DE4338314C1

DE4338314C1 - Pharmazeutische Präparate zur Prophylaxe und Therapie radikalvermittelter Zellschädigungen

Info

Publication number: DE4338314C1
Application number: DE4338314A
Authority: DE
Inventors: Peter Dr Droescher; Bernd Dr Menzenbach; Kurt Prof Dr Ponsold; Bernd Dr Undeutsch; Michael Prof Dr Oettel; Wolfgang Prof Dr Roemer; Guenter Dr Kaufmann; Jens Schroeder
Original assignee: Jenapharm GmbH and Co KG
Current assignee: Jenapharm GmbH and Co KG
Priority date: 1993-11-10
Filing date: 1993-11-10
Publication date: 1995-03-30
Anticipated expiration: 2013-11-11
Also published as: EP0728004A1; US6172056B1; WO1995013076A1; JP2845625B2; AU8104194A; CA2176370C; JPH09507470A; CA2176370A1

Description

Die Erfindung betrifft neue pharmazeutische Präparate zur Prophylaxe und Therapie radikalvermittelter Zellschädigungen.

Aus der Fach- und Patentliteratur ist bekannt, daß reaktive Sauer stoffspezies (ROS), freie Sauerstoffradikale und weitere Radikalformen eine wichtige Rolle bei der Entstehung vielfältiger Zellschädigungen spielen, beispielsweise bei ischämischen und traumatischen Organver letzungen, Entzündungs- und Vergiftungsprozessen.

Auch bei Hirn- und Wirbelsäulenverletzungen, Schockzuständen, Schlaganfall, Muskeldystrophie, Emphysemen, ARDS, Asthma, Alte rungsprozessen, bei Gewebeschädigungen nach Myokardinfarkt, Vergiftungs- und Verstrahlungsschäden, Verbrennungen und transplan tationsbedingten Immunreaktionen ist ein negativer Einfluß von ROS, freien Sauerstoffradikalen und anderen Radikalformen zu verzeichnen. Dabei ist u. a. die Lipidperoxidation und die Oxidation von Low Density Lipoprotein (LDL)-Cholesterol in Verbindung mit irreversiblen Membran- und Endothelschädigungen Ausgangspunkt für solche radikalvermittel ten Zellschädigungen.

Es ist weiterhin bekannt, daß lipophile Substanzen, wie z. B. lipophile Steroide mit "radikalfangenden" Eigenschaften sich zur Prophylaxe und Therapie radikalvermittelter Zellschädigungen eignen können.

Im Unterschied zu den bekannten niedermolekularen phenolischen An tioxidantien werden diese lipophilen Steroide mit gewisser Selektivität in die Region der Zellmembran bzw. des Endothels transportiert und können dort ihre Wirksamkeit entfalten.

Der therapeutische Nutzen wird dabei vom Wirkungsspektrum der je weiligen Substanz bestimmt.

WO-PS 87/01706; WO-PS 91/11453; EP-PS 0389 368; EP-PS 0389 369; EP-PS 0389 370 und FR-PS 2 640 977 beschreiben beispielsweise Steroide mit "radikalfangenden" Eigenschaften.

WO-PS 87/01706; WO-PS 91/11453; EP-PS 0389 368/ . . . 369/ . . . 370 be schreiben Steroide, die am terminalen Kohlenstoff-Atom der C-17-Sei tenkette eine Aminogruppe enthalten, die substituiert bzw. Bestandteil eines heterocyclischen Ringsystems sein kann.

In FR-PS 2 640 977 wird ein Strukturtyp aufgezeigt, der am C-11-Atom in β-Position einen substituierten Phenylring aufweist.

In J. Phys. Org. Chem. 3 (1990), 309-315 wird dargestellt, daß Estrogene, speziell Catecholestrogene, als Radikalfänger agieren kön nen. Estradiol, Estron, Estriol und 2-Hydroxy-estradiol hemmen die Peroxidation in vitro und in vivo.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue pharmazeutische Prä parate mit hoher Wirksamkeit zur Prophylaxe und Therapie radikal vermittelter Zellschädigungen zu finden.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß pharmazeuti sche Präparate gefunden wurden, bestehend aus Steroiden mit pheno lischer A-Ring-Struktur, ausgenommen die in ihrer diesbezüglichen Wirkung bekannten Estrogene 17β-Estradiol, Estron, Estriol und deren 2-Hydroxy-Derivate sowie Steroide mit cyclischen Substituenten oder mit einer Aminogruppe am terminalen C-Atom der aliphatischen C-17- Seitenkette, und pharmazeutischen Hilfsstoffen.

Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind dabei die im Anspruch 2 aufgeführten Verbindungen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch pharmazeutische Präparate zur oralen und parenteralen, incl. topischen, rektalen, subcutanen, intravenösen, intramuskulären, intraperitonealen, intrana salen, intravaginalen, intrabukkalen oder sublingualen Applikation, die neben üblichen Träger- und Verdünnungsmitteln eine im Anspruch 1 oder 2 aufgezeigte Verbindung als Wirkstoff enthalten.

Die Arzneimittel der Erfindung werden mit den üblichen festen oder flüssigen Trägerstoffen oder Verdünnungsmitteln und den üblicher weise verwendeten pharmazeutisch-technischen Hilfsstoffen entspre chend der gewünschten Applikationsart mit einer geeigneten Dosierung in bekannter Weise hergestellt.

Die Vorteile der Erfindung ergeben sich im wesentlichen dadurch, daß neue pharmazeutische Präparate zur Prophylaxe und Therapie radikal vermittelter Zellschädigungen gefunden wurden,

- mit Wirkstoffen, deren Wirkprofil sich von dem der bekannten weiter oben erwähnten Estrogene sowie von dem des Vitamin E unterschei det und/oder
- mit Wirkstoffen, die eine hohe Wirksamkeit bezüglich der Hemmung der Lipidperoxidation und LDL-Oxidation in vitro besitzen, im Vergleich zu den erwähnten Estrogenen, zum U-78517F und zum Vitamin E.

Die vorteilhafte Wirkung der erfindungsgemäßen Systeme als Inhibitoren der Lipidperoxidation und LDL-Oxidation werden in Tabelle 1 und Tabelle 2 demonstriert.

Als Vergleiche zu den erfindungsgemäßen Systemen dienten 17β- Estradiol, Estriol, U-78517F und Vitamin E, ebenfalls in Tabelle 1 und Tabelle 2 dargestellt und mit (x) gekennzeichnet.

Die Messung der In-vitro-Hemmwirkung auf die Lipidperoxidation wurde mittels des Thiobarbitursäuretestes vorgenommen.

Mit der Aussage zu den IC₅₀-Hemmwerten wird die lipidperoxida tionshemmende Wirkung der jeweiligen Verbindung charakterisiert. IC₅₀ gibt die Menge der zuzugebenden Substanz an, um eine 50%ige Hemmung der Lipidperoxidation zu erzielen (Tabelle 1).

Die Messung der In-vitro Hemmwirkung auf die LDL-Oxidation wurde nach ESTERBAUER et al. (1988): Effect of peroxidative conditions on human plasma low density lipoproteins. In: Eicosanoids, lipid peroxida tion and cancer (Hrsg. Nigam et al.), S. 203-214, Springer-Verlag Ber lin, Heidelberg, New York, vorgenommen.

Die in Tabelle 2 aufgeführten Werte für eine Hemmung der LDL-Oxida tion stellen Beispiele für Herz-Kreislauf-Aktivitäten dar.

Aussagen zur Estrogenität werden über die Messung der Estrogen-Re zeptor-Bindung getroffen.

Die Messung der Estrogen-Rezeptor-Bindung erfolgt durch kompetitive Bindung des ³H-markierten synthetischen Estrogens Ethinylestradiol und der zu testenden Verbindungen am Estrogen-Rezeptor im Uterus- Cytosol des infantilen Kaninchens bei 0°C. Dabei werden Reaktions gleichgewicht und Rezeptorsättigung angestrebt.

Aus Konzentrationsreihen, die die jeweilige IC₅₀ einschließen, werden die IC₅₀ für die Standardsubstanz 17β-Estradiol und für die zu testen de Verbindung ermittelt (Regressionsrechnung nach logit-log-Trans formation) und als Quotient dieser beiden Werte die relative Bin dungsaffinität (RBA) angegeben.

Mit der Aussage zu den RBA-Werten wird die Estrogen-Rezeptor-Af finität der jeweiligen Verbindung charakterisiert, die unter Berücksich tigung bestimmter Voraussetzungen für In-vitro-Untersuchungen (z. B. freie 3-OH-Gruppe) ein Maß für die Estrogenität ist (ebenfalls Tabelle 1).

