CS272562B1 - Průmyslový kmenhouby Clavicepa purpurea (Pr.) Tul. 88-EP/1988 pro přípravu elymoklaviau - Google Patents

Průmyslový kmenhouby Clavicepa purpurea (Pr.) Tul. 88-EP/1988 pro přípravu elymoklaviau Download PDF

Info

Publication number
CS272562B1
CS272562B1 CS305488A CS305488A CS272562B1 CS 272562 B1 CS272562 B1 CS 272562B1 CS 305488 A CS305488 A CS 305488A CS 305488 A CS305488 A CS 305488A CS 272562 B1 CS272562 B1 CS 272562B1
Authority
CS
Czechoslovakia
Prior art keywords
strain
elymoclavine
medium
tul
preparation
Prior art date
Application number
CS305488A
Other languages
English (en)
Other versions
CS305488A1 (en
Inventor
Vladimir Ing Kren
Premysl Rndr Csc Sajdl
Zdenek Rndr Phmr Drsc Rehacek
Zdenek Rndr Malinka
Jan Rndr Bremek
Original Assignee
Kren Vladimir
Sajdl Premysl
Rehacek Zdenek
Malinka Zdenek
Bremek Jan
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kren Vladimir, Sajdl Premysl, Rehacek Zdenek, Malinka Zdenek, Bremek Jan filed Critical Kren Vladimir
Priority to CS305488A priority Critical patent/CS272562B1/cs
Publication of CS305488A1 publication Critical patent/CS305488A1/cs
Publication of CS272562B1 publication Critical patent/CS272562B1/cs

Links

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

SeSení spadá do oblasti farmakologického průmyslu. Týká se nového průmyslového kmene, který v podmínkách kultivace na kapalných médiích produkuje za dobu kratší než dříve popsané kmeny vysoké koncentrace alkaloidu elymoklaviau o dostačující čistotě při vyloučení prodúkoe exooelulárních polysaoharidů a koaidií. Účelem řeSení jé urychlení a zefektivnění fermentační produkce elymoklavinu.

