CZ20002938A3

CZ20002938A3 - Farmaceutické přípravky k cílené náhradě nedostatku estrogenu v centrálním nervovém systému

Info

Publication number: CZ20002938A3
Application number: CZ20002938A
Authority: CZ
Inventors: Vladimir Patchev; Michael Oettel; Ina Thieme; Sigfrid Schwarz; Wolfgang RÖMER
Original assignee: Jenapharm Gmbh & Co. Kg
Priority date: 1998-02-20
Filing date: 1999-02-10
Publication date: 2001-01-17
Also published as: PL342313A1; EP1056460B1; CN1291102A; EE200000477A; KR20010041107A; AU2920999A; NZ506049A; CZ291764B6; JP2002503694A; DE59907446D1; BG104689A; EA002707B1; WO1999042108A1; TR200002400T2; EP1056460A1; CA2321498A1; ATE252388T1; NO20004153L; HUP0100742A3; UA57830C2

Description

FARMACEUTICKÉ PŘÍPRAVKY K CÍLENÉ NÁHRADĚ NEDOSTATKU ESTROGENU V CENTRÁLNÍM NERVOVÉM SYSTÉMU

Oblast techniky

Vynález se týká použití vybraných steroidů k přípravě farmaceutických přípravků k cílené náhradě nedostatku estrogenu v centrálním nervovém systému (CNS) bez ovlivnění jiných orgánů nebo systémů. Tyto steroidy se vyznačují tím, že na rozdíl od systémově účinných přirozených a syntetických estrogenů, včetně 17a-estradiolu, mají selektivní neurotropní transkripční účinek podobný estrogenu.

Tyto steroidy jsou sloučeniny obecného vzorce I

(I) kde Ri představuje vodíkový atom, hydroxylovou skupinu nebo alkoxylovou skupinu s 1 až 5 C-atomy, R₂ je vodíkový atom, alkyl skupina s 1 až 5 C-atomy, acylskupina s 1 až 5 C• · atomy, seskupení obecného vzorce SO₂NRi₀Rii, přičemž Rio a Ru navzájem nezávisle znamenají vždy vodíkový atom, alkyl skupinu s 1 až 5 C-atomy nebo spolu s dusíkem skupinu pyrrolidinovou, piperidinovou nebo morp^o línovou, R3 představuje vodíkový atom nebo hydroxylovou skupinu, R4 znamená vodíkový atom, hydroxylovou skupinu nebo alkyl skupinu až do 5 C-atomů, R5 a R6 navzájem nezávisle pokaždé vodíkový nebo halogenový atom, R₇ je vodíkový atom nebo methyl skupina, Rs je vodíkový atom a hydroxylové skupina, oxoskupina nebo seskupení obecného vzorce CRi₂Ri3, ve kterých R12 a R13 představují vodíkový atom nebo halogenový atom nezávisle na sobě, Rg je methyl skupina nebo ethyl skupina, Z je C=C-dvojná vazba nebo substituovaný nebo nesubstutiovaný cyklopropanový kruh a seskupení >CRsRe buď je v poloze a nebo β, přičemž R₇ je v β poloze, jestliže RCRsRs je v poloze a a naopak.

Dosavadní stav techniky

Náhlé nebo pozvolné ubývání koncentrací estrogenu v organismu se může vyskytovat jak u žen tak také u mužů za fyziologických (přibývající stáří, menopauza) a patologických podmínek (gonadektomie, použití GnRH-analog jako doplňková rakovinová terapie).

K nej známějším klinickým symptomům úbytku extrogenu patří poruchy termoregulace ve formě návalu tepla, osteoporosy a zvýšené predispozice k srdečním a oběhovým onemocněním (Netter A., The menopause, v: Thibault C., Levasseur M.C., Hunter R.H.F. (eds.), Reproduction in Mammals and Man, Ellipses, Paris, 627-642, 1993).

Nejnovější klinické studie (van den Beld A. W. et al.,

The role of estrogens in physical and psychosocial wellbeing in elderly men, The Aging Male 1 (Suppl. 1), 54, 1998) přinesly jednoznačné důkazy pro pokles sérové hladiny estrogenu s přibývajícím stářím u mužů. Tím se zvýrazňuje existence a patofyzologická relevance syndromu nedostatku estrogenu u stárnoucích mužů.

Mozek představuje velmi důležitý cílový orgán účinku estrogenu. Estrogeny mají rozhodující fyziologický vliv na mnoho neurobiologických procesů. Jejich efekty lze klasifikovat do obecně dvou velkých skupin - organizačních a aktivačních (McEwen B. S. et al., Steroid Hormones as mediators of neural plasticity, J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 39: 223-232, 1991). Ty první se hlavně týkají pohlavně specifické organizace neurálních substátů během ranné ontogeneze. Druhá skupina zahrnuje specifické změny ve funkci neurální periody za vlivu koncentrace estrogenu, které jsou výsledkem fyziologické sekrece pohlavních žláz podle pohlavní zralosti. Aktivační efekty estrogenu v CNS se uplatňují mimo jiné při následujících fyziologických procesech:

pohlavně specifická regulace sekrece gonadotropinu (Fink G,, Gonadotropin secretion and its control. V: Knobil E., Neil J. D. (eds.), The Physiology of Reproduction, Raven Press, New York, 1349 - 1376, 1988), řízení sexuálního chování (Baum M. J. et al., Hormonal basis of proceptivity and receptivity in female primates, Arch. Sex. Behav. 6: 173-192, 1977), regulace neuroendokrinmní reagibility na stres ( Viau V., Meaney M. J., Variations in the hypothalamic-pituitaryadrenal response to stress during the estrous cycle in the rat, Endocrinology 129: 2503-2511, 1991), učení a retence vzorového chování s adaptivní relevancí

0 • 0 0 · • 0 • · 0 0 0 0 0 00 00 00 · (O'Neal M. F. et al., Estrogen affects performance of ovariectomized rats in a two-choice water-escape working memory task, Psychoneuroendocrínology 21: 51-65, 1996), zachování reakční připravenosti neurochemických mechanismů, které jsou nepostradatelné k zajištění bdělosti a adekvátního zpracování informace ( Fink G et al., Estrogen control of centrál neurotransmission: effects on mood, mental statě and memory, Cell Mol Neurobiol. 16: 325-344, 1996), dynamické změny hustoty interneuronálních kontaktů v mozkových strukturách s rozhodující rolí pro kognitivní výkon a emocionální status ( Wooley C. S., McEwen B. S., Estradiol mediates fluctuations in hippocampal synapse density during the estrous cycle in the adult rat. J. Neurosci. 12: 2549-2554, 1992).

