KR20020057972A - Ｎ-포르밀 펩티드 수용체와 ｇ-단백질 키나아제 신호 경로변형제의 복합체 - Google Patents

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Abstract

인간 말초 혈액 단핵 세포 또는 다형핵 세포, 또는 고정 조직 세포의 전염증성 반응을 저해하는 방법을 기술한다. 세포를 전염증성 약제와 접촉시켜 전염증성 반응을 자극한다. 이어서, 세포를 G-단백질 키나아제 신호 경로 변형제와 접촉시켜 G 단백질에 의해 매개되는 염증 반응 신호전달과정 경로를 저해한다. G 단백질 키나아제 신호 경로 변형제가 전염증성 약제에 의해 자극된 인간 말초 혈액 단핵 세포 또는 다형핵 세포의 세포 표면 수용체에 결합한 수용체 복합체를 기술한다.

Description

Ｎ-포르밀 펩티드 수용체와 Ｇ-단백질 키나아제 신호 경로 변형제의 복합체{Ｎ-Formyl peptide receptor complex with a Ｇ-protein kinase signal pathway modification agent}
인체는 식균세포, 특히 호중구(neutrophil) 및 단핵구(monocyte)에 대한 화학유인물질로서 박테리아로부터-생산된 N-포르밀메티오닐 펩티드를 사용하여 박테리아 감염에 대한 방어기전을 개발하도록 진화하였다. N-포르밀 펩티드중, f-Met-Leu-Phe(FMLP)가 식균세포를 보충하고 호중구에 의한 리소솜성 효소의 방출을 촉진한다는 능력면에서 가장 효능이 있는 것으로 확인되었다(Showell et al., J, Exp. Med, 143:1154-1169, 1976). 합성 테트라펩티드, 특히, f-Met-Ile-Phe-Leu 및 f-Met-Leu-Phe-Ile는 또한 이후에 호중구 반응을 유발시키는 것으로 나타났다(Rot et al., Proc. Natl, Acad, Scie, USA 84:7967-7971, 1987). 초기에 상기 펩티드의 효능은 1) N-말단의 포르밀 그룹, 2) 메티오닌 측쇄, 및 3) 류신 및 페닐알라닌 측쇄에 기인하는 것으로 여겨졌다.
N-포르밀 펩티드 수용체(FRP) cDNA의 클로닝에 이어 단백질의 1차 구조의 설명(delineation)으로 N-포르밀 펩티드의 작용기전을 이해함에 중요한 해결책을 제공하였다(Boulay et al., Biochemistry 29:11123-11133, 1990;Boulay et al., Biochem.Biophys, Res. Commun.168:1103-1109, 1990). FPR은 초기에 호중구 및 단핵구상에서 발견되었지만 이후 인간의 뇌, 간세포, 수상세포, 및 성상세포에서 발현되는 것으로 나타났다(Lacy et al., J. Neuroimmunol. 61:71-78, 1995; Sozzani et al., J. Immunol. 155:3292-3295, 1995). 후에 두개의 다른 FPR 유전자, FPR2(또한, FPRL1 및 FPRH1으로 공지됨)(Bao et al.,Genomics 13:437-440, 1992; Murphy et al., J. Biol. Chem. 267:7637-7643, 1992; Ye et al., Biochem. Biophys Res. Cummun. 184: 582-589, 1992) 및 FPRL2(Bao et al., 상기 인용)를 분리하였다. FPRL1은 351개의 아미노산으로 구성되고 FPR과 70% 일치도를 갖지만 FMLP에 대한 원(original) FPR보다 400배 낮은 친화력(Kd=1nM)을 갖는 것으로 나타났다. 그러나, 단핵구 및 호중구 둘 모두에서 발현되는 FPRL1과 달리, FPRL2는 호중구를 제외한 단핵구에서 발현되는 것을 나타났다(Durstin et al., Biochem. Biophys, Res. Commun. 201:174-179, 1994).
FPR은 세포외 공간 또는 세포내 공간중 어느 것에 노출된 친수성 서열에 의해 연결된 원형질막에 놓여진 7개의 소수성 영역을 포함한다(Murphy, Annu. Rev. Immunol. 12: 593-633, 1994). 첫째 및 세째 세포내 루프(loop)는 상대적으로 작고, 각각 5개 및 6개의 아미노산으로 구성된다. 카복실 말단은 세포내 공간에 노출되는 반면, N-말단은 세포외 공간에 노출된다. 세포내 서열은 또한 G-단백질-결합 영역(하기에 기술되는 바, 수용체의 작용에 필수적인 영역) 및 잠재성 인산화 영역을 포함한다.
FMLP 결합 영역은 FPR의 첫째 및 세째 세포외 영역에 위치한다(Quehenberger et al., J.Biol. Chem. 268:18167-18175, 1993). 또한, FMLP 결합에 대한 높은 친화성 결합 및 낮은 친화성 결합 상태 사이로 바뀌는 FPR의 상호전환될 수 있는 상태가 제안되었다(Kermode et al., Biochem. J.276:715-723, 1991). G-단백질이 상기의 상호전환될 수 있는 상태를 조절한다고 여겨진다. G-단백질이 결합하지 않는 FPR만으로는 낮은 친화성 상태를 나타내는 반면, G-단백질에 결합된 FPR은 높은 친화성 상태를 보인다. 상기 모델이 추가로 상이한 펩티드에 의해 관찰되는 상이한 효능을 설명하는 3개의 상이한 상태로 G-단백질-결합 FPR을 분석한다. 상태 I은 FPR이 G-단백질과 결합하지 않았지만 G-단백질과의 결합시 상태 II의 높은 친화성 상태로 전환될 수 있는 낮은 친화력의 결합 상태를 나타낸다. 상태 III은 G-단백질의 Gα서브유니트를 방출하는 동안, 수용체가 리간드에 결합하는 높은 친화성의 중간체 단계이다. 상태 IV는 잔여 G-단백질 서브유니트(Gβ및 Gγ)가 수용체로부터 해리되는 일시적이고, 낮은 친화성 상태이다. G-단백질 서브유니트 Gα의 해리가 세포의 활성화를 일으키는 G-단백질의 작동세포(effector)의 작용을 유발한다. 유사한 모델이 Sklar 등(J. Bio. Chem. 264:8483-8487, 1989)에 의해 제안되었다.
상기 모델에 따라, 펩티드의 효능을 상태 III에서의 체류 시간에 의해 측정한다(Kermode et al., 상기 인용). fMet-Leu-Phe-Phe 및 fMet-Leu-Phe-NHBzl과 같은 가장 유효한 포르밀 펩티드는 일시적으로 안정화시키고 상태 III을 유지시키고, 즉각적인 탈과립화 반응을 유발하지만 상태 III 지속기간동안 화학주성 반응에 대한 신호를 유지시켜 이동을 최대화한다. 덜 유효한 포르밀 펩티드는 높은 친화성 상태 III로부터 낮은 친화성 상태 IV로의 신속한 전환을 매개한다. 상태 III에서 초기 탈과립화 반응은 영향을 받지 않지만, 화학주성 신화전달 능력은 최소화되어 세포 이동은 제한된다. 따라서, 일반적으로 고도로 유효한 리간드는 높은 친화성 상태의 FPR에 결합하여 화학주성 반응에 작용하지만, 덜 유효한 리간드는 낮은 친화성 상태의 FPR에 결합하여 탈과립화 반응에 작용한다고 말할 수 있다.
상기 모델을 사용하여 작용제 활성 및 길항제 활성을 정의할 수 있다. 작용제는 활성화된 수용체 상태 III를 안정화시키고 안정도가 그의 효능에 반영된다. 한편, 길항제는 수용체에 결합하지만 활성화된 상태 III을 불안정화시키고 수용체를 불활성화시킨다. 그러한 모델은 FPR로 제한하는 것은 아니다.
또한, 리간드가 수용체에 결합하고 동일하거나 상이한 수용체가 동일하거나 상이한 리간드에 의한 이후의 자극에 대하여 내성이 되는 경우, 탈감작화 (desensitization)된다. 이 탈감작화는 상태 III을 불안정화시키는 세포 활성화의 정상 과정에서 수용체 점유 후, 또는 상태 III이에 이르지 않는 수용체 점유 이전에 형성될 수 있다. 내성 상태 또는 수용체 불활성화가 하나의 자극제의 의해 유도되고 다수의 비리간드성(nonliganded) 수용체에 영향을 주는 경우, 상기 상태를 이질성 탈감작화라 명명한다.
가장 잘 연구된 N-포르밀 펩티드는 f-Met-Leu-Phe(FMLP 또는 fLMP)이다. 그러나, 더욱 유효한 펩티드, 특히 fMet-Leu-Phe-Phe, fMet-Leu-Phe-NHBzl(fMet-Leu-Phe-벤질아미드), 및 fNle-Leu-Phe-Tyr(N-포르밀-L-노르류실-Leu-Phe-Tyr)이 시험관내 래빗의 호중구상의 수용체로 설명되었다(Kermode et al., 상기 인용). 이는 최대 이동(약 20-35㎛) 및 탈과립화(약 10-10내지 10-11의 ED50를 나타낸다. 더 최근의 연구를 통해 비포르밀화된 펩티드 또한 FPR에 결합할 수 있고 호중구 작용의 유효한 활성자로서 작용할 수 있다고 제안되었다. 예를 들면, Met-Met-Trp-Leu-Leu이 유효한 펜타펩티드이고 활성면에서 FMLP에 비교할 만하다(Chen et al.,J. Bio.Chem 270:23398-23401, 1995). 펜타펩티드의 N-포르밀화된 형태로의 전환으로 그의 효능이 100-500배 상승되었고, 이는 생물작용이 N-포르밀화에 의해 엄격하게 결정되는 것은 아니지만, N-포르밀화가 여전히 펩티드의 효능에서 중요한 역할을 한다는 것을 입증한다.
