CZ177395A3

CZ177395A3 - Pharmaceutical compositions used for prevention and treatment of cancer diseases and process for preparing such compositions

Info

Publication number: CZ177395A3
Application number: CZ951773A
Authority: CZ
Inventors: Gyula Kulcsar
Original assignee: Immunal Kft
Priority date: 1993-11-09
Filing date: 1994-11-08
Publication date: 1996-01-17
Also published as: DE69429806D1; SE521049C2; PL309600A1; ES2094702B1; ATA900894A; EP0679081B1; AU682735B2; FI953369A0; SE9502474L; HU9303171D0; CA2151826C; KR100363779B1; WO1995013061A1; AT408414B; EP0679081A1; CA2151826A1; RU2138257C1; NL195007C; NL9420013A; PL177981B1

Description

Předložený vynález se týká farmaceutických přípravků pro prevenci a léčbu rakovinových chorob a způsobu jejich přípravy.

Dosavadní stav techniky

V terapii rakoviny jsou nejčastěji používanými metodami metody chirurgické, ozařovací a chemoterapeutické /The Pharmacological Basis of Therapeutics, Pergamon Press, lne.

New York, str. 1202-1263 /1990/» Harison's Principles of Internal Medicine, 12.vyd., International Edition, McGrawHill, lne., New York, Vol.2, str. 1587-1599 /1991/» Scientific American Medicine, Scientific American, lne., New York, Vol.2, 12/V/, str. 1-14/1984//. V ozařovací terapii, se vedle široce používané ionizace používají fototerapie a lokální hypertermie spojená s ozařováním a chemoterapií ve speciálních případech, např. při rakovině kůže. Podle svých účinků, původu a struktur je možno mezi těmito látkami nalézt pro chemoterapii alkylační činidla, rostlinné alkaloidy, antibiotika, antimetabolity, jiná léčiva /např. asparaginásu/ a často používané různé hormony. Nově používané Strategie v chemoterapii jsou následující: kombinační chemoterapie» dlouhodobé, nízkodávkové venozní nebo arteriální infuze chemoterapeutických léčiv pro snížení toxicity» vysokodávková chemoterapie pro překonání rezistence k léčivům a tentýž typ terapie spojený s autologní transplantací kostní dřeně» chemoterapeutická léčiva spojená s modifikátory biologické odezvy» použití adjuvantní a neoadjuvantní chemoterapie pro větší účinek. Nejčastěji používané modifikátory biologické odezvy jsou: interferony, faktor tumorové nekrozy, lymfokiny, např.interleukin-2 a monoklonální protilátky. Různé dietetické metody, slabě dráždivě sérové přípravky a Simontonova metoda za použití psychogenních efektů patří k metodám léčby, které se aplikují

-2v současné době při léčbě nádorových chorob, jejichž účinnost není dostatečně prokázána.

Nejcharakterističtějšími nevýhodami v současnosti aplikovaných metod popsaných výše, jsou: významné vedlejší účinky, nízká nádorová specifita, vývoj rezistence a omezený rozsah účinnosti.Nejtoxičtější léčiva používaná v terapii rakoviny nerozlišují mezi neoplastickými a normálně proliferujíčími buňkami» proto, aby se zabránilo jakémukoliv nevratnému poškození vitální hostitelovy tkáně /např. kostní dřeně, intestina/, musí být léčiva podávána v dávkách, které jsou obvykle nedostatečné pro odstranění všech přítomných neoplastických buněk /Pharmac.Ther. 49, 43-54 /1991// Ozařovací terapie může způsobit radiační poškození a současně není účinná u hypoxiálních buněk a určitých typů tumorů. Leči va používaná v chemoterapii mají také různé toxické vedlejší účinky. Mohou poškozovat centrální nervový systém, hematopoietické orgány, mukozní membrány žaludku a střev a všechny proliferující buňky. Dále mohou poškozovat ledviny, játra, plíce a srdeční sval. Téměř všechna účinná protinádorová činidla jsou imunosupresivní /Proč.Roy.Soc.Med., 63, 10631066 /1970//. Mnoho z nich má teratogenní nebo karcinogenní účinky, příležitostně vyvolávají neplodnost nebo zvýšení frekvence druhotné tvorby tumorů. Je obtížné nebo nemožné ovlivnit 60-70 % tumorů chemoterapií a během léčby se může vyvinout rezistence nebo křížová rezistence.

Bohužel léčení využívající modifikátory biologické odezvy za využití vlastního obranného mechanismu organismu mají podobné nevýhody, protože byly shledány účinnými jen u málo typů tumorů a mimoto mají také toxické vedlejší účinky /Harrison's Principles of internal Medicine, 12.vyd., Interna tional Edition, McGraw-Hill, lne. New York, Vol.2,str.15871599 /1991//. Interferony také mají mnoho a obtížných nežádoucích účinků, mezi než např. patří kardiotoxicita /Chest, 99, 557-561 /1991//. Podobně, naděje spojené s monoklonálními protilátkami při realizace také zklamávají /Eur.J.Cancer,

27, 936-939 /1991//. I když od roku 1980 bylo registrováno

-3více než čtyřista klinických zkoušek s imunoterapií, nebyla dosud zavedena žádná jako léčba pro jakýkoliv typ rakoviny /J.R.Soc.Med., 84, 321 /1991//.

PCT publikace č. WO 86/025555 se týká léčiva používaného při léčbě rakovinových onemocnění, zahrnujícíhoL-cystein, L-methionin, L-histidin, L-fenylalanin, L-lysin, L-tryptofan, L-valin, L-leucin, L-threonin, kyselinu L-jablečnou a lyselinu L-askorbovou. Kyselina L-jablečná a L-askorbová působí jako aktivátory pufru a stabilizují aminokyseliny v jejich kyselé formě a tak působí modifikaci hodnoty krevního pH v kyselém rozsahu pod 6,8. V této publikaci nejsou žádné údaje, potvrzující zastavení růstu nebo i regresi maligních tumorů.

Publikovaná japonská patentová přihláška č. 62-135421 se týká aminokyselinového transfuzního roztoku, obsahujícího specifické aminokyseliny, s výjimkou L-isoleucinu, schopného vykazovat inhibiční působení na multiplikaci tumorů. Možný, ale neprokázaný účinek tohoto přípravku by mohl být založen na restrikci aminokyseliny, např. isoleucinu.

Cílem předloženého vynálezu je připravit farmaceutické přípravky, obsahující přírodní substance pro odstranění nevýhod -např. toxicity, nízké specifity a omezeného rozsahu účinnosti- známých přípravků a metod tumorové terapie.

Podstata-, vynálezu

Vynález je založen na zjištění pasivního obranného systému /zde nazývanémo pasivní protinádorový obranný systém Passive Antitumour Defence System /PADS// proti tumorovým buňkách v různých organismech. Tento systém je schopen zničit vznikající a již existující tumoróvé buňky. Substance, které se účastní v PADS jsou endogenní a exogenní

-4přírodní substance, vyskytující se v oběhovém systému_fjmenovitě aminokyseliny, vitaminy, nukleové báze, karbohydrá£y a buněčné metabolické produkty, bylo zjištěno, že při použití alespoň tří z těchto substancí, které jsou složkami oběhového systému a mohou tak dosahovat a zasahovat do všech buněk - tyto synergicky zvyšují vliv každé z nich samotné a jsou tak schopny zničit tumorové buňky.

Vynález je dále založen na zjištění, že díky synergismu zde bude významný kvalitativní rozdíl mezi normálními a tumorovými buňkami v jejich chování k součástem PADS, čímž se stávají rozlišitelnými dva typy buněk. Zatímco klasický imunitní systém může rozpoznávat a selektivně ničit tumorové buňky díky jejich vnějším odchylkám od normálních buněk, nový rozpoznánýíimechanismus pasivrnbQ antitumorováio obranného mechanismu může působit totéž v souvislosti s vnitřními odchylkami.

Vynález je dále založen na zjištění, že díky zvýšení koncentrace svých složek v cirkulačním systému na takový stupeň, že jsou nadměrně dávkovány do tumorových buněk, působí výše uvedený přípravek fatální metabolický stres selektivně v rakovinových buňkách.

Vynález je nakonec založen na poznatku, že v závislosti na aplikované dávce a způsobu aplikace, může být dosaženo prevence nebo protinádorového účinku v různých tumorových buňkách. V případě různých typů tumorů, které se liší od normálních buněk v různých stupních, může být stanoveno kva-/,· litativní a kvantitativní složení co nejúčinnější směsi za použití synergismu jako kriteria.

-5Na základě výše uvedeného se vynález týká farmaceutických přípravků pro prevenci a léčbu rakovinových chorob, které obsahují alespoň tři sloučeniny, vyskytující se v oběhovém systému: alespoň jednu aminokyselinu, alespoň jeden vitamin a alespoň jeden člen vybraný ze skupiny, zahrnující adenin, 2-deoxy-D-ribosu, D-mannosu, D-glukosoarain, kyselinu jablečnou, oxaloctovou kyselinu, adenosin trifosfát a/nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli, s tou podmínkou, že jestliže přípravek obsahuje mimo aminokyseliny/kyselin/ pouze kyselinu jablečnou a vitamin, může vitamin být pouze jiný než kyselina askorbová. Přípravky mohou také obsahovat nosiče, ředidla a/nebo jiné pomocné složky používané ve farmacii.

Přípravek podle vynálezu může obsahovat L-methionin, E-tryptofan, L-tyrosin, L-fenylalanin, L-arginin, L-histidin, N-benzoylglycin a/nebo jejich soli jako aminokyselinu a d-biotin, pyridoxin, riboflavin, riboflavin-5'-fosfát, L-skorbovou kyselinu, lipoovou kyselinu, orotovou kyselinu a/nebo jejich sůl jako vitamin.

Preferovaný přípravek podle vynálezu obsahuje L-tryptofan, L-askorbovou kyselinu, alespoň jeden člen vybraný ze skupiny, zahrnující adenin, 2-deoxy-D-ribosu, D-glukosamin a/nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli.

Jiný preferovaný přípravek podle vynálezu obsahuje L-arginin, riboflavin-5'-fosfát, alespoň jeden člen vybraný ze skupiny, zahrnující D-mannosu, jablečnou kyselinu, adenosin trifosfát a/nebo jejich farmaceuticky přijatelné sole.