Enormní neurotropní potenciál estrogenů se projevuje jejich schopností, indukovat expresi řady specifických genů CNS, jejichž produkty mají kritický význam pro přežití nervových buněk (Miranda R.C., Sohrabji F., Toran-Allerand C.D., Presumptive estrogen target neurons express mRNA for both the neurotrophins and neurotrophin receptors: a basis for potential development interactions of estrogen with the neurotrophins, Mol. Cell Neurosci. 4: 510-525, 1993), zajistit mnohotvárnost a kvalitu přenosu signálu v CNS (Luine V.N., Estradiol increases choline acetyltransferase activity in specific basal forebrain nuclei and projection areas of female rats, Exp. Neurol. 89: 489-490, 1985); (Weiland N., Glutamic acid and decarboxylase messenger ribonucleic acid is regulated by estradiol and progesterone in the hippocampus, Endocrinology 131: 2697-2702, 1992); (Bossé R., Di Paolo T., The modulation of brain dopamine and • · • · · · · · • · · • · · · * ·

GABAa receptors by estradiol: a clue for CNS changes occurring at menopause, Cell Mol. Neurosbiol. 16: 199-212,

1996) a zvýšit rezistenci nervových, buněk vůči patologickým působením (Goodman Y. et al., Estrogens attenuate and corticosterone exacerbates excitotoxicity, oxidative injury, and amyloid β-peptide toxicity in hippocampal neurons, J. Neurochem. 66: 1836-1844, 1996).

Klinické nálezy implikovaly nedostatek estrogenu jako přičinový faktor v patogenezi Alzheimerovy choroby a ukazují na možnost náhrady estrogenu, která by zamezila klinickým projevům respektive vývoji tohoto onemocnění ( Henderson V.W. et al., Estrogen replacement therapy in older women: comparisons between Alzheimer's disease cases and Controls, Arch. Neurol. 51: 896-900, 1994); (Paganini-Hill A., Henderson V.W., Estrogen deficiency and risk of Alzheimer's disease, Am. J. Epidemiol., 14: 256-261, 1994).

Řada neuropeptidů, jejichž genová transkripce je ovlivněna fyziologickým množstvím estrogenu (například oxytocin a arginin-vasopresin) hraje důležitou roli při řízení emocionálních komponent chování (Adan R.A., Burbach J.P., Regulation of vasopressin and oxytocin gene expression by estrogen and thyroid hormone, Progr. Brain Res. 92: 127136, 1992).

Zprávy z odborné literatury dokazují, že nedostatek estrogenu pochází ze zřejmého oslabení schopnosti organismu eliminovat reaktivní kyslíkové specie a volné radikály (Niki E., Nakano M., Estrogens as antioxidants. Methods Enzymol. 186: 330-333, 1990); (Lacort M. et al., Protective effects of estrogens and catecholestrogens against peroxidative • · ··· · • · · • · · · · · · ·

membrane damage in vitro, Lipids 30: 141-146, 1995). Přebytek volných radikálů se implikuje do mechanismů buněčných poškozeni ve více orgánech a systémech a souvisí tak s patogenezí neurodegenerativních onemocnění (Smith C.D. et al., Excess brain protein oxidation and enzyme dysfunction in normál aging and in Alzheimer's disease. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 10540-10543, 1991); Hastigs T.G., Zigmond M.J., Neurodegenerative disease and oxidative stress: insights from an animal model of Parkinsonism. V: Fiskum G. (ed.), Neurodegenerative Diseases, Plenům Press, Nex York, 37-46, 1996). Proto hraje náhrada estrogenu také přiměřenou roli ve smyslu zachování a zvýšení endogenní antioxidativní kapacity. (Behl C. et al., 17P~Estradiol protects neurons from oxidative stress-induced cell death in vitro, Biochem. Biophys. Res. Commun. 216: 473-482, 1995).

V současné přirozenými a vyskytuje ve způsobují silnou genitálního traktu době se provádí náhrada estrogenu syntetickými estrogeny, jejichž účinek se všech orgánech obsahujících receptory estrogenu, to znamená prakticky v celém těle. Protože však tyto estrogeny, i když v malých farmakologických dávkách, proliferaci buněk v tkáních ženského (endometriu) a v epitelu prsní žlázy, které se potom mohou zvrhnout do karcinogenní odlišnosti, je jejich použití pro terapii symptomů nedostatku estrogenu v CNS kvůli více kontraindikacím omezeno (Bernstein B.A., Ross R.K., Henderson B.E., Relationship of hormone use to cancer risk. J. Nati. Cancer Inst. Monograph 12: 137-147,

1992) .

Proliferační efekty estrogenů platí za bezprostřední rizikové faktory vzniku benigní hyperplasie prostaty a/nebo gynekomastie u mužů ( Knabbe C., Endokrime Therapie von • 4>

Prostataerkrankungen. V: Allolio B., Schulte H.M. (eds.), Praktische Endokrinologie, Urban & Schwarzenberg, Miinchen, 645-651, 1996).

Z tohoto důvodu se náhrada estrogenu u mužů nebrala nikdy vážně v úvahu i přes dokázané indikace.

Použiti přirozených a syntetických estrogenů se systémovým účinkem - to znamená ve všech orgánech a systémech těla - k léčeni neurodegenerativnich onemocněni je nárokováno v následujicich patentech:

US 4,897,389, US 5,554,601 a WO 95/12402, WO 97/03661, DE 43 38 314 Cl

- US 4,897,389 chrání použití estradiolu, estronu a estriolu, samotných nebo v kombinaci s gonadotropiny, androgeny, anabolickými androgeny nebo lidským růstovým hormonem, k léčení senilní demence, Parkinsonovy choroby, cerebrální atrofie Alzheimerovy choroby, cerebelární atrofie, senilního nebo přirozeného tremoru.

