CN102604838A - 少孢节丛孢菌菌株n及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株少孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)菌株N，其保藏编号为CGMCC No.5508。该菌是低能氮粒子束注入少孢节丛孢菌获得的诱变株，其具有生长繁殖快、始发产孢子时间早、产孢子数量多、捕食线虫第3期幼虫强的特性，可用于生物防治家畜寄生虫性线虫。

Description

少孢节丛孢菌菌株N及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种具有捕食线虫能力的少孢节丛孢菌(Arthrobotrys oligospora)菌株N及其应用。

背景技术

寄生虫病特别是寄生性线虫病目前依然是严重危害畜牧业发展的大敌。对这类病原生物的防治主要依靠抗蠕虫化学药物，但长期频繁的使用化学驱虫药物不可避免地产生了耐药性、药物残留和生态环境污染等方面的问题。为了解决化学驱虫药物防治家畜寄生性线虫病所带来的上述弊端，促进畜牧业的可持续发展，迫切需要寻求新的家畜线虫病防治方法。目前，研究最多、最深入且最有应用前景的就是利用寄生性线虫的自然天敌-捕食线虫性真菌进行生物防治。

捕食线虫性真菌最初是一类纤维素裂解菌，生活在高碳氮比的环境中，为了获取活性氮而捕食线虫或其他微小动物。少孢节丛孢菌(Arthrobotrys oligospora)是节丛孢属真菌，将少孢节丛孢菌孢子投服给家畜，在家畜粪便中少孢节丛孢菌的孢子能够发芽，在粪便中家畜寄生性线虫第三期幼虫的诱发下生长发育，捕食家畜寄生性线虫第三期幼虫，从而可有效地预防家畜寄生性线虫病的发生。但是现有少孢节丛孢菌繁殖形成孢子的速度较慢，5～7d后孢子才开始产生，大量产生则要到3周后，产孢子量较少，而厚垣孢子产生的时间更长，产量也很少，捕食线虫第3期幼虫的捕食率约为80％，这在一定程度上阻碍了少孢节丛孢菌的推广应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生长繁殖快、始发产孢子时间早、产孢子数量多、吞噬线虫幼虫能力强的少孢节丛孢菌菌株及其应用。

本发明的技术方案为以少孢节丛孢菌为出发菌，通过低能氮离子束注入的诱变技术，改进少孢节丛孢菌菌株，通过实验室生物测定的方法筛选该菌种的生长速度快、早产及高产孢子、捕食线虫第3期幼虫能力强的突变菌株，通过实验动物消化道试验，得到低能氮离子束诱变少孢节丛孢菌菌株N(Arthrobotrys oligospora N)，并确定菌株遗传稳定性。

本发明提供的真菌菌株为少孢节丛孢菌株N，该菌株于2011年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类名少孢节丛孢，拉丁学名Arthrobotrysoligospora，保藏编号为CGMCC No.5508。

本发明提供的少孢节丛孢菌菌株N(Arthrobotrys oligospora N)，属于半知菌纲，节丛孢属。需氧或耐氧。生长适宜温度15℃～35℃。适宜pH5～8，以微酸性环境中生长最好。接种于0.4g/L玉米粉琼脂培养基上，置25℃±1℃温箱中培养。有菌丝和孢子2种形态。其菌丝发达无色，呈密集的丝状体，菌丝主要在琼脂表面生长，也可深入到内部。光镜下菌丝上隔不明显，表现为菌丝上间隔不等距离有发亮点。菌丝宽度在3μm～7μm之间，每天菌丝生长速度平均约10mm/d。培养4～5d后出现垂直生长的分生孢子梗，开始产分生孢子，大量产孢子在12～15d左右。分生孢子梗长而直立不分枝，在梗的游离端或接近梗的上部，密集的分生孢子围绕着分生孢子梗呈轮状排列，一般为2轮或以上，密集成簇状。分生孢子光滑、无色，每个分生孢子呈倒卵形，形态丰满，没有颜色，游离端大而钝圆，连接分生孢子梗基部的一端小而稍尖，大小约为16.7μm～25.2μm×4.9μm～9.9μm，横隔将分生孢子分成两部分，呈双孢体形态。

