende : un receptor de superficie celular de una célula mononuclear o una célula polimorfonuclear de sangre periférica humana y un agente de modificación de la ruta señal de proteína G, en donde, en comparación con las célula que no presentan el complejo receptor de superficie celular, la distribución de protein cinasa en las células es tal que no existe .cambio en la cantidad de PLC?, Pp60 Src y ERK-1, existe un aumento en la cantidad de PI3 (113 Kd) .y PI3 (83 Kd) , y existe una disminución en la cantidad de Ref, Ras, proteína a G y proteína ß G. 31. El complejo receptor de la superficie celular de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el receptor de superficie celular es un receptor FPR. 32. El complejo receptor de la superficie celular de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la estimulación por IL-4 de la célula mononuclear o la célula polimorfonuclear de sangre periférica humana proporciona una distribución de protein cinasas producida por la célula en donde, con comparación con las células estimuladas . que no presentan el complejo receptor, existe un aumento en la cantidad de PLC?, PI3 (102 Kd) y PI3 (83 Kd) , y una disminución en la cantidad de Ras y protein ? cinasa G. 33. El complejo receptor de la superficie .celular de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la estimulación por el agente pro-inflamatorio IL-13, de la célula mononuclear o la célula polimorfonuclear de sangre periférica humana proporciona una distribución de protein cinasa producida por la célula en donde, en comparación con las células estimuladas que no presentan el complejo receptor, existe un aumento en la cantidad de PLC?, PI3 (113 Kd) , PI3 (83 Kd) , y una disminución en la cantidad de Raf, Ras, Pp60 Src, proteína a G y proteína ß G cinasas. 34. El complejo receptor de la superficie celular de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la estimulación por el agente pro-inflamatorio C5a, de la célula mononuclear o la célula polimorfonuclear de sangre periférica humana proporciona una distribución de protein cinasa producida por la célula en donde, en comparación con las células estimuladas que no presentan el complejo receptor, existe un aumento en la cantidad de PI3 (83 Kd) y Raf, y una disminución en la cantidad de PLC?, PI3 (113 Kd) , proteína a G y proteína ß G cinasas. 35. El complejo receptor de la superficie celular de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la estimulación por el agente pro-inflamatorio IL-13, de la célula mononuclear o la célula polimorfonuclear de sangre periférica humana proporciona una distribución de protein cinasa producida por la célula en donde, en comparación con las células estimuladas que no presentan el complejo receptor, existe un aumento en la cantidad de Raf, ERK-1, Ras proteína a G, proteína ß G y proteína ? G, y una disminución en la cantidad de PLC?, PI3 (113 Kd) y Pp60 Src cinasa.