- US 5,554,601 a WO 95/12402 chrání použití estrogeních substancí, a to i takových, které vykazují malou sexuální aktivitu, k ochraně nervových buněk před progresivním poškozením a buněčnou smrtí, a k léčení neurodegenerativnich onemocnění. Jako příklad látky s nízkou sexuální aktivitou a neuroprotektivním účinkem se uvádí 17a-estradiol.

- WO 97/03661 chrání použití neestrogenních substancí, které ve své konstituci mají k zajišťování neuroprotekce minimálně dvě cyklické struktury, přičemž alespoň jedna z nich je terminální fenolový kruh a jejichž molekulová hmotnost je menší než 1000 Dalton.

• ·

- DE 43 38 314 Cl popisuje steroidy s fenolickou Akruhovou strukturou, jejichž vlastnosti vychytávat radikály a antioxidativní vlastnosti jsou nezávislé na míře účinnosti podobné estrogenu. Tyto sloučeniny mohou být použity k profylaxi a terapii poškozeni buněk, které je způsobeno radikály.

Ve všech těchto patentových dokumentech se má terapeutická a neuroprotektivni efektivita získaných substanci zakládat na jednom nebo více následujících konečných efektech:

- stimulace biosyntézy přirozených neuronálních růstových faktorů;

- stimulace aktivity enzymů syntetizujících acetylcholin respektive přijetí (uptake) substrátů syntézy acetylcholinu;

- přímá cytoprotekce zvýšením rezistence nervových buněk vůči odnětí výživných substrátů respektive růstových faktorů;

- zmenšení citlivosti nervových buněk vůči volným radikálům a reaktivním kyslíkovým speciím, které se mohou uvolnit v důsledku traumatického respektive neurotoxického působení.

Avšak v žádném z těchto uvedených patentů nebyly představeny steroidy se selektivními estrogenu podobnými neurotropními transkripčními efekty; to znamená takové, které při dávkování in vivo neukazují v reprodukčním systému žádný signifikantní biologický účinek a které ovlivňují transkripci na estrogenu závislých genů v CNS v módu podobném estrogenovému módu.

·· ··· ·

Zejména je třeba podtrhnout, že účinek 17a-estradiolu (látky, která vykazuje redukovanou estrogenitu v genitálním traktu (Clark J.H. et al., Effects of estradiol 17a on nuclear occupancy of the estrogen receptor, stimulation of nuclear type II sites, and uterine growth, J. Steroid Biochem. 16: 323-328, 1982)) popsaný v patentech US 5,554,601 a WO 95/12402, se vztahuje jenom na ochranu kultivačních nervových buněk před indukovanou buněčnou smrti odnětím potravy, přičemž relativní potence 17a-estradiolu nebyla vyhodnocována srovnáním s potencí 17p~estradiolu. Z toho lze vyvodit, že u dosud zveřejněných studií a patentů chybí důkazy pro selektivní neurotropní účinek 17a-estradiolu respektive jeho derivátů, zatímco 17βestradiol nevykazuje - jak známo - žádnou CNS selektivitu a tím může být odlišen jako estrogen se systémovým účinkem. Patentové dokumenty WO 97/03661 a DE 43 38 314 Cl interpretují cytoprotektivní účinek estrogenů pro konsekvence vlastností vychytávat radikály jejich terminálního fenolového A-kruhu. Disociovaný neurotropní účinek 17a-estradiolu, který je založen na ovlivnění transkripce genů citlivých na estrogen, nebyl studován ani v patentech ani oznámen v literatuře.

···· • · ·

Podstata vynálezu

Vynález si klade za úkol nalézt farmaceutické přípravky k cílené náhradě nedostatku estrogenu v centrálním nervovém systému (CNS) bez ovlivnění jiných orgánů nebo systémů.

Tato úloha je podle vynálezu řešena tak, že se používají vybrané steroidy k přípravě farmaceutických přípravků, které zajišťují náhradu nedostatku estrogenu v CNS aniž by ovlivňovaly jiné orgány nebo systémy.

Tyto steroidy se vyznačují tím, že oproti systémově účinným přirozeným a syntetickým estrogenům, inclusive 17aestradiolí^ mají selektivní neurotropní transkripční účinek podobný estrogenu.

Překvapivě bylo zjištěno, že zvolené steroidy při jejich užití podle vynálezu

- způsobují selektivní ovlivnění transkripce genů závislých na estrogenu v CNS a změny odpovídajících fyziologických parametrů;

- vykazují CNS-specifické transkripční efekty v takových dávkách, které nemají žádné biologické efekty v tkáních reprodukčního systému;

- vykazují CNS-specifické transkripční efekty při takových dávkováních, při nichž ani 17p-estradiol, ani 17a-estradiol nejsou účinné;

- a neovlivňují transkripce genů závislých na estrogenu v CNS účinkem sekundárně vytvořeného 17P~estradiolu.

Tyto steroidy jsou sloučeniny obecného vzorce I

4444 • 4 • · 44 • 4 44 44 44 • 4 4 · 4 4 4 4 • · 44 4 4 4 4

44 4 4 44

(I) kde Ri představuje vodíkový atom, hydroxylovou skupinu nebo alkoxylovou skupinu s 1 až 5 C-atomy, R₂ je vodíkový atom, alkyl skupina s 1 až 5 C-atomy, acylskupina s 1 až 5 C-atomy, seskupení obecného vzorce SO₂NRi_ORiiz přičemž Rio a Ru navzájem nezávisle vždy znamenají vodíkový atom, alkyl skupinu s 1 až 5 C-atomy nebo spolu s dusíkem skupinu pyrrolidinovou, piperidinovou nebo morfolinovou, R₃představuje vodíkový atom nebo hydroxylovou skupinu, R4 znamená vodíkový atom, hydroxylovou skupinu nebo alkyl skupinu až do 5 C-atomů, R₅ a R6 navzájem nezávisle pokaždé vodíkový nebo halogenový atom, R7 je vodíkový atom nebo methyl skupina, R₈ je vodíkový atom a hydroxylová skupina, oxoskupina nebo seskupení obecného vzorce CRi₂R_i3, ve kterých R_i2 a Ri₃ představují vodíkový atom nebo halogenový atom nezávisle na sobě, R9 je methyl skupina nebo ethyl skupina, Z je C=C-dvojná vazba nebo substituovaný nebo nesubstutiovaný cyklopropanový kruh a seskupení >CR₅R6 je buď v poloze a nebo β, přičemž R7 je v β poloze, jestliže >CRsR6 je v poloze a a naopak.