Další preferovaný přípravek podle vynálezu obsahuje 30-44 % hmotn. L-argininu, 27-35 % hmotn. riboflavin-5'-fosfátu, 38-62 % hmotn. kyseliny jablečné a/nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí.

-6Další výhodné provedení podle vynálezu obsahuje0,002 až 70 % hmotn. alespoň jednoho člena skupiny, zahrnující L-methionin, L-tryptofan, L-tyrosin, L-fenýlalanin, L-arginin, L-histidin, N-benzoylglycin a/nebo jejich soli jako aminokyselinu, 0,0004 až 80 % hmotn. alespoň jednoho ze členů skupiny, zahrnující d-biotin, pyridoxin, riboflavin, riboflavin-5-fosfát, kyselinu L-askorbovou, kyselinu lipoovou, ky selinu orotovou a/nebo jejich soli jako vitamin a 0,003 až 80 % hmotn. alespoň jednoho zečlenů skupiny, zahrnující adenin, 2-deoxy-D-ribosu, D-mannosu, D-glikosamin, kyselinu jablečnou, kyselinu oxaloctovou, adenosin trifosfát a/nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli.

Další preferovaný přípravek podle vynálezu zahrnuje 0,9 až 25 % hmotn. L-methioninu, 0,8-19 % hmotn. L-tryptofanu, 0,9 % až 46 % hmotn. d-biotinu, 1,2 až 16 % hmotn. pyridoxinu, 0,03 až 42 % hmotn. riboflavin-5'-fosfátu,

0,05 až 18 % hmotn. D-glukosaminu, 0,5 až 60 % hmotn. 2-deoxy-D-ribosy, 0,7 až 68 % hmotn. kyseliny jablečné,

0,6 až 40 % hmotn. D-mannosy a/nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí.

Velmi účinný přípravek podle vynálezu obsahuje 0,005 až 34 % hmotn. L-methioninu, 0,002 až 25 % hmotn. L-tryptofanu, 0,02 až 23 % hmotn. L-tyrosinu, 0,04 až 30 % hmotn. L-fenylalaninu, 0,04 až 50 % hmotn. L-argininu, 0,03 až 34 % hmotn. L-histidinu, 0,05 až 22 % hmotn. N-benzoylglycinu, 0,01 až 60 % hmotn. d-biotinu, 0,01 až 20 % hmotn. pyridoxinu, 0,0004 až 45 % hmotn. riboflavinu, 0,0005 až 45 % hmotn. riboflavin-5-fosfátu, 0,003 až 70 % hmotn. L-askorbové kyseliny, 0,004 až 15 % hmotn. kyseliny lipoové, 0,01 až 17 % hmotn. kyseliny orotové, 0,001 až 10 % hmotn.adeninu, 0,01 až 63 % hmotn. 2-deoxy-D-ribosy, 0,08 až 42 % hmotn. Drmannosy, 0,05 až 20 % hmotn. D-glukosaminu, 0,01 až 80 % hmotn.kyseliny jablečné, 0,02 až 60 % hmotn.

-7kyseliny oxalšňavelové, 0,001 až 10 % hmotn. adenosin trifosfátu a/nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí.

Dalším objektem vynálezu je způsob přípravy výše uvedeného přípravku, který zahrnuje smísení složek z aktivních sloučenin, vyskytujících se v oběhovém systému a to alespoň jedné aminokyseliny, alespoň jednoho vitaminu a alespoň jednoho člena vybraného ze skupiny, zahrnující adenin, 2-deoxy-D-ribosu, D-mannosu, D-glukosamin, kyselinu jablečnou, kyselinu oxaloctovou, adenosin trifosfát a/nebo jejich farmaceuticky přijatelné sole, na farmaceutický přípravek. S aktivním přípravkem mohou být také smíseny nosiče, ředidla a/nebo jiná pomocná činidla běžně užívaná ve farmacii, v množství nezbytném pro doplnění hmotnosti kompozice na 100 %.

Preferované provedení způsobu podle vynálezu zahrnuje smísení L-tryptofanu, kyseliny L-askorbové, alespoň jednoho člena ze skupiny, zahrnující adenin, 2-deoxy-D-ribosu, Dglukosamin a/nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli za vzniku farmaceutického přípravku.

Další preferované provedení způsobu podle vynálezu zahrnuje smísení L-argininu, riboflavin-5'-fosfátu, alespoň jednoho člena vybraného ze skupiny, zahrnující D-mannosu, kyselinu jablečnou, adenosin trifosfát a/nebo jejich farmaceuticky přijatelné sole, za vzniku farmaceutického přípravku .

Další preferovaná verze provedení vynálezu zahrnuje smísení 30 až 44 % hmotn. L-argininu, 27-35 % hmotn. riboflavin-5'-fosfátu, 38-62 % hmotn. kyseliny jablečné a/nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí, za vzniku farmaceutického přípravku.

-8Preferovaná verze provedení způsobu podle vynálezu zahrnuje smísení 0,002 až 70 % hmotn. alespoň jednoho člena skupiny, zahrnující L-methionin, L-tryptofan, L-tyrosin, L-fenylalanin, L-arginin, L-histidin, N-benzoylglycin a/nebo jejich soli jako amunokyselinu, 0,004 až 80 % hmotn. alespoň jednoho člena skupiny, zahrnující d-biotin, pyridoxin, riboflavin, riboflavin-5*-fosfát, L-askorbovou kyselinu, lipoovou kyselinu, orotovou kyselinu a/nebo jejich sůl jako vitamin a 0,003 až 80 % hmotn.alespoň jednoho člena skupiny, zahrnující adenin, 2-deoxy-D-ribosu, D-mannosu, D-glukosamin, kyselinu jablečnou, kyselinu oxaloctovou, adenosin trífosfát a/nebo jejich farmaceuticky přijatelné sole pro přípravu farmaceutického přípravku.

Další preferovaná verze provedení způsobu podle vynálezu zahrnuje smísení 0,9 až 25 % hmotn. L-methioninu, 0,8 až 19 % hmotn. L-tryptofanu, 1,1 až 48 % hmotn. L-argininu, 0,9 až 46 % hmotn. d-biotinu, 1,2-16 % hmotn. pyridoxinu, 0,03 až 42 % hmotn. riboflavin-5'-fosfátu, 0,05 až 18 % hmotn. D-glukosaminu, 0,5 až 60 % hmotn. 2-deoxy-D-ribosy, 0,7 až 68 % hmotn. kyseliny jablečné, 0,6 až 40 % hmotn. D-mannosy a/nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí pro přípravu farmaceutického přípravku.

Vysoce preferované provedení způsobu podle vynálezu zahrnuje smísení 0,005 až 34 % hmotn. L-methioninu, 0,002 až 25 % hmotn. L-tryptofanu, 0,02 až 23 % hmotn. L-tyrosinu,

0,04 až 30 % hmotn. L-fenylalaninu, 0,04 až 50 % hmotn. L-argininu, 0,03 až 34 S hmotn. L-histidinu, 0,05 až 22 % hmotn. N-benzoylglycinu, 0,01 až 60 % hmotn. d-biotinu, 0,01 až 20 % hmotn. pyridoxinu, 0,0004 až 45 % hmotn. riboflavinu, 0,0005 až 45 % hmotn. riboflavin-5'-fosfátu, 0,003 až 70 % hmotn. kyseliny L-askorbové, 0,004 až 15 % hmotn. kyseliny lipoové, 0,01 až 17 % hmotn. kyseliny orotové, 0,001 až 10 % hmotn. adeninu, 0,01 až 63 % hmotn. 2-deoxy-D-ribosy, 0,08 až 42 % hmotn. D-mannosy, 0,05 až 20 % hmotn. D-glukosaminu, 0,01 až 80 % hmotn. kyseliny jablečné, 0,02 až 60 % hmotn.“kyseliny

-9oxaloctové, 0,001 až10 % hmotn. adenosin trifosfátu a/nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí, pro přípravu farmaceutického přípravku.

Pro terapeutické použití přípravky podle vynálezu jsou vhodně formulovány do farmaceutických přípravku tak, že se po smísení s netoxickými inertními, pevnými nebo kapalnými nosiči, ředidly, pojivý a/nebo jinými aditivy obvykle používanými ve farmaceutickém průmyslu pro enterální nebo parenterální podání, převedou na jednu z obvyklých lékových forem. Nosiče, ředidla a pojivá vhodná pro výše uvedené účely jsou např. voda, želatina, laktosa, sacharosa, škrob, pektin, kyselina stearová, stearát hořečnatý, talek, různé rostlinné oleje jakož i glykoly jako je propylenglykol nebo polyethylenglykol. Farmaceutická aditiva a pomocné látky jsou např. chránící činidla jako je methyl-4-hydroxybenzoát, různé přírodní nebo syntetická emulgáční, dispergační a smáčecí činidla, barvící a ochucovací činidla, pufrovací substance jakož i činidla, promotující desintegraci nebo disoluci a další substance zlepšující požadovaný účinek.

Obvyklé formy léčiv jsou orální přípravky jsou orální přípravky připravené za použití výše uvedených farmaceutických přísad; tyto přípravky mohou být v pevné formě, např. tablety, kapsle, prášky, dražé, pilule nebo granule, nebo v kapalné formě, např. sirupy, roztoky, emulze nebo suspenze, dále ve formě čípků jakož i parenterálních přípravků, např. injektovatelných roztoků nebo infuzí.

Preferovaná denní dávka přípravků podle vynálezu závisí na mnoha faktorech jako je charakter léčené choroby, stav pacienta, způsob podání atd. Výhodně činí denní dávka 30 až 3000 mg/kg tělesné hmotnosti. V souladu s.tím je vhodné podávat denně 1-4 tablety, kapsle nebo dražé, obsahujících každé 0,2 až 3 g aktivní kompozice nebo 0,5 až 3 1 infuzních roztoků, obsahujících 10 až 200 g/1 aktivní kompozice.

-10Vynález se dále týká způsobu prevence a léčby rakovinových chorob. Tato metoda zahrnuje podání terapeuticky účinného množství kompozice podle vynálezu léčenému pacientovi.

Vynález bude dále blíže osvětlen v následujících tabulkách, obrázcích a příkladech. Používané buňky byly získány z American Type Culture Collection /Rockville, MD, USA/.