本发明提供了含有少孢节丛孢菌株N的菌剂。

本发明提供了少孢节丛孢菌株N或含有少孢节丛孢菌株N的菌剂在制备防治寄生虫药物中的应用。

所述的寄生虫为线虫。

本发明提供了少孢节丛孢菌株N或含有少孢节丛孢菌菌株N的菌剂在制备饲料添加剂中的应用。

本发明提供了少孢节丛孢菌株N在防治寄生虫上的应用。

本发明提供了少孢节丛孢菌株N在防治线虫第3期幼虫上的应用。

本发明提供少孢节丛孢菌株N的检定方法是：将捕食性真菌少孢节丛孢菌的分生孢子扩大培养，收集分生孢子，稀释后涂于一次性灭菌塑料培养皿中，干燥后进行低能氮离子束注入，剂量为90×2.6×10¹³～170×2.6×10¹³N⁺ions/cm²；将菌丝生长速度大于9.19mm/天，3天后能产生分生孢子，2周后产孢子量达到高峰的少孢节丛孢菌作为正突变株。

优选地，低能氮离子束注入剂量为130×2.6×10¹³N⁺ions/cm²。

本发明提供的低能氮离子束诱变的少孢节丛孢菌株N在0.4g/L玉米粉琼脂培养基上约4h开始发芽。平均菌落生长约10mm/d多。生长4～5d后开始出现分生孢子，在12～15d分生孢子数量达到高峰。培养3周玉米粒孢子数量大于约2×10⁷/mL。菌丝生长阶段，投入线虫第3期幼虫，2h后可形成菌环和12h左右可形成菌网，对马圆线虫第3期幼虫的捕食率为94％。给羊经口投服孢子能通过其消化道，并生长发芽，捕食线虫第3期幼虫。

本发明提供的少孢节丛孢菌菌株N具有生长繁殖快、始发产孢子时间早、产孢子数量多、捕食线虫第3期幼虫强的特性，可用于生物防治家畜寄生虫性线虫，也可用于制备防治寄生虫的药物和饲料添加剂，具有较好的实用性，可在农业生产中推广使用。

附图说明

图1为在CMA培养基上萌发的少孢节丛孢菌的分生孢子，其中图1a为放大100倍镜下分生孢子，图1b为放大200倍镜下分生孢子；

图2为突变后的少孢节丛孢菌产生的分生孢子梗及分生孢子(100×)；

图3为被少孢节丛孢菌捕食的马圆线虫，其中图3a为放大200倍镜下马圆线虫，图3b为放大100倍镜下马圆线虫。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1低能氮离子束诱变少孢节丛孢菌

1)0.4g/L玉米粉琼脂培养基。称取40g新鲜玉米粉，加入1000mL蒸馏水，微火煮沸1小时后，补足水分至1000mL，用纱布过滤，取滤液10mL，加990mL蒸馏水混匀，调pH值至6.0～6.2，加25g琼脂粉，高压灭菌后倾注灭菌玻璃培养皿备用。

出发菌株的准备：将少孢节丛孢菌菌株接种于0.4g/L玉米粉琼脂培养基，置25℃±1℃温箱中培养。

孢子洗脱液的制备：取蒸馏水1000mL，加2mL吐温-80，加热混匀，分装于500mL玻璃瓶中，1×10⁵Pa灭菌20min后备用。

培养3周后，加入孢子洗脱液，用灭菌玻璃棒搅动，每次3-5mL，洗3-5次，洗脱分生孢子，收集孢子洗脱液，并置于含玻璃珠的三角瓶内230r/min摇床打散25min，孢子块摇匀打散后，用灭菌纱布过滤两次，再于振荡器上振荡混匀，制成10⁶-10⁷个单孢/mL的分生孢子悬液。吸取0.1mL孢子悬液涂布于无菌空平皿表面，于超净台内自然风干制成孢子膜，用于后续离子束注入。