·· ···· ·· ·· ·♦.,·» φ · φ · · · · * · · · • ··· · ··· · » · · • ·.··'··»«·· • · · · · ·'·'·'··'· ·»·· 999 99 99 99 99

Upřednostněné sloučeniny jsou:

15βΗ,3 Ή-cykloprop[14,15]-estra-1,3,5(10),8-tetraen-3,17αdiol,

15βΗ, 3Ή-cykloprop[14,15]18a-homo-estra-l,3,5(10),8-tetraen3,17α-ο1,

17α-hydroxy-15βH,3 Ή-cykloprop[14,15]-estra-1,3,5(10),8tetraen-3-yl-pentanoat,

17-methylen-15βΗ,3'H-cykloprop[14,15]-estra-1,3,5(10),8tetraen-3-ol,

15βΗ,3 Ή-difluoro-cykloprop[14,15]-estra-1,3,5(10),8tetraen-3,17a-diol,

17-methylen-15βΗ,3 Ή-cykloprop[14,15]-estra-1,3,5(10) ,8tetraen-3-yl-sulfamat,

17-difluoromethylen-15βH,3 Ή-cykloprop[14,15]-estra1,3,5 (10),8-tetraen-3-ol,

3-methoxy- 15p-methyl-3 Ή-cykloprop [14,15] -estra-1,3,5(10),8tetraen-3-ol,

15a-methyl-3 Ή-cykloprop[14,15]-estra-1,3,5 (10),8-tetraen3,17a-diol,

17-dif luoromethylen-15PH, 3' H-cykloprop [14,15] -estra1,3,5(10) , 8-tetraen-3-yl-(tetramethylenimino)sulfonat, 17-methylen-3'H-cykloprop[8,9]-15βΗ,3'H-cykloprop[14,15]estra-1,3,5(10)-trien-3-ol.

Výhodnou úpravou vynálezu je použití sloučenin podle vynálezu k přípravě farmaceutických přípravků k profylaxi a terapii na stáří závislého snížení kognitivní výkonnosti, stářím podmíněné a perimenopausální dysforie, premenstruačního syndromu, neurózy a neurastenie, stavů úzkosti a úzkostných neuróz, návalů tepla v důsledku estrogenové deprivace (menopauza, gonadektomie, léčba s GnRH-analogy) a psychogenní zábrany sexuálního chování.

·· ···· 99 99 99 99 • 99 9 9 9 9 9 9 9 9

999 9 9 99 · · · · » · · · * · · · · 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9999 999 ·· 99 Ί» 9 99

Bylo zjištěno, že přitom může být naprosto vyloučeno riziko poškozeni tkáni senzitivních na hormony reprodukčního systému (endometrium, myometrium, prostata, prsní žláza), ve smyslu nekontrolované proliferace a karcinogeneze.

Předmětem předkládaného vynálezu jsou také farmaceutické přípravky k orální a parenterální, včetně topické, rektální, subkutánní, intravenosní, intramuskulární, intraperitonální, intranasální, intravaginální, intrabukální nebo sublingvální aplikaci, které kromě obvyklých nosičových a zřeďovacích prostředků obsahují jako účinnou látku sloučeniny vyznačené v nároku 1. Jako farmaceutické formy mohou nalézt použití:

- tablety nebo dražé od 0,1 do 2 mg denně orálně,

- ampule od 0,1 do 2 mg denně jako podkožní injekce,

- náplasti s transdermálním uvolňováním od 0,05 do 2 mg denně,

- podkožní implantáty s denní kapacitou uvolňování od 0, 05 do 2 mg,

- gely a krémy s transdermálním uvolňováním od 0,05 do 2 mg denně,

- bukálně aplikovatelné systémy s denním uvolňováním od 0,1 do 1 mg.

Tyto vynalezené léčivé látky se připraví známým způsobem s obvyklými pevnými nebo kapalnými nosiči nebo zřeďovacími prostředky a obvykle užívanými farmaceutickými technickými pomocnými látkami tak jak to odpovídá žádanému druhu aplikace s vhodným dávkováním.

·· »··♦ • · • ·*»

Příklady provedeni vynálezu

99 « » * · 99

9 9 9

99

9 9 9

99

Na příkladu

15βΗ,3'H~cykloprop[14,15]-estra1,3, 5(10), 8-tetraen-3,17a-diolu, (sloučenina obecného vzorce I: Ri = R₂ == R₃ - R₄ = Rs = R_s = R? = H; R₈ = α-ΟΗ, β-Η; R₉ = CH₃; Z = C=C-dvojná vazba) byl selektivní, estrogenu podobný účinek - dokumentováno dále v obrázcích jako prototypová substance - dokázán experimentálně porovnáváním 17βestradiolu a 17a-estradiolu.

Příklad 1

Vliv na hmotnost dělohy po chronické subkutánní aplikaci in vivo

Pohlavně dospělým (3 měsíce starým, hmotnosti 250 ± 30 g) krysím samičkám „Wistar (chov Schónwalde GmbH, Německo) byly operačně vyjmuty vaječníky pod ketaminovou narkózou. Po čtrnácti dnech byly zvířatům subkutánně implantovány minipumpy (Alzett, USA), které uvolňovaly denní dávku 0,01, 0,1, 0,3, 1, 3, 30 a 100 pg studované látky (15βΗ, 3Ήcykloprop[14,15]-estra-1,3,5(10),8-tetraen-3,17a-diolu) po sedm dní; kontrolní zvířata obdržela odpovídající objem vehikulu (propylenglykolu). Sedmý den léčení byla zvířata usmrcena a byla stanovena hmotnost dělohy za mokra (vztaženo na 100 g tělesné hmotnosti).

Obrázek 1 ukazuje uterotropní účinek různých dávek 17βestradiolu (čtverečky), 17a-estradiolu (kroužky) a 15βΗ,3·Ήcykloprop[14,15]-estra-1,3,5(10),8-tetraen-3,17a-diolu (trojúhelníky) u operovaných krys. Každý bod představuje střední hodnotu ± standardní odchylku (x ± SEM) 7-10 • ·

pokusných zvířat. Šrafováné pole ukazuje šířku rozptylu těchto parametrů u zvířat, kterým bylo podáváno placebo (OVX) .