Tabulka 1 představuje vliv na zabíjení tumorových buněk a synergickou spolupráci složek kompozic podle příkladů 1-20, obsahujících čtyři a pět aktivních komponent, popř. na Sp2/0-Agl4 myelomových buňkách /ATCC CRL 1581/.

Tabulka 2 představuje, podle příkladů 21-37, zvýšení účinku kompozice, obsahující .pět aktivních komponent na Sp2/0-Agl4 buňky, jestliže se přidají další komponenty.

Popis výkresů na připojených obrázcích

Obr.l představuje vlivy a synergické působení složek kompozic, obsahujících čtyři a pět aktivních komponent, podle př. 1-20.

Obr. 2 zahrnuje in vitro efekty kompozic, obsahujících pět aktivních komponent podle příkladů 102 až 106 a kompozic, obsahujících dvacetjedna aktivních komponent podle příkladů 107 až 111 na Sp2/0-Agl4 myších myelomových buňkách ve srovnání s odpovídající kontrolní směsí.

Obr. 3 představuje vliv kompozic, obsahujících dvacetjedna aktivních komponent podle příkladu 107 na Sp2/0-Agl4 myších myelomových buňkách jako funkci času ve srovnání s neošetřenými buňkami a vhodnou kontrolní směsí.

Obr.4 představuje in vitro účinky kompozic, obsahujících dvacetjedna aktivních složek podle příkladů 107 až 111 na K-562 buňkách lidské leukemie /ATCC CCL 243/ ve .srovnání ⁸

-11odpovídajícími kontrolními směsmi.

Obr.5 představuje in vitro účinky kompozic, obsahujících dvacetjedna aktivních komponent podle příkladů 107 až 111 na HeLa buňkách lidské, y epitheloidníírakoviny cervixu _e /ATCC CCL 2/ ve srovnání s odpovídajícími kontrolními směsmi.

Obr.6 představuje in vitro účinky kompozic, obsahujících dvacetjedna aktivních komponent podle příkladů 107 až 111 na Hep-2 lidský epidermoidní karcinom, larynx buňky /ATCC CCL 23/ ve srovnání s odpovídajícími kontrolními směsmi.

Obr. 7 představuje in vitro účinky kompozic, obsahujících dvacetjedna aktivních komponent podle příkladů 107 až 111 na buňkách ledvin /ATCC CCL 81/ ve srovnání s odpovídajícími kontrolními směsmi.

Obr. 8 představuje in vivo efekty kompozic, obsahujících dvacetjedna aktivních komponent podle příkladů 112 na tumoru vyvi nutém z Sp2/0-Agl4 buňkách myšího myelomu, injektovaných i.p. BALB/c myši ve srovnání s odpovídající kontrolní skupinou.

Obr. 9 představuje in vivo efekty kompozic, obsahujících dvacent jedna aktivních komponent podle příkladu 112 na pevném tumoru vyvinutém pod kůží z HeLa buněk lidského epitheloidního karcinomu cervixu, injektovaných s.c. BALB/c /nu/nu/ myši ve srovnání s odpovídající kontrolní skupinou.

Pro následující pokusy bylo použito: v případě Sp2/0Agl4 a K-562 buněk RPMI 1640 medium /Sigma Chemie GmbH,

D-8024 Deisenhofen, Německo, výrobní číslo: R 6504/, v případě HEp-2, HeLa a Věro buněk MEM medium /Sigma Chemie GmbH, výrobní číslo: M 4655/.

'·· i

-12Přiklady provedení vynálezu

Příklady 1-37

Do zařízení opatřeného míchadlem byly naváženy účinné složky v daných množstvích, potom se k získané'spráškové směsi přidají množství hydrogenuhličitanu sodného uvedená v tabulkách 1 a 2, nezbytná pro neutralizaci složek typu kyseliny.Za nepřetržitého míchání se přidá vhodné medium ke směsi pro doplnění hmotnosti kompozice na 100 %. Účinky roztoků připravených tímto způsobem jsou uvedeny v tabulkách 1 a 2 a na obr. 1.

Příklady 38 -67

Postupuje se jako v příkladech 1-37 s tím rozdílem, že se pro neutralizaci složek typu kyseliny použijí vhodná množství hydrogenuhličitanu draselného. Účinky roztoků připravených tímto způsobem se významně neliší v žádném případě od účinků roztoků z příkladů 1-37 uvedených v tabulkách 1 a 2 a na obr. 1.

Příklady 68-97

Postupuje se podle příkladů 1-37 s tím rozdílem, že se pro neutralizaci složek kyselinového typu použijí vhodná množství uhličitanu vápenatého místo hydrogenuhličitanu sodného. Účinky roztoků připravených tímto způsobem se výrazně neliší v žádném případě od účinků roztoků z příkladů 1-37 uvedených v tabulkách 1 a 2 a na obr. 1.

-13Příklady 98-101

Postupuje se podle příkladů 23,24, 27 a 28 s tím rozdílem, že se použije 0,053 % hmotn. hydrochloridů L-argininu, 0,052 % hmotn. L-histidin-thydrochloridu, 0,009 % hmotn. hydrochloridu L-methioninu a 0,025 % hmotn. hydrochloridů L-tyrosinu místo L-argininu, L-histidinu, L-methioninu a L-tyrosinu použitých v příkladech 23, 24, 27 a 28. Odpovídající množství hydrogenuhličitanu sodného byla v každém případě 0,054 % hmotn. Účinky takto připravených roztoků se významně neliší v žádném ze svých účinků od účinků roztoků z příkladů 23, 24, 27 a 28 uvedených v tabulce 2.

Příklad 102

Do zařízení opatřeného míchadlem se naváží 0,01 % hmotn. L-tryptofanu, 0,034 % hmotn. 2-deoxy-D-ribosy, 0,003 % hmotn. kyseliny jablečné, 0,007 % hmotn. kyseliny L-askorbové a 0,091 % hmotn. hydrogenuhličitanu sodného. Za nepřetržitého míchání se k této směsi přidá vhodné medium pro doplnění hmotnosti přípravku na 100 %. Účinek roztoku připraveného tímto způsobem je uveden na obr. 2 jako 100% přípravek.

Příklad 103

Postupuje se podle příkladu 102 s tím rozdílem, že se z každé složky naváží pouze 80 %. Potom se k této směsi přidá vhodné medium pro doplnění hmotnosti kompozice na 100 %. Účinek takto připraveného roztoku je uveden na obr.2 u 80% kompozice.

Příklad 104

Postupuje se podle příkladu 102 s tím rozdílem, že se z každé složky navážé pouze 60 % množství. Potom se přidá vhodné medium pro doplnění hmotnosti přípravku na-100 %.

'· J

-14Účinek-takto připraveného roztoku je uveden na obr.2 u 60% kompozice.

Příklad 105

Postupuje se podle příkladu 102 s tím rozdílem, že se navá ží pouze 40 % množství z každé složky. Potom se přidá vhodné medium pro doplnění hmotnosti přípravku na 100 %. Účinek roztoku připraveného tímto způsobem je uveden na obr.2 u 40% kompozice.

Příklad 106

Postupuje se podle příkladu 102 s tím rozdílem, že se naváží z každé složky pouze 20 % množství. Potom se přidá vhodné medium pro doplnění hmotnosti kompozice na 100 %.

Účinek roztoku připraveného tímto způsobem je uveden na obr.

u 20% kompozice.

Příklad 107

Do zařízení opatřeného míchadlem se naváží 0,011 % hmotn. L-methioninu, 0,01 % hmotn. L-tryptofanu, 0,036 % hmotn. L-tyrosinu, 0,041 % hmotn. L-fenylalaninu, 0,044 % hmotn. L-argininu, 0,039 % hmotn. L-histidinu, 0,089 % N-benzoylglycinu, 0,007 % hmotn. kyseliny L-askorbové, 0,012 % hmotn. d-biotinu, 0,010 % hmotn. pyridoxinu, 0,0004 % hmotn. riboflavinu, 0,006 % hmotn.riboflavin-5'-fosfátu, 0,006 % kyseliny lipoové, 0,017 % hmotn. kyseliny orotové, 0,003 % hmotn. adeninu, 0,034 % hmotn. 2-deoxy-D-ribosy, 0,90 % hmotn. D-mannosy, 0,053 % hmotn. D-glukosaminu, 0,065 % hmotn. kyseliny jablečné, 0,040 % kyseliny oxaloctové,

0,0015 % adenosin trifosfátu a 0,087 % hmotn. hydrogenuhličitanu sodného. Za míchání složek se ke směsi přidá vhodné medium pro doplnění hmotnosti kompozice na 100 %. Účinek připraveného roztoku tímto způsobem je uveden na obr.2,3,4,5,6 a 7 u 100% kompozice.

-15Příklad 108

Postupuje se podle příkladu 107 s tím rozdílem, že se naváží pouze 80 % množství každé ze složek. Přidá se vhodné medium k této směsi pro doplnění hmotnosti kompozice na 100 %. .Účinek tohoto roztoku je uveden na obr. 2,3,4,5,6 a 7 jako 80% kompozice.

Příklad 109

Postupuje se podle příkladu 107 s tím rozdílem, že se naváží pouze 60 % množství každé ze složek. Potom se přidá vhodné medium pro doplnění hmotnosti kompozice na 100 %.

Účinek roztoku připraveného tímto způsobem je uveden na obr. 2,3,4,5,6 a 7 jako 60% kompozice.

Příklad 110

Postupuje se podle příkladu 107 s tím rozdílem, že se naváží pouze 40 % každé složky. Potom se k této směsi přidá vhodné medium pro doplnění hmotnosti přípravku na 100 %. Účinek tohoto roztoku, připraveného tímto způsobem je uveden na obr. 2,3,4,5,6 a 7 jako 40% kompozice

Příklad 111

Postupuje se podle příkladu 107 s tím rozdílem, že se naváží pouze 20 % každé složky. Potom se k této směsi přidá vhodné medium pro doplnění hmotnosti kompozice na 100 %.

Účinek roztoku připraveného tímto způsobem je uveden na obr. 2,3,4,5,6 a 7 jako 20% kompozice.