2)低能氮离子束注入剂量：按照IBBe-Device离子照射装置(中国科学院等离子体物理研究所)的操作要求进行低能氮离子束注入处理。首先取前述含有干制孢子膜的平皿，以能量为10keV的N⁺，注入靶室内真空度10^-3Pa，剂量为n×2.6×10¹³N⁺ions/cm²氮离子束照射少孢节丛孢菌分生孢子，n＝(0，30，50，70，90，110，130，150，170，190，210)，脉冲剂量为2.6×10¹³ions/(cm²·s)照射分生孢子。然后分离单个经照射的分生孢子接于新近制备的CMA培养基，每一处理接种10个平皿，标记后于25℃±1℃温箱中培养，次日开始观察计数萌发的孢子数，计算萌发率，绘制存活率曲线，最终依据存活率曲线确定照射剂量。以未经离子束照射组(但经真空处理)和空白对照组(既不照射也未经真空处理)作对照。经选择确定，90×2.6×10¹³、130×2.6×10¹³、170×2.6×10¹³N⁺ions/cm²为合适的照射剂量，其中以130×2.6×10¹³N⁺ions/cm²为最佳。

3)诱变菌株筛选：按照选定条件(采用N⁺，能量10keV，注入靶室内真空度10^-3Pa，剂量为130×2.6×10¹³N⁺ions/cm²)，进行离子束注入实验。分离离子束注入后发芽的单孢子，分别接种于0.4g/L玉米粉琼脂培养基上，置25℃±1℃温箱中培养。每天定时测定菌落大小，判定菌丝生长速度，待分生孢子产生后，观察统计菌丝产孢情况，将生长速度快，产孢子量大的少孢节丛孢菌作为正突变株。传代培养5代进行稳定试验，经传代证实正突变后的菌株在传代5次后，主要遗传性状与出发菌株相比未见明显变化，然后再扩增培养。得到少孢节丛孢菌菌株N，低能氮离子束诱变的少孢节丛孢菌N菌丝无色有隔，分生孢子梗直立不分枝，分生孢子无色呈双孢，菌丝经线虫第3期幼虫诱导可产生菌环及三维立体结构的菌网。该菌株N于2011年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类名少孢节丛孢，拉丁学名Arthrobotrys oligospora，保藏编号为CGMCCNo.5508。

实施例2低能氮离子束诱变少孢节丛孢菌菌株孢子的培养

菌种扩增：减冻后的孢子，接种于0.4g/L玉米粉琼脂培养基。置25±1℃，培养7d。

孢子培养基制备：将250g新鲜玉米粒清洗干净，放入500mL三角瓶中，加250mL蒸馏水，置室温下浸泡24h后，经15磅25min高压灭菌。

孢子培养：将0.4g/L玉米粉琼脂培养基中菌丝孢子混合物随琼脂块切下，接种于玉米粒培养基，放入20℃土1℃温箱中培养3周。观察发现，实施例1诱变获得的少孢节丛孢菌菌株N在0.4g/L玉米粉琼脂培养基上约4h开始发芽。菌丝宽度在3μm～7μm之间，每天菌丝生长速度平均约10mm/d。培养4～5d后出现垂直生长的分生孢子梗，开始产分生孢子，在12～15d分生孢子数量达到高峰。培养3周玉米粒孢子数量大于约2×10⁷/mL。

实施例3低能氮离子束诱变少孢节丛孢菌菌株孢子的保存

孢子培养：将生长于玉米粉琼脂培养基中的少孢节丛孢菌菌丝孢子混合物随琼脂块切下，接种于玉米粒培养基，放入20℃土1℃温箱中培养3周。

保藏孢子提取及准备：用0.02％吐温-80溶液洗脱分生孢子，制备成分生孢子混悬液。取混悬液加入冷冻管，3000r/min离心10min弃上清液，加保护液。

孢子保藏：在普通冰箱-18℃冷冻室、-30℃冰柜、-70℃低温冷冻冰箱或-195℃液氮罐中，保藏经半年或一年冷冻保存，分生孢子仍保存活力。

实施例4少孢节丛孢菌菌株N对马圆线虫幼虫捕食率的测定

将实施例1获得的相同浓度的少孢节丛孢菌正突变株的单个孢子分别接种于0.4g/L玉米粉琼脂培养基上，置25℃±1℃温箱中培养备用。待菌丝长到培养皿直径的2/3后，向培养皿内加入有活力的马圆线虫第三期幼虫0.5mL(由本实验室分离自内蒙古农业大学实验动物园，500条/mL)，每组3个培养皿，作为试验组，另以未经能量10keV的N⁺照射的真空对照组作为对照。在倒置显微镜下，每天定时观察少孢节丛孢菌捕食器(菌环和菌网)的数量以及计算对线虫幼虫的致死率。开始时每隔2h观察一次，24h后每天观察一次。