Je zřejmé, že s 17p-estradiolem byla docílena signifikantní zvětšení dělohy již při denních dávkách 0,03 až 0,1 gg. Pro srovnatelný uterotropní efekt bylo třeba denních dávek 100 gg 17a-estradiolu respektive 30 gg substance 15βΗ, 3 Ή-cykloprop[14,15]-estra-1,3,5(10),8tetraen-3,17a-diol. Tento výsledek ukazuje, že účinnost 15βΗ, 3 Ή-cykloprop[14,15]-estra-1,3,5(10),8-tetraen-3,17adiolu v samičím genitálním traktu je asi tisíckrát menší než je u 17β-63ίΓβάϊο1η a je srovnatelná s účinností 17aestradiolu.

Příklad 2

Aktivace transkripce reporterového genu závislého na aestrogenovém receptoru in vitro.

Buňky rakoviny prsu MCF-7/2A, které exprimují aizoformu estrogenového receptoru (ERa), byly stabilně transfektovány reportérovým plazmidem EREwtcLUC. Reportér obsahuje estrogenovou odezvu elementu (ERE) vitellogeninu, promotor thymidinkinázy a gen kódující luciferázu z Photinus pyralis. Buněčná kultura byla po sedm dní před začátkem experimentu kultivována v prostředí bez steroidů a potom inkubována s 17β-estradiolem, 17a-estradiolem respektive substancí 15βΗ, 3 Ή-cykloprop [14,15] -estra-1, 3,5(10), 8tetraen-3,17a-diol ve čtyřech různých koncentracích (10¹¹, ΙΟ”¹⁰, 10“⁹ a 10⁸ M) po 48 hodin) . Buňky byly lyžovány a transkripce reporterového genu luciferázy byla získána

určením aktivity luciferázy specifickým testováním (Serva/Promega, Německo).

Obrázek 2 ukazuje indukci transkripce stabilně transfektovaného na estrogenu závislého reporterového genu (luciferázy) v receptorů estrogenu, exprimujícího rakovinné prsní buňky MCF-7, po 48 hodinovém léčeni různými dávkami 170-estradiolu (čtverečky), 17a-estradiolu (kroužky) a 15βΗ,3^zH-cykloprop[14,15]-estra-1,3,5(10),8-tetraen-3,17adiol (trojúhelníky). Vyobrazení představuje střední hodnotu ze dvou nezávislých pokusů.

Je zřejmé, že studované látky stimulují transkripci reportéru v závislosti na dávkách. Efektivita 15βΗ, 3Ήcykloprop[14,15]-estra-1,3,5(10),8-tetraen-3,17a-diolu a

17a-estradiolu je o jeden řád (to je 10 krát) nižší než 170-estradiolu.

Tento výsledek ukazuje, že substance 15βΗ, 3Ήcykloprop[14,15]-estra-1,3,5(10),8-tetraen-3,17a-diol má

několikrát estrogen.	slabší účinek v prsní rakovinné	tkáni	než
Příklad 3
Stimulace	transkripce oxytocinového genu v	mozku	po
chronickém	léčení in vivo dávkami, které nejsou	účinné	na
dělohu.

Pohlavně dospělým (3 měsíce starým, hmotnosti 250 ± 30

g) krysím samičkám „Wistar (chov Schónwalde GmbH, Německo) byly operačně vyjmuty vaječníky pod ketaminovou narkózou. Po čtrnácti dnech byly zvířatům subkutánně implantovány minipumpy (Alzett, USA), které uvolňovaly denní dávku 0,01,

ΦΦ φφ • « φ · • · · · • φ φ φ

Lactation as hypercorticalism:

0,1, a 1 pg zkoumané látky (15PH,3'H-cykloprop[14,15]~estra1,3,5 (10),8-tetraen-3,17a-diol, 17P-estradiol a 17aestradiol) po sedm dní; kontrolní zvířata obdržela odpovídající objem vehikulu (propylenglykolu). Bezprostředně po usmrcení zvířat byly stanoveny hmotnosti děloh za mokra ( vztaženo na 100 g tělesné hmotnosti). Messengerribonukleová kyselina (mRNA), která kóduje biosyntézu oxytocinu, byla hybridizací in šitu se specifickou radioaktivně značkovanou oligodeoxynukleotidovou sondou znázorněna podle etablované metody ((Fischer D. et al., a model of naturally reversible plasticity in the mechanism governing hypothalamo-pituitary-adrenal activity in the rat, J. Clin. Invest. 96, 1208-1215, 1995), 1995) v hypothalamickém jádře

Nucleus paraventricularis (PVN). Změny v transkripci genu oxytocinu podmíněné léčením byly kvantifikovány denzitometrickým měřením specifického signálu hybridizace uvnitř definované anatomické struktury.

Obrázek 3 ukazuje indukci transkriptů kódujících oxytocin (OT mRNA; horní grafika) v hypothalamickém paraventrikulárním jádře krys po ovariektomii po chronickém subkutánním léčení 17P~estradiolem (kroužky), 17aestradiolem (čtverečky) a 15PH,3'H-cykloprop[14,15]-estra1,3,5(10) , 8-tetraen-3,17a-diolem (trojúhelníky) po třech různých dávkováních. Spodní grafika ukazuje vlivy testovaných látek na hmotnost dělohy. Každý bod představuje x ± SEM z 5-7 jednotlivých stanovení. Stínované pole představuje šířku rozptylu příslušného parametru u krys léčených vehikulem (pomocným léčivem). Hvězdičky označují signifikantní rozdíly (p<0,05) ve srovnání s kontrolní skupinou (OVX).

Výsledky ukazují, že 15pH,3'H-cykloprop[14,15]-estra • · • · · · · 1 » · · • · · ·

1,3,5(10),8-tetraen~3,17a-diol stimuluje transkripci oxytocinového genu v PVN v závislosti na dávkách, přičemž stimulační efekt je velmi podobný jako u 17P~estradiolu. Ovšem neurotropní transkripční efekty u 15βΗ,3Ήcykloprop[14,15]-estra-1,3,5(10),8-tetraen-3,17a-diolu - na rozdíl od 17p-estradiolu - nejsou spojeny se zvětšením dělohy. V použitých dávkách neměl 17a-estradiol žádný vliv na koncentrace mRNA oxytocinu v hypothalamickém PVN.