Description

Vynález se týká průmyslového kmene houby Claviceps purpurea (Fr.)Tul. pro přípravu elymoklavinu. .
Alkaloid elymoklavin obecného vzorce I
(I) se stal významnou farmaceutickou surovinou pro přípravu semisyntetických derivátů námelových alkaloidů, využívaných jako léčiva, například. Nicergolinu (US Pat. 2835675).
Elymoklavin se vyrábí převážně submersní fermentací pomocí průmyslových kmenů Claviceps purpurea a Claviceps fusiformis.
Nevýhodami dosud využívaných, kmenů je pomalý nástup produkce, kdy ekonomicky zajímavých koncentrací alkaloidu je dosahováno až 21, den kultivace, dále tvorba doprovodného alkaloidu agroklavinu, který je nutno následnou separací od elymoklavinu odstraňovat, a také produkce exocelulárních glukanů a konidií, které vyvolávají tvorbu emulsí a tak snižují filtravatelnost fermentační tekutiny a komplikují extrakci alkaloidů.
Uvedené nevýhody odstraňuje kmen Claviceps purpurea (Er.)Tul. 88-EP podle vynálezu, který se vyznačuje rychlým nástupem produkce elymoklavinu při submersní kultivaci. Již 16. den fermentaoe produkuje průměrně 2 500 mg elymoklavinu/L· média o čistotě cca 90 %. Přitom se netvoří nežádoucí konidie ani exocelulární glukany.
Vzorky nového kmene jsou uloženy ve sbírce mikroorganismů Mikrobiologického ústavu ČSAV v Praze pod označením Claviceps purpurea pod číslem 88-EP/1988.
Charakteristika nového kmene Claviceps purpurea (Fr.)Tul. 88-EP:
Nárůst kultury kmene na tuhém agarovém médiu NL 829 (viz Tabulka 2) (Maier a kol., Planta Medica 40, 104, 1980) je souvislý, slabě zvrásnělý. Mycelium kmene je šedivé až šedobílé. Po delší době kultivace produkuje do půdy hnědočervený pigment. Kolonie kmene v UV světle tmavěmodře fluoreskují. Kmen nesporuluje na pevném ani kapalném médiu. V kapalném médiu tvoří ojedinělé blastospory a arthospory. Mycelium submersní kultury kmene je převážně sfaceliálního typu a je provázeno řídkým výskytem shluků sklerociálních buněk. Na půdách CS2, (viz Tabulka 2) tvoří submersní kultura sespenzní, snadno filtrovatelné mycelium bez nežádoucích, execelulárních. glukanů. Hnědý až hnědočervený rozpustný pigment je tvořen až v konečné fázi kultivace - po 20. dnu. '
Kmen podle vynálezu se od původního rodičovského kmene liší ztrátou tvorby konidií, změnou spektra alkaloidů (z ergotoxinů na elymoklavin) a vyšší produkcí alkaloidů.
Uchovávání kmene Claviceps purpurea 88-EP
Krátkodobě lze kmen podle vynálezu uchovávat na agarovém médiu NI 829 (jako 20 až 22 denní kultury) při teplotě 4 °C. Kmen je nutno přeočkovávat po 2 až 3 měsících, delším skladováním se podstatně snižuje jeho životaschopnost.
Pro dlouhodobé uchovávání kmene lze s výhodou použít lyofilizace podle postupu: Konzervační roztok ml> 6Q% rozt. sacharosy sterilizovaného v autoklávu při 115 °C/15 min. 15 mL rozt. sušeného netučného mléka (12,5 g/100 ml dest. H20) sterilizuje se v autoklávu při 105 až 110 °C 10 až 15 min (nesmí zhnědnout), po sterilizaci se oba roztoky sterilně smísí a přidá se promyté mycelium kmene připravené 6 až 8 denní kultivací, na médiu TI promlčíme, rozpl3
CS 272 562 Bl 2 nine do ampuli, lyofilizujeme, ampule uzavřeme zatavením a uchováváme při 4 °C. Za těchto podmínek si kmen podle vynálezu uchová vitalitu minimálně 1 rok.
Suspenzi mycelia kmene podle vynálezu lze v konzervačním roztoku pouze zmrazit a bez lyofilizace ji uchovávat minimálně 6 měsíců při -18 °C. Rozmražením a opětným zmrazením ztrácí kmen životaschopnost.
Postup získání nového kmene podle vynálezu:
Kmen Claviceps purpurea (Fr.)Tul 88-EP byl získán kombinovanou mutační technikou a následujícím testováním asi 500 izolátů (Tab. 1). '
Protoplasty kmenů v průběhu šlechtění byly připravovány následujícím postupem:
Submersní kultivací kmene v médiu TI (viz Tabulka 2) 4 dny za podmínek uvedených v příkladu 1 bylo získáno mycelium, které bylo odstředěno a promyto 2x médiem PM (viz Tabulka 2). Do sterilní baňky (100 mL) se vloží 500 mg vlhké váhy mycelia, přidá 10 mL média PM a 1 až 2 mL roztoku (5 %) gastrické šíávy (helikasa) z hlemýždě zahradního Helix pomatia a za mírného třepání se inkubuje asi 2 h při 28 °C, směs se přefiltruje přes fritu SI a odstředí se (10 min/5 000 rpm). Protoplasty se nashromáždí na hladině, odkud se stáhnou Pasteurovou pipetou. Protoplasty se potom naředí médiem PM a buS se přímo vysévají na médium NL 829, nebo se ozařují UV světlem, popřípadě se na ně působí N-nitro-N'-nitrosomethylguanidinem (NNTG). NNTG se rozpustí v malém množství acetonu a doplní se na koně. 1/mg/mL médiem PM. K 5 mL suspenze protoplastů v médiu PM se přidá 0,5 mL rozt. NNTG. Po 1 h inkubaci při 24 °C ve tmě se protoplasty odstředí, promyjí médiem PM a vysévají na médium NL 829. Samotný proces přípravy protoplastů helikasou vyvolává mutagenní účinky; helikasa je mírným mutagenem (Černá, Mutat. Res. j.43, str 169, (1985)).