펩티드의 다른 변형을 통해 일부의 펩티드가 FPR에 대한 유효한 작용제로 전환될 수 있다는 것이 나타났다(Derian et al., Biochemistry 35:1265-1269, 1996;Higgins et al., J.Med. Chem.39:1013-1017, 1996). 상기 변형은 아미노 말단 그룹의 우레아 치환 및 카바메이트 변형을 포함한다. 과산화 음이온 방출 및 혈관 내피로의 호중구의 유착으로 측정되는 바와 같이 MLF 펩티드의 아미노산 조성의 변형이 FPR의 작용제로부터 길항제로 전환시킨다고 나타났다.
호중구중 FPR을 통해 N-포르밀에 의해 자극받은 화학주성이 잘 연구되었다. N-포르밀 펩티드에 의한 자극에 앞서, 호중구는 일시적으로 내피세포에서 발현되는 P-셀렉틴에 결합한다. 염증 부위에서 생산된 N-포르밀 펩티드에 의해 매개된 호중구의 활성화로 상기 부위에 호중구가 축적된다. N-포르밀 펩티드는 호중구상에 L-셀렉틴을 상향조절하고 내피를 따라 호중구를 롤링(rolling)시킨 후 호중구의 표면상의 인테그린을 상향조절한다. 인테그린은 세포-세포 및 세포-세포외 기질 상호작용을 매개하고 라미닌, 피브로넥틴, 빅트로넥틴, 및 내피상에서 발견되는 ICAM(세포내 세포 유착 분자) 및 VACM(혈관 세포 유착 분자)에 결합한다. 인테그린이 ICAM 및 VCAM에 결합한 경우, 신호는 세포골격과의 상호작용을 통해 호중구의 내부로 전달된다. 이어서 호중구는 L-셀렉틴을 방출하고 내피를 따라 퍼지기 시작한다. 이어서, 내피 세포의 표면상의 E-셀렉틴 및 ICAM-1의 상향조절이 내피를 가로지르는 호중구의 이동을 매개한다(Luscinskas et al., J.Immunol. 146:1617-1625, 1991). 내피막을 통과하는 경우, 호중구는 N-포르밀 펩티드의 농도 구배를 감지하여 염증 부위로 이동한다. 고농도의 상기 펩티드를 포함하는 그의 목적지에 도달하였을 때, 호중구는 그의 항균 작용을 한다.
자극받은 호중구는 신속하게 호흡 방출 산화제(respiratory burst oxidase)를 활성화시켜 과산화 라디칼 O2 -의 생산을 촉진시킨다. 과산화 라디칼은 다른 분자와 반응하여 둘 모두 고도로 반응성 약제인 과산화수소 및 차아염소산을 생산하고, 따라서 미생물의 작용을 방해함에 효과적이다. 탈과립화 또한 외래 미생물을 파괴하는 유효한 방법이다. 그러나, 탈과립화는 또한 숙주 조직을 손상시킬 수 있다. 식균 작용은 호중구가 외래 미생물을 제거하는 또다른 기전이다. 다수의 이 작용은 2차 메신저로서 포스포리파아제를 사용하여 G-단백질에 의해 자극을 받고, 그중 3개의 포스포리파아제가 설명된다.
포스포리파아제 C, PLCβ2는 두개의 2차 메신저, 1,4,5-이노시톨 트리포스페이트(IP3) 및 디아실글리세롤(DG)을 생산한다. FPR의 활성화시 생산된 G-단백질의 βγ서브유니트는 PLCβ2를 활성화시킨다. IP3는 특정 칼슘 채널에 결합하여 세포내 저장소로부터 칼슘의 방출을 자극하여, 화학유인물질에 의한 자극에서 관찰되는 칼슘의 세포질 농도를 증가시킨다. 방출된 칼슘과 함께, DG는 단백질 키나아제 C(PKC)를 활성화시킨다. 문헌(Beaven, et al., J.of Immunology 160:5136-5144, 1998)에서 G-단백질 활성화된 PLC 키나아제가 Ca+2증가와 관련되는, 시험관내 래트의 복막세포중 비만세포 탈과립화에 대한 주요 경로로서 보고되었다.
포스포리파아제 A2(PLA2)는 원형질막 내면의 인지질로부터 아라키돈산을 생산한다. 아라키돈산은 류코트리엔 및 프로스타글란딘과 같은 염증성 매개체에 대한 전구체를 제공한다. 마이토젠 활성 단백질(MAP) 키나아제에 의한 인산화시 PLA2가 활성화된다.
세번째 포스포리파아제는 포스파티딜콜린으로부터 포스파티드산 및 콜린을 생산하는 포스포리파아제 D(PLD)이다. 포스파티드산은 PKC를 활성화시키는 DG의 생산에서 중요한 역할을 할 뿐만 아니라, 호흡 방출 산화제의 활성화에 관여할 수 있다. 그러나, PLD의 활성화는 칼슘을 요구하고, FMLP는 칼슘-결핍된 세포에서 PLD를 자극할 수 없다(Kessels et al., J.Bio.Chem. 266:23152-23156, 1991). 또한, G-단백질 Arf 및 G-단백질 Rho가 PLD 활성을 조절하는 것으로 나타났다(Brown et al., Cell 75:1137-1144, 1993;Cockcroft et al., Science 263:523-526, 1994; Singer et al., J.Biol.Chem, 270:14944-14950, 1995).
단백질 인산화는 FMLP에 의해 개시된 신화전달 경로에서 중요한 역할을 한다. 3개의 주요 단백질 키나아제가 FMLP 자극의 결과로서 단백질의 인산화에 관여한다.
상기 기재한 바와 같이, PKC는 PLC에 의해 생산되는 DG에 의해 활성화된다. PKC는 작용하여 세린 및 트레오닌 잔기를 인산화시킨다. PKC는 6개의 상이한 이소폼(isoform)으로 구성되고, 이중 3개(α,β및 γ형)는 세포내 칼슘에 민감하고 다른 3개(δ,ε및 ζ형)는 아니다. 호중구는 α,β및 ζ형을 포함하지만 γ형은 포함하지 않는다. 칼슘-의존 및 DG-의존 PKC(PKC-β)는 세포질로부터 막으로 전위시켜 FMLP 및 포르볼 에스테르 자극에 반응한다. 이어서, 호흡 방출 산화제 시스템에 관여하는 것과 같은 다수의 세포질 단백질을 인산화시킨다. FMLP는 또한 칼슘-의존, DG-의존 및 포스파티딜 세린-의존 PKC형을 활성화시킬 수 있자만 그의 작용은 불분명하다.
보고된 바에 따르면, MAP 키나아제(MAPK)는 Ras 및 Raf의 활성에 의해한 G-단백질의 βγ서브유니트에 의해 활성화된다. 최근 문헌에서는 세포고사를 유도하고(Bugl et al., J. Mol.Cell Bil. 19(9):5892-901, 1999) 내피 세포 유착(Finkel, et al., -----)에 고강도 Ras 신호전달이 관여한다고 제안되었다. Raf는 현재 세포 생존, 성장 및 분화를 포함하는 성장 신호전달에서 중요한 역할을 한다고 가정되고 있다(Rapp, et al, ...). 이 키나아제 경로는 C5a 및 IL-8에 의해 자극받는다(Biol.Chem.270:19828-19832, 1995; Knall et al., J.Biol. Chem. 271:2832-p2838, 1996). MAP 키나아제는 수개의 조절 단백질, 예로서, 세포외 신호-조절 키나아제(ERK)-1의 티로신 인산화를 유도한다. 최근 문헌에서 MAPK 경로가 사이토카인을 생산한다고 제안되었다; 그러나, TH-1 및 TH-2 사이토카인 둘 모두, 및 다른 전염증성 분자, 예를 들면, C5a, IL-8 및 FMLP의 활성화는 삼합(trimeric) G-단백질 신호전달에 의존한다.
포스파티딜이노시톨 3-키나아제(PI3K)는 FMLP에 의한 자극시 관찰되는 PI 트리포스페이트(PIP3)를 형성한다. 증가된 PIP3수준에 의해 명백하게 호흡 방출 산화제 시스템이 활성화되고 세포 골격의 변화 및 세포 이동을 조절함에 있어 중요한 것으로 판단되는 호중구내 액틴이 중합화된다. 최근 문헌(Rankin, et al., J. Exp. Med, 188(9): 1621-32, 1998)에서 IL-5의 활성화에 기초한 G-단백질 신호전달에 기초하여, 증가된 PI3키나아제 수준은 또한 호산구의 탈과립화를 촉진시킬 수 있다고 보고되었다. 또한, Sagi-Eisenberg 등(Eur. J. Immunol, 1998.28:3468-3478)은 PKC 및 PI3 키나아제의 중간 경로를 사용하는 G-단백질 신호전달이 히스타민 및 알레르기성 기도 과민증에 관여하는 다른 전염증성 사이토카인의 방출을 위한 IgE에 의해FCεR 수용체를 활성화시킬 수 있다고 제안하였다. 문헌(Uckun, et al., J. of Biolog. Chemistry, Vol, 274, No. 38. Sep., 1999, pp.27028-27038)에서는 IgE/FEεR1 교차결합을 통한 JAK3 키나아제 경로중 G-단백질 신호전달이 비만세포 탈과립화를 이르게한다고 보고하였다. 문헌(Beaven et al., J. of Immunology, 1998, 160:5136-5144)에서는 PKC 활성화 및 Ca+2의 생성 흡수를 통해 G-단백질 신호전달이 비만세포의 분비 및 탈과립화시킨다고 보고되었다. 따라서, G-단백질은 IgE 항원 감염(Challenge)시 FEεR1 의 하류 활성화에 필수적일 수 있고, G-단백질 신호전달을 간섭시키는 상응하는 능력이 FEεR 수용체 활성화의 하류 저해에 중요한 원리가 될 수 있다.