Příklad 112 j {

Do zařízení opatřeného míchadlem se naváží 1,47 % hmotn. L-methioninu, 1,01 % hmotn. L-tryptofanu, 0,036 % hmotn

-16L-tyrosinu, 1,63 % hmotn. L-fenylalaninu, 1,71 % hmotn. L-argininu, 1,53 % hmotn. L-histidinu, 0,18 % hmotn. N-benzoylglycinu, 1,94 % hmotn. L-askorbové kyseliny, 1,21 X hmotn. d-biotinu, 2,02 % hmotn. pyridoxinu, 0,038 % hmotn. riboflavinu,

0,05 % hmotn. riboflavin-5'-fosfátu, 0,02 % hmotn. kyseliny lipoové, 0,09 % hmotn. kyseliny orotové, 0,068 % hmotn. adeninu, 1,32 % hmotn. 2-deoxy-D-ribosy, 1,8 % hmotn. D-mannosy,

1,1 % hmotn. D-glukosaminu, 1,32 % hmotn. kyseliny jablečné, 0,040 % hmotn. kyseliny oxaloctové, 0,11 % hmotn. adenosin trifosfátu, 1,34 % hmotn. hydrogenuhličitanu sodného, a 0,04 % hmotn. hydrogenuhličitanu draselného. Za nepřerušovaného míchání s k této směsi přidá 83,168 % hmotn. pufru, obsahujícího 0,02 % hmotn. KHjPO^ a 0,3 % hmotn. .i^HPO^· Účinek takto připraveného roztoku ;ja použitého při léčbě zvířat je uveden na obr. 8 a 9.

Příklad 113

Do mixéru se naváží 20 % hmotn. L-tryptofanu, 62 % hmotn. kyseliny L-askorbové a 18 % hmotn. D-glukosaminu. Po promísení se výsledná prášková směs použije pro preventivní pokusy.

Příklad 114

Postupuje se podle příkladu 113 s tím rozdílem^ že se použije 32 % hmotn. L-argininu, 28 % hmotn. riboflavin-5 fosfátu a 40 % hmotn. kyseliny jablečné.

Příklad 115

Postupuje se podle příkladu 113 s tím rozdílem, že se použije 23 % hmotn. L-tryptofanu, 0,2 % hmotn. pyridoxinu,

17,8 % hmotn. N-benzoylglycinu a 59 % hmotn. kyseliny oxaloctové.

-17Příklad 116

Postupuje se podle příkladu 113 s tím rozdílem, že se použije 19 % hmotn. L-tyrosinu, 61 % hmotn. kyseliny L-askorbové, 0,2 % hmotn. adeninu a 19,8 % hmotn L-histidinu.

Příklad 117

Postupuje se podle příkladu 113 s tím rozdílem, že se použije 31 % hmotn. L-methioninu, 53 % hmotn. d-biotinu,

0,2 % Hmotn. adeninu a 15,8 % hmotn. kyseliny orotové.

Příklad 118

Postupuje se podle příkladu 113 s tím rozdílem, že se použije 27 % hmotn. L-fenylalaninu, 33 % hmotn. riboflavinu,

0,2 % hmotn. adenosin trifosfátu a 39,8 % hmotn. D-mannosy.

P5íklad 119

Postupuje se podle příkladu 113 s tím rozdílem, že se použije 32 % hmotn. L-histidinu, 9 % hmotn. kyseliny lipoové a 59 % hmotn. 2-deoxy-D-ribosy.

Příklad 120

Postupuje se podle příkladu 113 s tím rozdílem, že se použije 12 % hmotn. L-argininu, 11 % hmotn. pyridoxinu a 77 % hmotn. kyseliny jablečné.

Příklad 121

Do mixéru se naváží 10 % hmotn. L-methioninu, 3 % Hmotn.

I

L-tryptofanu, 0,2 % hmotn. L-tyrosinu, 10,9 % hmotn. L-fenylalaninu, 22,7 % hmotn. L-argininu, 10 % hmotn. L-histidinu, 1,1 % hmotn. N-benzoylglycinu, 11,9 % hmotn. kyseliny askorbové, 0,1 % hmotn. d-biotinu, 0,2 % hmotn. pyridoxinu, 0,05 % hmotn. riboflavinu, 0,35 % hmotn. riboflavin-5'-fosfátu,

-180,1 % kyseliny lipoové, 0,6 % hmotn. kyseliny orotové, 0,3 % hmotn. adeninu, 0,9 % hmotn. 2-deoxy-D-ribosy, 11,5% hmotn. D-mannosy, 7 % hmotn. D-glukosaminu, 8 % hmotn. kyseliny jablečné, 0,4 % hmotn. kyseliny oxaloctové a 0,7 % hmotn. adenosin trifosfátu. Po intenzivním míšení se výsledná prášková směs použije pro preventivní experimenty.

Účinky kompozic z příkladů 1-37 a synergické působení aktivních složek /ve srovnání s účinky složek samotných/ byly hodnoceny na Sp2/0-Agl4 myších myelomových buňkách.

V pokusech byly použity nejnovější metody popsané ve vědecké literatuře. V případě Sp2/0-Agl4 a K562 linií, byly logarimetricky rostoucí buňky získány z media a resuspendovány v 96-jamkových plotnách používaných pro buněčné kultury na konečnou koncentraci 4x10 Sp2/0-Agl4 buněk a 2 x 10 K562 buněk, ve 250 /Ul vhodného media na jamku, obsahujícího testované materiály v uvedených koncentracích. V případě HeLa, HEp-2 a Věro buněk, byly kultivované buňky sklizeny ze 75% splývající tkáňové kultury s 0,2 % trypsinu a byly resuspendová ny ve vhodném mediu na hustotu 10 buněk/ml. Podíly /100 /ul/ byly rozděleny na 96-jamkové mikroplotny a 24 hodin inkubovány. Potom bylo medium odloženo a nahrazeno 250 ^ul čerstvého media, obsahujícího testované sloučeniny v uvedených koncentracích. Všechny typy buněk byly ponechány prolif erovat 48 hodin. Počet životaschopných Sp2/0-Agl4 a K562 buněk byl pak spočten mikroskopicky vylučovací metodou s barvivém trypanovou modří. Přežívající HeLa, HEp-2 a Věro buňky byly měřeny vyhodnocením aktivity endogenní alkalické fosfatázy buněk. Výsledky byly hodnoceny za použití Studentova testu. Údaje za průměrnými hodnotami v tabulkách a značky na obrázcích znamenají: standardní průměrnou odchylku /standard error of mean SEM/.

První sloupec v tabulce 1 představuje číslo příkladu, druhý číslo kontrolního pokusu a v dalších šesti sloupcích

-19jsou uvedena množství složek použitých v pokusech a vyjádřených v % hmotn. Kontrolní směsi byly složeny ze stejných množství chemicky podobných ale farmakologicky neúčinných substancí /0,026 % hmotn. L-serinu, 0,033 % hmotn. L-asparaginu, 0,029 % hmotn. L-valinu, 0,018 % hmotn. L-alaninu,

0,006 % hmotn. glycinu, 0,059 % hmotn. trimethylglycinu a 0,006 % hmotn. L-prolinu jako aminokyselin; 0,017 % hmotn. hydrochloridu thiaminu, 0,006 % hmotn. niacinu, 0,019 % hmotn. kyseliny folové ve formě sodné soli, 0,001 % hernívápenaté soli kyseliny D-pantothenové, 0,012 % hmotn. uracilu a 0,0008 % hmotn. kyseliny oktanové jako vitaminy; 0,003 % hmotn. hypoxanthinu, 0,038 % hmotn. D/-/ribosy, 0,090 % hmotn. glukosy, 0,055 % hmotn. N-acetyl glukosaminu, 0,081 % hmotn. dvojsodné soli kyseliny jantarové, 0,080 % hmotn. dvojsodné soli kyseliny fumarové a 0,0015 % trojsodné soli guanosin trifosfátu/ jako aktivní kompozice. Dva poslední sloupce představují účinky přípravků, obsahujících čtyři a pět aktivních složek a účinky složek per se /kontrolní pokusy/, počet buněk po 48 hodinách inkubace a množství buněk vyjádřené v procentech množství neošetřených buněk /množství neošetřených buněk je 100 %/. V případě L-tryptofanu například 2-4h kontrolní pokusy představují účinky 0,002, 0,006 a 0,01 % hmotn. L-tryptofanu samotného na počet buněk. V případě příkladů 2-4 je uveden efektu L-tryptofanu použitého ve stejných množstvích, ale aplikovaného spolu s dalšími čtyřmi aktivními ingrediencemi.

Z údajů v posledních dvou sloupcích tabulky 1 je zřejmé, že za použití výše uvedených substancí samotných žádná z nich nevykazuje účinek zabíjení tumorových buněk; ve skutečnosti použití udaných množství L-tryptofanu i slabě zvyšuje proliferaci buněk. Současně je z údajů ve sloupcích zřejmé, že je pochybné, zda každá substance zvyšuje účinek .dalších čtyř aktivních složek úměrně jejich množství synergickým způsobem. Například 0,01 % hmotn. L-tryptofanu zvyšuje 73,1% účinek čtyř dalších aktivních ingrediencí na 92,3 %. Stejné množství

-20/0,01 %' hmotn./ L-tryptofanu samotného, bez dalších čtyř složek i slabě zvyšuje proliferaci buněk. Toto jednoznačně potvrzuje synergický účinek.

Rozdíl mezi účinky kompozic, obsahujících čtyři aktivní složky /příklady 1,5,9, 13 a 17/ a kompozicemi, obsahujícími pět aktivních složek /příklady 4,8,12,16 a 20/ v maximálních zde použitých množstvích /např. v případě L-tryptofanu 0,01 % hmotn./ byljvýrazný ve všech případech /p < 0,01/, takže všechny substance významně zvyšují účinky dalších čtyř komponent.