Tyto výsledky dokumentují selektivní estrogenu podobný účinek 15βΗ,3 Ή-cykloprop[14,15]-estra-1,3,5(10),8-tetraen3,17a-diolu v mozku krysích samiček.

Příklad 4

Stimulace transkripce antiapoptózního genu bcl-2 v hipokampu po chronickém léčení in vivo dávkami, které nevykazují uterotropní účinek

Zkoumaný materiál pocházel ze zvířat, která byla léčena v pokusu popsaném v příkladu 3. Gen bcl-2 kóduje syntézu proteinu, který je zahrnut v kaskádě proliferace buněk a působí proti programované buněčné smrti (apoptóze) ( Merry D. E., Korsmeyer S. J., Bcl-2 gene family in the nervous systém, Ann. Rev. Neurosci. 20: 245-267, 1997). Transkripce tohoto genu je stimulována estrogeny ( Kandouz M. et al., Antagonism between estradiol and progestin on bcl-2 expression in breast cancer cells, Int. J. Cancer 68: 120125, 1996).

Gyrus dentalus je součástí hipokampální formace, ve které neurogeneze u krys přetrvává také ve věku dospělosti (Gould E. et al., Proliferation of granule cell precursors in the dentate gyrus of adult monkeys is diminished by stress, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 96: 3168-317, 1998) a • · · · • ·

IQ · »···♦·«· ± _e ···*·« «,···«·· ·· ** ·· bcl-2 je exprimován. Transkripty bcl-2 jsou představeny v mozkových řezech hybridizací in šitu specifickou oligonukleotidovou sondou (Clark R. S. B. et al.: Apoptosissuppressor gene bcl-2 expression after traumatic brain injury in rats, J. Neuřosci. 17: 9172-9182, 1997), a podle metody popsané v příkladu 3 byly denzitometricky kvant i f i kovány.

Obrázek ukazuje vliv tří různých dávek 17p~estradiolu (kroužky), 17a-estradiolu (čtverečky) a 15βΗ, 3Ήcykloprop[14,15]-estra-1,3,5(10),8-tetraen-3,17a-diolu (trojúhelníky) na expressi bcl-2 v gyrus dentatus hipokampu krys po ovariektomií; značky a zkratky jsou jako v předchozím obrázku 3.

Léčení substancí 15βΗ,3'H-cykloprop[14,15]-estra1,3, 5(10), 8-tetraen-3,17a-diol se projevilo na dávkách závislou stimulací exprese bcl-2 v gyrus dentatus. Efekt byl identický s efektem, který byl vyvolán stejnými dávkami 173~estradiolu. Substance 17a-estradiol neměla v použitém dávkování žádný efekt na transkripci bcl-2 - jak vidno z obrázku 4.

Tyto výsledky ukazují, že použité dávkování 15βΗ, 3Ήcykloprop[14,15]-estra-1,3,5(10),8-tetraen-3,17a-diolu ovlivňuje transkripci antiapoptického genu bcl-2 v CNS podle modu podobného estrogenu, aniž by se vyskytoval účinek na dělohu.

Příklad 5

Disociovaná indukce receptorů oxytocinu v mozku a v myometriu

Vazebná místa s identickými biochemickými • · « · ·<

·.» *· • · · t » · · · « · * « • · · · »· »♦ charakteristikami pro peptidový hormon oxytocin existují v myometriu a v CNS. V obou orgánech způsobuje akutní nebo chronické léčení estrogenem vzestup počtu (hustoty) oxytocinových receptorů. Mozkové struktury, v nichž tento parametr obzvlášť citlivě reaguje na estrogen, jsou nucleus interstitialis striae terminalis, nucleus ventromedialis a amygdaloidní jaderný komplex. Estrogenem podmíněná indukce oxytocinových receptorů v těchto strukturách je v kauzální relaci k formování prosociálních vzorů chování, mezi tím i sexuálního (Insel T. R., Oxytocin - a neuropeptide for affiliation: evidence from behavioral, receptor autoradiografic, and comparative studies, Psychoneuroendocrinology 17: 3-35 , 1992).

K určení hustoty oxytocinových receptorů v definovaných anatomických strukturách je zvolena metoda ( Kremarik P. et al., Histoautoradiografic detection of oxytocin- and vasopresin-binding sites in the telencephalon of the rat, J. Comp. Neurol. 333: 343-359, znázornění vazbou radioaktivně

1993) autoradiografického značkovaných antagonistů

125.

byly inkubovány s v koncentraci 50 pM autoradiogramy, které receptorů oxytocinu d (CH2) 5-Tyr (Me)², Thr⁴, Orn⁸-[¹²⁵] Tyr⁹vasotocin (¹²⁵I-OVTA) .

Zmrazené řezy mozku a dělohy krys po ovariektomii, které 7 dní dostávaly denní subkutánní dávku 1 μρ 15βΗ,3Ήcykloprop[14,15]-estra-1,3,5(10),8-tetraen-3,17a-diolu, 17βestradiolu, respektive 17a-estradiolu (srovnej příklad 3) X-OVTA (NEN Potom byly byly použity stanovení vazebných míst oxytocinu podle etablované metody (Panchev V. K. et al., Oxytocin binding sites in rat limbic and hypothalamic structures: site-specific modulation by adrenal and gonadal steroids. Neuroscience 57: 537-543,

1993).

DuPont, Německo) provedeny filmové k denzitometrickému

Obrázek 5 představuje specifickou vazbu ligandů značkovaných ¹²⁵I receptoru oxytocinu (¹²⁵I-OVT) v myometriu a ve dvou mozkových strukturách citlivých na estrogen, v hypothalamickém ventromediálním jádru (VMN) a v nucleus interstitialis striae terminalis (BNTS), po 7 denním léčení 17p-estradiolem (černé sloupce), 17a-estradiolem (šrafované sloupce) a 15βΗ,3Ή-cykloprop[14,15]-estra-1,3,5 (10),8tetraen-3,17a-diolem (šedé sloupce) v denních dávkách 1 gg. Hvězdičky znázorňují signifikantní rozdíly ( p < 0,05 ) ve srovnáni s krysami po ovariektomii, kterým bylo podáváno placebo (OVX). Grafika vpravo představuje efekty testovaných látek na proliferaci endometria. Každý sloupec reprezentuje x ± SEM ze 4-5 jednotlivých stanovení.