래빗 호중구 FPR의 수개의 길항제가 동정되었지만 특정 분자를 길항제로 만드는 특성은 여전히 불명확하다. FMLP의 특정 부톡시카보닐 유사체가 경쟁적으로 화학주성 펩티드-유도 세포의 활성화를 저해하는 것으로 나타났고, 이중 BocPLPLP가 가장 유효한 것으로 나타났다(Schiffman et al., FEBS Lett. 117:1, 1980; Freer et al., Biochemistry 19:2404, 1980; Kanaho et al., J. Leukocyte Biol. 47:420, 1990). 사이클릭 운데카펩티드이고 사이클로스포린 A의 유사체인 사이클로스포린 H 또한 포르밀 펩티드 수용체에 대하여 길항성을 갖는 것으로 나타났다(Wenzel-Seifert et al., J.Immunol. 150:4591-4599, 1993). 자연발생 포르밀 펩티드 수용체 길항제, 레트로바이러스-유래된 헥사펩티드가 동정되었다(Oostendorp et al.,J. Immunol. 149:1010, 1992), 그러나, 이 길항제중어느 것도 높은 친화력으로 포르밀 펩티드 수용체에 결합하지 않고, 따라서 연구 도구 또는 항-염증성 약물로서 실제 사용되고 있지 않다.
흥미롭게도, N-포르밀-메티오닐-류실-페닐알라닌에 의한 비만세포 탈과립화의 저해가 문헌(Inflammation, Vol. 5, No. 1, pp 13-16(1981))에 보고되었다. 여기서, 구조적으로 상이한 두개의 화학주성 펩티드, 즉, 펩스타틴 및 N-포르밀-메티오닐-류실-페닐알라닌이 40/80, 항-래트 IgE 혈청, 또는 소의 폐로부터 분리된 거대분자 음이온성 침투 인자의 주사에 의해 생성된 래트 피부중 혈관 침투성의 증가를 저해한다고 보고되었다. 이 펩티드가 비만세포에 직접 작용한다고 보고되었다. FPR이 비만세포상에 발현된다고 보고된 바 없기 때문에 이 저해기전은 불명확하다.
분명하게는 FPR의 작용 및 작용기전과 관련하여 해결되지 않는 문제들이 많이 있다. 또한, FPR이 뇌 및 수상세포와 같은 비백혈구 세포에서 발현되었다는 발견이 FPR이 아직 밝혀지지 않은 다른 세포형태에서 신규한 작용을 수행할 수 있다는 것을 제안한다. 따라서, 세포의 전염증성 반응을 저해하기 위한 추가의 약제 및 세포의 전염증성 반응 연구 방법이 요구되고 있다.
발명의 요약
인간 말초 혈액 단핵 세포 또는 다형핵 세포, 또는 고정된 조직 세포를 전염증성 약제로 자극시킨 후, G-단백질 키나아제 신호 경로 변형제를 사용하는 상기 세포의 요법이 통상의 전염증성 반응, 특히 전염증성 약제 예를 들면, C5a, FMLP, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13 및 TNFα또는 FCε수용체에 의해 유도된 하류 전염증성 반응을 저해하는 것이 발견되었다. G-단백질의 세포 생산의 변형이 G 단백질에 의해 매개되는 염증 반응 신호전달 경로를 저해한다. 특히 유용한 G-단백질 키나아제 신호 경로 변형제는 f-Met-Leu X(여기에서, X는 Tyr, Tyr-Phe, Phe-Phe 및 Phe-Tyr으로 구성된 그룹으로부터 선택된다)이고, 가장 바람직하게 f-Met-Leu-Phe-Phe이다.
인간 말초 혈액 단핵 세포 또는 다형핵 세포, 또는 고정된 조직 세포는 림프구 및 과립구, 바람직하게 호산구, 호염구, 및 활성화된 T-세포, 및 비만세포일 수 있다.
G-단백질 키나아제 신호 경로 변형제는 본 발명의 바람직한 일례에서 전염증성 약제의 존재하에 G-단백질 서브유니트 γ의 인산화를 저해하는, 세포상에 존재하는 세포 표면 수용체, 바람직하게 포르밀 펩티드 수용체("FPR")와 복합체를 형성한다. 또한, G-단백질의 하류의 인산화를 저해하거나 차단하여, 삼합 G-단백질 성분에 의존하는 다양한 경로는 전염증성 약제에 대한 세포의 반응을 차단하거나 하향조절한다.
본 발명의 바람직한 일례에서, FCε수용체(FCεR)의 수준으로 IgE의 존재하에 G-단백질 키나아제 신호 경로 변형제는 IgE에 의한 FCεR의 활성화를 저해한다.
본 발명에 따라, 인간 말초 혈액 단핵 세포 또는 다형핵 세포, 또는 고정된 조직 세포를 자극시키기 위해 사용되는 전염증성 약제는 바람직하게 사이토카인, 케모탁신, 또는 마이토젠이다. 특히 바람직한 전염증성 약제는 N-포르밀 펩티드, 예를 들면, FMLP, 활성화된 보체 단편(C5a), 류코트리엔 B4(LTB4), 혈소판 활성 인자(PAF), 및 사이토카인 예를 들면, TNFα, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 및 IL-13,및 항원 교차결합된 IgE, IgG 또는 IgA이다.
본 발명의 또다른 일면에서, 인간 말초 혈액 단핵 세포 또는 다형핵 세포를 G-단백질 키나아제 신호 경로 변형제와 접촉시키고, 상기 약제를 세포상의 수용체에 결합시키는 것을 포함하는, 상기 세포의 전염증성 반응을 저해하는 방법을 제공한다. 전염증성 매개 세포는 림프구 또는 과립구일 수 있다. 바람직하게, 세포는 우선 상기 기재된 전염증성 약제에 의해 자극을 받는다.
본 발명의 바람직한 일면에서, 리간드-결합 수용체는 포르밀 펩티드 수용체이다. FCεR 수용체의 G-단백질 활성화의 하류 차단은 유사한 치료적 효능을 제공한다.
본 발명은 또한
a) 활성화된 T-림프구, 비만세포, 호산구 및 호염구로 구성된 그룹으로부터 선택되는 전염증성 매개 세포를 사이토카인, 케모카인, 케모탁신 및 마이토젠으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 공지된 전염증성 매개체와 접촉시켜 전염증성 반응을 유발시키고;
b) 단계 a)에 G-단백질 키나아제 신호 경로 변형제 후보물질을 가하고;
c) (i) 상기 후보 길항제 및 상기 전염증성 매개체와 동시에 접촉된 전염증성 매개 세포에서 조절성(regulating) G 단백질 키나아제 양의 증감을 (ii) 상기 전염증성 매개체 단독과 접촉된 전염증성 매개 세포와 비교하여 검출하는 단계를 포함하는, G-단백질 키나아제 신호 경로 변형제를 동정하는 방법을 제공한다. 바람직한 G-단백질 키나아제는 G-단백질 γ키나아제이다.
본 발명의 또다른 일면에서 전염증성 매개 세포를 G-단백질 키나아제 신호 경로 변형제와 접촉시켜 전염증성 반응을 저해시키는, G-단백질 키나아제 신호 경로 변형제와 결합된 수용체를 활성화된 T-림프구, 비만세포, 호산구 및 호염구로 구성된 그룹으로부터 선택된 전염증성 매개 세포의 표면에 제공한다.
본 발명의 추가의 일면에서, G-단백질 키나아제 신호 경로 변형제를 동정하는 방법은
활성화된 T-림프구, 비만세포, 호산구 및 호염구로 구성된 그룹으로부터 선택되는 전염증성 매개 세포를 삼합 G-단백질 키나아제 신호 경로 변형제 후보물질과 접촉시키고;
상기 세포에 의해 생산된 단백질 키나아제의 분포를 결정하는
(여기에서, 캔디데이트 삼합 G-단백질 키나아제 신호 경로 변형제와 접촉되지 않는 세포와 비교하여, PLCγ, Pp60 Src, 및 ERK-1의 양은 변함에 없고, PI3(102Kd) 및 PI(83Kd)의 양은 증가하고, Raf, Ras, G-단백질 α및 G-단백질 β키나아제의 양은 증가한다) 단계를 포함한다.
따라서, 본 발명은 세포 표면 수용체 및 G-단백질 신호 경로 변형제를 포함하는 인간 말초 혈액 단핵 세포 또는 다형핵 세포의 신규한 수용체 복합체를 제공한다(여기에서, 상기 수용체 복합체를 나타내지 않는 세포와 비교하여, 상기 세포중 단백질 키나아제 분포가 PLCγ,Pp60 Src, 및 ERK-1의 양에는 변함이 없고, PI3(102Kd) 및 PI3(83Kd)의 양은 증가하고, Raf, Ras, G-단백질 α및 G-단백질 β키나아제의 양은 증가한다). 바람직한 세포 표면 수용체는 FPR 수용체이다. FCεR 수용체의 G-단백질 활성화의 2차 차단이 또한 바람직하다.
G-단백질 신호 경로 변형제와 결합된 세포 표면 수용체를 갖는 인간 말초 혈액 단핵 세포 또는 다형핵 세포의 IL-4에 의한 자극이 상기 세포에 의해 생산되는 단백질 키아나제의 분포를 제공한다(여기에서, 상기 수용체 복합체를 나타내지 않는 자극받은 세포와 비교하여, PLCγ,PI3(102Kd) 및 PI(83Kd)의 양은 증가하고, Ras, G-단백질 γ 키나아제의 양은 감소한다).
G-단백질 신호 경로 변형제와 결합된 세포 표면 수용체를 갖는 인간 말초 혈액 단핵 세포 또는 다형핵 세포의 IL-6에 의한 자극이 상기 세포에 의해 생산되는 단백질 키아나제의 분포를 제공한다(여기에서, 상기 수용체 복합체를 나타내지 않는 자극받은 세포와 비교하여, PLCγ,PI3(102Kd), Raf, Pp60 Src, ERK-1 및 G-단백질 α의 양은 증가하고, PI(83Kd), G-단백질 β 및 G-단백질 γ 키나아제의 양은 감소한다).
G-단백질 신호 경로 변형제와 결합된 세포 표면 수용체를 갖는 인간 말초 혈액 단핵 세포 또는 다형핵 세포의 IL-10에 의한 자극이 상기 세포에 의해 생산되는 단백질 키아나제의 분포를 제공한다(여기에서, 상기 수용체 복합체를 나타내지 않는 자극받은 세포와 비교하여, PI3(102Kd), ERK-1 및 G-단백질 α의 양은 증가하고, PLCγ, PI(83Kd), Ras 및 키나아제의 양은 감소한다).