-21Tabulka 1

Vlivy kompozic podle vynálezu a jejich jednotlivých aktivních složek na Sp2/Ó-Agl4 buňky myšího 'myelcmu u

příklad	kontrola	množství složek^; ; ·.. · yy v % hmotn. .	vliv
L-TRYP- TOFAN	2-DEOXY- RIBOSa	ADE- NIN'	JABLEČ- NÍ. KYSE- LINA	‘ASCOR- BOVÍ KYSELIN	Na- íydrogen- ^hličitar	změna . v počtu⁶buněk /10⁴ x/ (X 10⁴)	v % a^í^etře;. buněk
1		—	0.034	0.003	0.065	0.007	0.091	15.9± 1.2	26.9 ± 2.0
	1				—	—	—	59.1 ±3.2	100.0
2		0.002	0.034	0.003	0.065	0.007	0.091	10.7±2.9	18.1 ± 4.8
	2	0.002	—	—	—	—	—	61.7 + 3.0	104.4 ±5.0
3		0.006	0.034	0.003	0.065	0.007	0.091	6.0 ± 1.4	10.1 ± 2.4
	3	0.006	—	—	—	—	—	62.6 ±2.0	106.0± 3.4
4		0.010	0.034	0.003	0.065	0.007	0.091	4.5 ±0.3	7.7 ±0.6
	4	0.010	—	—	—	—	—	63.0 ±3.4	106.6 ±5.8
b		0.010	—	0.003	0.065	0.007	0.091	14.8 ±0.4	25.1 ±0.7
	5		——	—	—	—	—	59.1 ±3.2	100.0
6		0.010	0.013	0.003	0.065	0.007	0.091	12.2±0.3	20.6 ±0.6
	6	·—·	0.013	—	—	—	—	59.3 ±2.3	100.4 + 4.1
7		0.010	0.025	0.003	0.065	0.007	0.091	8.7 ±0.8	14.8 ± 1.3
	7		0.025	—	—	—	—	59.8 ± 1.2	101.1 ±2.2
8		0.010	0.034	0.003	0.065	0.007	0.091	4.5 ±0.3	7.7 ±0.6
	8		0.034	—	—	—	—	59.0 ±3.2	99.9±5.9
9		0.010	0.034	—	0.065	0.007	0.091	12.6± 1.3	21.4±2.3
	9	'¹ '		—	—	—	—	59.1 ±3.2	100.0
10		0.010	0.034	0.001	0.065	0.007	0.091	10.1 ±1.8	17.1 ±3.2
	10		—	0.001	—	—	—	60.5 ± 1.4	102.4 ± 2.5
11		0.010	0.034	0.002	0.065	0.007	0.091	7.9 ± 1.7	13.4 ± 2.9
	11	——	—.	0.002	—	—	—	58.2 ± 1.8	98.5 + 3.2
12		0.010	0.034	0.003	0.065	0.007	0.091	4.5 ±0.3	7.7±0.6
	12	——		0.003	—	—	—	58.6 ± 1.5	99.1 ±2.8
13		0.010	0.034	0.003	—	0.007	0.007	16.6± 1.2	28.1 ±2.1
	13	*		—	— .	—	—	59.1 ±3.2	100.0
14		0.010	0.034	0.003	0.013	0.007	0.024	13.1 ±2.2	22.2 ±4.0
	14	—	—	—	0.013	—	—	58.7±2.1	99.3±3.7
15		0.010	0.034	0.003	0.039	0.007	0.057	9.9± 1.1	16.7±2.0
	15	——	*—	—	0.039	—	—	60.4 ± 1.7	102.2 + 3.0
16		0.010	0.034	0.003	0.065	0.007	0.091	4.5 ±0.3	7.7 ±0.6
	16		—	—	0.065	—	—	58.8 ± 2.5	99.5 ±4.5
17		0.010	0.034	0.003	0.065	—	0.084	13.2 ±0.8	22.3 ± 1.3
	17		—	—	—	—		59.1 ±3.2	100.0
18		0.010	0.034	0.003	. 0.065	0.003	0.087	11.9±2.1	20.2 ±3.7
	18	—	—	—	—	0.003	—	58.2 ± 1.4	98.5 ±2.5
19		0.010	0.034	0.003	0.065	0.005	0.089	6.8 ±2.0	11.6 ±3.5
	19		—	—	—	0.005		56.7 ± 2.1	96.0 ± 3.7
20		0.010	0.034	0.003	0.065	0.007	0.091	4.510.3	7.7 ±0.6
	20	““*	—-	‘—·	—	0.007	—	56.3 ± 2.6	95.2+4.8

-22Synergický účinek kopozic z příkladů 1-20, obsahujících pět aktivních složek je uveden na obr. 1, kde množství Spú2/0-Agl4 buněk vyjádřená v procentech množství neošetřených buněk /množství neošetřených buněk je 100 %/ jsou uvedena na vertikální ose. Na horizontální ose jsou množství vyjádřena v % hmotn. L-tryptofanu, 2-deoxy-D-ribosy, adeninu, kyseliny jablečné a kyseliny askorbové. Bílé sloupce představují množství buněk vyjádřená v procentech množství neošetřených buněk po 48 hodinách inkubace za použití výše uvedených substancí samotných a černé sloupce představují výsledky získané, jestliže se tyto použijí společně s dalšími čtyřmi aktivními složkami. Změny v různých stupních /v případě L-tryptofanu , i v opačném směru/ v bílých a černých sloupcích se zvyšujícími se množstvími jednotlivých substancí potvrzují synergický účinek a černé sloupce demonstrují vliv kompozic na zabíjení tumorových buněk.

Na základě příkladů 21-37 ukazuje tabulka 2 jak se bude účinek kompozice, obsahující pět aktivních složek zvyšovat v případě Sp2/0-Agl4 buněk,jestliže se přidají další složky. V tabulce 2 jsou množství materiálů vyjádřena v % hmotn. a násobena 1000, takže čísla v tabulce je třeba číst jako násobená 10 , například v příkladu 21 v případě L-tryptofanu znamená číslo 6 6 x 10 tj. 0,006 % hmotn. Podmínky v příkladech byly stejné jako výše.

Podobně jako v tabulce 1 je možno vidět z ůdajů v posledních dvou sloupcích tabulky 2 /v počtu buněk a v %/, že použití výše uvedených substancí samotných ani jednou nemělo efekt snižování buněčné proliferace, navíc se při působení L-fenylalaninu /kontrola 22/, L-argininu /kontrola 23/, L-histidinu /kontrola 24/ a riboflavinu /kontrola 29/ počet buněk ve srovnání s počtem neošetřených buněk /kontrola 21/ i slabě zvýšil. Je také zřejmé, že stejné substance, jestliže se použijí ve stejných množstvích, synergicky zvyšují účinek kompozice podle příkladu 21. Bez potencujících

-23substancí byly účinky v příkladu 21, obsahujícího pět aktivních složek ve všech případech výrazně menší než společně s jinými sloučeninami.

Účinky kompozic z příkladů 107-111, obsahujících dvacet jedna aktivních složek a účinky kompozic z příkladů 102 až 106, obsahujících pět aktivních složek, majících stejná množství běžných aktivních složek byly také porovnávány. Nas pomoc porovnání s nejčerstvějšími výsledky byly také použity Sp2/0-Agl4 buňky a experimentální podmínky byly jako dříve. Výsledky jsou uvedeny na obr. 2. Na vertikální ose jsou uvedeny změny v množstvích buněk vyjádřené v procentech množství neošetřených buněk. Na horizontální ose jsou uvedeny změny vyjádřené v % kompozice /změny v množství aktivních složek/. Kompozice z příkladu 102, obsahující pět aktivních složek je hodnocena jako 100%, Tak 80% kompozice z příkladu 103 obsahuje každou složku v množství 80 %. V případech kompozic, obsahujících dvacet jednu aktivní složku je kompozice z příkladu 107 hodnocena jako 100%.

'· i

-25Tabulka 2 /pokrač./

Vlivy kcmpozic podle vynálezu a jednotlivých aktivních složek na Sp2/0-Agl4 myší myelomovébnňky

P Ř í K L A D	K 0 N T R 0 L A'	množství složek v . % hmotn. „ (x10*3)	vliv
L- T R Y P T 0 F A N	2- D E 0 X γ- ό- η I B 0 s f	A D E N I N	J A B L E Č N A K Y s.	Ι- Α S S 0 R B 0 V A K Y s.	Na H . Y D R Ó G E N U H L I Č I T A N	A T P Na s ů, 1	D- M A N N 0 S A	D- G L U K O s A M I N	N- B E N Z 0 Y L G L Y C 1 N	R 1 B 0 F L. 5'- F 0 S F A T	L 1 P 0 0 v A $ s.	0 R 0 T 0 v A K Y s.	směna . v počtu buně^k (x 10⁴)	v % neošetřených buněk
21	21	6	20	2	39	4	54	-	-	-	-	-	-	-	49.8 ±0.4 74.3 ±3.9	67.6 ±0.6 100.0
31	31	6	20	2	39	4	54	1.5 1.5	-	-	-	-	-	-	27.5 ±0.5 71.0±1.1	55.3± 1.1 95.6 ±1.5
32	32	6	20	2	39	4	33	-	90 90	-	-	-	-	-	24.5 ±0.9 73.1 ±1.1	49.2 ±1.2 98.4 ±1.5
33	33	6	20	2	39	4	33	-	-	53 53	-	-	-	-	20.1 ± 0.8 71.7± 1.3	40.3 ±1.1 96.5 ± 1.8
34	34	6	20	2	39	4	54	- '	-	-	89 89	-	-	-	24.0 ±0.6 74.2 ± 1.6	48.2 ±0.8 99.8 ±2.1
35	35	6	20	2	39	4	54	-	-	-	-	0.6 0.6	-	-	16.3±0.5 73.5 ± 1.3	32.7 ±0.7 98.9 ± 1.8
36	36	6	20	2	39	4	52	-	-	-	-	-	0.6 0.6	-	23.8 ± 1.0 73.1 ± 1.6	47.8 ±1.3 98.4 ±2.1
37	37	6	20	2	39	4	54	-	-	-	-	-	-	17 17	26.4 ±0.6 70.0 ± 1.3	53.1 ±0.8 94.2 ± 1.7

-24Tabulka 2

Vlivy p kompozic podle vynalezu a jednotlivých aktivních složek na Sp2/0-Agl4 , myší ntyelcmové buňky