Mutageneze hyfových fragmentů:
Mycelium připravené obdobně jako pro tvorbu protoplastů se důkladně zhomogenizuje mixérem Ultra-Turrax. Stupeň homogenizace se kontroluje mikroskopicky. Suspenzí takto připravených hyfových fragmentů ozáříme UV světlem a potom se vysévá na médium NL 829.
Kolonie, které po cca 23 dnech kultivace při 24 °C vyrostly ze zárodků mutovaných různým postupem, se potom přeočkují na šikmé agary s médiem NL 829 a testují na produkci elymoklavinu kultivačním způsobem na médiu OS2.
Způsob kultivace kmene C. purpurea 88-EP podle vynálezu pro získání výchozí suroviny k izolaci elymoklavinu a k následné výrobě finálních produktů a léčebných preparátů je doložen v příkladech použití, aniž by se tímto příkladem jakkoliv omezovaly vlastnosti nového kmene, způsob jeho kultivace a použití při průmyslové výrobě.
Příklad 1
Výchozí inokulum kmene pro submersní fermentaoi elymoklavinu se připraví ze zásobní kultury kmene C. purpurea 88-EP narostlé na agarovém médiu NL 829 v Endově zkumavce. Kultura má být stará 21 až 25 dní, nejlépe bez uchovávání v chladničce. Veškeré kultivace kmene podle vynálezu probíhají ve tmě při teplotě 24 °C. Mycelium kultury takto narostlé je velmi křehké a je možno ho snadno smýt uříznutou pipetou do inokulačního média TI (Spala C., ing Genetics of Industrial Microorganisms, eds. Z. Vaněk et al., Elsevier, Amsterdam 1973, str. 393). Zaočkované médium (60 mL ve 300 mL Erlenmayerově baňce) se kultivuje na rotační třepačce (240 rpm, 5,5 cm excentr.) s výhodou 6 dní, popřípadě i déle. Z takto získaného inokula je 5 mL přeneseno do Erlenmayerových baněk (300 mL) s médiem GS2 (60 mL) (AO 199986). Kultury se kultivují 16 až 21 dní. Produkce celkových alkaloidů v 16. dni fermentace činí 2 100 až 2 500 mg/L s obsahem elymoklavinu až 90 %, produkce v 21. dni je 2 800 až 3 500 mg/L s obsahem elymoklavinu 70 až 80 %.
Příklad 2
Kultivace probíhá za obdobných podmínek, jak je uvedeno v příkladu 1, pouze místo produkčního média CS2 je použito média 0S25, popřípadě média CS30 a vyššími koncentracemi sacharosy. Tento postup dává o 10 až 20 % vyšší výtěžky elymoklavinu a nástup produkce to3
CS 272 562 Bl hoto alkaloidu je rychlejší, než při použití média CS2.
Tabulka 1 Postup přípravy nového kmene Clavieeps purpurea (Fr. )Tul 88-EP kombinovaným mutačním šlechtěním (na médiu CS2)
Generalogie Clavieeps purpurea pracovní označení । Mutace Produkce alkaloidů agro- elymo- klavin (%) klavin (%)
objekt (mezistupně) mutagenese mutagen celková (mg/L)
1. (výchozí kmen) P - 900^ stopy stopy
2 E protoplasty C 900 až 1 100 10 80
3 E-I protoplasty c 1 300 • 10 80
4. E-HF . fragmenty hyf UV 80 mJ/cm2 1 700 15 70
5 EK 10 protoplasty UV 40 mJ/cm2 2 000 až 2 200 15 75
6 88-EP protoplasty NNTG 0,1 mg/mL 2 100 až 2 500 5 90
(působení 1 h) a16. den submersní fermentace bkmen P produkoval převážně ergotoxiny cvýeev intaktních protoplastů - potenciální mutagenní účinek helikasy při přípravě protoplastů
Tabulka 2
Složení použitých médií:
Bř-222 g/L TI g/L
sacharosa 100 sacharosa 100
Ii-asparagin 10 kvas, extrakt 0,1
Ca(H03)2.4H2 1 L-asparagin .10
KH2P°4 0,25 Ca(K03)2.4H20 1
MgS°4.7H2° 0,30 L-cystein.HC1 0,1
Kvasničný extrakt Difco o,i kh24 0,25
FeSO4.7H2O 0,02 MgS04.7H20 0,3
ZnS0A*7H20 . 0,02 ZnS04.7^0 0,02
KC1 0,1 (kh4)2so4 10
agar ’ 25 voda vodovodní
H20 destilovaná pH upravit KH^OH 5,4 až 5,6 pH upravit NaOH 5,5
EM mol/I> z CS2 g/L
sacharosa 0,8 ' sacharosa 100
MgCl2 . 0,01 kys. citrónová
CaCl2 0,01 monohydrát 16,8
citrát sodný 0,01 CaCl2 1,2
pH (NaOH) 4,8 KOI · 0,12
destilovaná voda kh2po4 0,25
MgS04.7H20 0,25
FeS04.7H20 0,02
ZnS04«7H2O 0,015
(^4)2^4, 10
voda vodovodní pH upravit NaOH 5,5
CS 272 562 Bl . 4
CS25 g/L CS30 g/L
sacharosa ostatní komponenty jako médium 0S2 250 sacharosa ostatní komponenty jako médium CS2 ’ 300
PŘEDMĚT VYNÁLEZU