G-단백질 신호 경로 변형제와 결합된 세포 표면 수용체를 갖는 인간 말초 혈액 단핵 세포 또는 다형핵 세포의 전염증성 약제, IL-13에 의한 자극이 상기 세포에 의해 생산되는 단백질 키아나제의 분포를 제공한다(여기에서, 상기 수용체 복합체를 나타내지 않는 자극받은 세포와 비교하여, PLCγ,PI3(102Kd), PI3(83Kd), ERK-1 및 Raf의 양은 증가하고 Ras, Pp60 Src,G-단백질 α, G-단백질 β 및 G-단백질 γ 키나아제의 양은 감소한다).
G-단백질 신호 경로 변형제와 결합된 세포 표면 수용체를 갖는 인간 말초 혈액 단핵 세포 또는 다형핵 세포의 전염증성 약제, C5a에 의한 자극이 상기 세포에 의해 생산되는 단백질 키아나제의 분포를 제공한다(여기에서, 상기 수용체 복합체를 나타내지 않는 자극받은 세포와 비교하여, Pp60 Src 및 Raf의 양은 증가하고, PLCγ,PI3(102Kd), G-단백질 α, G-단백질 β 및 G-단백질 γ 키나아제의 양은 감소한다).
G-단백질 신호 경로 변형제와 결합된 세포 표면 수용체를 갖는 인간 말초 혈액 단핵 세포 또는 다형핵 세포의 전염증성 약제, TNFα에 의한 자극이 상기 세포에 의해 생산되는 단백질 키아나제의 분포를 제공한다(여기에서, 상기 수용체 복합체를 나타내지 않는 자극받은 세포와 비교하여, Raf, Ras 및 Pp60 Src의 양은 증가하고, PLCγ,PI3(83Kd), G-단백질 α, G-단백질 β 및 G-단백질 γ 키나아제의 양은 감소한다).
도면의 간단한 설명
도 1은 FITC-표지된 HK-X(f-Met-Leu-Phe-Phe)의 인간 말초 혈액 유핵 세포에결합을 나타낸 그래프이다.
도 2A 내지 2C는 활성화된 림프구에 결합한 FITC-표지된 HK-X의 도트 플랏이다. 도 2A는 100nM FITC-표지된 HK-X를 첨가한 배양액에서 방치한 후 24시간째 6㎍ Concanavalin A(ConA)로 자극시킨 림프구를 나타내고; 도 2B는 FITC-표지된 HK-X이 없는 배양액에서 방치한 후 120시간째 6㎍ ConA로 자극시킨 림프구를 나타내고; 도 2C는 100nM FITC-표지된 HK-X를 첨가한 배양액에서 방치한 후 120시간째 6㎍ ConA로 자극시킨 림프구를 나타낸다.
도 3A 내지 3B는 도 2A 내지 2C로부터 얻은 림프구의 DNA 함량의 히스토그램이다. 도 3A는 도 2A로부터 얻은 세포의 히스토그램이고 3B는 도 2B 및 2C로부터 얻은 세포의 히스토그램이다.
도 4는 총 인간 호중구 세포 용해질로부터 회수한35S-메티오닐 표지된 단백질 및 다양한 수지의 방사선 사진이다.
도 5A 내지 도 5B는 포스포티로신에 대한 모노클로날 항체에 의해 검출되는 바 담체(0.3% DMSO)로 처리된 단핵 세포중 인산화된 단백질의 존재를 나타낸다. 도 5A는 정상 세포의 SDS-PAGE의 농도 측정이고 도 5B는 담체(DMSO)로만 처리된 정상 세포의 SDS-PAGE의 사진이다.
도 6A 내지 6B는 포스포티로신에 대한 모노클로날 항체에 의해 검출되는 바 HK-X로 처리된 단핵 세포중 인산화된 단백질의 존재를 나타낸다. 도 6A는 HK-X로 처리된 세포의 SDS-PAGE의 농도 측정이고 도 6B는 HK-X로만 처리된 정상 세포의SDS-PAGE의 사진이다.
도 7A 내지 7B는 포스포티로신에 대한 모노클로날 항체에 의해 검출되는 바 IL-8로 처리된 단핵 세포중 인산화된 단백질의 존재를 나타낸다. 도 7A는 IL-8로 처리된 세포의 SDS-PAGE의 농도 측정이고 도 7B는 IL-8로만 처리된 정상 세포의 SDS-PAGE의 사진이다.
도 8A 내지 8B는 포스포티로신에 대한 모노클로날 항체에 의해 검출되는 바 HK-X 및 IL-8로 처리된 단핵 세포중 인산화된 단백질의 존재를 나타낸다. 도 8A는 HK-X 및 IL-8로 처리된 세포의 SDS-PAGE의 농도 측정이고 도 8B는 HK-X 및 IL-8로 처리된 정상 세포의 SDS-PAGE의 사진이다.
도 9A 내지 9B는 포스포티로신에 대한 모노클로날 항체에 의해 검출되는 바 말초 혈액으로부터 회수된 새로운 단핵 세포중 인산화된 단백질의 존재를 나타낸다. 도 9A는 새로 회수된 세포의 SDS-PAGE의 농도 측정이고 도 9B는 새로 회수된 세포의 SDS-PAGE 겔의 사진이다.
본 발명은 말초 혈액 세포의 표면상에서 발견되는 N-포르밀 펩티드 수용체, 및 특히 G-단백질 신호전달 경로를 변경시키거나 교란시키는 약제와 상기 수용체와의 복합체, 특히 특정 N-포르밀 펩티드, 및 전염증성 약제에 의한 동시 자극에 의한 신호전달의 변경 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따라, G-단백질 키아나제 신호 경로 변형제가 전염증성 약제 또는 분자에 의해 자극받은 인간 말초 혈액 세포의 특정 전염증성 반응을 불활성화시킨다는 것이 발견되었다.
본 발명의 따른 바람직한 G-단백질 키아나제 신호 경로 변형제는 전염증성 매개 세포, 예를 들면, 림프구, 특히 활성화된 T-림프구, 과립구, 예로서 호산구, 호염구, 및 고정 세포, 예로서 비만세포상에서 발견되는 수용체에 결합할 수 있다.
G-단백질 키아나제 신호 경로 변형제가 그의 수용체에 결합한 경우, 전염증성 반응은 저해된다. 본 발명의 바람직한 일면에 따라, G-단백질 서브유니트 α, β 및 γ는 변형되고 또한 이 서브유니트의 인산화는 저해된다. 약제-수용체 복합체에 의해 저해될 수 있는 전염증성 반응은 수용체-수반 세포(receptor-bearing cell)의 분비, 탈과립화 및 이동, 및 다른 전염증성 분자의 합성 및 분비이다.
바람직하게, 본 발명의 G-단백질 키나아제 신호 경로 변형제는 전염증성 분자에 의해 앞서 자극받은 수용체를 불활성화시킬 수 있지만 자극을 받지 않은 세포에 대하여 영향을 주지 않는다. 세포의 자극에 유용한 전염증성 약제의 예는 IL-8, N-포르밀 펩티드, 활성화된 보체 단편(C5a), 류코트리엔 B4(LTB4), 혈소판 활성 인자(PAF)이다. 바람직하게 본 발명의 약제-수용체 복합체는 또한 동일한 전염증성 약제 또는 상이한 전염증성 약제에 의한 추가의 자극으로부터 수용체를 탈감작화시킬 수 있다.
G-단백질 키나아제 신호 경로 변형제-수용체 복합체의 수용체-수반 세포에 대하여 관찰되는 효능을 사용하여 G-단백질 키나아제 신호 경로 변형제를 동정할 수 있다. 전염증성 매개 세포를 공지된 전염증성 매개체와 접촉시켜 전염증성 반응을 유도한 후, 약제 후보물질을 첨가하고 약제 후보물질 및 전염증성 분자와 동시와 접촉하고 있는 전염증성 세포중 G 단백질 키나아제 양의 감소를 전염증성 분자 단독으로 접촉하고 있는 전염증성 매개 세포의 양과의 비교로 결정하는 상기 약제를 선별하는 것을 수행할 수 있다.
특히 유용한 G-단백질 키나아제 신호 경로 변형제는 f-Met-Leu-Phe-Phe이다.다른 유용한 약제는 상기 방법중 하나를 사용하는 통상 시험에 의해 동정될 수 있다.
본 원에서 사용되는 바, 전염증성 반응은 전염증성 매개 세포의 분비 또는 탈과립화 및 류코트리엔, 히스타민, 및 다른 사이토카인의 방출을 포함한다. 상기 반응은 또한 림프구, 호산구, 호염구, 비만세포, 호중구의 화학주성 유착, 이동 및 응집의 결과로서 염증 조직내로 호산구, 호염구 및 비만세포의 침윤을 포함한다. 염증 부위의 혈관 투과성 및 IgE, IgG 및 IgA, 및 그 각각의 FC 수용체 생산의 증가 또한 전염증성 반응과 관련될 수 있다.
따라서, 본 발명의 따른 펩티드-수용체 결합에 이어, 전염증성 반응의 저해는 전염증성 매개 세포에 의한 류코트리엔, 히스타민 및 다른 사이토카인의 방출 및 탈과립화의 감소, 또는 바람직한 일면에서 완전한 정지를 포함한다. 전염증성 매개 세포의 침윤 및 이동은 또한 현저하게 감소되거나, 완전히 저해될 수 있다. 염증 부위의 혈관 투과성 및 IgE 수준 또한 감소될 수 있다.