Tabelle 1

Lipidperoxidationshemmung und Estrogen-Rezeptor-Affinität aus gewählter Verbindungen

LDL-Oxidations-Hemmwirkungen ausgewählter Verbindungen (5 µmol)
Verbindung
LDL-Oxidationshemmwirkung (Verlängerung der Iag-Phase in min)
17β-Estradiol (x)
110
ent-Estradiol	120
8-Dehydro-estradiol	120
Estriol (x)	45
U-78517F (x)	70
3-Hydroxy-1,3,5(10)-estratrien-17S-spirooxiran	170
3-Hydroxy-1,3,5(10),9(11)-estratetraen-17S-spirooxiran	210

Es ist aus Tabelle 1 ersichtlich, daß die radikalfangenden Eigenschaf ten unabhängig sind von der Estrogenität der jeweiligen Verbindungen. Beispielsweise ist die In-vitro-Hemmwirkung auf die Lipidperoxidation für ent-Estradiol genauso hoch wie für 17-Epi-estradiol, jedoch die Estrogenität signifikant unterschiedlich.

Weiterhin ist Tabelle 1 und Tabelle 2 zu entnehmen, daß die erfin dungsgemäß ermittelten Verbindungen sowohl eine Lipidperoxidations- hemmende als auch eine LDL-Oxidations-hemmende Wirkung in vitro besitzen, die höher ist als die des Vitamin E bzw. in der Größenord nung oder besser, als die des 17β-Estradiols, Estriols und U-78517F liegt.

Weiterhin wurde gefunden, daß konjugierte Doppelbindungen, wie die 6-, 8- und 9(11)-Doppelbindung ebenso wie die 8(14)-Doppelbindung, zur erheblichen Steigerung der Lipidperoxidations- und der LDL-Oxida tions-Hemmung führen.

Die erfindungsgemäßen Präparate stellen sowohl Inhibitoren der Lipid peroxidation als auch Inhibitoren der LDL-Oxidation dar und sind des halb geeignet zur Prophylaxe und Therapie radikalvermittelter Zell schädigungen wie beispielsweise beim spinalen Trauma, des ischämi schen (thromboembolischen) Schlaganfalls, der Ischämie, des Organ schadens in der Reperfusionphase nach Transplantationen, den chro nisch-degenerativen Erkrankungen des ZNS, der Senilen Demenz vom Alzheimer-Typ (SDAT), des Asthma, der muskulären Dystrophie und degenerativer neurologischer Krankheiten u. a. in Form von ZNS-Intoxi kations- bzw. Degenerationszuständen.

Die erfindungsgemäßen Präparate erweisen sich ebenfalls als vorteil haft zur Prophylaxe und Therapie solcher durch radikalvermittelte Zellschädigungen hervorgerufenen Erkrankungen, wie die multiple Sklerose, die Skin Graft Reaction, Akute Pankreatitis, Lebernekrosen (z. B. virale Hepatitis), der hämorrhagische, traumatische und septische Schock, Entzündungszustände, wie die osteo- oder rheumatoide Arthri tis, adjuvante Arthritis, Arthrose, das nephrotische Syndrom (immunologisch), das systemische Lupus erythematosis, die Adriamycin-induzierte Herztoxizität und neuroprotectiven Hirntumoren.

Die erfindungsgemäßen Präparate eignen sich auch zur Prophylaxe und Therapie derartiger durch radikalvermittelte Zellschädigungen her vorgerufenen Erkrankungen, wie allergische Reaktionen, die Atherosklerose, die Entzündung unter dermatologischen, inflammatorischen und psoriatischen Bedingungen, der Stress-induzierte Ulcer, Migräne, die maligne Hyperthermie, das hypoxische Syndrom, das ischämische Bowel-Syndrom und die Reduzierung der notwendigen Dosis bei der therapeutischen Anwendung radikalabbauender Enzyme, wie z. B. Superoxiddismutase und Catalase.

Weiterhin sind die erfindungsgemäßen Arzneimittel als antitumorale Wirksubstanzen einsetzbar und eignen sich für die prophylaktische und therapeutische Behandlung von Herz- und Kreislauf-Krankheitszustän den.