Claims (1)

  1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU
    Průmyslový kmen houby Claviceps purpurea (Fr.)Tul, pro přípravu elymoklavinu kultivací na tekutých médiích, které obsahují zdroj asimilovatelného uhlíku, dusíku, minerální sole, stopové a/nebo biologicky aktivní látky, uložený ve Sbírce mikroorganismů Mikrobiologického ústavu ČSAV v Praze pod číslem 88-BP/1988.
CS305488A 1988-05-05 1988-05-05 Průmyslový kmenhouby Clavicepa purpurea (Pr.) Tul. 88-EP/1988 pro přípravu elymoklaviau CS272562B1 (cs)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CS305488A CS272562B1 (cs) 1988-05-05 1988-05-05 Průmyslový kmenhouby Clavicepa purpurea (Pr.) Tul. 88-EP/1988 pro přípravu elymoklaviau

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CS305488A CS272562B1 (cs) 1988-05-05 1988-05-05 Průmyslový kmenhouby Clavicepa purpurea (Pr.) Tul. 88-EP/1988 pro přípravu elymoklaviau

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CS305488A1 CS305488A1 (en) 1990-05-14
CS272562B1 true CS272562B1 (cs) 1991-02-12

Family

ID=5369484

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS305488A CS272562B1 (cs) 1988-05-05 1988-05-05 Průmyslový kmenhouby Clavicepa purpurea (Pr.) Tul. 88-EP/1988 pro přípravu elymoklaviau

Country Status (1)

Country Link
CS (1) CS272562B1 (cs)

Also Published As

Publication number Publication date
CS305488A1 (en) 1990-05-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CS272562B1 (cs) Průmyslový kmenhouby Clavicepa purpurea (Pr.) Tul. 88-EP/1988 pro přípravu elymoklaviau
DE3104151C2 (cs)
RU2118661C1 (ru) Штамм гриба claviceps purpurea (fr.) tul. - продуцент эргокриптинов
KR100754821B1 (ko) 벌 동충하초 j―201 균주의 균사체와 그 세포외 다당체의대량 생산방법
Selim et al. Specific long-chain fatty acids promote optimal growth of Frankia: accumulation and intracellular distribution of palmitic and propionic acid
Shirane et al. Mineral salt medium for the growth of Botrytis cinerea in vitro
Malinka Saprophytic cultivation of Claviceps
CS276627B6 (cs) Nový průmyslový kmen mikroorganismu druhu Claviceps purpurea (Fr.) TUL. CCM 8059
CS245153B1 (en) Strain of acremonium chrysogenum microorganism
FR2550549A1 (fr) Nouvelle souche produisant de la clavine, procede pour sa preparation, ainsi qu'un procede microbiologique de production d'alcaloides de la clavine
CZ283773B6 (cs) Průmyslový produkční kmen mikroorganismu Claviceps purpurea /Fr./ Tul.
CS253097B1 (cs) Průmyslový kmen houby Claviceps fusiformis Loveless F 27 CC-4/85
Nnoruka EV J\LUJ\TION Of DTECJ I AND HEXAGON TB KITS USED fOR DIAGNOSIS Of TUBERCULOSJS JN NIGERIA.
RU2226547C1 (ru) Штамм гриба entomophthora thaxteriana (petch.) (zygomycetes; entomophthorales) № 9 (визр) - продуцент биопрепарата энтокс
CZ279533B6 (cs) Průmyslový produkční kmen mikroorganismu Claviceps purpurea /Fr./ Tul.
CS225272B1 (cs) Nový průmyslový kmen mikroorganismu Claviceps purpurea (Fr.) TUL, CCM F-721
CZ282335B6 (cs) Vysokoprodukční kmen mikroorganismu Penicillium chrysogenum CCM 8197
CN102604838A (zh) 少孢节丛孢菌菌株n及其应用
CS262188B1 (cs) Kmen mikroorganismu Penicillium chrysogenuniCCM F-8012
CZ239691A3 (en) novel industrial strain of micro-organisms claviceps purpurea (fr.) tul., ccm 8058
CZ405598A3 (cs) Průmyslový produkční kmen mikroorganismu Claviceps purpurea (Fr.) Tul.
DE2336765A1 (de) Verfahren zur herstellung von mutterkornalkaloiden, vorzugsweise von ergokryptin und ergokornin, durch fermentation
CH501728A (de) Verfahren zur Herstellung eines Gemisches von Mutterkornalkaloiden der Polypeptid- und der Ergobasin-Gruppe
HU195249B (en) Process for producing ergot alkaloides first of all ergochristine by parasites
CZ282334B6 (cs) Vysokoprodukční kmen mikroorganismu penicillium chrysogenum CCM 8196

Legal Events

Date Code Title Description
IF00 In force as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20020505