본 원에 기재된 본 발명을 더욱 상세히 설명하기 위하여, 하기 실시예를 기재한다. 이 실시예는 설명을 위한 것이며 어느 방식으로든 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: 표지된 HK-X과 말초 혈액 유핵 세포와의 결합
말초 혈액 유핵 세포상의 HK-X("f-Met-Leu-Phe-Phe")의 Kd 및 Bmax(포화 결합)을 측정하였다. 밀도 원심분리에 의해 제조된 다양한 분획(단핵구, 림프구, 과립구)로부터의 100㎕의 용액중 2x105세포를 0.1% 소듐 아지드를 포함하는 1% BSA-PBS 용액중에서 미리 세척하였다. 하기 분자 농도의 FITC-표지된 HK-X(1% BSA-PBS 용액중) 100㎕를 표 1에 따라 각 튜브 세트에 가하였다:
표 1
튜브를 30초동안 혼합하고 와동시켰다. 이어서 튜브를 30분동안 4-8℃에서 유지시켰다. 이어서, 100㎕의 Cal-Lyse를 가하고, 5분동안 인큐베이션시키거나, 500㎕의 1% 포름알데히드를 가하였다. Cal-Lyse를 가한 경우, 1㎖의 물을 가하고 추가로 5분동안 인큐베이션시켰다. 이어서 세포를 유식세포측정기(flow cytometer(Coulter Epics Elite)상에서 분석하였다. 결합 결과를 도 1에 나타낸다. Bmax는 47.66 및 Kd는 1.674x10-10M으로 측정되었다. 따라서, 이 결과는 HK-X가 단핵구, 림프구 및 과립구와 같은 말초 혈액 유핵세포에 결합한다는 것을 보여준다.
또한 유사한 방법에 의해 HK-X가 활성화된 T-세포, 비만세포, 호산구, 및 호염구 및 공지된 호염구에 결합하는 것을 측정하였다.
실시예 2: HK-X는 활성화된 수용체에 결합한다
배양에서 방치한 후 24시간 또는 120시간째 말초 혈액 림프구를 마이토젠 Concanavalin A(ConA)로 자극시켰다. 이어서 세포를 100nM FITC-표지된 HK-X에 노출시키거나 노출시키지 않았다. 또한 세포 주기 측정을 위해 DAPI로 세포를 염색하였다. 이어서 세포를 유식세포 측정법에 의해 분석하였다.
도 2A-2C는 ConA에 의해 활성화된 림프구 및 FITC-표지된 HK-X에 대한 결합 부위의 출현사이의 관계를 보여준다. 4개의 사분면은 하기 특성을 나타낸다:
좌상4분부는 1n 초과의 DNA 함량 및 도 1의 프로필을 사용하여 확인된 백그라운도 수준 이상의 증가된 수준의 FITC HK-X 결합을 갖는 세포를 나타내고;
우상4분부는 1n 초과의 DNA 함량을 포함하고 백그라운드 초과의 FITC-리간드 결합을 갖는 세포를 나타내고;
우하4분부는 1n DNA 함량을 갖지만 백그라운드 수준 이상의 결합 FITC-리간드를 갖는 세포를 포함하고;
좌하4분부는 1n DNA 함량 및 백그라운드 수준의 FITC-리간드를 갖는 세포를 포함한다.
도 2B 및 2C로부터 판단할 수 있는 바, 식물 렉틴 또는 마이토젠에 대한 노출은 세포를 자극시켜 세포주기를 시작시키고 FITC-표지된 HK-X에 대한 결합 부위를 발현시킨다. 120시간의 더욱 장기간의 배양기에 의해 더욱 많은 세포가 세포주기를 시작하도록 하였다(비교 도 2A). Con A과 함께 배양되었지만 FITC-표지된 HK-X로 염색되지 않는 세포를 사용하여 역치(thresholds)(사분역(quadrants))세팅하여 내재성 형광의 백그라운드 수준의 가장 정확한 측정값을 수득하였다(참조, 도 2B).
통계학적 분석으로 도트 플랏 조사에 의해 제공된 정성(qualitative) 관측을 확인하였다. 도 2C의 약 25% 세포가 1n 초과의 DNA 함량을 포함하고 FITC-리간드 결합은 백그라운드 수준 이상이었다. 이는 각각 도 2A 및 2B중 우상4분부의 세포의 수와 현저하게 대조적이다.
소프트웨어 패키지 "MultiCycle"(Phoenix Software, Phoenix, AZ)를 사용하여 세포주기중 다양한 기(phase)에서 세포의 분포를 정식으로 연구하였다. 이 소프트웨어가 DNA 히스토그램을 해독하고 통계학적으로 적합도(fit) 및 유의수준에 대하여 성분을 분석한다.
도 3A는 도 2A에 포함된 동일한 샘플을 나타내고 도 3B는 도 2B 및 2C에 포함된 동일한 샘플을 나타낸다. 2배체(>1n DNA 함량)인 세포의 퍼센트 연구로부터 확인할 수 있는 바 분획은 도 2A의 2.2%로부터 도 2B 및 2C의 29%로 증가하였다.
따라서, 마이토젠을 사용한 인간 말초 혈액 림프구의 자극이 DNA의 복제, 이 과정과 동시에 FITC-표지된 HK-X에 대한 결합 부위의 발현을 개시한다는 것으로 보인다. 단지 1n DNA 함량을 갖는 세포, 또는 세포 주기중 G0/G1기의 세포의 분획이 리간드에 대한 결합 부위의 증가된 발현을 보인다. 반대로, 2배체 DNA 함량(>1n)을 갖는 모든 세포는 리간드에 대한 결합 부위를 포함한다.
실시예 3: HK-X 수용체의 동정 및 특징
HK-X 및 다른 N-포르밀 펩티드에 결합하는 수용체를 쥐의 복막 비만세포, 인간 다형핵 세포 및 단핵 세포 군집으로부터 분리하고 특징화하였다. 또한, PKC,PI3 및 Ca+2의 이동의 증가의 하류 결과로서 FCεR 수용체의 G-단백질 활성화는 FCε수용체를 G-단백질 간섭의 하류 작동세포 수용체로 전환시킨다.
HK-X에 대한 노출후 변화된 생물학적 반응 및 형광 또는 방사능 표지된 HK-X이 결합에 의해 입증된 바와 같이 HK-X에 결합하는 세포는 비만세포, 호염구 및 호산구를 포함한다. HK-X에 대한 수용체는 확인된 바 없다. 반대로, 호중구는 그의 표면상에 포르밀 펩티드 수용체를 발현시킨다. 그러나, 혈액 림프구 및 단핵구는 호중구보다 덜 HK-X에 결합하는 것으로 보인다.
상세한 재료 및 방법
1. 세포 분리--- 35㎖의 Tyrode's Solution을 마취시킨 래트의 복강내 주입하여 래트의 복막 비만세포를 분리하였다. 과량의 마취제를 주사하여 래트를 희생시켰다. 복막 세포를 회수하고 15㎖ 원심분리 튜브에 넣었다. 세포를 실온에서 10분동안 250 x g으로 원심분리하여 펠릿화하였다.
인간 말초 혈액 단핵구 및 다형핵구 세포를 정상 헌혈자로부터 수득한 말초 혈액으로부터 분리하였다. 혈액을 헤파린중에서 회수하였다. 다양한 형태의 세포를 실온에서 60분동안 500 x g으로 Ficoll-Hypaque상에서 원심분리하여 분리하였다. 각 분획을 회수하고, 따로따로 푸울(pooling)시키고 항생제를 포함하는 RPMI 1640중에서 1회 세척하였다.
2.35S-메티오닌을 사용한 세포의 대사 표지화 --- 세포를 10μCi의35S-메티오닌을 포함하는 무-메티오닌(methionine-less) RPMI 1640 배지 1㎖당 1 x 107로 조정하고 5% CO2존재하에 37℃에서 밤새 유지시켰다.
3. 조(crude) 막의 세포 및 표본의 회수 --- 세포를 PBS에서 3회 세척한 후 0.3% NP40 및 단백질 분해 효소 저해제 칵테일을 포함하는 pH 7.2의 Hepes 완충액중에서 초음파 처리에 의해 용혈(lyse)시켰다. 생산된 세포 표본을 10분동안 600 x g으로 원심분리하고 상등액을 추가의 분석을 위해 회수하였다.
4. 다양한 세포 단백질의 세파로스 및 세파로스 HK-X 크로마토그래피 분리 -- 세포 표본을 세파로스 비치환된 수지 또는 세파로스 HK-X 수지의 칼럼에 통과시키고 두개의 분량, A 및 B로 나누었다.
분취량 A를 HK-X 치환된 세파로스 칼럼상에 통과시켰다. 칼럼을 세척한 후 HK-X(5mg/㎖)을 포함하는 완충액, 이어서 0.1M 글리신(pH 2.5)으로 용출시켰다.
분취량 B를 가용성 HK-X의 존재하에 HK-X 치환된 칼럼에 결합시키고 단백질을 용출시켰다. 각 분획을 농축시키고 동결시켰다.
이 단계에서 실행된 접근법은 HK-X를 세파로스 수지에 결합시켜 HK-X 치환된 수지를 제조하는 것을 포함하였다. HK-X 치환된 수지에 노출시키기 앞서, 표지된 세포 단백질을 혼합물을 HK-X로 치환되지 않은 수지상에 통과시켜 원(native) 수지와 반응하는 단백질종을 제거하였다. 따라서, 수용체 단백질을 포함하는 세포 단백질을 적절한 이온 환경하에서 HK-X 치환된 수지에 통과시켰을 때, 다른 단백질중 (HK-X 수용체에 대한) 수용체 단백질이 HK-X에 단단하게 결합하였다. 수지를 완화제(gentle agent), 예를 들면, 중성 pH의 인산 완충제를 사용하여 낮은 친화력의결합 단백질을 제거하였다. 이어서, 수지를 과량의 유리 HK-X에 노출시켜 수지에 결합된 수용체 단백질을 경쟁적으로 용출시켰다. 각 단계에서 방출된 방사성 단백질을 농축시키고 하기 상세히 설명되는 바와 같이 12% SDS-PAGE 시스템상에서 분석하였다.
5. 12% SDS-PAGE --- 250cpm 내지 2000 cpm 방사능을 갖는 25㎕의 방사성 세포 표본을 겔의 각 레인에 적용시켰다. 착색된 견본(standards)의 우수한 분할을 관찰할 때까지 겔을 30mA에서 90V으로 이동시켰다. 견본은 포스포릴라아제 b(MW=94,000); 소 혈청 알부민(MW=68,000); 알부민(MW=43,000); 탄산무수물(MW=30,000); 및 소이빈 트립신 저해제(MW=21,000)였다.