P Ř 1 K L A D	K 0 N T R 0 L A	mi	nož	stv	í s	Ložek v %bmotn. · - - v% > (X10-3)	vliv
L- T R Y P T 0	2- D E 0 X Y- D- R I B 0 S	A D E N I N	J A B L E Č. N Á K Y s.	Ι- Α S K 0 R B I 0 V Á K Y s.	Na H Y D R· 0 G E N U H L I č I T A N	L- E E N Y L A L A N I N	Ι- Α R G I N I N	L- H I S T I D 1 N	B 1 0 T 1 N	P Y R I D 0 X 1 N	L- M E T H I 0 N I N	L- T Y R 0 S I N	R I B 0 F L A V I N	0 X A L 0 c T 0· v Á K Y\ s.	změna počtu buněk (x 10⁴)	v % neosetí. buněk
21	21	6	20	2	39	4	54									-	49.8 ±0.4 74.3 ±3.9	67.0 ±0.6 100.0
22	22	6	20	2	39	4	54	41 41	-							-	30.4 ± 1.4 81.3±3.0	40.9 ± 1.9 109.4 ±4.0
23	23	6	20	2	39	4	33	-	44 44	-	-	-	-	-	-	-	33.8 ±1.1 76.8 ±1.3	45.4 ± 1.5 103.4 ± 1.8
24	24	6	20	2	39	4	33	-	-	39 39	-	-	-	-	-	-	40.1 ±0.7 80.7 ±2.0	54.0 ±0.9 108.7 ±2.7
25	25	6	20	2	39	4	54	-	-	-	12	-	-	-	-	-	31.2 ± 1.7 74.2 ± 2.3	42.0 ±2.2 99.9 ±3.1
26	26	6	20	2	39	4	54	-	-	-	-	10	-	-	-	-	33.9 ±1.2 67.6 ± 1.6	45.6± 1.6 91.0 ±2.1
27	27	6	20	2	39	4	52	-	-	-	-	-	11	-	-	-	31.1 ±1.1 73.3 ±2.7	41.8 ±1.5 98.7 ±3.6
28	28	6	20	2	39	4	54							36 36	-	-	33.6 ±1.0 70.5 ±1.1	45.3± 1.3 94.9 ± 1.5
29	29	6	20	2	39	4	54								0.4 0.4	i	24.9 ±2.1 76.9 ± 1.7	33.6 ±2.8 103.5 ±2.2
30	30	6	20	2	39	4	54									40 40	35.4 ± 1.6 72.4 ±1.3	47.6 ±2.2 97.4 ± 1.7

26Pro vyloučení možnosti, že naměřený účinek je výsledkem osmotičkého účinku nebo nespecifického předávkování živin nebo aminokyselinové nerovnováhy, byly také kontrolní směsi připraveny. Tyto kontrolní směsi obsahují substance, které v předchozích experimentech se ukázaly být neúčinné v PADS. B-logeníc??,kontrolních směsí bylo uvedeno v souvislosti s tabulkou 1. Získané výsledky z pokusů s kompozicemi z příkladů 102 až 106 a 107-111 a s kontrolními směsmi jsou uvedeny na obr. 2, kde čára označená ^prázdnými kruhy představuje změnu v množstvích buněk po 48 h inkubace v případě kontrolních směsí čára s plnými kroužky představuje změny v případě kompozic, ob sáhujících pět aktivních složek z příkladů 102-106 a čára s prázdnými trojúhelníky představuje změny v případě kompozic obsahujících dvacetjedna aktivních složek z příkladů 107111. V pokusech provedených se 100% kompozicemi z příkladů 102 a 107 a uvedených na obr. 2 byly jednotlivé aktivní složky použity v takových množstvích, která neovlivňují podstatně počet buněk /jak je možno vidět z výsledků dřívějších pokusů uvedených v tabulce 1 a 2/. Z obr. 2 je možno vidět, že tyto komponenty, jsou-li použity společně, mají významný protinádorový účinek. Tato skutečnost znovu potvrzuje synergicky způsob působení aktivních ingrediencí. Je také možno z obr. 2 vidět, že kontrolní směsi nevykazují jakýkoliv podstatný vliv na počet buněk. Na základě těchto pokusů je možno vyloučit, že naměřené účinky jsou výsledkem osmotičkého efektu nebo nespecifického předávkování živin nebo aminokyselinové nerovnováhy.

Pro zjištění, zda partnerské ionty mají vliv na účinek kompozic, byly provedeny pokusy, kde K⁺ /příklad 38-67/ nebo

2+ +

Ca /příklady 68-97/ ionty byly použity místo Na iontů, není zde žádný výrazný rozdíl mezi účinky kompozic, využívá jícíchrňzná partnerské ionty, ve skutečnosti byly výsledky přesně stejné. i /

-2ΊByl hodnocen vliv 100% kompozice z příkladu 107 jako funkce času na Sp2/0-Agl4 buňky a byl porovnán se 100% kontrolní směsí a s neošetřenými buňkami. Experimentální podmínky byly stejné jako v předcházejících pokusech s tím rozdílem, že v tomto případě byly buňky spočteny nejen po 48 hodinách ale také po 6, 12, 24 a 36 h. Výsledky těchto kinetických pokusů jsou uvedeny na obr. 3. Na vertikální ose je uveden počet buněk/ml. Na horizontální ose je uveden čas v hodinách. Čára s prázdnými kroužky představuje změnu počtu buněk v případě neošetřených buněk, čára s plnými kroužky představuje změnu v případě kontrolní směsi a čára s plnými tro júhelníčkyjfpředstavu je změnu v případě kompozic z příkladu 107, obsahujících dvacetjedna aktivních ingrediencí jako funkci času. Z obr. 3 je možno vidět, že zatímco kontrolní směs neposkytuje žádný podstatný efekt na počet buněk, protože se tento zvyšuje exponenciálně s časem a tvar křivky odpovídá tomu, že křivka znázorňuje proliferaci neošetřených buněk, je kompozice podle vynálezu toxická k tumorovým buňkám a vyvolává u tumorových buněk snížení jejich počtu s časem. Kompozice podle vynálezu tak nejen inhibuje buněčnou proliferaci, ale má i cytotoxický účinek. Množství aktivních složek ve výše uvedené kompozici, obsahující dvacet jeden substancí byla zvolena tak, že nevyvolávají žádný podstatný efekt, jsou-li podávány odděleně. /Přirozeně toto je mnohem pravdivější u 80%, 60% atd. kompozic, kde jsou množství aktivních činidel o 20 %, 40 % atd. menší/. Protože stejné kompozice byly použity ve všech in vitro pokusech, potvrzují výsledky ve všech případech synergické působení aktivních komponent.

Výše uvedené výsledky potvrzují, že efekt je vyvolán synergickým působením substancí vybraných podle zjištění, S'.;> které tvoří základ vynálezu. Dále tyto výsledky také potvrzují, že zjištění jsou správná. Protože se různé rakovinové buňky liší od normálních buněk v různých stupních, rovněž se od sebe liší nejúčinnější kompozice proti rakovinovým buňkám mezi sebou. To znamená, že proti každému tumoru může být vybrána nejvíce odpovídající kompozice za použití synergického

-28tumorové buňky žabíjecího účinku jako kriteria. Avšak pro prevenci nebo tam, kde nebyl typ tumoru verifikován nebo je nedostatek času je výhodné použít obecné kompozice, obsahující dvacetjedna aktivních složek. V následujících příkladech bylo hodnocen), jak je obecný účinek těchto kompozic a jejich účinnost.

Efekt kompozic z příkladu 107-111, obsahujících dvacet jedna aktivních ingrediencí na K-562 buňky lidské erythroleukemie byl hodnocen a srovnáván s efektem výše uvedené kontrolní směsi. Výsledky pokusů jsou uvedeny na obr. 4.

Stejně jako na obr. 2 jsou na vertikální ose uvedeny změny množství buněk vyjádřené v procentech množství neošetřených buněk. Na horizontální ose jsou uvedeny změny vyjádřené v procentech kompozice /změny v množstvích aktivních složek/. Křivka s prázdnými kroužky představuje účinky kontrolních směsí, zatímco křivka s plnými kroužky představuje účinky přípravků, obsahujících dvacetjedna aktivních složek. Z obr.

je zřejmé, že kompozice podle vynálezu mají významný účinek i při zabíjení tumorových buněk v případě K-562 buněk.

Dále byl hodnocen vliv kompozic podle příkladů 107-111, obsahujících dvacetjedna aktivních složek, v případě?'©HeLa buněk lidského epitheloidního karcinomu cervixu a HEp-2 buněk lidského epidermoidního karcinomu hrtanu ve srovnání s vlivem kontrolní směsi. Tento pokus je nezbytný pro znázornění toho, že předchozí výsledky jsou obecné a nezávislé na účincích použitého media, suspenzní metodě, sčítání a detekci. Přežívající HeLa, HEp-2 a Věro buňky byly měřeny hodnocením aktivity endogenní alkalické fosfatásy buněk.

Stručně, po inkubačhí periodě byly neadherované buňky /převážně poškozené/ odstraněny promytím. Potom bylo do každé jamky přidáno 150 ^,ug substrátu alkalické fosfatásy /4-nitrofenylfosfát, Sigma tablety č. 111-112 rozpuštěného ve 150 /Ul čerstvého 10% diethanolaminového pufru /pH 9,8/. Plotny byly inkubovány při 30 °C až absorbance v případě neošetřených

-29buněkdosáhla asi 1. Reakce byla ukončena přídavkem 50 yUl 3M NaOH do každé jamky. Absorbance byla měřena při 405 nmpomocí Dynatech ELISA čtečky. Základní hodnoty byly odečteny z každého čtení. Výsledky jsou uvedeny na obr. 5 /v případě HEp-2 buněk/. Podobně jako na obr. 2 a 4 na obou obr. jsou na vertikálních osách uvedeny změny v počtech buněk vyjádřené v procentech množství neošetřených buněk. Změna v počtu buněk v těchto případech byla detegována měřením extinkce. Horizontální osa ukazuje změny vyjádřené v % kompozice /změny v množstvích aktivních složek/. Na obou obr. 5 a 6 křivky s prázdnými kroužky představují účinky kontrolních směsí, zatímco křivky s plnými kroužky představují účinky kompozic z příkladů 107 až 111, obsahujících dvacetjedna aktivních složek. Z obrázků je zřejmé, že kompozice jsou účinné proti oběma buněčným liniím. Tento výsledek je o to cennější, že HEp-2 je známa jako hard cell line rezistentní k účinkům prostředí /(American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, 5.vyd., str. 15-16 /1985//.

Podle teoretických základů vynálezu působí kompozice selektivně pouze na rakovinové buňky. Pro další potvrzení tohoto konstatování byl také hodnocen vliv kompozic z příkladu 107-111, obsahujících dvacetjedna aktivních ingrediencí a kontrolních směsí na normální buněčnou linii buněk ledvin Věro Afričan opic. Výsledky jsou uvedeny na obr.