Untersuchungen zur pharmakologischen Wirksamkeit der "radikal fangenden" Substanzen

Die Testung der Substanzen auf die Hemmwirkung bezüglich der Lipid peroxidation wurde mittels des Thiobarbitursäuretestes folgenderma ßen durchgeführt:

Reaktionsansatz

1 ml biologische Probe (cont. 0,1 mg Plasmamembranen) incl. Fentons Reagenz und Testsubstanz.

Die 1 ml Gesamtvolumen teilen sich auf in 0,01 bis 0,02 ml synaptoso male Membranfraktion; 0,1 ml Eisen(II)-chlorid (2 mmol); 0,1 ml Was serstoffperoxid (2 mmol), auf 1 ml auffüllen mit 0,9% NaCl (nicht PBS) und Ethanol oder DMSO als Vehikel der Testsubstanz.

Prozedere

Der Reaktionsansatz wird 30 min bei 37°C inkubiert, anschließend mit 2 ml Reagenz A abgestoppt und 10 min bei konstanten 80°C inkubiert.

Nach Abkühlen in einem Eisbad (19 min) wird die Probe in einer Kühl zentrifuge zentrifugiert (1000 x g; 4°C). Der Überstand wird (bis zu 2 h stabil) bei 535 nm gegen den Blindwert gemessen, der bis auf die Membranfraktion alle Reagenzien enthält.

Als Vergleichswert dient der Ansatz, der neben der Membranfraktion NaCl sowie im gegebenen Falle Vehikel mit gleichen Anteilen erhält.

Zusammensetzung des Reagenz A

15% (w/v) Trichloressigsäure (15 g); 0,375% (w/v) Thiobarbitursäure (375 mg); 0,25 mol/l HCl (2,11 ml konz. HCl) in 100 ml wäßriger Lösung.

Prüfsubstanzen

Die Prüfsubstanzen werden vorzugsweise in Ethanol als 20 millimolare Stammlösungen angesetzt und entsprechend verdünnt. Geprüft wird im Dosierungsbereich 1-150 µmol.

In allen Versuchsansätzen wird eine entsprechende Standardsubstanz mitgeführt.

Bewertungsparameter

- Dosis-Wirkungsanalyse der Prüfsubstanzen.
- Ermittlung der Lipidperoxidationshemmwerte mit mindestens fünf Substanzkonzentrationen im Hemmbereich 30 bis 70%, bezogen auf die Testwerte ohne Substanzeffekt.

Die Testung der Substanzen auf die Hemmwirkung bezüglich der LDL- Oxidation nach der Methode von Esterbauer et al. (1988) wurde folgen dermaßen ausgeführt:

Reaktionsansatz

2 ml biologische Probe (cont. 0,5 mg LDL, isoliert aus humanem Voll blut, incl. 10 µmol CuSO₄ sowie 1 bis 150 µmol Testsubstanz und Et hanol als Vehikel der Testsubstanz im zellfreien Medium PBS.

Prozedere

Der Reaktionsansatz wird bei RT über einen Zeitraum von mindestens 8 h inkubiert und spektralphotometrisch (Absorptionsmaximum des oxidierten LDL liegt bei 234 nm) verfolgt. Entsprechend den bei der Meßwellenlänge von 234 nm registrierten Extinktionsveränderungen in Gegenwart bzw. Abwesenheit von Testsubstanzen bzw. in der Gegen überstellung des nativen zum oxidierten LDL werden definitive Aussa gen zur Beeinflussung des oxidierten LDL durch Testsubstanzwirkung ermöglicht.

Prüfsubstanzen

Bewertungsparameter

- Dosis-Wirkungsanalyse der Prüfsubstanzen.
- Ermittlung der LDL-Oxidations-Hemmwerte, ausgewiesen als Verzö gerung der LDL-Oxidation in Form einer zeitlich verlängerten Iag- Periode (min).

Claims

1. Pharmazeutische Präparate zur Prophylaxe und Therapie radikalvermittelter Zellschädigungen, bestehend aus Steroiden mit phenolischer A-Ring-Struktur,
ausgenommen

- die Estrogene Estradiol, Estron, Estriol und deren 2-Hydroxy-Derivate,
- Steroide mit cyclischen Substituenten oder mit einer Aminogruppe am terminalen C-Atom der aliphatischen C-17-Seitenkette,

und pharmazeutischen Hilfsstoffen.

2. Pharmazeutische Präparate nach Anspruch 1 mit zusätzlicher konjugierter Doppelbindung oder 8(14)-Doppelbindung.