6. 분할된 방사성 단백질의 분자량 평가 --- 겔상에 가시화된 견본 및 각각의 상이한 분자량의 종에 대하여 상대 이동도를 계산하였다. 각 견본에 대한 상대 이동도에 대하여 견본의 로그 분자량 플랏을 플랏팅하였다. 데이타를 PRISM 소프트웨어에 입력하고 불확인 단백질의 분자량을 Standard Curve Program으로부터 예측하였다. 문헌 (Goetzl et al., Biochemistry 20:5717-5722, 1981)에 공개된 FPR 수용체 단백질과 결과를 비교하였다.
도 4는 대표 실험 결과를 보여준다. 세포 용해질(lysate)중 존재하는 모든 단백질을 레인 A에 나타낸다. 레인 B에서, HK-X로 치환되지 않은 세파로스 칼럼으로부터 비결합된 물질은 전체 세포 용해질와 유사한 단백질 밴드 분포 패턴을 나타낸다. 레인 C는 전(pre)-용출 물질을 포함한다. 레인 D는 빈 레인이다. 레인 E에서, 1mg의 HK-X(경쟁자)의 존재하에 칼럼을 용출시켰을 때, 3개의 단백질 밴드를볼 수 있다. 분자량은 각각 ~94,000, ~68,000 및 ~40,000 달톤으로 추정된다. 이 실험 조건으로 결합 특이성을 확인하였다.
Goetzl등에 의해 보고된 것과 이 실험에서 용출된 밴드의 상대 존재비를 비교하여 흥미로운 차이점을 밝혀냈다(참조 표 2). 수용체의 표준화된 비 조사를 통해 FMLP 칼럼(Goetzl) 및 HK-X 칼럼(상기 실시예)로부터 회수된 3종의 분포에서 상당한 차이점을 밝힌다. 68Kd종은 Goetzl 등에 의해 FMLP 친화성 칼럼으로부터 회수된 가장 우수한 종인 반면, 40Kd종은 HK-X 친화성 칼럼으로부터 회수된 우수한 종이었다.
표 2
HK-X-세파로스로부터 회수된 것과 FMLP-세파로스로부터 포르밀 수용체의 보고된 회수와의 차이
도 4의 방사선 사진으로부터 1mg의 HK-X를 추가하여 래트의 복막 비만세포로부터 용출된 3종의 분자가 존재하는 것이 확인된다. 이 단백질의 계산된 분자량은 Goetzl 등에 의해 보고된 분자 크기와 일치한다. HK-X 또는 산과 경쟁시킨 후 래트의 복막 비만세포 및 호중구로부터 회수된 단백질의 분자량은 인간 호중구에 대하여 Goetzl에 의해 보고된 것과 동일하였다.
40Kd 분자중 메티오닌의 총 평균 수는 5.1이지만, 각각 1분자당 11 및 14개의 잔기를 포함하는 68,000 및 94,000종 어느 것보다 더욱 짙은 방사선상을 갖는다. 상기 실시예에서,35S-메티오닌으로 생합성 방사선 표지에 의해 회수된 각 단백질종의 상대 존재비를 측정하였다. 방사선 자동 사진법으로부터 곡선하의 면적을 적분하여 친화성 크로마토그래피로부터 회수한 상대비를 측정하였다. Goetzl는 화학법에 의한 단백질 측정에 의해 각 단백질 종의 상대 존재비를 측정하였다. 따라써, 두 연구에서 회수된 단백질의 분포를 더욱 정확하게 비교하기 위하여, 각 종의 상대 존재비를 메티오닌 잔기수로 나누어 분포값을 표준화하였다. 방법차에 의해 이 비는 값의 잠재된 변이에 대하여 보정된다. 보정된 비를 통하여 Goetzl에 보고된 값과 상기 실시예에서 수득한 값 사이의 결합 및/또는 회수 프로필이 매우 상이하다는 것이 밝혀졌다. 한가지 가능성은 수용체 복합체로부터 해리된 세제가 HK-X 치환된 세파로스의 것과는 상이한, 선택적 방식으로 FMKP-치환된 세파로스에 결합한다는 점이다.
요약하면, 상기 실시예에서, HK-X를 사용하여35S-메티오닌으로 단백질을 표지화 후 회수된 세포 용해질중 결합 단백질을 선택적으로 회수하였다. FMLP 수용체 복합체와 관련되는 펩티드의 크기면에서 선행 보고와 일치하는 3종의 분자량을 분리하였다.
또한, 상기 실시예에서 사용된 기술에 의해 HK-X가 인간 다형핵구 및 단핵구, 특히 활성화된 T-세포, 비만세포, 호산구, 및 호염구에 결합한다는 것이 입증되었다.
실시예 4: 신호전달 및 작용기전
백혈구는 다수의 화학유인물질 및 다른 전염증성 매개체에 반응한다. 일부의 매개체는 화학주성, 효소계의 활성화 및 병리학적으로 중요한 매개체의 방출을 유발한다. 전형적인 N-포르밀 펩티드(원형--FMLP), 활성화된 보체 단편(C5a), 류코트리엔 B4(LTB4), 혈소판 활성 인자(PAF), 및 일부 화학주성 사이토카인(예: IL-8)은 인정된 화학주성 전염증성 약제이다. 이 약제는 G-단백질-결합 수용체(GPCRs)에 결합한 후 단백질 키나아제 시스템에 의해 매개되는 다중 신호전달 경로를 일으킨다. 초기 이벤트를 발생시키기 위한 캐스캐이드는 복잡하고 상호관련되지만, 모든 유핵세포의 전체 행동(behavior)에 관여한다. 프로그램화된 세포 사멸(세포고사), 면역반응의 발생, 자가-인식 T 세포의 제거, 및 세포외 기질의 합성이 신호전달 경로 작용의 일례이다.
포스페이트 그룹을 포스페이트 도너(donor)로부터 단백질내 위치하는 수용체 아미노산으로 이동시키는 능력에 의해 단백질 키나아제를 확인하였다. 통상 ATP의 γ포스페이트가 도너이다. 단백질내 3개의 주요 수용체 아미노산 잔기는 티로신, 세린 및 트레오닌이다. 1999중 115 이상의 단백질 키나아제가 확인되었고 문헌에 기재되었다.
FMLP 자극에 대한 반응에서 세포의 행동은 문헌(Prosnitz et al., Pharmacol. Ther. 74:73-102, 1997)에 잘 기재되어 있다. 식균세포에 결합한 FMLP는 세포 작용과 관련되는 인산화를 자극한다. FMLP 및 다른 화학유인물질은 포스파티딜이노시놀 3-키나아제(PI3K)를 자극시켜 단백질 키나아제(PKC)를 활성화시킨다. 호중구에서, FMLP 결합은 마이토젠-활성화된 단백질 키나아제(MAP 키나아제)라 불리는 키나아제의 일반 패밀리에 속하는 세포외 조절 키나아제(ERK-1)의 인산화를 개시한다. MAP 키나아제 패밀리의 구성원중 일부는 Raf-1 및 Ras이다.
상기 단백질 키나아제 패밀의 구성원은 SDS-PAGE 기술에 의해 하나로부터 또다른 것으로 분할될 수 있을 정도로 분자량이 상이하다. 또한, 포스포티로신 단백질은 포스포티로신 에피토프만을 인식하는 모노클로날 항체에 의해 총 질량의 세포내 단백질로부터 검출될 수 있다(Ross et al., Mature(London)294:654,1981; Frackleton et al., Mom.Cell Biol. 3: 1343,1983).
인간 말초 혈액 단핵 및 다형핵세포에 HK-X를 가하여 매개되는 단백질 키나아제의 변화를 분석하여 HK-S의 작용기전을 밝혀냈다. HK-X 단독으로, 공지된 화학주성 및 전염증성 약제인 FMLP 또는 IL-8을 가하였다.
상세한 재료 및 방법
1. 세포 분리--- 인간 말초 혈액 단핵구 및 다형핵구 세포를 정상 헌혈자로부터 수득한 말초 혈액으로부터 분리하였다. 혈액을 헤파린중에서 회수하였다. 다양한 형태의 세포를 실온에서 60분동안 500 x g으로 Ficoll-Hypaque상에서 원심분리하여 분리하였다. 각 분획을 회수하고, 따로따로 푸울(pooling)시키고 항생제를 포함하는 RPMI 1640중에서 1회 세척하였다.
2. 세포 배양 및 처리 --- 자극제를 첨가하기 앞서, 1㎖의 배지당 107의 세포를 37℃에서 30분동안 유지시켜 세포가 인산화된 단백질 푸울에서 안정상태에 도달하도록 하였다. 이어서, 하기 자극제를 각 ㎖의 세포에 가하였다:
A. 100㎕의 담체(배지중 0.3% DMSO 용액)
B. 20ug HK-X가 함유된 100㎕의 HK-X
C. 0.1ug FMLP가 함유된 100㎕의 FMLP
D. 0.1ug IL-8(재조합 인간 IL-8)이 함유된 100㎕의 IL-8
E. 20ug HK-X가 함유된 100㎕의 HK-X 및 0.1ug FMLP가 함유된 100㎕의 FMLP
F. 20ug HK-X가 함유된 100㎕의 HK-X 및 0.1ug IL-8가 함유된 100㎕의 IL-8
G. 자극제를 포함하지 않는 세포 배양 배지.
세포를 5% CO2의 존재하에서 추가로 30분동안 인큐베이션시켰다.
3. 세포의 회수 및 SDS-PAGE 분석 --- 세포를 실온에서 5분동안 250xg으로 펠릿화하였다. 상등액을 제거하고 25㎕의 2x SDS-PAGE 출발 완충액을 가하였다. 펠릿을 15분동안 끓이고 5분동안 10,000xg으로 원심분리하였다. 소량의 샘플을 12% 아크릴아마이드 겔상에서 겔 전기영동을 위해 제거하였다.
4. 인단백질의 이뉴노블랏(immunoblot) 검출 --- 단백질을 나일론 막상에서 30분동안 13V에서 이동시킨 후 12시간동안 1% BSA로 차단하였다. 0.3% BSA중 HRP와 컨쥬게이트된 항체를 60분동안 가하였다. 막을 세척하고, 고정시키고 촬영하였다.