Výsledky tohoto studia jsou rovněž na obrázku 5. Léčením 17β-β3ί^άίο1βπι a 15βΗ,3Ή-αγ^ορτορ[14,15]-βείΓ31,3, 5(10), 8-tetraen-3,17a-diolem se dospělo k signifikantnímu vzestupu hustoty receptorů oxytoxinu ve všech zkoumaných mozkových strukturách, přičemž 15βΗ,3Ήcykloprop[14,15]-estra-1,3,5(10),8-tetraen-3,17a-diol v VMN vykázal slabší efekt než 17β-estradiol. Substance 17aestradiol nebyla při použitém dávkování účinná v žádné mozkové struktuře. V myometriu způsobil 17β-β3ύΓ3άϊο1 silnou indukci vazebných míst pro oxytocin, zatímco 17a*-estradiol a substance 15βΗ, 3 Ή-cykloprop[14,15]-estra-1,3,5(10),8tetraen-3,17a-diol vykázaly signifikantně menší účinek. Za podpory počítačového měření tloušťky endometria v preparátech dělohy se ukázalo, že denní dávka 1 gg 17βestradíolu působí signifikantní endometriální proliferaci, zatímco 15βΗ,3Ή-cykloprop[14,15]-estra-1, 3,5(10),8-tetraen3,17a-diol a 17a-estradiol v ekvivalentním dávkování tloušťku endometria neovlivňují.

• · • · · · · · • · • · ··

99

Výsledky pokusu 5 souhrnně ukazují, že substance 15βΗ,3Ήcykloprop [14,15] -estra-1., 3.,.5.(10), 8-tetraen-3,17a-diol ovlivňuje biochemický parametr - receptor oxytocinu - který je charakteristický jak pro reprodukční systém (myometrium), tak také pro CNS, převážně v centrálním nervovém systému, a tímto selektivním neurotropním účinkem se od přirozených estrogenů 17p~estradiolu a 17a-estradiolu odlišuje.

Příklad 6

Ovlivňování kognitivních funkcí po chronickém léčení

Je známo, že zmenšení koncentrací estrogenů je spojováno se snížením učebního a paměťového výkonu (Kopera H., Estrogens and psychic functions. Aging and estrogens. Front. Hormone Res. 2: 118-133, 1973).

Korelace mezi hladinou estrogenu v séru a kognitivní výkonností byla také dokázána na zvířecím pokusném modelu (Kondo Y., Suzuki K., Sakuma Y. Estrogen aleviates cognitive dysfunction following transient brain ischemia in ovariectomized gerbils, Neurosci. Lett. 238: 45-48, 1997).

K srovnávacímu studiu vlivu substance 15βΗ, 3Ήcykloprop[14,15]-estra-1,3,5(10),8-tetraen-3,17a-diol, 17βestradiolu a 17a-estradiolu na kognitivní výkonnost byly provedeny následující pokusy:

Pohlavně dospělým krysím samičkám „Wistar''' (o hmotnosti 240 ± 20 g) byly operačně vyjmuty vaječníky pod nembutalovou narkózou. Týden po operaci bylo započato s denním subkutánním podáváním substancí v následujících denních dávkách: 17p-estradiol, 1 pg; 17a-estradiol, 100 μς;

15βΗ, 3'H-cykloprop[14,15]-estra-1,3,5(10),8-tetraen-3,17adiol, 30 pg. Celková doba léčení byla 14 dní. 5. a 6. den ·· ·· • · - I

I · · · • · ► · · · · • · • · «· léčení se provádělo cvičení, aby se krysy naučily podmíněnému , chování escape podle etablované metody (Diaz-Veliz G. et al., Influence of the estrous cycle, ovariectomy and estradiol replecement upon the acquisition of conditioned avoidance responses in rats, Physiol. Behav. 46: 397-401, 1989). Každé zvíře bylo v jednom cvičení 50 krát exponováno kombinací jednoho nepodmíněného stimulu (elektrickým drážděním) a dvou podmíněných stimulů (světelným a zvukovým signálem). 7. den léčení byly testovány retence naučeného vzoru chování. Po 6 denním přerušení učení byla 14. den zjišťována extinkce naučeného podmíněného chování. Počet přesných reakcí chování ( útěk do bezpečného prostoru aparátu během tří sekund po prezentaci podmiňujícího signálu) z 50 po sobě jdoucích exposicí bylo použito jako kriterium pro vyhodnocení retence respektive extinkce naučeného chování.

Obrázek 6 ukazuje vliv 17P-estradiolu (černé sloupce), 17a-estradiolu ( šrafované sloupce) a 15βΗ,3Ήcykloprop[14,15]-estra-1,3,5(10),8-tetraen-3,17a-diolu (šedé sloupce) na akvizici a retenci nového vzoru chování u krys po ovariektomii (prázdné sloupce; OVX). Hvězdičky přestavují signifikantní rozdíly ve srovnání se zvířaty, kterým bylo podáváno placebo (OVX) příslušného testovacího dne. Byly zjištěny následující hmotnosti dělohy (x ± SEM; n = 8-10 na léčenou skupinu; údaje v mg/100 g KG) po 14 denním léčení: OVX, 53 ± 2; 17P-estradiol, 187 ± 9; 17a-estradiol, 100 ± 5; 15βΗ,3Ή-cykloprop[14,15]-estra-1,3,5(10),8tetraen-3,17a-diol, 108 ± 4.

Je zřejmé, že substance 15βΗ,3Ή-ογ^ορΓορ[14,15]estra-1,3,5(10),8-tetraen-3,17a-diol v použitém dávkování má estrogenu podobný stimulující efekt na retenci naučeného vzorového chování, přičemž uterotropní účinek je významně > · · · · • 9

9 99 *

• · menší, než účinek 170-estradiolu v denní dávce 1 gg. Tento výsledek dokazuje, že 15βΗ,3'H-cykloprop[14,15]-estra1,3, 5 (10), 8-tetraen-3,17cc-diol ovlivňuje kognitivní výkonnost jako estrogen, zatímco v reprodukčních orgánech vykazuje zanedbatelný proliferační účinek.