7. Na vertikální ose je uvedena změna množství buněk vyjádřená v procentech množství buněk k neošetřeným buňkám.

Na horizontální ose jsou uvedeny změny vyjádřené v % kompozic /změny v množstvích aktivních složek/. Křivka s prázdnými kroužky představuje účinek kontrolních směsí zatímco křivka s plnými kroužky představuje účinky kompozic z příkladu 107111, obsahujících dvacetjedna aktivních složek. Z obr. 7 je zřejmé, že kompozice podle vynálezu neprojevují?cytotoxické účinky na normální Věro buněčné linii, protože účinek 100%

-30kompozice z příkladu 107 na proliferaci by byl, vyjádřen grafic ky proti času, stejný jako je úveden na obr. 3 v případě kontrolních směsí. Věro je rychle proliferující buněčná linie /American Type Cfcltur Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, 5.vyd., str. 45-46 /1985//# a tento pokus potvrzuje, že narozdíl od cytostatik, je kompozice podle vynálezu netoxická pro všechny rychle proliferující buňky, ale selektivně ovlivňuje pouze tumorové buňky.

Na základě výše uvedených výsledků mohou být kompozice podle vynálezu hodnoceny jako antineoplastické a ne jako cytotoxické přípravky.

Pro ověření in vivo účinností kompozice podle vynálezu byly také provedeny farmakologické pokusy. Během těchto pokusů byly vždy použity pokusné metody a podmínky popsané ve vědecké literatuře. Pokusy byly provedeny s Sp2/0-Agl4 buňkami. Pro pokusy byly použity 5-6 týdnů staré samice BALB/c myší. Pokusy byly prováděny na dvou skupinách po 10 myších každá. I.p. bylo myši injektováno 5.10^ Sp2/0-Agl4 buněk suspendovaných ve 200 /Ul nekompletního

RPMI 1640 media. Den injekce byl označen jako O.den pokusu. Počet buněk nutný pro pokus byl stanoven testem tumorogenicity. Ošetření zvířat započalo 24 h po injekci buněk /toto byl první den pokusu/ a pokračovalo 10 následujících dnů. Kontrolní skupina byla injektována i.p. 200 ^ul PBS /fosfátem pufrovaný salinický roztok/ při každém ošetření, zatímco ošetřená skupina byla i.p. injektována stejným objemem kompozice z příkladu 112, obsahující dvacetjeden aktivních složek.

Nejúčinnější způsob ošetření byl kontinuální infuze, udržující koncentraci komponent kompozice na značně vysoké hladině. Pro obtíže při praktickém provedení^bylo použito přibliž ně kontinuální, periodické ošetření, tj. zvířata byla ošetřována šestkrát denně. Výsledky pokusů jsou uvedeny na obt.

8. Na horizontální ose je uveden počet dnů uplynulých od

-31zahájení pokusu. Na vertikální ose jsou uvedeny hodnoty % přežívájících,tj. močet myší živých daný den. 10 myší tak znamená 100 % a 8 myší 80 %. Bílé sloupce představují přežívající ošetřené myši, černé sloupce totéž u neošetřených myší. Z obr. 8 je možno vidět že např. 16.den nepřežila žádná z neošetřených myší a všechny myši ošetřené ještě žily. Všechny neošetřené myši zemřely po 16 dnech, z ošetřených pouze jedna 25.den.Je zřejmé, že díky ošetření došlo k významnému zvýšení přežití. Průměrná doba přežití byla 21 dnů u ošetřené skupiny a 14 dnů u skupiny neošetřené. Hodnota T/C % vypočtená z těchto průměrných dob přežití /150 %/ je tak vysoká, že kriteriem účinnosti je 125 %. Podle literatury na základě této hodnoty může být přípravek podle vynálezu hodnocen jako přípravek se silným protitumorovým účinkem vůči dané buněčné linii.

Za účelem potvrzení, že doba přežití je výsledkem toxického účinku kompozice z příkladu 112 na tumorové buňky a ne silného roboračního účinku, byl proveden další pokus.

10-10 myší bylo ošetřeno stejným způsobem. Po 10 dnech ošetřování byly buňky odstraněny z abdominálních dutin obou skupin myší a spočteny. Rozdíl mezi průměrným počtem buněk 5 7 /5,55 x 10 a 5,95x 10 / je významný /p < 0,001/ a potvrzuje in vivo účinnost kompozice podle vynálezu.

Pro potvrzení účinnosti přípravku podle vynálezu a pro vyloučení možnosti, že výsledky jsou pouze následkem lokálního efektu /buňky byly v abdominální dutině a ošetřeny i.p./, byl proveden další pokus s vrozeným imunitním deficitem /bez thymu/ /holé/ myšmi injektovanými s.c. s lidskými pevnými tumory. Pro pokus byly použity He-La buňky a

6-8 týdnů staré samice BALB/c /nu/nu/ myši. 5 x 10® buněk bylo injektováno s.c. do zadních končetin myši. Ošetření započalo s kompozicíz příkladu 112, když velikost tumorů dosáhla průměrného objemu 50 mm . Postup ošetření, doba ošetření a roztoky

-32/příklad 112/, použité pro léčení byly stejné jako v předchozím farmakologickém pokuse, velikost tumorů /(délka /L/, šířka (W), výška (H)/ byly měřeny dvakrát týdně digitálními posuvnými měřítky /Mitutoyo, lne. Tokyo , Japonsko/. Objemy tumorů /vypočtené podle rovnice LWH/2/ a také relativní objemy tumorů ν^/νθ /Eur.J.Cancer. Clin.Oncol., 21, 1253-1260/1988//, kde je aktuální objem tumoru a νθ je objem tumoru na začátku léčby se vypočítají. Výsledky jsou shrnuty na obr.9. Na vertikální ose je uveden průměr hodnot ν^,/νθ a na horizontální ose dny od počátku ůéčby. Křivky s prázdnými kroužky představují zvětšení relativního objemu tumoru po počátku léčby v případě kontrolní myši a křivky s plnými kroužky představují totéž v případě pšetřených zvířat. Z obr.9 je možno vidět, že léčba působí pokles růstu tumoru. Například v případě kontrolní myši se objem tumoru zvyšuje během 16,5dne devětkrát, zatímco v případě ošetřené myši bylo pro devitinásobný růst zapotřebí 33 dnů. T/C % se také spočtou z ν^,/νθ hodnot ošetřené a kontrolní skupiny. Hodnoty T/C % byly ve všech případech pod 42 %, což je přijatelné jako kriterium účinnosti /Europ.J.Cancer, 17, 129-142 /1981//. Pokus ukázal, že opět mají přípravky podle vynálezu významný protinádorový účinek. Výsledky jsou zvláště slibné proto, že pro technické problémy bylo ošetření vzdáleno od optimálního postupu a maxima tolerovatelné dávky a že stejná léčba v klinických podmínkách by měla probíhat účinněji /delší doba léčby, trvalé působení např. infuzí atd./.

Změna tělesné hmotnosti během léčby je dobrá a obecně se užívá index k charakteristice toxicity léčby; hmotnost zvířat byla proto měřena během výše uvedených pokusů. Podle literatury, jestliže se tělesná hmotnost snižuje o 10-15 %, je přípravek považován za toxický /Eur.J.Cancer.Clin.Oncol., 21, 12531260 /1988//. V našem pokuse byla změna tělesné hmotnosti -5,9 %+4,l % v případě kontrolní skupiny a^-6,6+3,9 % v případě ošetřené skupiny. Není zde žádný významný rozdíl mezi dvěma skupinami a to znamená, že přípravek podle vynálezu nemá žádné toxické jedlejší účinky.

-33Pro potvrzení preventivní použitelnosti kompozice podle vynálezu byly 2-2 skupiny BALB/c myši /10 myší na skupinu/ ošetřeny takovým způsobem, že potrava ošetřovaných zvířat byla smísena v poměru 1:1 kompozicemi z příkladů 113-121 a zvířata byla krmena ad libitum. 5 dnů po započetí léčby

.................

bylo i.p. inokulovano 1x10 Sp2/0-Agl4 buněk oběma skupinám zvířat. Léčba pokračovala 100 dnů. Myši krmené 1-1 směsí kompozic z příkladů 113 až 121 a normální potravou nevykazovaly zřejmý i.p. tumorový růst když byly usmrceny 100 dnů po injekci buněk. Ve stejné době se doba přežití kontrolních zvířat v různých experimentálních skupinách pohybuje od 21 do 26 dnů po injekci Sp2/0-Agl4 buněk.

V závislosti na dávce a způsobu léčby mohou být kompozice podle vynálezu použity pro prevenci rakovinových chorob, pro inhibici vývoje tumoru v případě AIDS a orgánové transplantace, pro zabránění tvorby metastáz a pro podpůrnou, kombinovanou a přímou terapii pacientů s tumory.

Hlavní výhody kompozic podle vynálezu jsou následující:

a/ Použití adekvátního dávkování kompozic může být použito pro prevenci rakovinových chorob, pro inhibici tvorby tumoru v případě AIDS a transplantací, pro zabránění tvorby metastáz a pro a pro přímou, podpůrnou nebo kombinovanou terapii a ošetřování rakovinových chorob.

b/ Nejsou toxické. Pokusy s toxicitou, založené na měření ztráty tělesné hmotnosti zvířat potvrzují, že kompozice nejsou toxické. Podle literárních údajů je toxicita jednotlivých složek kompozic velmi nízká a i tato nízká toxicita se snižuje, jestliže se tyto substance používají společně. Mimoto primáti tolerují tyto substance lépe než malá zvířata používaná pro stanovení hodnot toxicity. Jestliže se vezmou v úvahu všechny tyto skutečnosti je možno konstatovat, že kompozice mohou být hodnoceny jako netoxické.