5. 데이타 분석 --- 전문 연구소에서 촬영하고 고대비(high contrast) 및 저입자 필름을 사용하여 각 겔의 음성 카피를 제작하였다. 이어서 사진을 600 dpi로 스캐닝하고 Image Pro Plus 소프트웨어, SPSS를 사용하여 사진 농도 분석을 수행하였다. 분자량을 각 밴드에 대하여 계산하였다.
SDS-PAGE의 각 레인에 사용되는 세포 단백질의 양을 표준화하기 위하여, 동일한 수의 세포를 각 처리에 대하여 사용하고 대략적으로 동일한 부피의 샘플을 각 레인에 가하였다. 도 5 내지 도 9에서, 모노클로날 항-포스포티로신 항체에 의해 검출된 인단백질의 화학발광 패턴을 보여준다. 고해상도의 밴드 및 그에 상응하는 형광발광 세기를 얻기 위하여 전문 사진가에 의해 음성의 형광발광 상을 제작하였다. 예를 들면, 도 5A에서, 30분동안 담체에 노출된 세포내 존재하는 단백질 키나아제는 겔의 농도 분석중 피크에 나타나는 바와 같이 9개의 상이한 단백질종을 나타내었다. 명확하게 하기 위하여, 농도 분석중 피크르 화살표로 표시하고 겔중 상응하는 분자 종을 또한 동일한 화살표로 표시한다(겔의 원점은 고분자 종이 위치하는 겔의 우측에 존재한다).
도 6에서, HK-X에 대한 세포의 단백질 키나아제 반응을 나타낸다. 약 83Kd 분자량을 갖는 종에서 다른 처리에서는 나타나지 않았던 증가가 분명하게 나타났다. 20ug HK-X 및 0.1ug IL-8 및 20ug HK-X 및 0.1ug FMLP(나타내지 않은 데이타)로 세포를 동시에 처리한 후 현저한 차이가 나타났다. 저분자 종이 현저히 감소하였다(겔의 좌측 대부분). 이 감소는 피크 범위에 의해 정량적으로 반영된다. 농도 측정 기록에서 이 범위를 수평의 이중 화살표로 나타낸다. 새로운 단핵 세포의 단백질 키나아제 함량 및 분포를 도 9에 나타낸다. 이 세포의 키나아제 분포는 담체처리된 세포(도 5) 및 HK-X 처리된 세포(도 6)의 것과 현저하게 유사하다. FMLP의 단독 자극 및 HK-X 및 FMLP 자극에 대한 키나아제 반응 패턴은 나타내지 않는다. 그러나, 이들 각각의 패턴은 각각 IL-8 단독 및 HK-X 및 IL-8로 관찰된 것과 실질적으로 일치하였다.
말초 혈액 다형핵 세포에 대한 단백질 키나아제의 패턴 및 분포는 단핵 세포에 대한 것과 실질적으로 동일하였다. 두 세포 형태사이의 중요한 차이는 단핵 세포가 다형핵 세포보다 대사적으로 더욱 활성이라는 점이었다.
농도분석 접근법을 사용하여, 각 분자량을 갖는 종에 대한 피크하의 면적을 계산하였다. 따라서, 총 키나아제 함량중 각 키나아제의 정량치를 퍼센트로 계산하였다. 또한, 이 시험에서 공지된 키나아제의 분자량을 상대 이동율(Rf) 계산에 의해 산정된 것과 비교하였다. 따라서 본 연구에서 키나아제를 확인할 수 있었다.
표 3는 HK-X에 노출시킨 후 인간 말초 혈액 세포로부터 유래된 단백질 키나아제 분포의 정량적 변화를 나타낸다.
표 3
표 4는 다양한 시험에 대한 G 단백질 γ키나아제의 정량을 나타내고, 이는앞의 정량 데이타를 입증하고 부연한다. 동일한 수의 세포를 각 처리에 사용하고 대략적으로 동일한 양의 회수된 세포내 단백질을 각 레인에 가하려고 시도하였지만, 키나아제의 총량은 관찰된 면적에 의해 나타낸 바와 같이 상이하였다.
표 4
HK-X 및 IL-8 및 FMLP에 노출시킨 후 말초 혈액 세포로부터의 단백질 키나아제 요약
표 5는 (1) HK-X 및 (2) fMLP 또는 IL-8에 대한 동시자극성(costimulatory) 노출과 비교하여 HK-X에 노출 시킨후 인간 말초 혈액 세포로부터 유래된 단백질 키나에의 분포 변화를 나타내는 실험의 결과를 설명한다.
표 6 및 7은 (1) HK-X 및 (2) Ca5, TNFα, IL-4, IL-6, IL-10 또는 IL-13에 대한 동시자극성 노출과 비교하여 HK-X에 노출시킨 후 인간 말초 혈액 세포로부터 유래된 단백질 키나에의 분포 변화를 나타내는 실험의 결과를 설명한다.
포르밀 펩티드에 대한 수용체를 수반하는 세포의 자극시 다수의 중요한 이벤트가 발생한다. 이는 하기를 포함한다:
A. FMLP 또는 다른 유사체 결합시, FPR은 LTB4 및 C5a 수용체와 같은 다른 화학유인제 수용체에 공통된 G-단백질 푸울과 상호작용한다(Jacobs et al., J.Leukoc.Biol.57:679-686, 1995;McLeish et al.,Mol.Pharm.36:384-390);
B. FMLP 또는 다른 화학유인제의 자극후, 세포는 동일하거나 다른 화학유인제에 대한 추가의 또는 연속된 반응에 대하여 내성을 띤다. 내성 상태 또는 불활성화가 하나의 자극제에 의해 유도되고 다중 비리간드화 수용체에 영향을 주는 경우, 이 상태는 이질성 탈감작화이다. 이러한 형태의 탈감작화는 FCεR 수용체와 같이, 하류-활성화된 키나아제에 의한 비리간드성 수용체의 인산화로부터 초래될 수 있다;
C. IL-8, C5a, 및 FMLP가 다른 수용체를 탈감작시켰다. 이 연구를 확장하여 PAF 및 LTB4 수용체까지 포함시켰다. 이 과정을 개시할 수 있는 기전은 PKC에 의한 수용체 인산화를 포함할 수 있다. 그러나, FPR은 PKC에 의해 인산화될 수 있는 세포내 영역을 포함하지 않지만, 또다른 키나아제가 반응하는 것으로 보인다;
D. FPR 인산화의 부재하에 하류 FPR 반응의 탈감작은 발생한다.
HK-K만의 단독 처리는 특이적으로 키나아제를 하향조절하지 않는다. HK-X 및 IL-8 또는 HK-X 및 FMLP로 단핵 세포를 동시에 자극시킨 후 G-단백질 γ키나아제는 선택적으로 현저하게 감소하였다. 이러한 관찰은 하기 기재되는 HK-X의 작용기전을 제안한다.
HK-X 및 잠재성 전염증성 분자, 예를 들면, IL-8 및 FMLP는 함께 존재할 수 있다. 삼합 G-단백질 복합체중 하나의 하향 조절이 존재한다. 특히, 안정상태 조건하에서 G-단백질 γ인산화는 감소하였다. 따라서, IL-8 또는 FMLP의 존재하에 HK-X가 G-단백질 γ서브유니트의 인산화를 직접 또는 간접적으로 저해하는 수용체 탈감작화를 개시하는 것으로 나타났다.
본 데이타 및 앞의 보고로부터 다수의 결론을 유추할 수 있다. 이는 하기와 같다:
1. HK-X가 특이적 전염증성 수용체에 의해 매개되는 전염증성 자극제에 반응할 수 있는 세포에 대한 특이성을 입증한다;
2. 염증 이벤트동안 HK-X가 상기 시스템에 유지되는 경우, HK-X는 잠재성 반응 세포의 탈감작화를 유지시켜야 한다.
3. 이 보고에서 기재된 시험관내 배양 시스템을 사용하여, HK-X의 작용에 대한 그의 감수성에 대하여 다른 세포 표적 및 다른 전염증성 매개체를 선별할 수 있다. 따라서, 간단한 분석법을 사용하여 강력한 치료적 효능을 신속하게 검사하고 치료적 가정을 입증한다.
일부에서, HK-X는 전염증성 매개체 수용체의 탈감작화를 통해 그의 치료적 효능을 매개하는 것으로 보인다. 이 이벤트로부터 하류, 염증성 세포의 불활성화는G-단백질 γ서브유니트의 인산화의 저해를 통해 직접 또는 간접적으로 유지된다.
본 발명은 그의 바람직한 일례를 포함하여 상세히 설명되었다. 그러나, 청구 범위에 기재되는 본 발명의 의도 및 범위내에서 변형 및 개선될 수 있다는 것을 본 분야의 기술자는 이해할 수 있을 것이다.

Claims (35)

  1. 인간 말초 혈액 단핵 세포 또는 다형핵 세포, 또는 고정 조직 세포를 G-단백질 키나아제 신호 경로 변형제와 접촉시켜 G 단백질에 의해 매개되는 염증 반응 신호전달 경로를 저해하는 것을 포함하는, 전염성 약제와 접촉시 인간 말초 혈액 단핵 세포 또는 다형핵 세포, 또는 고정 조직 세포의 전염증성 반응을 저해하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 인간 말초 혈액 단핵 세포가 림프구 및 단핵구로부터 선택되거나 다형핵 세포가 과립구로부터 선택되는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 인간 말초 혈액 단핵 세포 또는 다형핵 세포가 호산구, 호염구, 및 활성화된 T-세포로부터 선택되는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 고정 조직 세포가 비만세포, 수상세포, 성상세포 또는 대식세포로부터 선택되는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 전염증성 약제가 사이토카인, 케모탁신, 및 마이토젠으로부터 선택되는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 전염증성 약제가 fMLP, 활성화된 보체 단편, 류코트리엔 B4, 혈소판 활성 인자, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13 및 TNFα로부터 선택되는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, G-단백질 키나아제 신호 경로 변형제가 f-Met-Leu 펩티드인 방법.