Příklad 7

Biotransformace 17a-hydroxy-14,15a-methylen-estra1,3, 5(10),8-tetraen-3-olu a 17a-estradiolu na 170-estradiol

Krysy po ovariektomii dostávaly denní subkutánní dávky 100 gg 17a-estradiolu, 30 gg 15βΗ,3'H-cykloprop[14,15]estra-1,3,5(10),8-tetraen-3,17a-diolu respektive 1 gg 170estradiolu po 7 dní ( srovnej příklad 6) . Poslední den léčení byly zjišťovány sérové koncentrace 170-estradiolu ve třech pokusných skupinách a byly porovnávány s kontrolními zvířaty , léčenými pomocnými látkami.

Obrázek 7 ukazuje hodnoty séra 170-estradiolu po 7 denním subkutánním léčení operovaných krys 17βestradiolem ( černé sloupce), 17a-estradiolem ( šrafované sloupce) a 15βΗ,3'H-cykloprop[14,15]-estra-1,3, 5(10),8tetraen-3,17a-diolem ( šedé sloupce) v udávaných dávkováních. Hvězdičky označují signifikantní rozdíly ve srovnání s hodnotami, které byly naměřeny u léčených zvířat, kterým bylo podáváno placebo; ty druhé byly pod prokazatelnou hranicí metody; každá skupina se skládala ze 7 zvířat.

Je zřejmé, že po aplikaci 170-estradiolu a 17aestradiolu ve zmíněných dávkováních jsou v séru registrovány měřitelné koncentrace 170-estradiolu. Chronické subkutánní ·· • 0

léčení 15βΗ,3 Ή-cykloprop[14,15]-estra-1,3, 5(10), 8-tetraen3,17a-diolem nezpůsobuje zvýšení endogenní hladiny 17βestradiolu. Tento výsledek ukazuje, že pozorované farmakologické efekty po podávání 153H,3'H-cykloprop[14,15]~ estra-1,3,5(10),8-tetraen-3,17a-diolu nevedou zpět k biotransformaci substance na 17β-θ5ίΓβάίο1.

Přehled obrázků na výkresech

Vynález je blíže vysvětlen prostřednictvím konkrétních příkladů provedení znázorněných na 7 obrázcích.

(Pozn. překladatele: texty nadpisů obr. 1-7 nejsou v originále)

Claims

?!/MM- Μ Μ

PATENTOVÉ NÁROKY ( I ) kde Ri představuje vodíkový atom, hydroxylovou skupinu nebo alkoxylovou skupinu s 1 až 5 C-atomy, R₂ je vodíkový atom, alkyl skupina s 1 až 5 C-atomy, acylskupina s 1 až 5 Catomy, seskupení obecného vzorce SO₂NRi₀Rii, přičemž Ri₀ a Ru navzájem nezávisle znamenají vždy vodíkový atom, alkyl skupinu s 1 až 5 C-atomy nebo spolu s dusíkem skupinu pyrrolidínovou, piperidinovou nebo morfolinovou, R₃představuje vodíkový atom nebo hydroxylovou skupinu, R₄znamená vodíkový atom, hydroxylovou skupinu nebo alkyl skupinu až do 5 C-atomů, Rs a R₆ navzájem nezávisle pokaždé vodíkový nebo halogenový atom, R₇ je vodíkový atom nebo methyl skupina, R₈ je vodíkový atom a hydroxylová skupina, oxoskupina nebo seskupení obecného vzorce CRi2Ri3r ve kterých R12 a Ri₃ představují vodíkový atom nebo halogenový atom nezávisle na sobě, R₉ je methyl skupina nebo ethyl skupina, • ·

-27··· · · ···· ·· ··· ··· ♦ ·· ·* ··

Z je C=C-dvojná vazba nebo substituovaný nebo nesubstituovaný cyklopropanový kruh a seskupení >CR5Rs je buď v poloze a nebo β, přičemž R·? je v β poloze, jestliže >CR₅R₆je v poloze a a naopak, k přípravě farmaceutických přípravků k cílené náhradě nedostatku estrogenu v centrálním nervovém systému (CNS) bez ovlivňování jiných orgánů nebo systémů.
2. Použití steroidů podle nároku 1, přičemž tyto steroidy jsou

15βΗ,3 Ή-cykloprop[14,15]-estra-1,3,5(10) , 8-tetraen-3,17adiol,

15βΗ,3Ή-cykloprop[14,15]18a-homo-estra-l,3,5(10),8-tetraen3,17a-ol,

17a-hydroxy-15βH,3Ή-cykloprop[14,15]-estra-1, 3, 5(10), 8tetraen-3-yl-pentanoát,

17-methylen-15βΗ,3 Ή-cykloprop[14,15]-estra-1,3,5(10),8tetraen-3-ol,

15βΗ, 3 Ή-difluoro-cykloprop[14,15] -estra-1, 3,5(10),8tetraen-3,17a-diol,

17-πΐΘϋΗγ1θη-15βΗ, 3 Ή-cykloprop [14,15] -estra-1, 3,5(10),8tetraen-3-yl-sulfamát,

17-άίί1ηο^ΐϊΐβί1ιγ1βη-15βΗ, 3 Ή-cykloprop [14,15] -estra1,3,5(10),8-tetraen-3-ol,
3-ιηθΐΗοχγ-15β-ιηβ1ϊιγ1-3 Ή-cykloprop [14,15] -estra-1,3, 5 (10), 8tetraen-3-ol,

15a-methyl-3 Ή-cykloprop[14,15]-estra-1,3,5(10),8-tetraen3,17a-diol,

17-dif ΙηοΓΟχηθΙΐΊγΙθη-ΙδβΗ, 3 Ή-cykloprop [14,15] -estra1,3,5(10),8-tetraen-3-yl-(tetramethylenimino)sulfonát,

-2817-me.thylen-3Ή-cykloprop[8,9] -150H,3Ή-cykloprop[14,15] estra-1,3,5(10)-trien-3-ol.

3. Použití steroidů podle nároku 1 a 2 k přípravě farmaceutických přípravků k profylaxí a terapii na stáří závislého snížení kognitivní výkonnosti, stářím podmíněné a perimenopausální dysforie, premenstruačního syndromu, neurózy a neurastenie, stavů úzkosti a úzkostných neuróz, návalů tepla v důsledku estrogenové deprivace (menopauza, gonadektomie, léčba GnRH-analogy), psychogenní zábrany sexuálního chování.