-34c/ Nemají, nebo mají jen nepatrné vedlejší účinky.Určitá pozorování vedlejších účinků složek byla učiněna téměř u všech z nich / s výjimkou 2-deoxy-D-tibosy/, kteréibyly použity v určitých typech terapií /v protirakovinové terapii pouze kyselina askorbová/ nebo jako doplněk potravy. Podle pozorování učiněných v těchto aplikacích je zcela jasné, že kompozice prakticky nemají žádné vedlejší účinky.

d/ Jsou selektivní. Selektivita je potvrzena pokusy, které ukazují, že kompozice toxické pro různé rakovinové buňky nejsou toxické pro normální Věro buňky a pro experimentální zvířata nebo pro jejich normální buňky. Tato selektivita je zvýšena skutečností, že je zde mnohem více normálních buněk než buněk rakovinových a posledně uvedené buňky akumulují složky kompozic, zatímco v případě normálních buněk je jejich příjem regulován.

e/ Mohou být použity v širokém rozsahu, jejich účinky jsou obecné. Účinky kompozic byly hodnoceny v případě myšího myelomu /Sp2/0-Agl4/, lidské erythroleukemie /K-562/, lidského epitheloidního karcinomu cervixu /HeLa/ a lidského epidermoidního karcinomu hltanu /HEp-2/ buněčných linií. Tyto buňky představují široké spektrum, protože zahrnují jak lidské tak zvířecí tumory a i z lidských tumorů jsou zastoupeny leukémie a dva velmi rozdílné pevné tumory. Získaný výsledek z pokusů s těmito buněčnými liniemi podporuje výše uvedené hodnocení, že kompozice mají obecné účinky a mohou být široce využívány.

f/ Mohou být připraveny bez obtíží. Složky kompozic jsou složky s nízkou molekulovou hmotností a jsou snadno dostupné, takže kompozice je možno snadno připravit.

g/ Jsou rozpustné ve vodě a tak snadno dávkovatelné.

-35PATENTOVÉ ř c· > 2 z, - J> <? ' <x>

on σ

o <n« o

r>

Claims

1. Farmaceutické kompozice pro prevenci a léčbu rakovinových chorob,v yznačující se tím, že obsahují alespoň tři aktivní sloučeniny, vyskytující se v oběhovém systému: alespoň jednu aminokyselinu, alespoň jeden vitamin a alespoň jeden člen vybraný ze skupiny, zahrnující adenin, 2-deoxy-D-ribosu, D-mannosu, D-glukosamin, kyselinu jablečnou, kyselinu oxaloctovou, adenosin trifosfát a/nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli s tou podmínkou, že jestliže kompozice obsahuje vedle aminokyseliny/kyselin/ pouze kyselinu jablečnou a vitamin, vitaminem může být pouze jiný vitamin než kyselina askorbová.

2. Kompozice podle nároku 1,vyznačující se tím, že obsahuje vedle aktivních sloučenin také nosiče, ředidla a/nebo jiná pomocná činidla běžně používaná ve farmacii.

3. Kompozice podle nároku 1,v yznačující se t í m , že aminokyselinou je L-methionin, L-tryptofan, L-tyrosin, L-fenylalanin, L-arginin,L-histidin, N-benzoylglycin a/nebo jejich soli.

4. Kompozice podle nároku 1,vyznačující se t í m , že vitaminem je d-biotin, pyridoxin, riboflavin, riboflavin-5'-fosfát, kyselina L-askorbová, kyselina lipoová, kyselina orotová a/nebo jejich sůl.

5. Kompozice podle nároku 1,vyznačující se t í m , že obsahuje L-tryptofan, kyselinu L-askorbovou a alespoň jeden člen vybraný ze skupiny, zahrnující adenin, 2-deoxy-D-ribosu, D-glukosamin a/nebo jejich farmaceuticky přijatelné sole.

< Τ» r— 7G i cp I ·* S o1 O 1 H < xť CO X > :X o o i cn O o —4 — m O j to CZX r— O íj c V ř h—* o tn □O

0,0004-45 % hmotn. riboflavinu, 0,0005-45 % hmotn. riboflavin5'-fosfátu, 0,003-70 % hmotn.kyseliny L-askorbové, 0,00415 % hmotn. kyseliny lipoové, 0,01 až 17 % hmotn. kyseliny orotové, 0,001 až 10 % hmotn. adeninu, 0,01 - 63 % hmotn. 2-deoxy-D-ribosy, 0,08-42 % hmotn. D-mannosy, 0,05-20 % hmotn. D-glukosaminu, 0,01-80 % kyseliny jablečné, 0,02-60 % hmotn. kyseliny oxaloctové, 0,001 až 10 % hmotn. adenosin trifosfátu a/nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí.

10. Kompozice podle nároku 1,vyznačuj ící se t í m , že obsahuje 30-44 % hmotn. L-argininu, 27-35 % hmotn. riboflavin-5'-fosfátu, 38-62 % hmotn. kyseliny jablečné a/nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí.

1-1;. Způsob přípravy kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že zahrnuje smí,sení z mnoha aktivních sloučenin, objevujících se v oběhovém systému, alespoň jedné aminokyseliny, alespoň jednoho vitaminu, alespoň jednoho člena vybraného ze skupiny, zahrnující adenin, 2-deoxy-D-ribosu, D-mannosu, D-glukosamin, kyselinu jablečnou, kyselinu oxaloctovou, adenosin trifosfát a je-li to žádoucí, také nosiče, ředidla a/nebo jiná pomocná činidla používaná ve farmacii, na farmaceutickou kompozici.

-12. Způsob podle nároku .l\v yznačující se t í ra ,že zahrnuje smísení L-tryptofanu, kyseliny L-askorbové, alespoň jednoho člena vybraného ze skupiny, zahrnující adenin, 2-deoxy-D-ribosu, D-glukosamin a/nebo jejich farmaceuticky přijatelné sole paivzňiku farmaceutické kompozice.

13? Způsob podle nároku 11,νγζηε.__^___ __ t í m , že zahrnuje smísení L-argininu, riboflavin-5'-fosfátu, alespoň jednoho člena vybraného ze skupiny, zahrnující D-mannosu, kyselinu jablečnou, adenosin trifosfát a/nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli za vzniku farmaceutické kompozice.

14«. Způsob podle nároku 11,v yznačující se t t £ m , že zahrnuje smísení 30t44 % hmotn.L-argininu, 27-35 % hmotn. riboflavin-5'-fosfátu, 38-62 % hmotn. kyseliny jablečné a/nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí za vzniku farmaceutické kompozice.

15· Způsob podle nároku 11,v yznačující se t í m , že zahrnuje smísení 0,002 až 70 % hmotn. alespoň jednoho člena vybraného ze skupiny, zahrnující L-methionin, L-tryptofan, L-tyrosin, L-fenylalanin, L-arginin, L-histidin, N-benzoylglycin a/nebo jejich sole jako aminokyseliny, 0,004 až 80 % hmotn. alespoň jednoho člena vybraného ze skupiny, zahrnující d-biotin, pyridoxin, riboflavin, riboflavin-5'fosfát, L-askorbovou kyselinu, kyselinu lipoovou, kyselinu orotovou a/nebo jejich sůl jako vitamin a 0,003 až 80 % hmotn. alespoň jednoho člena vybraného ze skupiny, zahrnující adenin, 2-deoxy-D-ribosu, D-mannosu, D-glukosamin, kyselinu jablečnou, kyselinu oxaloctovou, adenosin trifosfát a/nebo jejich farmaceuticky přijatelné sole za vzniku farmaceutické kompozice.

16.. Způsob podle nároku p£,v yznačující se tím , že zahrnuje smísení 0,9 až 25 % hmotn. L-methioninu,

0,8 až 19 % hmotn. L-tryptofanu, 1,1 až 48 % hmotn. L-argininu, 0,9 až 46 % hmotn. d-biotinu, 1,2-15 % hmotn. pyridoxinu,

0,03 až 42 % hmotn riboflavin-5'-fosfátu, 0,05 až 18 % hmotn. D-glukosaminu, 0,5 až 60 % hmotn. 2-deoxy-D-ribosy, 0,7 až 68 % hmotn. kyseliny jablečné, 0,6 až 40 % hmotn. D-mannosy a/nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí za vzniku farmaceutické kompozice.

/

-3917/· Způsob podle nároku Η,v yznačující se tím ,že zahrnuje smísení 0,005 až 34 % hmotn. L-methioninu, 0,002 až 25 % hmotn. L-tryptofanu, 0,02 až 23 % hmotn. Ltyrosinu, 0,04 až 30 % hmotn. L-fenylalaninu, 0,04 až 50 % hmotn. L-argininu, 0,03 až 34 % hmotn. L-histidinu, 0,05 až 22 % hmotn. N-benzoylglycinu, 0,01 až 60 % hmotn. d-biotinu, 0,01 až 20 % hmotn. pyridoxinu, 0,004 až 45 % hmotn. riboflavinu, 0,0005 až 45 % hmotn. réboflavin-5'-fosfátu, 0,003 až 70 % hmotn. kyseliny L-askorbové, 0,004 až 15 % hmotn. kyseliny lipoové, 0,01 až 17 % hmotn. kyseliny orotové,

0,001 až 10 % hmotn. adeninu, 0,01 až 63 % hmotn. 2-deoxy-Dribosy, 0,08 až 42 % hmotn. D-mannosy, 0,05 až 20 % hmotn. D-glukosaminu, 0,01 až 80 % Hmotn. kyseliny jablečné, 0,02 až 60 % hmotn. kyseliny oxaloctové, 0,001 až 10 % hmotn. adenosinxrtrifosfátu a/nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí za vzniku farmaceutické kompozice.

1θ· Kompozice podle nároku 1 pro použití jako léčivo.

19· Kompozice podle nároku '18 pro použití při léčbě rakoviny.

2Q· Kompozice podle nároku 1 a farmaceutické nosiče a/nebo pomocná činidla pro použití jako léčivo.

21. Kompozice podle nároku dorové činidlo.

2Q pro použití jako protiná22,. Kompozice podle nároku při léčbě rakoviny.

1 pro použití jako přísada .23

Kompozice podle nároku

1 ve formě tablety, dražé, čípku, kapsle nebo infuzního roztoku pro použití při léčbě rakoviny. . _i—_

-σ

-< -o rj> C3> tn 3 O -¹ » rn.

o

řo· O; σ X o * c-x ι- to tn Ο

cr:

o<

-4024 ·. Kompozice podle nároku 22, obsahující terapeuticky aktivní množství produktu podle nároku 1.

2^ . KOmpozice podle nároku 2 4; , obsahující 0,2 až 420 g produktu podle nároku 1.

26 Použití kompozice podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro léčbu rakoviny.

27. Použití kompozice podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro orální podání ve formě tablety nebo kapsle pro léčbu rakoviny.

28. Použití kompozice podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro parenterální podání ve formě infuzního roztoku pro léčbu rakoviny.

29. Použití kompozice podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro orální podání ve formě tablety nebo kapsle pro prevenci rakoviny.