  8. 제 1항에 있어서, G-단백질 키나아제 신호 경로 변형제가 f-Met-Leu-Phe-Phe인 방법.
  9. 세포 표면 수용체와 G-단백질 키나아제 신호 경로 변형제의 복합체를 형성시켜 전염증성 반응을 저해하는 것을 포함하는, 전염증성 약제와 접촉시 인간 말초 혈액 단핵 세포 또는 다형핵 세포, 또는 고정 조직 세포의 전염증성 반응을 저해하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 세포 표면 수용체가 포르밀 펩티드 수용체인 방법.
  11. 제 9항에 있어서, 전염증성 반응이 이뮤노글로블린, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 및 IL-13 및 TNFα로 구성된 그룹으로부터 선택되는 사이토카인, 또는 C5a, FMLP, PAF, LTB4로 구성된 그룹으로부터 선택되는 케모카인으로부터 선택되는 약제에 대한 수용체인 FC 수용체인 하류 수용체를 저해하는 것을 포함하는 방법.
  12. 제 9항에 있어서, 인간 말초 혈액 단핵 세포가 림프구 및 단핵구로부터 선택되거나 다형핵 세포가 호산구 및 호염구로부터 선택되는 방법.
  13. 제 9항에 있어서, 인간 말초 혈액 단핵 세포 또는 다형핵 세포가 호산구, 호염구, 및 활성화된 T-세포로부터 선택되는 방법.
  14. 제 9항에 있어서, 고정 조직 세포가 비만세포, 수상세포, 성상세포 또는 대식세포로부터 선택되는 방법.
  15. 제 9항에 있어서, 전염증성 약제가 사이토카인, 케노카인, 케모탁신, 및 마이토젠으로부터 선택되는 방법.
  16. 제 9항에 있어서, 전염증성 약제가 fMLP, 활성화된 보체 단편, 류코트리엔 B4, 혈소판 활성 인자 또는 IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13 및 TNFα으로부터 선택되는 방법.
  17. 제 9항에 있어서, G-단백질 키나아제 신호 경로 변형제가 f-Met-Leu 펩티드인 방법.
  18. 제 9항에 있어서, G-단백질 키나아제 신호 경로 변형제가 f-Met-Leu-Phe-Phe인 방법.
  19. G-단백질 키나아제 신호 경로 변형제 및 전염증성 약제에 의해 자극받은 인간 말초 혈액 단핵 세포 또는 다형핵 세포, 또는 고정 조직 세포의 세포 표면 수용체를 포함하는 수용체 복합체.
  20. 제 19항에 있어서, 인간 말초 혈액 단핵 세포가 림프구 및 단핵구로부터 선택되거나 다형핵 세포가 호산구 및 호염구로부터 선택되는 수용체 복합체.
  21. 제 19항에 있어서, 고정 조직 세포가 비만세포, 수상세포, 성상세포 또는 대식세포로부터 선택되는 수용체 복합체.
  22. 제 19항에 있어서, G-단백질 키나아제 신호 경로 변형제가 f-Met-Leu 펩티드인 수용체 복합체.
  23. 제 19항에 있어서, G-단백질 키나아제 신호 경로 변형제가 f-Met-Leu-Phe-Phe인 수용체 복합체
  24. 제 19항에 있어서, 전염증성 약제가 사이토카인, 케모카인, 케모탁신, 및 마이토젠으로부터 선택되는 수용체 복합체.
  25. 제 19항에 있어서, 전염증성 약제가 fMLP, 활성화된 보체 단편, 류코트리엔 B4, 혈소판 활성 인자 또는 IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13 및 TNFα으로부터 선택되는 수용체 복합체.
  26. a) 활성화된 T-림프구, 비만세포, 호산구 및 호염구로 구성된 그룹으로부터 선택되는 전염증성 매개 세포를 사이토카인, 케모카인, 케모탁신 및 마이토젠으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 공지된 전염증성 매개체와 접촉시켜 전염증성 반응을 유발시키고;
    b) 단계 a)에 G-단백질 키나아제 신호 경로 변형제 후보물질을 가하고;
    c) (i) 상기 후보 길항제 및 상기 전염증성 매개체와 동시에 접촉된 전염증성 매개 세포에서 조절성(regulating) G 단백질 키나아제 양의 증감을 (ii) 상기 전염증성 매개체 단독과 접촉된 전염증성 매개 세포와 비교하여 검출하는 단계를 포함하는, G-단백질 키나아제 신호 경로 변형제를 동정하는 방법.
  27. 제 26항에 있어서, 전염증성 매개체가 fMLP, 활성화된 보체 단편, 류코트리엔 B4, 혈소판 활성 인자 또는 IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13 및 TNFα으로부터 선택되는 방법.
  28. 전염증성 약제에 대한 전염증성 세포 반응의 저해를 제공하는, 활성화된 T-세포, 비만세포, 호산구 및 호염구로 구성된 그룹으로부터 선택되는 전염증성 매개 세포 표면의 수용체와 결합하는 G-단백질 키나아제 신호 경로 변형제를 포함하는 세포 표면 수용체 복합체.
  29. 활성화된 T-림프구, 비만세포, 호산구 및 호염구로 구성된 그룹으로부터 선택되는 전염증성 매개 세포를 삼합 G-단백질 키나아제 신호 경로 변형제 후보물질과 접촉시키고;
    상기 세포에 의해 생산된 단백질 키나아제의 분포를 결정하는
    (여기에서, 삼합 G-단백질 키나아제 신호 경로 변형제와 접촉되지 않는 세포와 비교하여, PLCγ, Pp60 Src, 및 ERK-1의 양에 변함이 없고, PI3(102Kd) 및 PI(83Kd)의 양은 증가하고, Raf, Ras, G-단백질 α및 G-단백질 β키나아제의 양은 증가한다)
    단계를 포함하는, G-단백질 키나아제 신호 경로 변형제를 동정하는 방법.
  30. 인간 말초 혈액 단핵 세포 또는 다형핵 세포의 세포 표면 수용체 및
    G-단백질 키나아제 신호 경로 변형제를 포함하는 세포 표면 수용체 복합체(여기에서, 상기 세포 표면 수용체 복합체를 나타내지 않는 세포와 비교하여, 세포중 단백질 키나아제의 분포가 PLCγ, Pp60 Src, 및 ERK-1의 양에는 변함이 없고, PI3(113Kd) 및 PI(83Kd)의 양은 증가하고, Raf, Ras, G-단백질 α및 G-단백질 β키나아제의 양은 증가한다).
  31. 제 30항에 있어서, 세포 표면 수용체가 FPR 수용체인 세포 표면 수용체 복합체.
  32. 제 30항에 있어서, 인간 말초 혈액 단핵 세포 또는 다형핵 세포의 IL-4에 의한 자극이 상기 세포에 의해 생산되는 단백질 키나아제 분포를 제공하는 세포 표면 수용체 복합체(여기에서, 상기 수용체 복합체를 나타내지 않는 자극받은 세포와 비교하여, PLCγ, PI3(120Kd) 및 PI(83Kd)의 양은 증가하고, Ras, G-단백질 γ키나아제의 양은 감소한다).
  33. 제 30항에 있어서, 인간 말초 혈액 단핵 세포 또는 다형핵 세포의 전염증성 약제, IL-13에 의한 자극이 상기 세포에 의해 생산되는 단백질 키나아제 분포를 제공하는 세포 표면 수용체 복합체(여기에서, 상기 수용체 복합체를 나타내지 않는 자극받은 세포와 비교하여, PLCγ, PI3(113Kd) 및 PI(83Kd)의 양은 증가하고, Raf, Ras, Pp60 Src, G-단백질 α및 G-단백질 β키나아제의 양은 감소한다).
  34. 제 30항에 있어서, 인간 말초 혈액 단핵 세포 또는 다형핵 세포의 전염증성 약제, C5a에 의한 자극이 상기 세포에 의해 생산되는 단백질 키나아제 분포를 제공하는 세포 표면 수용체 복합체(여기에서, 상기 수용체 복합체를 나타내지 않는 자극받은 세포와 비교하여, PI3(83Kd) 및 Raf의 양은 증가하고, PLCγ, PI3(113Kd), G-단백질 α및 G-단백질 β키나아제의 양은 감소한다).
  35. 제 30항에 있어서, 인간 말초 혈액 단핵 세포 또는 다형핵 세포의 전염증성 약제, TNFα에 의한 자극이 상기 세포에 의해 생산되는 단백질 키나아제 분포를 제공하는 세포 표면 수용체 복합체(여기에서, 상기 수용체 복합체를 나타내지 않는 자극받은 세포와 비교하여, Raf, ERK-1, Ras, G-단백질 α, G-단백질 β및 G-단백질 γ의 양은 증가하고, PLCγ, PI3(113Kd) 및 Pp60 Src 키나아제의 양은 감소한다).
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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US6844315B2 (en) 1998-05-20 2005-01-18 Erasmus Universiteit Rotterdam Immunoregulator
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EP1300418A1 (en) * 2001-10-04 2003-04-09 Erasmus Universiteit Rotterdam Gene regulation by oligopeptides
USRE43279E1 (en) 2000-03-29 2012-03-27 Biotemp B.V. Compositions capable of reducing elevated blood urea concentration
US7786084B2 (en) 2001-12-21 2010-08-31 Biotempt B.V. Treatment of burns
WO2004100978A1 (en) * 2003-05-13 2004-11-25 Medvet Science Pty. Ltd. A method of modulating cellular transmigration and agents for use therein
WO2007004869A2 (en) 2005-07-05 2007-01-11 Biotempt B.V. Treatment of tumors
EP1864692A1 (en) 2006-06-07 2007-12-12 Biotempt B.V. Use of peptides for the control of radiation injury
US20110082091A1 (en) * 2009-09-28 2011-04-07 Theramab Gmbh Method for Preclinical Testing of Immunomodulatory Drugs

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69840851D1 (de) * 1997-11-13 2009-07-09 Mowycal Lending Llc Kleine peptide und methoden zur behandlung von asthma und entzündungen

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