观察记录为：2h后，形成第一个完整的菌环，基本形态为圆形、类圆形，菌环直径大约在16μm～35μm之间；每个菌环由3～4个细胞相连形成，在此菌环上又产生突起，继之形成多个菌环，与原菌环相接，形成菌网。菌网在加入三期幼虫12h左右形成，每个菌网由3～11个菌环组成。组成菌环、菌网的菌丝都比较粗。在菌环与线虫幼虫的接触部位，菌丝更为膨大，表面粗糙。在菌环和菌网形成的同时就可见被黏住或套住的线虫幼虫。幼虫被套4h后失去运动能力，渐形成空壳，直至完全消失。

捕食率(X)＝(捕食致死虫体+捕食未致死虫体)/(捕食致死虫体+捕食未致死虫体+未捕食虫体)×100％

投入线虫第3期幼虫，2h后形成菌环和12h左右形成菌网，对马圆线虫第3期幼虫的捕食率为94％。

表1离子束照射对少孢节从孢菌菌丝捕食率的影响

实施例5少孢节丛孢菌菌株N临床投喂动物实验

孢子批量培养：将菌株接种于玉米粒培养基，培养3周。

孢子含量测定：取1g带分生孢子的玉米粒，用0.2mL/L的吐温-80孢子洗脱液洗脱孢子，计数。

投服：以含5×10⁷孢子的玉米粒培养物投服羊。实验羊为年龄在6月龄-1岁之间，平均体重约为50kg，自然感染寄生性线虫(食道口线虫(Oesophagostomum)、毛圆线虫(Trichostrongylus)和捻转血矛线虫)的绵羊，共接种14只。

观察：采集动物新鲜粪便15g放入无菌平皿中，于(20±1)℃恒温培养箱中培养15d，每天翻动、加水(根据干湿情况定加水量)，15d后用贝尔曼氏法分离幼虫，进行第三期幼虫观察，统计克粪便幼虫数(LPG)。比较对照组与试验组的幼虫数，得出捕食线虫性真菌少孢节丛孢菌杀虫率，评价杀虫效果。杀虫率按以下公式计算：

杀虫率(％)＝(对照组L PG-试验组L PG)/对照组L PG×100％

给羊饲喂少孢节丛孢菌菌株分生孢子48～60h后的粪便幼虫培养数据显示：试验组羊与对照组羊相比，其平均杀虫率为96.3％。

试验后48h，取1g试验动物的粪便在0.4g/L玉米粉琼脂培养基上培养，有少孢节丛孢菌菌株的菌丝和分生孢子形成，且加入虫体后，有菌网、菌环生成，并有虫体被捕获。说明经口喂入的少孢节丛孢菌菌株N分生孢子顺利通过了动物消化道，并在粪便中存活、发育，且保持着较好的捕食活性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.少孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)菌株N，其保藏号为CGMCC No.5508。

2.含有权利要求1所述少孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)菌株N的菌剂。

3.权利要求1所述的菌株N或权利要求2所述的菌剂在制备防治寄生虫药物中的应用。

4.权利要求1所述的菌株N或权利要求2所述的菌剂在制备饲料添加剂中的应用。

5.权利要求1所述的菌株N或权利要求2所述的菌剂在生物防治寄生虫中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的寄生虫为线虫。

7.一种筛选少孢节丛孢菌突变株的方法，其特征在于，将捕食性真菌少孢节丛孢菌的分生孢子扩大培养，收集分生孢子，稀释后涂于一次性灭菌塑料培养皿中，干燥后进行低能氮离子束注入，剂量为90×2.6×10¹³～170×2.6×10¹³N⁺ions/cm²；将菌丝生长速度大于9.19mm/天，3天后能产生分生孢子，2周后产孢子量达到高峰的少孢节丛孢菌作为正突变株。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，低能氮离子束注入剂量为130×2.6×10¹³N⁺ions/cm²。

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